ES2277581T3 - Proteinas y peptidos alergenos de acaros del polvo domestico y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un alergeno proteínico Der f VII que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 7 o la porción madura de dicho alergeno.

Description

Proteínas y péptidos alergenos de ácaros del polvo doméstico y usos de los mismos.

Antecedentes de la invención

Los individuos de aproximadamente el 10% de la población devienen hipersensibilizados (alérgicos) al sufrir exposición a antígenos de una variedad de fuentes ambientales. Aquellos antígenos que inducen tipos inmediatos y/o retardados de hipersensibilidad son conocidos como alergenos (King, T.P., (1976) Adv. Immunol., 23:77-105). Éstos incluyen productos de gramíneas, árboles, malas hierbas, caspa animal, insectos, alimentos, drogas y productos químicos. Se cree que la predisposición genética de un individuo desempeña un papel en el desarrollo de respuestas alérgicas inmediatas (Young, R. P. et al., (1990) Clin. Sci., 79:19) tales como atopia y anafilaxis cuyos síntomas incluyen la fiebre del heno, el asma y la urticaria.

Los anticuerpos que intervienen en la alergia atópica pertenecen principalmente a la clase IgE de inmunoglobulinas. La IgE se fija a los basófilos, los mastocitos y las células dendríticas a través de un receptor específico de alta afinidad Fc\varepsilonRI (Kinet, J.P., (1990) Curr. Opin. Immunol., 2:499-505). Al tener lugar la combinación de un alergeno que actúa como ligando con su IgE receptora afín, el FceRI fijado a la IgE puede ser objeto de unión intermolecular sobre la superficie de la célula, dando como resultado manifestaciones fisiológicas de la interacción entre el alergeno y la IgE. Estos efectos fisiológicos incluyen la liberación de, entre otras sustancias, histamina, serotonina, heparina y fac-
tor(es) quimiotáctico(s) para leucocitos eosinofílicos y/o leucotrienos C4, D4 y E4, que ocasionan una constricción prolongada de las células de músculo liso bronquiales (Hood, L.E. et al., Immunology (2ª ed.), The Benjamin/Cumming Publishing Co., Inc. (1984)). Por consiguiente, la última consecuencia de la interacción de un alergeno con IgE es la consistente en la aparición de síntomas alérgicos activados por la liberación de los mediadores anteriormente mencionados. Tales síntomas pueden ser de naturaleza sistémica o local, en dependencia de la ruta de entrada del antígeno y del patrón de deposición de IgE sobre los mastocitos o los basófilos. Las manifestaciones locales tienen generalmente lugar en las superficies epiteliales en el sitio de entrada del alergeno. Los efectos sistémicos pueden inducir anafilaxis (shock anafiláctico) que es resultado de la respuesta de la combinación de IgE-basófilo al antígeno circulante (intravascular).

Los estudios llevados a cabo con alergenos purificados han demostrado que aproximadamente el 80% de los pacientes que son alérgicos al ácaro Dermatophagoides pteronyssinus producen IgE reactiva al Der p I y al Der p II (Chapman M.D. et al., J. Immunol. (1980) 125:587-92; Lind P., J. Allergy Clin. Immunol. (1985) 76:753-61; Van derZee J.S. et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1988) 81:884-95). Para aproximadamente la mitad de los pacientes, estas especificidades constituyen el 50% del anticuerpo antiácaro IgE. El alergeno Der p III, recientemente identificado como tripsina, (Stewart G.A. et al., Immunology (1992) 75:29-35) reacciona con una frecuencia similar o más alta (Stewart G.A. et al., supra; Ford S.A. et al., Clin. Exp. Allergy (1989) 20:27-31). Sin embargo, en el único estudio cuantitativo llevado a cabo hasta la fecha, los investigadores informaron de que el nivel de fijación de IgE es considerablemente inferior al del Der p I. Las técnicas de electroforesis (Ford S.A. et al., supra; Bengtsson A. et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. (1986) 80:383-90; Lind P. et al., Scand. J. Immunol. (1983) 17:263-73; Tovey E.R. et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1987) 79:93-102) han puesto de manifiesto que la mayoría de sueros reconocen otros alergenos. Por ejemplo, en el estudio de Ford et al. (supra) el análisis Western blot mostró 8 sueros que reaccionaban con 1-2 bandas, 6 con 3-6 y 3 con un número mayor, incluyendo uno con al menos 13. En otro estudio, Baldo et al. (Adv. Bioscience (1989) 4:13:31) informan sobre el hallazgo de componentes a nivel de una Mr de 30, 26 y 25 K que reaccionan con el 50% de sueros. Para determinar la importancia de las especificidades particulares en las reacciones alérgicas, se requerirían alergenos purificados para los ensayos cuantitativos de fijación de IgE y para examinar la frecuencia y el perfil linfocínico para la reactividad de las células T.

El tratamiento de los pacientes con sensibilidad a los ácaros del polvo doméstico mediante la administración de dosis crecientes de extractos de polvo doméstico tiene los inconvenientes de la potencial anafilaxis durante el tratamiento y de la posible necesidad de continuar la terapia por espacio de un período de tiempo de varios años para generar una tolerancia suficiente que redunde en una importante disminución de los síntomas clínicos. Serían beneficiosos una composición terapéutica y un método terapéutico que evitasen estos problemas.

Breve exposición de la invención

Esta invención aporta ácidos nucleicos aislados que codifican péptidos que tienen la actividad antigénica del Der f VII, que es un alergeno proteínico de la especie Dermatophagoides faringe. El ácido nucleico preferido es el cDNA (cDNA = DNA complementario) que tiene una secuencia de nucleótidos ilustrada en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 6) (Der f VII). La invención es también relativa a péptidos que son codificados por todo este cDNA (ID SEC Nº: 6) o por una parte del mismo y que tienen la actividad antigénica del Der f VII. Están también contemplados ácidos nucleicos que hibriden bajo condiciones estrictas (es decir, equivalentes a aproximadamente 20-27ºC por debajo de la temperatura de fusión (T_{m}) y a sal aproximadamente 1M) para formar un ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos ilustrada en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 6) o que codifican un péptido que comprende la totalidad o una parte de una secuencia de aminoácidos de la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 7) (Der f VII). Se aportan también ácidos nucleicos que codifican péptidos que tienen una actividad de Der f VII y tienen al menos un 50% de homología con una secuencia ilustrada en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 7) (Der f VII). Son también aportados por esta invención péptidos que tienen una actividad de Der f VII producidos por medio de la expresión recombinante de un ácido nucleico de la invención, y péptidos que tienen una actividad de Der f VII preparados por síntesis química. Los péptidos preferidos tienen la capacidad de inducir una respuesta de las células T que puede incluir la estimulación de las células T (medida, por ejemplo, por medio de la proliferación de células T o de la secreción de citoquina) o la incapacidad de respuesta de las células T (es decir que el contacto con el péptido o con un complejo del péptido con una molécula de MHC (MHC = complejo mayor de histocompatibilidad) de una célula que presente el antígeno induce a la célula T a ser incapaz de responder a las señales estimuladoras o a ser incapaz de proliferar). Otros péptidos preferidos, ya sea aparte de o bien además de la capacidad de inducir una respuesta de las células T, tienen la capacidad de fijar la IgE específica de los ácaros del polvo doméstico de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo. Tales péptidos son útiles para diagnosticar la sensibilidad de un sujeto a los ácaros del polvo. Aun otros péptidos, ya sea aparte o bien además de la capacidad de inducir una respuesta de las células T, tienen una capacidad considerablemente reducida para fijar la IgE alérgica a los ácