PT1018550E

PT1018550E - Proteína e péptidos alergénicos dos ácaros do pó e suas utilizações

Info

Publication number: PT1018550E
Application number: PT00102413T
Authority: PT
Inventors: Kaw-Yan Chua; Wayne Robert Thomas
Original assignee: Inst Child Health Res
Priority date: 1993-03-12
Filing date: 1994-03-11
Publication date: 2007-02-28
Also published as: US6905845B2; EP0690914A1; EP0690914A4; JP3742426B2; EP1018550A2; IL108921A0; ATE346149T1; US20050260218A1; DK0690914T3; DE69434885T2; ATE195343T1; IL149905A0; ZA941713B; DK1018550T3; JP2007151555A; AU6278394A; JP2004113249A; PT690914E; US8003382B2; US6413738B1

Description

ΡΕ1018550 1

DESCRIÇÃO "PROTEÍNA E PÉPTIDOS ALERGÉNICOS DOS ÁCAROS DO PÓ E SUAS UTILIZAÇÕES"

Antecedentes do Invento

Aproximadamente 10% da população torna-se hiper-sensível (alérgica) após a exposição a antigénios de uma variedade de fontes ambientais. Os antigénios que induzem tipos imediatos e/ou retardados de hipersensibilidade são conhecidos como alérgenos (King, T.P., Adv. Immunol., 23: 77-105, 1976). Estes incluem produtos de gramineas, árvores, ervas, pêlo animal, insectos, alimentos, fármacos e produtos quimicos. Crê-se que a predisposição genética de um indivíduo tem um papel no desenvolvimento de respostas alérgicas imediatas (Young, R. P. et al., Clin. Sei., 79: 19, 1990) tal como atopia e anafilaxia cujos sintomas incluem febre dos fenos, asma e urticária.

Os anticorpos envolvidos em alergias atópicas pertencem primeiramente à classe IgE das imunoglobulinas. As IgE ligam-se aos basófilos, mastócitos e células dendrí-ticas através de um receptor específico de alta afinidade FcsRI (Kinet, J.P., Curr. Opin. Immunol., 2: 499-505, 1990). Após a combinação de um alérgeno que actue como ligando com o seu receptor cognato IgE, o FcsRI ligado à IgE ΡΕ1018550 pode ligar-se de forma cruzada à superfície celular, resultando em manifestações fisiológicas de interacção IgE-alér-geno. Estes efeitos fisiológicos incluem a libertação de, entre outras substâncias, histamina, serotonina, heparina, factor(es) quimiotático(s) para os leucócitos eosinófilos e/ou leucotrienos C4, D4 e E4, que causam constrição prolongada das células do músculo liso bronquial (Hood, L.E. et al., Immunology (2a ed.), The Ben jamin/Cumming Publishing Co., Inc. (1984)). Por este motivo, a consequência última da interacção de um alérgeno com a IgE são os sintomas alérgicos despoletados pela libertação dos mediadores supracitados. Tais sintomas podem ser de natureza sistémica ou local, dependendo da via de entrada do antigénio e do padrão de deposição da IgE nos mastócitos ou basófilos. As manifestações locais ocorrem geralmente em superfícies epiteliais no local de entrada do alérgeno. Os efeitos sistémicos podem induzir anafilaxia (choque anafilático) que resulta da resposta de IgE-basófilo ao antigénio em circulação (intravascular).

Estudos com alérgenos purificados mostraram que cerca de 80% dos doentes alérgicos ao ácaro Dermatophagoides pteronyssinus produzem IgE reactiva a Derp I e Derp II (Chapman M.D. et al., J. Immunol., 125: 587-92, 1980; Lind P., J. Allergy Clin. Immunol., 76: 753-61, 1985; van der Zee J.S. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 81: 884-95, 1988) . Para cerca de metade dos doentes, estas especificidades constituem 50% do anticorpo IgE anti-ácaro. O alérgeno Derp III, recentemente identificado como 3 ΡΕ1018550 tripsina, (Stewart G.A. et al., Immunology 75: 29-35, 1992) reage com uma frequência semelhante ou superior (Stewart G.A. et al., supra; Ford S.A. et al., Clin. Exp. Allergy 20: 27-31, 1989). No entanto, no único estudo quantitativo efectuado até à data, os investigadores relataram que o nível de ligação à IgE é consideravelmente menor que o de Derp I. Técnicas electroforéticas (Ford. S.A. et al., supra; Bengtsson A. et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 80: 383-90, 1986; Lind P. et al., Scand. J.

Immunol. , 17: 263-73, 1983; Tovey E.R. et al., J. Allergy

Clin. Immunol., 79: 93-102, 1987) mostraram que a maioria dos soros reconhece outros alérgenos. Por exemplo, no estudo de Ford et al. (supra) a marcação "Western" mostrou que 8 soros reagiam com 1-2 bandas, 6 com 3-6 e 3 com um número maior incluindo um com pelo menos 13. Noutro estudo, Baldo et al., (Adv. Bioscience 4: 13-31, 1989) relatam a descoberta dos componentes a Mr 30, 26 e 25 K que reagiam com 50% dos soros. Para determinar a importância de determinadas especificidades nas reacções alérgicas, eram necessários alérgenos purificados para testes quantitativos de ligação à IgE e para examinar a frequência e o perfil das linfocinas para a reactividade das células T. 0 tratamento de doentes com sensibilidade aos ácaros do pó através da administração de doses crescentes de extractos de pó tem a desvantagem da potencial ana-filaxia durante o tratamento e a possível necessidade de continuar a terapia ao longo de um período de vários anos para construir a tolerância suficiente que resulta na 4 ΡΕ1018550 diminuição significativa dos sintomas clínicos. Uma composição terapêutica e um método de terapia que evite estes problemas seriam benéficos.

Sumário do Invento

Este invento proporciona ácidos nucleicos isolados codificando péptidos possuindo pelo menos uma actividade biológica de Der f VII, um alérgeno proteico da espécie Dermatophagoides farinae. 0 ácido nucleico preferido é ADNc possuindo a sequência nucleotidica mostrada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 6) (Der f VII) . 0 invento refere-se também a péptidos codificados por todo ou por uma porção do tal ADNc (SEQ ID No. 6) e que possuem pelo menos uma actividade biológica de Der f VII. Estão também contemplados ácidos nucleicos isolados que hibridam sob condições de elevado rigor (e.g., equivalentes a 20-27°C abaixo da Tm e NaCl 1 M) com um ácido nucleico possuindo uma sequência nucleotidica mostrada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 6) ou que codificam um péptido compreendendo toda ou uma porção de uma sequência de aminoácidos da Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 7) (Der f VII) . Os ácidos nucleicos que codificam péptidos possuindo uma actividade de Der f VII e possuindo pelo menos 50% de homologia com uma sequência mostrada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 7) (Der f VII) são também apresentados. Os péptidos possuindo uma actividade de Der f VII produzidos através de expressão recombinante de um ácido nucleico do invento e os péptidos possuindo uma actividade de Der f VII preparados através de síntese química estão também incluídos neste invento. Os 5 ΡΕ1018550 péptidos preferidos possuem a capacidade de induzir uma resposta de células T, que pode incluir a estimulação de células T (medida através de, por exemplo, proliferação das células T ou secreção de citocinas) ou a ausência de capacidade de resposta (i.e., o contacto com o péptido ou com um complexo do péptido com uma molécula do MHC (CHP) de uma célula de apresentação de antigénio induz as células T a tornarem-se não responsivas a sinais estimuladores ou incapazes de proliferação). Outros péptidos preferidos, à parte da ou para além da capacidade de induzir uma resposta das células T, possuem a capacidade de se ligarem à IgE especifica dos ácaros do pó dos sujeitos alérgicos aos ácaros do pó. Tais péptidos são úteis no diagnóstico de sensibilidade aos ácaros do pó num sujeito. Ainda outros péptidos, à parte da ou para além da capacidade de induzir uma resposta das células T, possuem uma capacidade significativamente reduzida de se ligarem à IgE de alérgicos aos ácaros do pó. Tais péptidos são particularmente úteis como agentes terapêuticos.

Outros péptidos preferidos compreendem uma sequência de aminoácidos mostrada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 7) (Der f VII) . Numa concretização, são incluídos péptidos possuindo a actividade de Der f VII e compreendendo uma porção da sequência de aminoácidos da Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 7) . Tais péptidos têm pelo menos 8-30 aminoácidos de comprimento, de preferência 10-20 aminoácidos de comprimento sendo ainda preferível terem 10-16 aminoácidos de comprimento. 6 ΡΕ1018550

Outro aspecto do invento inclui anticorpos espe- cificamente reactivos com um péptido possuindo uma actividade de Der f VII. Um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ser utilizado em composições adequadas para administração farmacêutica. Tais composições podem ser utilizadas de um modo semelhante aos extractos de ácaros do pó para tratar ou prevenir reacções alérgicas a um alérgeno dos ácaros do pó num sujeito. Os ácidos nucleicos do invento e os péptidos possuindo uma actividade de Der f VII também podem ser utilizados para o diagnóstico de sensibilidade num sujeito a um alérgeno dos ácaros do pó.

Breve Descrição dos Desenhos A Fig. 1 mostra a frequência de ligação da IgE de soros de alérgicos com placas de λρ^Ι-Ηϋβ. A Fig. 2 mostra a reactividade da IgE e de anticorpo de coelho anti-ácaros do pó para o produto purificado da fusão glutationa-S-transferase da inserção HD6 clonada em pGEX-1. A Fig. 3A e a Fig. 3B são a sequência nucle-otidica e a sequência de aminoácidos deduzida do clone HD6 de Der p VII. A Fig. 4 mostra extractos de ácaros do pó sujeitos a electroforese em SDS-PAGE a 8-18%, electro- 7 ΡΕ1018550 transferidos para nitrocelulose e feitos reagir com soro de alérgicos reunidos absorvidos com lisados de E. coli contendo um vector pGEX-1 de controlo (pista 1) ou pGEZ-1 HD6 (pista 2) . A Fig. 5 mostra a reactividade de anticorpos purificados por afinidade anti-HD6 para extractos de D. pteronyssinus. Os anticorpos de coelho foram purificados por afinidade em nitrocelulose e utilizados para sondar uma marcação Western de extractos de ácaros, sujeitos a Ί o c electroforese em SDS-PAGE a 8-18% e revelados com I-proteína A. A Fig. 6A e a Fig. 6B é a sequência nucleotídica e a sequência de aminoácidos deduzida de Der f VII. A Fig. 7A, 7B, 7C, 7D e 7E é uma comparação da sequência nucleotídica e da sequência de aminoácidos deduzida de Der f VII e Der p VII. Os pontos indicam um consenso na sequência nucleotídica entre Der f VII e Der p VII. As bases nucleotídicas que diferem entre Der f VII e Der p VII estão indicadas, juntamente com quaisquer diferenças de aminoácidos correspondentes.

Descrição Detalhada do Invento

Este invento refere-se a ácidos nucleicos isolados codificando péptidos que possuem pelo menos uma actividade biológica de Der f VII, alérgeno da espécie ΡΕ1018550

Dermatophagoides farinae. De preferência, o ácido nucleico é ADNc compreendendo uma sequência nucleotidica mostrada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 6) (Der p VII). 0 ADNc mostrado na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 6) codifica um péptido Der f VII. 0 péptido Der f VII é codificado pelas bases 43 a 681 desta sequência de ADNc. A sequência de aminoácidos deduzida de Der f VII com base neste ADNc é também mostrada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 7). Este péptido Der f VII pode conter uma sequência líder não verificada na proteína madura.

Uma célula hospedeira transfectada com um vector de expressão contendo uma sequência nucleotidica codificando Der f VII foi depositada sob o Tratado de Budapeste com a Australian Government Analytical Laboratories a 10 de Março de 1994 e foi-lhe atribuído o número de acesso N94/8705.

Concordantemente, um aspecto deste invento refere-se a ácidos nucleicos isolados compreendendo sequências nucleotídicas codificando Der f VII, fragmentos destas codificando péptidos possuindo pelo menos uma actividade biológica de Der f VII e equivalentes de tais ácidos nucleicos. 0 termo ácido nucleico tal como aqui se utiliza pretende incluir tais fragmentos e equivalentes. O termo equivalente pretende incluir sequências nucleotídicas codificando proteínas funcionalmente equivalentes a Der f VII ou péptidos funcionalmente equivalentes possuindo uma 9 ΡΕ1018550 actividade de Der f VII. Tal como aqui definido, um péptido possuindo uma actividade de Der f VII possui pelo menos uma actividade biológica do alérgeno Der f VII. As sequências nucleotidicas equivalentes incluirão sequências que difiram numa ou mais substituições, adições ou deleções nucleotidicas, tais como variantes alélicas, e incluirão também sequências que difiram da sequência nucleotídica que codifica Der f VII mostrada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 6) devido à degenerescência do código genético. Os equivalentes incluirão também sequências nucleotídicas que hibridem sob condições rigorosas (i.e., equivalentes a cerca de 20-27° C abaixo do ponto de fusão (Tm) e cerca de 1 M de sal) com a sequência nucleotídica de Der f VII mostrada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 6).

Os péptidos aqui referidos como possuindo uma actividade de Der f VII ou possuindo uma actividade Der f VII são aqui definidos como péptidos que possuem uma sequência de aminoácidos que correspondente substancialmente a toda ou a uma porção da sequência de aminoácidos de Der f VII mostrada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 7), péptidos esses que possuem pelo menos uma actividade biológica de Der f VII. Por exemplo, um péptido possuindo a actividade de Der f VII pode ter a capacidade de induzir uma resposta a Der f VII em células T restringidas tal como estimulação (e.g., proliferação de células T ou secreção de citocinas) ou de induzir ausência de capacidade de resposta em células T. Alternativamente, ou adicionalmente, um péptido possuindo uma actividade de 10 ΡΕ1018550

Der f VII pode ter a capacidade de se ligar a (de ser reconhecido por) anticorpos de imunoglobulina E (IgE) de sujeitos alérgicos aos ácaros do pó. Os péptidos que se ligam a IgE são úteis em métodos de detecção de sensibilidade alérgica a Der f VII num sujeito. Os péptidos que não se ligam a IgE, ou que se ligam a IgE numa menor extensão que uma proteína Der f VII nativa purificada se liga a IgE, são particularmente úteis como agentes terapêuticos.

Numa concretização, o ácido nucleico é um ADNc codificando um péptido possuindo uma actividade de Der f VII. De preferência, o ácido nucleico é uma molécula de ADNc compreendendo pelo menos uma porção da sequência nucleotídica que codifica Der f VII mostrada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 6) . Uma porção preferida das moléculas de ADNc da Figura 6A e 6B inclui a região de codificação da molécula.

Noutra concretização, o ácido nucleico do invento codifica um péptido possuindo uma actividade de Der f VII e compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 7) (Der f VII) . Os ácidos nucleicos preferidos codificam um péptido possuindo uma actividade de Der f VII e possuindo pelo menos cerca de 50% de homologia, de maior preferência pelo menos cerca 60% de homologia, sendo preferível pelo menos cerca de 70% de homologia com a sequência mostrada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 6) (Der f VII). Os ácidos nucleicos que codificam 11 ΡΕ1018550 péptidos possuindo uma actividade de Der f VII e possuindo pelo menos cerca de 90% de homologia, de preferência pelo menos cerca 95%, sendo preferível pelo menos cerca de 98-99% de homologia com uma sequência exposta na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 7) (Der f VII) estão também dentro do âmbito do invento. A homologia refere-se à semelhança entre dois péptidos possuindo uma actividade de Der f VII ou entre duas moléculas de ácido nucleico. A homologia pode ser determinada através de comparação de uma posição em cada uma das sequências que podem ser alinhadas com o objectivo de as comparar. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base ou pelo mesmo aminoácido, então as moléculas são homólogas nessa posição. Um grau de homologia entre sequências é uma função do número de coincidências ou posições homólogas partilhadas pelas sequências.

Outro aspecto do invento proporciona um ácido nucleico que híbrida sob condições de elevado ou baixo rigor com um ácido nucleico que codifica um péptido possuindo toda ou uma porção de uma sequência de amino-ácidos mostrada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 7) {Der f VII). As condições de rigor apropriadas que promovem a hibridação do ADN, por exemplo, cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) 6,0x a cerca de 45°C, seguido de uma lavagem de SSC 2,0x a 50°C são conhecidas dos peritos na arte ou podem ser verificadas em "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sais no passo de lavagem pode ser seleccionada de um rigor baixo de cerca de SSC 2, Οχ a 12 ΡΕ1018550 50°C a um rigor elevado de cerca de SSC 0,2x a 50°C. Adicionalmente, a temperatura no passo de lavagem pode ser aumentada de condições de baixo rigor à temperatura ambiente, cerca de 22°C, para condições de elevado rigor a cerca de 65°C. Ácidos nucleicos isolados codificando péptidos possuindo uma actividade de Der f VII, tal como aqui descrito, e possuindo uma sequência que difira das sequências nucleotidicas mostradas nas Figuras 6A e 6B (SEQ ID No. 6) devido à degenerescência no código genético estão também incluídas no âmbito do invento. Tais ácidos nucleicos codificam péptidos funcionalmente equivalentes (i.e., um péptido possuindo uma actividade de Der f VII) mas que diferem na sequência das sequências da Figura 6A e 6B devido à degenerescência do código genético. Por exemplo, vários aminoácidos são designados por mais de um tripleto. Os codões que especificam o mesmo aminoácido, ou sinónimos (por exemplo, CAU e CAC são sinónimos para a histidina) podem resultar em mutações "silenciosas" que não afectam a sequência de aminoácidos da proteína Der f VII. No entanto, espera-se que existam dentro da população de ácaros do pó polimorfismos da sequência de ADN que conduzam a alterações na sequência de aminoácidos de Der f VII. Um perito na arte apreciará que estas variações num ou mais nucleótidos (até cerca de 3-4% dos nucleótidos) dos ácidos nucleicos codificando péptidos possuindo uma actividade de Der f VII possam existir entre cada um dos ácaros do pó devido a variação alélica natural. Qualquer uma e todas estas 13 ΡΕ1018550 variações nucleotídicas e polimorfismos de aminoácidos resultantes estão dentro do âmbito deste invento. Para além disso, podem existir uma ou mais isoformas ou relacionadas, que rejam de forma cruzada com membros da familia de Der f VII. Tais isoformas ou membros da familia são definidos como proteínas aparentadas na função e na sequência de aminoácidos com Der f VII, mas codificadas por genes em diferentes loci.

Fragmentos do ácido nucleico que codifica Der f VII estão também incluídos no âmbito do invento. Tal como aqui se utiliza, um fragmento do ácido nucleico que codifica Der f VII refere-se a uma sequência nucleotídica possuindo menos nucleótidos que a sequência nucleotídica que codifica toda a sequência de aminoácidos da proteína Der f VII e que codifica um péptido possuindo uma actividade de Der f VII (i.e., um péptido possuindo pelo menos uma actividade biológica do alérgeno Der f VII) tal como aqui definido.

Os fragmentos de ácidos nucleicos preferidos codificam péptidos de pelo menos cerca de 7 resíduos de aminoácidos de comprimento, de preferência de cerca de 13-40 resíduos de aminoácidos de comprimento, sendo ainda preferível de cerca de 16-30 resíduos de aminoácidos de comprimento. Os fragmentos de ácido nucleico que codificam péptidos possuindo uma actividade de Der f VII de pelo menos cerca de 30 resíduos de aminoácidos de comprimento, pelo menos cerca de 40 resíduos de aminoácidos de compri- 14 ΡΕ1018550 mento, pelo menos cerca de 60 resíduos de aminoácidos de comprimento, pelo menos cerca de 80 resíduos de aminoácidos de comprimento, pelo menos cerca de 100 resíduos de aminoácidos de comprimento, pelo menos cerca de 140 resíduos de comprimento e pelo menos cerca de 200 resíduos de aminoácidos de comprimento ou mais estão também incluídos no âmbito deste invento. Em geral, a expressão de péptidos numa célula hospedeira transformada é muito vantajosa quando o péptido desejado tem mais de cerca de 20 aminoácidos de comprimento. Péptidos menores são tipicamente mais fáceis de sintetizar quimicamente.

Os fragmentos de ácido nucleico dentro do âmbito do invento incluem os que são capazes de hibridar sob condições de alto ou baixo rigor com ácidos nucleicos de outra espécie animal para utilização em protocolos de pesquisa para detectar Der f VII ou alérgenos que são reactivos de forma cruzada com Der f VII. Geralmente, o ácido nucleico que codifica um péptido possuindo uma actividade de Der f VII será seleccionado a partir das bases que codificam a proteína madura, no entanto, nalguns casos pode ser desejável seleccionar todo ou parte de um péptido a partir da porção da sequência líder dos ácidos nucleicos do invento. Os ácidos nucleicos dentro do âmbito do invento podem também conter sequências ligadoras, locais de restrição de endonucleases modificados e outras sequências úteis para clonagem molecular, expressão ou purificação de péptidos recombinantes possuindo uma actividade de Der f VII. 15 ΡΕ1018550

Um ácido nucleico codificando um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ser obtido a partir de ARNm do ácaro do pó Dermatophagoides farinae. Deve ser também possível obter ácidos nucleicos codificando Der f VII a partir de ADN genómico de Dermatophagoides farinae. Por exemplo, o gene codificando Der f VII pode ser clonado a partir de ADNc ou de uma biblioteca genónica de acordo com os protocolos aqui descritos. Um ADNc codificando Der f VII pode ser obtido através do isolamento do ARNm total de Dermatophagoides farinae. Os ADNcs de cadeia dupla podem então ser preparados a partir do ARNm total. Subsequentemente, os ADNcs podem ser inseridos num vector plasmídico ou bacteriofágico adequado utilizando qualquer uma das várias técnicas conhecidas. Os genes codificando Der f VII também podem ser clonados utilizando as técnicas estabelecidas de reacção em cadeia de polimerase (ver Exemplos 1 e 2) de acordo com a informação da sequência nucleotídica proporcionada pelo invento. Os ácidos nucleicos do invento podem ser ADN ou ARN. Um ácido nucleico preferido é um ADNc codificando Der f VII possuindo a sequência representada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 6) (Der f VII).

Este invento proporciona também vectores de expressão contendo um ácido nucleico codificando um péptido possuindo uma actividade de Der f VII, operativamente ligado a pelo menos uma sequência reguladora. Operativamente ligado pretende significar que a sequência núcleo- 16 ΡΕ1018550 tídica está ligada a uma sequência reguladora de um modo que permite a expressão da sequência nucleotidica. As sequências reguladoras são reconhecidas na arte e são seleccionadas para dirigir a expressão do péptido possuindo uma actividade de Der f VII. Concordantemente, o termo sequência reguladora inclui promotores, estimuladores e outros elementos de controlo da expressão. Tais sequências reguladoras estão descritas em Goeddel; "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology" 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Entenda-se que a concepção do vector de expressão pode depender de factores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada e/ou o tipo de proteína que se deseje expressar. Numa concretização, o vector de expressão inclui um ADN codificando um péptido possuindo uma actividade de Der f VII. Tais vectores de expressão podem ser utilizados para transfectar células para deste modo produzir proteínas ou péptidos, incluindo proteínas de fusão ou péptidos codificados por ácidos nucleicos tal como aqui descrito.

Este invento refere-se ainda a uma célula hospedeira transformada para expressar um péptido possuindo uma actividade de Der f VII. A célula hospedeira pode ser uma qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ser expresso em células bacterianas tais como E. coli, células de insecto (baculovírus) , levedura, ou células de mamífero tais como células de ovário de hamster chinês (CHO). Outras células hospedeiras adequadas podem ser encontradas em 17 ΡΕ1018550

Goeddel, (1990) supra ou serem conhecidas dos peritos na arte. A expressão em células eucarióticas tais como células de mamífero, levedura ou insecto pode conduzir a glicosilação parcial ou completa e/ou à formação de ligações dissulfureto relevantes inter- ou intra-cadeias da proteína recombinante. Exemplos de vectores de expressão na levedura S. cerevisae incluem pYepSecl (Baldari. et al., Embo J., 6: 229-234, 1987), pMFa (Kurjan e Herskowitz,

Cell, 30: 933-943, 1982), pJRY88 (Schultz et al., Gene, 54: 113-123, 1987) e pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectores de baculovírus disponíveis para expressão de proteínas em células de insecto em cultura (células SF 9) incluem a série pAc (Smith et al., Mol. Cell Biol., 3: 2156-2165, 1983) e a série pVL (Lucklow, V.A., e Summers, M.D., Virology, 170: 31-39, 1989). Geralmente as células COS (Gluzman, Y., Cell, 23: 175-182, 1981) são utilizadas em conjunto com vectores tais como pCDM 8 (Aruffo, A. e Seed, B. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84: 8573-8577, 1987) para amplificação/expressão transiente em células de mamífero, enquanto que as células de CHO (dhfr - Ovário de Hamster Chinês) são utilizadas com vectores tais como pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. , 6: 187-195, 1987) para amplificação/expressão estável em células de mamífero. O ADN do vector pode ser introduzido em células de mamífero através de técnicas convencionais tais como co-precipitação com fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano ou electroporação. Métodos 18 ΡΕ1018550 adequados para transformação de células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook et al., ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) e outros manuais de laboratório. A expressão em procariotas é frequentemente efectuada em E. coli com vectores de expressão indutiveis de fusão ou de não fusão. Os vectores de fusão adicionam habitualmente vários aminoácidos NH2-terminais ao gene alvo expresso. Estes aminoácidos NH2-terminais são frequentemente referidos como grupo repórter. Tais grupos repórter servem habitualmente dois objectivos: 1) aumentam a solubilidade da proteína alvo recombinante; e 2) auxiliam na purificação da proteína alvo recombinante actuando como ligandos em purificação por afinidade. Frequentemente, em vectores de expressão de fusão, é introduzido um local de clivagem proteolítica na junção do grupo repórter e da proteína alvo recombinante para permitir a separação da proteína alvo recombinante do grupo repórter subsequente à purificação da proteína de fusão. Tais enzimas e as suas sequências cognatas de reconhecimento incluem o Factor Xa, a trombina e a enterocinase. Vectores de expressão de fusão típicos incluem pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Austrália), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fundem glutationa-S-transferase, proteína de ligação à maltose E ou proteína A, respecti-vamente, com a proteína alvo recombinante.

Vectores de expressão indutiveis de não fusão 19 ΡΕ1018550 incluem pTrc (Amann et al., Gene, 69: 301-315, 1988) e pET lld (Studier et al., "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology", 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 60-89) . Enquanto que a expressão de genes alvo se baseia na transcrição pela ARN-polimerase do hospedeiro do promotor de fusão híbrida trp-lac em pTrc, a expressão de genes alvo inseridos em pET lld baseia-se na transcrição do promotor da fusão T7 gnlO-lac 0 mediada pela ARN-polimerase virai co-expressa (T7 gnl). Esta polimerase virai é fornecida pelas estirpes hospedeiras BL21(DE3) ou HMS174(DE3) de um profago λ residente que ancora uma T7 gnl sob o controlo transcricional do promotor lacUV 5.

Uma estratégia para maximizar a expressão recombinante de Der f VII em E. coli é expressar a proteína numa bactéria hospedeira com uma capacidade enfraquecida para clivar proteoliticamente a proteína recombinante (Gottesman, S., "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology", 185, Academic Press, San Diego, Califórnia (1990) 119-128). Outra estratégia é estar a alterar o ácido nucleico codificando a proteína Der f VII a ser inserida num vector de expressão para que cada um dos codões para cada aminoácido seja dos preferencialmente utilizados em proteínas de E. coli altamente expressas (Wada et al., Nucl. Acids Res., 20: 2111-2118, 1992). Tal alteração dos ácidos nucleicos do invento pode ser efectuada através de técnicas padrão de síntese de ADN.

Os ácidos nucleicos do invento podem também ser 20 ΡΕ1018550 sintetizados quimicamente utilizando técnicas padrão. São conhecidos vários métodos de síntese química de polidesoxinucleótidos, incluindo síntese de fase sólida que, tal como a síntese peptídica, tem sido completamente automatizada em sintetizadores de ADN comercialmente disponíveis (Ver e.g., Itakura et al., Patente U.S. N° 4598049; Caruthers et al., Patente U.S. N° 4458066; e Itakura, Patent U.S. Nos 4401796 e 4373071, aqui incorporadas por referência).

Este invento refere-se ainda a métodos de produção de péptidos que possuem uma actividade de Der f VII. Por exemplo, uma célula hospedeira transfectada com um vector de ácido nucleico dirigindo a expressão de uma sequência nucleotídica codificando um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ser cultivada sob as condições apropriadas para permitir que ocorra a expressão do péptido. O péptido pode ser secretado e isolado de uma mistura de células e meio contendo o péptido que possui uma actividade de Der f VII. Alternativamente, o péptido pode ser retido citoplasmaticamente e as células colhidas, lisadas e a proteína isolada. Uma cultura de células inclui células hospedeiras, meios e outros subprodutos. Os meios adequados para a cultura de células são bem conhecidos na arte. O péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ser isolado a partir do meio de cultura, das células hospedeiras ou de ambos utilizando técnicas bem conhecidas na arte para purificação de proteínas incluindo cromatografia de troca iónica, cromatografia de filtração 21 ΡΕ1018550 em gel, ultrafiltração, electroforese e purificação por imunoafinidade com anticorpos específicos para um péptido com uma actividade de Der f VII.

Outro aspecto do invento refere-se a péptidos isolados possuindo uma actividade de Der f VII. Um péptido possuindo uma actividade de Der f VII possui pelo menos uma actividade biológica do alérgeno Der f VII. Por exemplo, um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ter a capacidade de induzir uma resposta em células T específicas para Der f VII tal como estimulação (proliferação de células T ou secreção de citocinas) ou de induzir incapacidade de resposta em células T. Numa concretização, um péptido possuindo uma actividade de Der f VII estimula células T tal como evidenciado através de, por exemplo, proliferação de células T ou secreção de citocinas. Noutra concretização, péptidos possuindo uma actividade de Der f VII induzem incapacidade de resposta em células T em que as células T não respondem a um confronto subsequente com um péptido Der f VII após exposição ao péptido. Ainda noutra concretização, um péptido possuindo uma actividade de Der f VII possui reduzida actividade de ligação a IgE em comparação com a proteína Der f VII nativa e purificada. Um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode diferir na sequência de aminoácidos da sequência de Der f VII representada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 7) {Der f VII) mas tais diferenças resultam numa proteína modificada que funciona do mesmo modo ou de modo semelhante que a proteína Der f VII nativa ou que possui as mesmas características ou 22 ΡΕ1018550 características semelhantes a uma proteína Der f VII nativa. Várias modificações da proteína Der f VII para produzir estes e outros péptidos funcionalmente equivalentes são aqui descritas em detalhe. 0 termo péptido, tal como aqui se utiliza, refere-se a proteínas inteiras e a polipéptidos ou fragmentos peptídicos destes.

Um péptido pode ser produzido através da modificação da sequência de aminoácidos da proteína Der f VII mostrada na Figura 6A e 6B (SEQ ID No. 7) (Der f VII), tal como substituição, adição ou deleção de um resíduo de aminoácido que não esteja directamente envolvido na função da proteína. Os péptidos do invento podem ter pelo menos 10 resíduos de aminoácidos de comprimento, de preferência cerca de 10-20 resíduos de aminoácidos, sendo preferível cerca de 10-16 resíduos de aminoácidos de comprimento. Os péptidos possuindo uma actividade de Der f VII e que têm pelo menos 30 resíduos de aminoácidos de comprimento, pelo menos cerca de 40 resíduos de aminoácidos de comprimento, pelo menos cerca de 60 resíduos de aminoácidos de comprimento, pelo menos cerca de 80 resíduos de aminoácidos de comprimento e pelo menos cerca de 100 resíduos de aminoácidos de comprimento estão também incluídos no âmbito deste invento.

Outra concretização do invento proporciona uma preparação substancialmente pura de um péptido possuindo uma actividade de Der f VII. Tal preparação é substancialmente isenta de proteínas e péptidos com os quais o péptido 23 ΡΕ1018550 ocorre naturalmente (i.e., outros péptidos dos ácaros do pó), numa célula ou quando secretado por uma célula. 0 termo isolado tal como aqui se utiliza refere-se a um ácido nucleico ou péptido que é substancialmente isento de material celular ou de meio de cultura quando produzido através de técnicas de ADN recombinante, ou de percursores químicos ou de outros químicos quando sintetizado quimicamente. Tais proteínas ou péptidos são também caracterizados como sendo isentos de todas as outras proteínas dos ácaros do pó. Concordantemente, um péptido isolado possuindo uma actividade de Der f VII é produzido de forma recombinante ou sinteticamente e é substancialmente isento de material celular e de meio de cultura ou substancialmente isento de percursores químicos ou de outros químicos e é substancialmente isento de todas as outras proteínas dos ácaros do pó. Um ácido nucleico isolado é também isento das sequências que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (i.e., sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no organismo do qual o ácido nucleico é derivado.

Os péptidos possuindo uma actividade de Der f VII podem ser obtidos, por exemplo, através de pesquisa de péptidos produzidos de forma recombinante a partir do fragmento correspondente do ácido nucleico de Der f VII que codifica tais péptidos. Além disso, os fragmentos podem ser sintetizados quimicamente utilizando técnicas conhecidas na arte tais como química f-Moc ou t-Boc de Merrifield em fase 24 ΡΕ1018550 sólida. Por exemplo, a proteína Der f VII pode ser arbitrariamente dividida em fragmentos de comprimentos desejados sem sobreposição dos fragmentos ou de preferência dividida em fragmentos que se sobreponham de um comprimento desejado. Os fragmentos podem ser produzidos (de forma recombinante ou através de síntese química) e testados para identificar os péptidos que possuem uma actividade de Der f VII (i.e., a capacidade para induzir uma resposta das células T tal como estimulação (proliferação, secreção de citocinas), incapacidade de resposta e/ou possuem reduzida actividade de ligação a igE).

Numa concretização, os péptidos possuindo uma actividade de Der f VII podem ser identificados através da capacidade do péptido para estimular células T ou induzir incapacidade de resposta em células T. Os péptidos que estimulam células T, tal como determinado através de, por exemplo, proliferação de células T ou secreção de citocinas são aqui definidos como compreendendo pelo menos um epitopo para as células T. Crê-se que os epitopos para as células T estejam envolvidos na iniciação e perpetuação da resposta imunitária à proteína alérgeno que é responsável pelos sintomas clínicos da alergia. Pensa-se que estes epitopos para as células T desencadeiem os acontecimentos iniciais ao nível das células T ajudantes através da ligação a uma molécula HLA apropriada à superfície de uma célula de apresentação do antigénio, estimulando deste modo a subpopulação de células T com o receptor relevante das células T para o epitopo. Estes acontecimentos conduzem à 25 ΡΕ1018550 proliferação de células T, à secreção de linfocinas, a reacções inflamatórias locais, ao recrutamento de células imunitárias adicionais para o local da interacção antigénio/células T e à activação da cascata das células B, conduzindo à produção de anticorpos. Um isotipo destes anticorpos, IgE, é fundamentalmente importante para o desenvolvimento dos sintomas alérgicos e a sua produção é influenciada inicialmente na cascata de acontecimentos ao nivel das células T ajudantes, pela natureza das linfocinas segregadas. Um epitopo para as células T é o elemento básico, ou a menor unidade de reconhecimento por um receptor das células T, quando o epitopo compreende os aminoácidos essenciais para o reconhecimento pelo receptor. As sequências de aminoácidos que imitam as dos epitopos para as células T e que modificam a resposta alérgica aos alérgenos proteicos estão dentro do âmbito deste invento. A pesquisa de péptidos que retenham uma actividade de Der f VII tal como aqui descrito pode ser alcançada utilizando um ou mais de vários ensaios diferentes. Por exemplo, a actividade estimuladora de células T de Der f VII, in vitro, é ensaiada pondo em contacto um péptido conhecido ou suspeito de possuir uma actividade de Der f VII com uma célula de apresentação de antigénio que apresente moléculas do MHC apropriadas numa cultura de células T. A apresentação de um péptido possuindo uma actividade de Der f VII em associação com moléculas do MHC apropriadas a células T em conjunto com a necessária co-estimulação tem o efeito de transmissão de um 26 ΡΕ1018550 sinal às células T que induz a produção de maiores níveis de citocinas, particularmente de interleucina-2 e interleucina-4. 0 sobrenadante da cultura pode ser obtido e ensaiado quanto a interleucina-2 ou outras citocinas conhecidas. Por exemplo, qualquer um dos vários ensaios convencionais para a interleucina-2 pode ser empregue, tal como o ensaio descrito em Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86: 1333, 1989 cujas porções pertinentes são aqui incorporadas por referência. Um conjunto para um ensaio para a produção de interferão está também disponível em Genzyme Corporation (Cambridge, MA).

Alternativamente, um ensaio vulgar para a proliferação de células T engloba a medição da incorporação de timidina tritiada. A proliferação de células T pode ser medida in vitro através da determinação da quantidade de timidina marcada com 3H incorporada no ADN em replicação das células cultivadas. Portanto, a taxa de síntese de ADN e, por sua vez, a taxa de divisão celular podem ser quantificadas.

Numa concretização, os péptidos que possuem a actividade estimuladora de células T de Der f VII (i.e., o péptido compreende pelo menos um epitopo para células T) podem ser identificados utilizando um algoritmo que prevê a presença de epitopos para células T numa sequência proteica, tal como o algoritmo descrito por Hill et al., Journal of Immunology, 147: 189-197, 1991. 0 algoritmo de Hill et al. prevê a localização de epitopos para células T 27 ΡΕ1018550 numa proteína através da presença de certos padrões dentro da sequência que são prováveis de se ligarem ao MHC e portanto podem conter epitopos para células T.

Para determinar epitopos para células T precisos através de, por exemplo, técnicas de mapeamento fino, um péptido possuindo a actividade estimuladora de células T de Der f VII e compreendendo assim pelo menos um epitopo para células T tal como determinado através de técnicas de biologia das células T é modificado através de adição ou deleção de resíduos de aminoácidos nos terminais amino ou carboxilo do péptido e testado para determinar uma mudança na reactividade das células T ao péptido modificado. Seguindo esta técnica, os péptidos são seleccionados e produzidos de forma recombinante ou sinteticamente. Os péptidos são seleccionados com base em vários factores, incluindo a força da resposta das células T ao péptido (e.g., índice de estimulação), a frequência da resposta das células T ao péptido numa população de indivíduos sensíveis aos alérgenos dos ácaros do pó e a potencial reactividade cruzada do péptido com outros alérgenos dos ácaros do pó. As propriedades físicas e químicas destes péptidos seleccionados (e.g., solubilidade e estabilidade) são examinadas para determinar se os péptidos são adequados para utilização em composições terapêuticas ou se os péptidos requerem modificação tal como aqui descrito. A capacidade dos péptidos seleccionados ou dos péptidos modificados seleccionados de estimularem células T humanas (e.g., induzirem proliferação, secreção de linfocinas) é então determinada tal como aqui descrito. 28 ΡΕ1018550

Noutra concretização, um péptido possuindo uma actividade de Der f VII é pesquisado quanto à capacidade de induzir incapacidade de resposta em células T. A capacidade de um péptido que se sabe que estimula células T (tal como determinado através de um ou mais dos ensaios acima descritos) para inibir ou bloquear completamente a actividade de Der f VII nativa purificada ou uma parte desta e induzir um estado de incapacidade de resposta, pode ser determinada utilizando tentativas subsequentes de estimulação de células T com células de apresentação de antigénio que apresentem Der f VII nativa ou um péptido possuindo uma actividade de Der f VII após exposição ao péptido, possuindo uma actividade de Der f VII. Se as células T forem não responsivas às tentativas subsequentes de activação, determinado através da síntese de interleucina-2 e/ou proliferação de células T, foi induzido um estado de incapacidade de resposta. Ver, e.g., Gimmi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 6586-6590, 1993; e Schwartz Science, 248: 1349-1356, 1990, para sistemas de ensaio que podem ser utilizados como base para um ensaio de acordo com o presente invento.

Ainda noutra concretização, péptidos possuindo uma actividade de Der f VII são identificados através da actividade de ligação da IgE. Para objectivos terapêuticos, os péptidos do invento de preferência não se ligam a IgE específica para o alérgeno dos ácaros do pó, ou ligam-se a tal IgE numa extensão substancialmente menor (e.g., pelo 29 ΡΕ1018550 menos 100 vezes menos, de preferência pelo menos 1000 vezes menos) que o correspondente alérgeno dos ácaros do pó nativo purificado se liga à IgE. A reduzida actividade de ligação da IgE refere-se à actividade de ligação da IgE que é menor que a da proteína Der f VII nativa purificada. Se um péptido possuindo uma actividade de Der f VII é para ser utilizado como reagente de diagnóstico, não é necessário que o péptido possua actividade de ligação à IgE reduzida em comparação com o alérgeno Der f VII nativo. A actividade de ligação à IgE dos péptidos pode ser determinada através de, por exemplo, um imunoensaio enzimático (ELISA) utilizando, por exemplo, soros obtidos de um sujeito (i.e., um sujeito alérgico) que foi previamente exposto ao alérgeno Der f VII nativo. Resumidamente, o péptido suspeito de possuir uma actividade de Der f VII é revestido nos poços de uma placa de microtítulo. Após a lavagem e o bloqueio dos poços, a solução de anticorpo consistindo em plasma de um sujeito alérgico que foi exposto a um péptido suspeito de possuir uma actividade de Der f VII é incubada nos poços. Geralmente retira-se a IgG do plasma antes da incubação. É adicionado aos poços um anticorpo secundário marcado e incuba-se. A quantidade de ligação à IgE é então quantificada e comparada com a quantidade de IgE ligada por uma proteína Der f VII nativa purificada. Alternativamente, a actividade de ligação à IgE de um péptido pode ser determinada através de análise de marcação Western. Por exemplo, um péptido suspeito de possuir uma actividade de Der f VII é corrido num gel de poliacrilamida utilizando SDS-PAGE. O péptido é então transferido para nitrocelulose 30 ΡΕ1018550 e subsequentemente incubado com soros de um sujeito alérgico. Após a incubação com um anticorpo secundário marcado, a quantidade de IgE ligada é então determinada e quantificada.

Outro ensaio que pode ser utilizado para determinar a actividade de ligação à IgE de um péptido é um ensaio ELISA de competição. Resumidamente, é criado um banco de anticorpos IgE através da combinação de plasmas de sujeitos alérgicos aos ácaros do pó que se tenha mostrado através de ELISA directa possuírem IgE reactiva com Der f VII nativa. Este banco é utilizado num ensaio ELISA de competição para comparar a ligação à IgE da Der f VII nativa e de um péptido suspeito de possuir uma actividade de Der f VII. A ligação à IgE para a proteína Der f VII nativa e para um péptido suspeito de possuir uma actividade de Der f VII é determinada e quantificada.

Se um péptido possuindo uma actividade de Der f VII se liga à IgE e é para ser utilizado como agente terapêutico, é preferível que tal ligação não resulte na libertação de mediadores (e.g., histaminas) dos mastócitos ou dos basófilos. Para determinar se um péptido que se liga à IgE resulta na libertação de mediadores, pode ser efectuado um ensaio de libertação de histamina utilizando reagentes padrão e protocolos obtidos, por exemplo, de Amac, Inc. (Westbrook, ME). Resumidamente, uma solução tamponada de um péptido suspeito de possuir uma actividade de Der f VII é combinada com um volume igual de sangue 31 ΡΕ1018550 completo heparinizado de um sujeito alérgico. Após a mistura e a incubação, as células são sedimentadas e os sobrenadantes são processados e analisados utilizando um radioimunoensaio para determinar a quantidade de histamina libertada.

Os péptidos possuindo uma actividade de Der f VII que são para utilizar como agentes terapêuticos são de preferência testados em modelos mamíferos de atopia dos ácaros do pó, tal como o modelo de ratinho divulgado em Tamura et al.r Microbiol. Immunol., 30: 883-896, 1986, ou na Patente U.S. N° 4939239, ou no modelo de primata divulgado em Chiba et ai., Int. Arch. Allergy Immunol., 93: 83-88, 1990. A pesquisa inicial de ligação da IgE a um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ser efectuada através de testes cutâneos superficiais ou de testes cutâneos intradérmicos em animais de laboratório ou em voluntários humanos, ou em sistemas in vitro tais como RAST, inibição de RAST, ensaio ELISA, RIA (radioimunoensaio) ou um ensaio de libertação de histamina, tal como descrito acima. É possível modificar a estrutura de um péptido possuindo uma actividade de Der f VII para objectivos tais como aumento da solubilidade, melhoramento da eficácia terapêutica ou profilática, ou estabilidade (e.g., validade ex vivo e resistência à degradação proteolítica in vivo). Tais péptidos modificados são considerados equivalentes funcionais de péptidos possuindo uma actividade de Der f 32 ΡΕ1018550 VII tal como acima definido. Pode ser produzido um péptido modificado no qual a sequência de aminoácidos foi alterada, tal como através de substituição, deleção ou adição de aminoácidos, para modificar a imunogenicidade e/ou reduzir a alergenicidade, ou ao qual foi adicionado um componente para o mesmo objectivo.

Por exemplo, um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ser modificado de forma a manter a capacidade de induzir incapacidade de resposta em células T e de se ligar a proteínas do MHC sem a capacidade de induzir uma forte resposta proliferativa ou, possivelmente, qualquer resposta proliferativa quando administrado na forma imunogénica. Neste caso, os resíduos de ligação críticos para a função do receptor das células T podem ser determinados utilizando técnicas conhecidas (e.g., substituição de cada um dos resíduos e determinação da presença ou ausência de reactividade das células T). Os resíduos que se mostre serem essenciais para interagir com o receptor das células T podem ser modificados através da substituição do aminoácido essencial por outro, de preferência um resíduo de aminoácido semelhante (uma substituição conser-vativa) cuja presença se mostre aumentar, diminuir mas não eliminar ou não afectar a reactividade das células T. Além disso, os resíduos de aminoácidos que não sejam essenciais para a interacção com o receptor das células T podem ser modificados através da sua substituição por outros aminoácidos cuja incorporação possa aumentar, diminuir mas não eliminar ou não afectar a reactividade das células T, mas que não eliminam a ligação ao MHC relevante. 33 ΡΕ1018550

Adicionalmente, um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ser modificado através da substituição de um aminoácido que se mostre ser essencial para interagir com o complexo proteico MHC por outro, de preferência um resíduo de aminoácido semelhante (substituição conservativa) cuja presença se mostre aumentar, diminuir mas não eliminar ou não afectar a actividade das células T. Além disso, os resíduos de aminoácidos que não sejam essenciais para a interacção com o complexo proteico MHC mas que ainda se ligam ao complexo proteico MHC podem ser modificados através da sua substituição por outro aminoácido cuja incorporação possa aumentar, não afectar ou diminuir mas não eliminar a reactividade das células T. As substituições de aminoácidos preferidas de aminoácidos não essenciais incluem, mas não se limitam a substituições com alanina, ácido glutâmico ou um metil-aminoácido.

Outro exemplo de modificação de um péptido possuindo uma actividade de Der f VII é a substituição de resíduos de cisteína de preferência com resíduos de alanina, serina, treonina, leucina ou ácido glutâmico para minimizar a dimerização através de ligações dissulfureto. Além disso, as cadeias laterais de aminoácidos de fragmentos da proteína do invento podem ser modificadas quimicamente. Outra modificação é a ciclização do péptido.

Para aumentar a estabilidade e/ou a reactividade, um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ser 34 ΡΕ1018550 modificado para incorporar um ou mais polimorfismos na sequência de aminoácidos da proteína alérgeno resultante de qualquer variação alélica natural. Adicionalmente, os D-aminoácidos, os aminoácidos não naturais ou análogos não aminoácidos podem ser substituídos ou adicionados para produzir uma proteína modificada dentro do âmbito deste invento. Para além disso, um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ser modificado utilizando polietilenoglicol (PEG) de acordo com o método de A. Sehon e colaboradores (Wie et al., supra) para produzir uma proteína conjugada com PEG. Além disso, pode ser adicionado PEG durante a síntese química da proteína. Outras modificações de um péptido possuindo uma actividade de Der f VII incluem a redução/alquilação (Tarr, "Methods of Protein Microcharacterization", J.E. Silver ed., Humana Press, Clifton NJ 155-194 (1986)); acilação (Tarr, supra); ligação química a um transportador apropriado (Mishell e Shiigi, eds, "Selected Methods in Cellular Immunology", WH Freeman, San Francisco, CA (1980), Patente U.S. N° 4939239; ou tratamento suave em formalina (Marsh, Int. Arch. of Allergy and Appl. Immunol., 41: 199-215, 1971).

Para facilitar a purificação e aumentar potencialmente a solubilidade de um péptido possuindo uma actividade de Der f VII, é possível adicionar uma metade de fusão de aminoácidos à estrutura do péptido. Por exemplo, pode ser adicionada hexa-histidina à proteína para purificação através de cromatografia de afinidade com um ião metálico imobilizado (Hochuli, E. et al., Bio/Technology, 6: 1321- 35 ΡΕ1018550 1325, 1988). Além disso, para facilitar o isolamento de péptidos isentos de sequências irrelevantes, podem ser introduzidos locais de clivagem por endoproteases específicas entre as sequências da metade de fusão e do péptido. Para dessensibiiizar com sucesso um sujeito à proteína Der f VII ou a um alérgeno relacionado, pode ser necessário aumentar a solubilidade da proteína através da adição de grupos funcionais à proteína, ou através da omissão de regiões hidrófobas da proteína. Grupos funcionais, tais como aminoácidos carregados e pares de aminoácidos carregados são adequados para aumentar a solubilidade quando adicionados aos terminais amino ou carboxilo do péptido.

Para auxiliar potencialmente o processamento apropriado do antigénio dos epitopos para células T em Der f VII, podem ser concebidos locais canónicos sensíveis à protease entre as regiões, cada um compreendendo pelo menos um epitopo para células T através de métodos recombinantes ou sintéticos. Por exemplo, pares de aminoácidos carregados, tais como KK ou RR, podem ser introduzidos entre as regiões numa proteína ou fragmento durante a sua construção recombinante. Pode-se tornar o péptido resultante sensível a clivagem através de catepsina e/ou outras enzimas semelhantes a tripsina que criariam porções da proteína contendo um ou mais epitopos para células T. Além disso, tais resíduos de aminoácidos carregados podem resultar num aumento da solubilidade do péptido.

Mutagénese dirigida ao local de um ácido nucleico 36 ΡΕ1018550 codificando um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ser utilizada para modificar a estrutura do péptido através de métodos conhecidos na arte. Tais métodos podem, entre outros, incluir reacção em cadeia da poli-merase (PCR) com iniciadores oligonucleotidicos com uma ou mais mutações (Ho et al., Gene, 77: 51-59, 1989) ou sintese total de genes mutados (Hostomsky, Z. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm, 161: 1056-1063, 1989). Para aumentar a expressão de proteína recombinante, os métodos supracitados podem ser aplicados para mudar os codões presentes na sequência de ADNc do invento para os preferencialmente utilizados pela célula hospedeira na qual a proteína recombinante está a ser expressa (Wada et al., supra).

Outro aspecto do invento refere-se a um anticorpo especificamente reactivo com um péptido possuindo uma actividade de Der f VII. Os anticorpos deste invento podem ser utilizados para padronizar extractos de alérgeno ou para isolar a forma de ocorrência natural ou nativa de Der f VII. Por exemplo, através da utilização de péptidos possuindo uma actividade de Der f VII com base na sequência de ADNc de Der f VII, podem ser feitos anti-soros ou anticorpos monoclonais anti-proteína/anti-péptido utilizando métodos padrão. Um mamífero tal como um ratinho, um hamster ou um coelho pode ser imunizado com uma forma imunogénica do péptido (e.g., proteína Der f VII ou um fragmento antigénico que seja capaz de provocar uma resposta de anticorpo). Técnicas para conferir imunogeni-cidade a uma proteína ou péptido incluem a conjugação com 37 ΡΕ1018550 transportadores ou outras técnicas bem conhecidas na arte. Um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ser administrado na presença de adjuvante. 0 progresso da imunização pode ser monitorizado através da detecção do titulo de anticorpo no plasma ou no soro. Pode ser utilizado ELISA padrão ou outro imunoensaio com o imunogénio como antigénio para avaliar os níveis dos anticorpos.

Após a imunização, podem ser obtidos anti-soros anti-Der f VII e, se desejado, podem ser isolados do soro anticorpos policlonais anti-Der f VII. Para produzir anticorpos monoclonais, as células produtoras de anticorpos (linfócitos) podem ser colhidas de um animal imunizado e fundidas através de procedimentos de fusão de células somáticas padrão com células de imortalização tais como células de mieloma para produzir células de hibridoma. Tais técnicas são bem conhecidas na arte, por exemplo a técnica do hibridoma originalmente desenvolvida por Kohler e Milstein, Nature, 256: 495-497, 1975) bem como outras técnicas tais como a técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbar et al., Immunology Today, 4: 72, 1983) e a técnica de hibridoma de EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., (1985) "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, Inc. págs. 77-96). As células de hibridoma podem ser pesquisadas imunoquimicamente quanto à produção de anticorpos especifi-camente reactivos com um péptido possuindo uma actividade de Der f VII e os anticorpos monoclonais podem ser isolados. 38 ΡΕ1018550 0 termo anticorpo tal como aqui se utiliza pretende incluir fragmentos deste que sejam também reactivos com o péptido possuindo uma actividade de Der f VII. Os anticorpos podem ser fragmentados utilizando técnicas convencionais e os fragmentos podem ser pesquisados quanto à utilidade do mesmo modo que descrito acima para anticorpos inteiros. Por exemplo, podem ser criados fragmentos F(ab')2 através do tratamento do anticorpo com pepsina. 0 fragmento F(ab')2 resultante pode ser tratado para reduzir as pontes dissulfureto para produzir fragmentos Fab'. 0 anticorpo do presente invento pretende ainda incluir moléculas bi-especificas e quiméricas possuindo uma porção anti-Der f VII.

Outro aspecto deste invento proporciona clones de células T e receptores solúveis de células T especifi-camente reactivos com um péptido possuindo uma actividade de Der f VII. Populações monoclonais de células T (i.e., células T geneticamente idênticas umas às outras e expressando receptores de células T idênticos) podem ser derivadas de um indivíduo sensível a Der f VII, seguido de estimulação repetitiva in vitro com uma proteína Der f VII ou um péptido possuindo uma actividade de Der f VII na presença de células de apresentação de antigénio do MHC. As células individuais responsivas do MHC de Der f VII podem então ser clonadas através de diluição limitante e as linhas permanentes expandidas e mantidas através de re-estimulação periódica in vitro. Alternativamente, podem ser 39 ΡΕ1018550 produzidos hibridomas T-T específicos de Der f VII através de uma técnica semelhante à produção de hibridoma de células B. Por exemplo, um mamífero, tal como um ratinho, é imunizado com um péptido possuindo uma actividade de Der f VII, as células T são então purificadas e fundidas com uma linha tumoral de células T em crescimento autónomo. Dos hibridomas resultantes, as células que respondem a um péptido possuindo uma actividade de Der f VII são seleccionadas e clonadas. Procedimentos de propagação de populações de células T monoclonais estão descritos em Cellular and Molecular Immunology (Abul K. Abbas et al., ed.), W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA (1991) página 139. Os receptores de células T solúveis especificamente reactivos com um péptido possuindo uma actividade de Der f VII podem ser obtidos através de imunoprecipitação utilizando um anticorpo contra o receptor das células T tal como descrito em "Immunology: A Synthesis" (Second Edition), Edward S. Golub et al., ed., Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1991) páginas 366-269.

Os clones de células T especificamente reactivos com um péptido possuindo uma actividade de Der f VII podem ser utilizados para isolar e clonar molecularmente o gene codificando o receptor das células T relevante. Além disso, um receptor solúvel das células T especificamente reactivo com um péptido possuindo uma actividade de Der p VII pode ser utilizado para interferir com ou inibir a activação dependente de antigénio da subpopulação de células T relevante, por exemplo, através da administração a um 40 ΡΕ1018550 indivíduo sensível a Der f VII. Anticorpos especificamente reactivos com um tal receptor das células T podem ser produzidos de acordo com as técnicas aqui descritas. Tais anticorpos podem ser utilizados para bloquear ou interferir com a interacção das células T com os péptidos apresentados pelo MHC. A exposição de sujeitos alérgicos a péptidos possuindo uma actividade de Der f VII e que possuem actividade estimuladora das células T, pode provocar que as subpopulações de células T apropriadas se tornem incapazes de responder ao respectivo alérgeno proteico (e.g., não se conseguir estimular uma resposta imunitária após tal exposição). Além disso, tal administração pode modificar o perfil de secreção de linfocinas em comparação com a exposição ao alérgeno proteico de ocorrência natural ou uma porção deste (e.g., resultar numa diminuição de IL-4 e/ou num aumento de IL-2) . Para além disso, a exposição a péptidos possuindo uma actividade de Der f VII que possuem a actividade estimuladora de células T pode influenciar subpopulações de células T que normalmente participam na resposta ao alérgeno pelo que estas células T são levadas do local ou locais de normal exposição ao alérgeno (e.g., mucosa nasal, pele e pulmão) para o local ou locais de administração da proteína ou do fragmento derivado desta. Esta redistribuição das subpopulações de células T pode melhorar ou reduzir a capacidade do sistema imunitário de um indivíduo para estimular a resposta imunitária usual no local de exposição normal ao alérgeno, resultando numa diminuição dos sintomas alérgicos. 41 ΡΕ1018550

Um péptido possuindo uma actividade de Der f VII quando administrado a um sujeito sensível aos ácaros do pó é capaz de modificar a resposta das células B, a resposta das células T ou ambas as respostas das células B e das células T do sujeito ao alérgeno. Tal como aqui se utiliza, a modificação da resposta alérgica de um sujeito ao alérgeno dos ácaros do pó pode ser definida como incapacidade de resposta ou diminuição nos sintomas ao alérgeno, tal como determinado através de procedimentos clínicos padrão (Ver e.g., Varney et al., British Medicai Journal, 302: 265-269, 1990), incluindo a diminuição dos sintomas asmáticos induzidos pelos ácaros do pó. Tal como aqui se refere, uma diminuição dos sintomas inclui qualquer redução na resposta alérgica de um sujeito ao alérgeno após um regime de tratamento com um péptido do invento. Esta diminuição dos sintomas pode ser determinada subjectiva-mente (e.g., o doente sente-se mais confortável após a exposição ao alérgeno), ou clinicamente, tal como com um teste de pele padrão.

Os péptidos ou anticorpos do presente invento podem também ser utilizados para detecção e diagnóstico da sensibilidade a Der f VII. Por exemplo, isto pode ser feito in vitro através da combinação de sangue ou de produtos do sangue obtidos de um sujeito a ser avaliado quanto à sensibilidade com o péptido possuindo uma actividade de Der f VII, sob as condições apropriadas para a ligação dos componentes do sangue (e.g., anticorpos, células T, células 42 ΡΕ1018550 B) com o(s) péptido(s) e determinação da extensão a que ocorre tal ligação. Outros métodos de diagnóstico para doenças alérgicas em que os péptidos ou anticorpos do presente invento podem ser utilizados incluem o teste radio-alergoabsorvente (RAST), teste radioimunoabsorvente em papel (PRIST), imunoensaio enzimático (ELISA), radio-imunoensaios (RIA), ensaios imuno-radiométricos (IRMA), imunoensaios de luminescência (LIA), ensaios de libertação de histamina e "immunoblots" de IgE. 0 presente invento proporciona ainda métodos de detecção e tratamento da sensibilidade de um sujeito a Der f VII. A presença em sujeitos de IgE especifica para Der f VII e a capacidade das células T dos sujeitos para responderem a epitopos de Der f VII podem ser determinadas através da administração ao sujeito de um teste de Hiper-sensibilidade de Tipo Imediato e/ou um teste de Hipersen-sibilidade de Tipo Retardado (Ver e.g., "Immunology" (1985) Roitt, I.M., Brostoff, J., Male, D.K. (eds), C.V. Mosby Co., Gower Medicai Publishing, London, NY, págs. 19.2-19.18; págs. 22.1-22.10) utilizando um péptido possuindo uma actividade de Der p VII ou uma forma modificada de um péptido possuindo uma actividade de Der f VII, cada um dos quais se liga à IgE especifica para o alérgeno. Aos mesmos sujeitos é administrado um teste de Hipersensibilidade de Tipo Retardado antes, simultaneamente ou subsequentemente à administração do teste de Hipersensibilidade de Tipo Imediato. Obviamente, se o teste de Hipersensibilidade de Tipo Imediato for administrado antes do teste de Hipersen- 43 ΡΕ1018550 sibilidade de Tipo Retardado, o teste de Hipersensibilidade de Tipo Retardado seria dado aos sujeitos que exibissem uma reacção especifica de Hipersensibilidade de Tipo Imediato. 0 teste de Hipersensibilidade de Tipo Retardado utiliza um péptido possuindo uma actividade de Der f VII que possui actividade estimuladora de células T e que não se liga à IgE especifica para o alérgeno numa percentagem substancial da população de sujeitos sensíveis ao alérgeno (e.g., pelo menos cerca de 75%). Aos sujeitos que se verifica terem uma reacção específica de Hipersensibilidade de Tipo Imediato e uma reacção específica de Hipersensibilidade de Tipo Retardado é administrada uma quantidade de uma composição adequada para administração farmacêutica. A composição compreende o péptido possuindo uma actividade de Der f VII tal como utilizado no teste de Hipersensibilidade de Tipo Retardado e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ser utilizado em métodos de diagnóstico, tratamento ou prevenção de reacções alérgicas a um alérgeno dos ácaros do pó ou a um alérgeno proteico que tenha reacção cruzada. Assim, o presente invento proporciona composições adequadas para utilização in vitro e administração farmacêutica compreendendo uma quantidade de pelo menos um péptido possuindo uma actividade de Der f VII. As composições farmacêuticas serão tipicamente formuladas com um transportador farmaceuticamente aceitável. 44 ΡΕ1018550

Quando se pretende uma composição de acordo com o invento para administração a um doente a ser dessen-sibilizado, tal administração pode ser efectuada utilizando procedimentos conhecidos, em dosagens e durante períodos de tempo eficazes para reduzir a sensibilidade (i.e., reduzir a resposta alérgica) do sujeito ao alérgeno dos ácaros do pó. 0 termo sujeito pretende incluir organismos vivos nos quais pode ser provocada uma resposta imunitária, e.g., mamíferos. Exemplos de sujeitos incluem seres humanos, cães, gatos, ratinhos, ratos e espécies transgénicas destes. Uma quantidade de pelo menos um péptido possuindo uma actividade de Der p VII necessária para alcançar um efeito terapêutico pode variar de acordo com factores tais como o grau de sensibilidade do sujeito aos ácaros do pó, a idade, o sexo e o peso do sujeito e a capacidade de um péptido possuindo uma actividade de Der f VII provocar uma resposta antigénica num sujeito. Os regímenes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta terapêutica óptima. Por exemplo, podem ser administradas diariamente várias doses divididas ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida tal como indicado pelas exigências da situação terapêutica. 0 composto activo (i.e., um péptido possuindo uma actividade de Der f VII) pode ser administrado de um modo conveniente tal como através de injecção (subcutânea, intravenosa, etc.), administração oral, inalação, aplicação transdérmica ou administração rectal. Dependendo do tipo de via de administração, o composto activo pode ser revestido 45 ΡΕ1018550 de um material para proteger o composto da acção de enzimas, ácidos e outras condições naturais que podem inactivar o composto.

Para administrar um péptido possuindo uma activi-dade de Der f VII através de outra forma que não a administração parentérica, pode ser necessário revestir o péptido com, ou co-administrar o péptido com, um material para evitar a sua inactivação. Por exemplo, um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ser administrado a um indivíduo num transportador, diluente ou adjuvante apropriado, co-administrado com inibidores de enzimas ou num transportador apropriado tal como lipossomas. Diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções tampão salinas e aquosas. 0 adjuvante é utilizado no seu sentido mais amplo e inclui qualquer composto estimulador imunitário tal como interferão. Os adjuvantes aqui contemplados incluem resorcinóis, surfactantes não iónicos tais como éter de polioxietileno e éter de n-hexadecil-polietileno. Os inibidores de enzimas incluem inibidor da tripsina pancreática, di-isopropilfluorofosfato (DEP) e trasilol. Os lipossomas incluem emulsões CGF água-em-óleo-em-água bem como lipossomas convencionais (Strejan et al., J. Neuroimmunol., 7: 27, 1984). Para o objectivo de induzir incapacidade de resposta nas células T, a composição é administrada de preferência numa forma não imunogénica, e.g., uma que não contenha adjuvante. 0 composto activo pode também ser administrado 46 ΡΕ1018550 parentericamente ou intraperitonealmente. As dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e misturas destes e em óleos. Sob condições vulgares de armazenamento e utilização, estas preparações podem conter um conservante para evitar o crescimento de microrganismos.

As composições farmacêuticas adequadas para utilização injectável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para preparação extemporânea de soluções injectáveis estéreis ou para dispersão. Em todos os casos, a composição tem de ser estéril e tem de ser fluida até ao ponto em que a sua utilização numa seringa se torna fácil. Tem ser estável sob as condições de manufactura e armazenamento e tem de ser conservada contra a acção contaminadora de microrganismos tais como bactérias e fungos. 0 transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido, e semelhantes), misturas adequadas destes e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho das partículas necessário no caso de dispersão e através da utilização de surfactantes. A prevenção da acção de microrganismos pode ser alcançada através de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorambutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir na compo- - 47 - ΡΕ1018550 sição agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliál-coois tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser obtida através da inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

As soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação de composto activo (i.e., um péptido possuindo uma actividade de Der f VII) na quantidade necessária num solvente apropriado com um dos ingrediente ou uma combinação dos ingredientes acima mencionados, conforme necessário, seguido de esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação de composto activo num veículo estéril que contêm um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários dos acima enumerados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem em vácuo e a secagem por congelação que produzem um pó do ingrediente activo (i.e., pelo menos um péptido possuindo uma actividade de Der f VII) com qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução destes previa-mente esterilizada por filtração.

Quando o péptido possuindo uma actividade de Der f VII é adequadamente protegido, tal como descrito acima, o péptido pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou um transportador comestível assi- 48 ΡΕ1018550 milável. 0 péptido e outros ingredientes podem também ser encerrados numa cápsula dura ou mole de gelatina, comprimidos em pastilhas ou incorporados directamente na dieta individual. Para a administração terapêutica oral, o composto activo pode ser incorporado com excipientes e utilizado na forma de pastilhas comestíveis, pastilhas orais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias e semelhantes. A percentagem de composições e preparações pode, obviamente, ser variada e pode ser convenientemente de entre cerca de 5 a cerca de 80% do peso da unidade. A quantidade de composto activo em tais composições terapeuticamente úteis é tal que será obtida uma dosagem adequada.

Tal como aqui se utiliza "transportador farmaceu-ticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes anti-bacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção e semelhantes. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é bem conhecida na arte. Excepto até ao ponto em qualquer meio convencional ou agente se torna incompatível com o composto activo, a sua utilização nas composições terapêuticas está contemplada. Compostos activos suplementares podem também ser incorporados nas composições. E especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de unidades de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma da 49 ΡΕ1018550 unidade de dosagem tal como aqui se utiliza refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos mamíferos a serem tratados; contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de composto activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico necessário. A especificação para as formas da unidade de dosagem do invento são ditadas e directamente dependentes das (a) características únicas do composto activo e do efeito terapêutico a ser alcançado, e (b) limitações inerentes na arte de compor um tal composto activo para o tratamento da sensibilidade dos sujeitos. 0 presente invento proporciona também pelo menos dois péptidos possuindo uma actividade de Der f VII (e.g., uma mistura física de pelo menos dois péptidos), possuindo cada um actividade estimuladora das células T. Por exemplo, podem ser combinados pelo menos dois péptidos possuindo, cada um, uma actividade de Der f VII. Alternativamente, pode ser administrado a um sujeito alérgico um péptido possuindo pelo menos duas regiões, possuindo, cada uma, uma actividade estimuladora das células T (i.e., cada região compreendendo pelo menos um epitopo para as células T). Um tal péptido pode possuir pelo menos duas regiões derivadas do mesmo alérgeno, Der f VII. Uma composição de dois péptidos ou de um péptido possuindo pelo menos duas regiões pode ser administrada a um sujeito na forma de uma composição com um transportador farmaceuticamente aceitável tal como acima descrito. Uma quantidade de uma ou mais dessas composições pode ser administrada simultaneamente ou 50 ΡΕ1018550 sequencialmente a um sujeito sensível a um alérgeno dos ácaros do pó para tratar tal sensibilidade. Tais composições podem ser úteis para o fabrico de um medicamento para o tratamento da sensibilidade de um indivíduo aos ácaros do pó. O ADNc (ou o ARNm que serviu de molde durante a transcrição reversa) codificando um péptido possuindo uma actividade de Der f VII pode ser utilizado para identificar sequências de ácidos nucleicos semelhantes em qualquer variedade ou tipo de animal e, assim, clonar molecularmente os genes que possuem homologia sequencial suficiente para hibridarem com o ADNc codificando um péptido possuindo uma actividade de Der f VII. Assim, o presente invento inclui não apenas péptidos possuindo uma actividade de Der f VII, mas também outras proteínas que podem ser alérgenos codificados por ADN que híbrida com o ADN do presente invento.

Os péptidos isolados que são imunologicamente relacionados com Der f VII, tal como através de reacti-vidade cruzada com o anticorpo ou de reactividade cruzada com as células T, ou outras para além das já identificadas, estão dentro do âmbito do invento. Tais péptidos ligam-se a anticorpos específicos para a proteína e péptidos do invento, ou estimulam as células T específicas para a proteína e péptidos deste invento.

Um péptido possuindo uma actividade de Der p VII (i.e., Der f VII produzido de forma recombinante ou através 51 ΡΕ1018550 de síntese química) é isento de todas as outras proteínas dos ácaros do pó e, assim, é útil na padronização dos extractos de alérgeno que são reagentes chave para o diagnóstico e tratamento de hipersensibilidade aos ácaros do pó. Adicionalmente, um tal péptido é de uma composição e actividade biológica consistente e bem definida para utilização em preparações que podem ser administradas para objectivos terapêuticos (e.g., para modificar a resposta alérgica de um sujeito sensível aos ácaros do pó) . Tais péptidos podem também ser utilizados para estudar o mecanismo da imunoterapia da alergia a Dermatophagoides farinae e para conceber derivados modificados ou análogos úteis em imunoterapia. 0 trabalho de outros tem mostrado que elevadas doses de extractos de alérgenos produzem geralmente os melhores resultados durante a imunoterapia (i.e., melhor alívio dos sintomas). No entanto, muitos sujeitos são incapazes de tolerar grandes doses de tais extractos devido a reacções sistémicas provocadas pelos alérgenos e outros componentes dessas preparações. Um péptido possuindo uma actividade de Der f VII de acordo com o invento possui a vantagem de ser isento de todas as outras proteínas dos ácaros do pó, e ser assim mais seguro e mais adequado para utilizações terapêuticas. É agora também possível conceber um agente ou um fármaco capaz de bloquear ou inibir a capacidade de um alérgeno dos ácaros do pó de induzir uma reacção alérgica em sujeitos sensíveis. Tais agentes podiam ser concebidos, 52 ΡΕ1018550 por exemplo, de um modo tal que se ligassem a moléculas de IgE anti-Der f VII relevantes, evitando assim a ligação IgE-alérgeno e a subsequente desgranulação de mastóci-tos/basófilos. Alternativamente, tais agentes podiam ligar-se aos componentes celulares do sistema imunitário, resultando na supressão ou dessensibilização das respostas alérgicas aos alérgenos dos ácaros do pó. Um exemplo não restritivo disto é a utilização de péptidos incluindo epitopos de Der f VII para as células B ou T, ou modificações destes, com base na estrutura da proteína do ADNc de Der f VII para suprimir a resposta alérgica a um alérgeno dos ácaros do pó. Isto podia ser efectuado definindo as estruturas dos fragmentos que codificam os epitopos para as células B e T que afectam a função das células B e T em estudos in vitro com componentes do sangue de sujeitos sensíveis aos ácaros do pó. 0 invento é ainda ilustrado através dos seguintes exemplos que não devem ser entendidos como limitando ainda mais o presente invento. Os conteúdos e todas a referências e pedidos de patentes publicados citados ao longo deste pedido são aqui incorporados por referência.

Exemplo 1 - Isolamento de um clone de ADNc codificando Der f VII a partir de uma biblioteca de ADNc de Xgtll

Foi preparada uma biblioteca de ADNc de Xgtll a partir de Dermatophagoides farinae adulto vivo adquirido em Commonwealth Serum Laboratories, Parkville, Austrália (Thomas, W., et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 85: 53 ΡΕ1018550 127-9, 1988). A biblioteca foi preparada de acordo com Trudinger et ai., Chem. Exp. Allergy, 21: 33-37, 1991). A amplificação por PCR e sequenciação de ADN foram utilizadas para isolar ADNc de Der f VII da biblioteca de Xgtll. Foi produzido um iniciador oligonucleotidico (Dfl na Tabela 1) baseado na sequência N-terminal prevista de Der p VII. Este iniciador tinha a sequência GCGAATTCGATCCAATTCACTATGAT- 3' (SEQ ID No. 8). Os primeiros GCGAATTC codificam um local EcoRI (GAATTC) e a sequência GAT codifica os primeiros seis resíduos de Der f VII. Para o outro iniciador, foi utilizado o iniciador directo GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG-3' (SEQ ID No. 9) de Xqtll (Df2 na Tabela 1) que flanqueia o local de clonagem EcoRI (New England Biolabs, Beverley, USA).

As reacções de PCR foram realizadas num volume reaccional final de 50 μΐ contendo Tris-HCl 20 mM, pH 8,2, KC1 10 mM, (NH4)2S04 6 mM, MgCl2 2 mM, Triton X-100 a 0,1%, 10 ng/μΐ de BSA isenta de nucleases, dNTPs 10 mM, 20 pmol de cada iniciador e 2,5 unidades de ADN-polimerase Pfu. Isto foi obtido como um estojo de Stratagene (La Jolla, Califórnia, USA) . O ADN alvo (ligações de ADNc de D. farinae em Xgtll, 0,001 pg) foi adicionado e o conteúdo do tubo foi misturado e coberto com óleo de parafina. Os tubos foram inicialmente desnaturados a 95°C durante 5 min., depois ligados a 55°C durante 2 min. e estendidos a 72°C durante 2 min. A partir daí, durante 48 ciclos, foi realizada a desnaturação durante 1 min. a 94°C e a ligação durante 1 min. a 55°C e extensão como anteriormente. No 54 ΡΕ1018550 ciclo final (50°), a reacção de extensão foi prolongada para 10 min, para assegurar que todos os produtos amplificados tinham o comprimento inteiro.

Dez microlitros da reacção foram então verificados quanto às bandas amplificadas num gel de agarose a 1%. 0 restante da mistura reaccional foi precipitado em etanol antes da purificação do produto amplificado num gel de agarose de baixo ponto de fusão (Bio-Rad, Richmond, USA). O produto de PCR foi digerido com EcoRI e foi ligado no vector M13 mpl8 (ver Messing, supra), digerido com EcoRI e depois transferido para células competentes de E. coli da estirpe TG1. As placas brancas isoladas foram apanhadas e utilizadas para preparar reservas de fagos e ADN de cadeia simples para sequenciação.

Exemplo 2 - Análise da sequência de ADN do ADNc de Der f VII A sequenciação do ADN foi efectuada com o método de terminação da cadeia didesoxinucleotidica utilizando Sequenase versão 2.0 (USB Corp., Cleveland, USA) de acordo com o protocolo do fornecedor. Os iniciadores utilizados para sequenciação incluem o iniciador de sequenciação M13 (-40) 17-mero GTTTTCCCAGTCACGAC-3' (SEQ ID No. 10) (Df3 na Tabela 1), o iniciador Dfl (SEQ ID No. 8) utilizado para a reacção de PCR descrita no Exemplo 1, e 2 outros iniciadores oligonucleotidicos, Df4 e Df5, ambos mostrados 55 ΡΕ1018550 na Tabela 1. 0 iniciador Df4 GGTGAATTAGCCATGCG-3' (SEQ ID No. 11) foi anteriormente utilizado para a sequenciação de Der P VII e O iniciador Df5 TCAATCTTGGATCCAATTTTTGGC-3' (SEQ ID No. 12) foi baseado em sequências de Der f VII dos nucleótidos 559-582.

Para isolar um ADNc contendo a região 5' não traduzida de Der f VII, foi produzido um iniciador oligonucleotidico baseado na sequência C-terminal de Der f VII. Este iniciador (Df6 na Tabela 1) possui a sequência GGAATTCTTAATTTTTTTCCAATTCACG-3' (SEQ ID No. 13). 0 primeiro GGAATTC codifica um local EcoRI. Esta sequência e a seguinte (TTA...), são complementares às sequências reversas do codão de terminação e aos últimos seis resíduos de Der f VII. Para o outro iniciador, foi utilizado o iniciador reverso TTGACACCAGACCAACTGGTAATG-3' de Xgtll (SEQ ID No. 14) (Df 7 na Tabela 1), flanqueando o local de clonagem EcoRI.

As reacções de PCR foram realizadas de acordo com as condições descritas no Exemplo 1. 0 produto de PCR foi purificado num gel de agarose de baixo ponto de fusão, digerido com EcoRI e foi ligado em pUC19 digerido com EcoRI e depois transferido para células competentes de E. coli da estirpe TGI. 0 ADN plasmídico da E. coli transformante foi isolado e utilizado para sequenciação. A sequenciação do ADN foi efectuada utilizando o mesmo método de terminação da cadeia didesoxinucleotídica, Sequenase versão 2.0, descrito acima. No entanto, antes da 56 ΡΕ1018550 sequenciação, os moldes de ADN plasmídico de cadeia dupla foram desnaturados através de tratamento com NaOH e neutralizados através da adição de acetato de sódio e depois precipitados em etanol de acordo com o protocolo do fabricante. Para obter a extremidade 5' não traduzida do ADNc de Der f VII, foi utilizado o iniciador Df8 (ver Tabela 1). Este iniciador tinha a sequência ATGACGTTCGAATTTATC-3' (SEQ ID No. 15) que corresponde à sequência reversa de Der f VII dos nucleótidos 225-208.

Tabela 1. Oligonucleótidos utilizados para amplificação por PCR e sequenciação

Posições dos nucleótidos derivadas de Der f VII 94-111 iniciador directo de Àgtll iniciador de sequenciação M13 (-40) 247-263 559-582 684-664 iniciador reverso de Àgtll 225-208

Nome Sequência

Dfl GCGAATTCGATCCAATTCACTATGAT-3'

Df2 GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG-3'

Df3 GTTTTCCCAGTCACGAC-3'

Df 4 GGTGAATTAGACATGCG-3'

Df5 TCAATCTTGGATCCAATTTTTGGC-3'

Df6 CGAATTCTTAATTTTTTTCCAATTCACG-3'

Df7 TTGACACCAGACCAACTGGTAATG-3'

Df8 ATGACGTTCGAATTTATC-3'

Equivalentes

Os peritos na arte reconhecerão ou serão capazes de avaliar utilizando apenas experimentação de rotina, numerosos equivalentes às concretizações especificas aqui descritas. Tais equivalentes são considerados como estando dentro do âmbito deste invento e estão englobados pelas seguintes reivindicações. ΡΕ1018550 57

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: (A) NOME: WESTERN AUSTRALIAN RESEARCH INSTITUTE FOR CHILD HEALTH (B) RUA: GPO Box Dl84 (C) CIDADE: Perth (D) ESTADO: MA (E) PAÍS: Western Australia (F) CÓDIGO POSTAL: 6001 (ii) TÍTULO DO INVENTO: Proteína e Péptidos Alergénicos dos Ácaros do Pó e Utilizações Destes (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 15 (IV) (v) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Lahive & < (B) RUA: 60 State Street (C) CIDADE: Boston (D) ESTADO: MA (E) PAÍS: USA (F9 CÓDIGO POSTAL : 02109 FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO ACTUAL PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE SUBMISSÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO: USSN 08/031141 (B) DATA DE SUBMISSÃO: 12 de Março de 1993 (A) NÚMERO DO PEDIDO: USSN 08/081540 (B) DATA DE SUBMISSÃO: 22 de Junho de 1993 (viii)INFORMAÇÃO SOBRE O AGENTE/PROCURADOR: (A) NOME: Amy E. Mandragouras (B) NÚMERO DE REGISTO: 36207 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO RECIBO: 053.2 PCT (IMI-032CPPC) (IX) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 617-227-7400 (B) TELECÓPIA: 617-227-5941 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 58 ΡΕ1018550 (A) COMPRIMENTO: 812 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 68..712 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: TTTTTTTTTT TTTTGGTTAT TCCCATTTTT TTCATATCGT AAAAATCCAA ATTCACTTTT 60 TTACCAA ATG ATG AAA TTA TTA TTG ATT GCT GCC GCA GCT TTT GTT GCC 109 Met Met Lys Leu Leu Leu Ile Ala Ala Ala Ala Phe Vai Ala -1 -5 -10 GTT TCG GCT GAT CCA ATT CAC TAT GAT AAA ATC ACC GAA GAA ATT AAC 157 Vai Ser Ala Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn -15 1 5 10 AAA GCT GTT GAT GAA GCC GTC GCT GCA ATT GAA AAA TCC GAA ACA TTC 205 Lys Ala Vai Asp Glu Ala Vai Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe 15 20 25 GAT CCA ATG AAG GTA ccc GAT CAT TCT GAT AAA TTC GAA CGA CAT ATT 253 Asp Pro Met Lys Vai Pro Asp His Ser Asp Lys Phe Glu Arg His Ile 30 35 40 45 GGT ATC ATC GAT TTA AAA GGT CAA TTA GAC ATG CGA AAC ATT CAA GTT 301 Gly Ile Ile Asp Leu Lys Gly Gin Leu Asp Met Arg Asn Ile Gin Vai 50 55 60 CG A GGA TTA AAA CAA ATG AAA CGT GTA GGT GAT GCT AAT GTG AAA AGT 349 Arg Gly Leu Lys Gin Met Lys Arg Vai Gly Asp Ala Asn Vai Lys Ser 65 70 75 GAA GAT GGT GTT GTC AAA GCT CAT TTG TTG GTC GGT GTT CAT GAT GAC 397 Glu Asp Gly Vai Vai Lys Ala His Leu Leu Vai Gly Vai His Asp Asp 80 85 90 GTT GTT TCA ATG GAA TAT GAT TTA GCA TAC AAA TTG GGT GAT CTT CAT 445 Vai Vai Ser Met Glu Tyr Asp Leu Ala Tyr Lys Leu Gly Asp Leu His 95 100 105 CCA AAC ACT CAT GTC ATT TCG GAT ATT CAG GAT TTT GTT GTC GAA TTA 493 Pro Asn Thr His Vai Ile Ser Asp Ile Gin Asp Phe Vai Vai Glu Leu 110 115 120 125 TCG CTC GAA GTT AGC GAA GAA GGT AAT ATG ACA TTG ACA TCG TTC GAA 541 Ser Leu Glu Vai Ser Glu Glu Gly Asn Met Thr Leu Thr Ser Phe Glu 130 135 140 59 ΡΕ1018550 GTA CGT CAA TTT GCC AAT GTT GTC AAT CAT ATT GGT GGT CTT TC A ATT 589 Vai Arg Gin Phe Ala Asn Vai Vai Asn His Ile Gly Gly Leu Ser Ile 145 150 155 TTG GAT CCA ATT TTC GCT GTC TTA TCC GAT GTT TTG ACC GCT ATT TTC 637 Leu Asp Pro Ile Phe Ala Vai Leu Ser Asp Vai Leu Thr Ala Ile Phe 160 165 170 CAG GAT ACC GTA CGT GCA GAA ATG ACC AAA GTA TTG GCA CCA GCA TTC 685 Gin Asp Thr Vai Arg Ala Glu Met Thr Lys Vai Leu Ala Pro Ala Phe 175 180 185 AAA AAA GAA TTG GAA CGA AAC AAC CAA 715 Lys Lys Glu Leu Glu Arg Asn Asn Gin 190 195 TAGACTTACA CACAACATAA CACTGTTATT TTTACACTGG ATAATCAAAT GAAATAAATT 775 TTTTTATCAT TTTGTTTAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 812 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 215 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) 1 DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: : SEQ : ID NO: 2 Met Met Lys Leu Leu Leu Ile Ala Ala Ala Ala Phe Vai Ala -1 -5 -10 Vai Ser Ala Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn -15 1 5 10 Lys Ala Vai Asp Glu Ala Vai Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe 15 20 25 Asp Pro Met Lys Vai Pro Asp His Ser Asp Lys Phe Glu Arg His Ile 30 35 40 45 Gly Ile Ile Asp Leu Lys Gly Gin Leu Asp Met Arg Asn Ile Gin Vai 50 55 60 Arg Gly Leu Lys Gin Met Lys Arg Vai Gly Asp Ala Asn Vai Lys Ser 65 70 75 Glu Asp Gly Vai Vai Lys Ala His Leu Leu Vai Gly Vai His Asp Asp 80 85 90 Vai Vai Ser Met Glu Tyr Asp Leu Ala Tyr Lys Leu Gly Asp Leu His 95 100 105 60 ΡΕ1018550

Pro Asn Thr His Vai Ile Ser Asp Ile Gin Asp Phe Vai Vai Glu Leu 110 115 120 125 Ser Leu Glu Vai Ser Glu Glu Gly Asn Met Thr Leu Thr Ser Phe Glu 130 135 140 Vai Arg Gin Phe Ala Asn Vai Vai Asn His Ile Gly Gly Leu Ser Ile 145 150 155 Leu Asp Pro Ile Phe Ala Vai Leu Ser Asp Vai Leu Thr Ala Ile Phe 160 165 170 Gin Asp Thr Vai Arg Ala Glu Met Thr Lys Vai Leu Ala Pro Ala Phe 175 180 185 Lys Lys Glu Leu Glu Arg Asn Asn Gin 190 195 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: GATCCAATTC ACTATGAT 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: GGTGAATTAG ACATGCG 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples 61 ΡΕ1018550 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: TCAATTTTGG ATCCAATTTT CGCT 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 761 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 43..618 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: GATCTTATAT CAATAACAAT CCAAAAAAAC ATATCTTACA AA ATG ATG AAA TTT 54

Met Met Lys Phe TTG TTG ATT GCT GCC GTG GCA TTT GTC GCC GTT TCG 1 GCT GAT CCA ATT 102 Leu Leu Ile Ala Ala Vai Ala Phe Vai Ala Vai Ser Ala Asp Pro Ile 5 10 15 20 CAC TAT GAT AAA ATC ACC GAA GAA ATC AAC AAA GCT ATT GAT GAT GCC 150 His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Ile Asp Asp Ala 25 30 35 ATT GCT GCT ATT GAA CAA TCC GAA ACA ATA GAT CCA ATG AAA GTA CCT 198 Ile Ala Ala Ile Glu Gin Ser Glu Thr Ile Asp Pro Met Lys Vai Pro 40 45 50 GAT CAT GCC GAT AAA TTC GAA CGT CAT GTT GGT ATT GTG GAT TTC AAA 246 Asp His Ala Asp Lys Phe Glu Arg His Vai Gly Ile Vai Asp Phe Lys 55 60 65 GGT GAA TTA GCC ATG CGA AAC ATT GAG GCT CGA GGA TTG AAA CAA ATG 294 Gly Glu Leu Ala Met Arg Asn Ile Glu Ala Arg Gly Leu Lys Gin Met 70 75 80 AAA CGT CAA GGT GAT GCT AAT GTC AAA GGT GAA GAG GGT ATT GTT AAA 42 Lys Arg Gin Gly Asp Ala Asn Vai Lys Gly Glu Glu Gly Ile Vai Lys 85 90 95 100 62 ΡΕ1018550 GCT CAT TTG TTG ATC GGT GTT CAC GAT GAT ATC GTC TCG ATG GAA TAT 90 Ala His Leu Leu Ile Gly Vai His Asp Asp Ile Vai Ser Met Glu Tyr 105 110 115 GAT TTA GCA TAC AAA TTG GGT GAT CTT CAT CCA ACC ACT CAT GTC ATT 38 Asp Leu Ala Tyr Lys Leu Gly Asp Leu His Pro Thr Thr His Vai Ile 120 125 130 TCG GAT ATT CAA GAT TTT GTT GTT GCC TTG TCC CTT GAA ATT TCT GAT 86 Ser Asp Ile Gin Asp Phe Vai Vai Ala Leu Ser Leu Glu Ile Ser Asp 135 140 145 GAA GGT AAC ATA ACA ATG ACA TCT TTT GAA GTA CGA CAA TTC GCT AAT 34 Glu Gly Asn Ile Thr Met Thr Ser Phe Glu Vai Arg Gin Phe Ala Asn 150 155 160 GTT GTC AAC CAT ATT GGT GGT CTT TC A ATC TTG GAT CCA ATT TTT GGC 582 Vai Vai Asn His Ile Gly Gly Leu Ser Ile Leu Asp Pro Ile Phe Gly 165 170 175 180 GTT TTA TCT GAT GTA TTG ACC GCT ATT TTC CAA GAC ACC GTA CGT AAG 630 Vai Leu Ser Asp Vai Leu Thr Ala Ile Phe Gin Asp Thr Vai Arg Lys 185 190 195 GAA ATG ACC AAA GTA TTG GCA CCA GCA TTT AAA CGT GAA TTG GAA AAA 678 Glu Met Thr Lys Vai Leu Ala Pro Ala Phe Lys Arg Glu Leu Glu Lys 200 205 210 AAT TAACCAATAG ACATCATTTT TCCAACTGTA CAATCTCTAT TTCACTGACA 731

Asn ATAAAATAAA ATTTTTATTT TTATTTCTCC 761 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 213 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

Met Met Lys Phe Leu Leu Ile Ala Ala Vai Ala Phe Vai Ala Vai Ser 15 10 15

Ala Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala 20 25 30

Ile Asp Asp Ala Ile Ala Ala Ile Glu Gin Ser Glu Thr Ile Asp Pro 35 40 45

Met Lys Vai Pro Asp His Ala Asp Lys Phe Glu Arg His Vai Gly Ile 63 ΡΕ1018550 50 55 60 Vai Asp Phe Lys Gly Glu Leu Ala Met Arg Asn Ile Glu Ala Arg Gly 65 70 75 80 Leu Lys Gin Met Lys Arg Gin Gly Asp Ala Asn Vai Lys Gly Glu Glu 85 90 95 Gly Ile Vai Lys Ala His Leu Leu Ile Gly Vai His Asp Asp Ile Vai 100 105 110 Ser Met Glu Tyr Asp Leu Ala Tyr Lys Leu Gly Asp Leu His Pro Thr 115 120 125 Thr His Vai Ile Ser Asp Ile Gin Asp Phe Vai Vai Ala Leu Ser Leu 130 135 140 Glu Ile Ser Asp Glu Gly Asn Ile Thr Met Thr Ser Phe Glu Vai Arg 145 150 155 160 Gin Phe Ala Asn Vai Vai Asn His Ile Gly Gly Leu Ser Ile Leu Asp 165 170 175 Pr o Ile Phe Gly Vai Leu Ser Asp Vai Leu Thr Ala Ile Phe Gin Asp 180 185 190 Thr Vai Arg Lys Glu Met Thr Lys Vai Leu Ala Pro Ala Phe Lys Arg 195 200 205

Glu Leu Glu Lys Asn 210 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: GCGAATTCGATCCAATTCACTATGAT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 64 ΡΕ1018550 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: GTTTTCCCAGTCACGAC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: GGTGAATTAGACATGCG 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12: TCAATCTTGGATCCAATTTTTGGC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: 65 ΡΕ1018550 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13 GGAATTCTTAATTTTTTTCCAATTCACG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14 T T GACAC CAGAC CAACTGGTAATG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15 ATGACGTTCGAATTTATC

Lisboa, 21 de Fevereiro de 2007

Claims

ΡΕ1018550 1 REIVINDICAÇÕES 1. Ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência nucleotidica codificando um alérgeno proteico Der f VII compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 7, ou a porção madura desta.
2. Ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência nucleotidica codificando um alérgeno proteico Der f VII compreendendo uma porção da sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 7, em que a referida porção não reage de forma cruzada com o alérgeno proteico Der p VII.
3. Ácido nucleico isolado da reivindicação 1 ou 2 compreendendo a sequência nucleotidica de SEQ ID No. 6.
4. Ácido nucleico isolado da reivindicação 3 compreendendo a região de codificação da sequência nucleotidica de SEQ ID No. 6.
5. Ácido nucleico isolado da reivindicação 1 ou 2 em que o alérgeno proteico compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 7.
6. Ácido nucleico isolado da reivindicação 1 ou 2, em que o péptido tem pelo menos 10-20 aminoácidos de comprimento. 2 ΡΕ1018550
7. Ácido nucleico isolado da reivindicação 1 ou 2, em que o péptido tem pelo menos 10-16 aminoácidos de comprimento.
8. Vector de expressão recombinante compreendendo o ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
9. Célula hospedeira transfectada com o vector de expressão recombinante da reivindicação 8.
10. Método de produção de um alérgeno proteico Der f VII ou de um péptido compreendendo pelo menos um epitopo para células T deste, compreendendo a cultura da célula hospedeira da reivindicação 9 em meio para expressar o alérgeno proteico ou péptido e isolamento do alérgeno proteico ou péptido da cultura.
11. Alérgeno proteico do Grupo VII isolado Der f VII compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 7, ou a porção madura deste.
12. Alérgeno proteico do Grupo VII isolado Der f VII compreendendo uma porção da sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 7, em que a referida porção não reage de forma cruzada com o alérgeno proteico Der p VII .
13. Proteína ou péptido alérgeno da reivindicação 11 ou 12 produzido através de expressão recombinante 3 ΡΕ1018550 de um ácido nucleico codificando a proteína ou péptido alérgeno.
14. Alérgeno proteico ou péptido da reivindicação 11 ou 12 produzido através de síntese química.
15. Alérgeno proteico ou péptido da reivindicação 11 ou 12 que tem pelo menos 10-20 aminoácidos de comprimento.
16. Preparação substancialmente pura de um alérgeno proteico ou péptido de qualquer uma das reivindicações 11 a 15.
17. Alérgeno proteico ou péptido de qualquer uma das reivindicações 11 a 15 para o tratamento ou diagnóstico de sensibilidade num indivíduo a ácaros do pó. Lisboa, 21 de Fevereiro de 2007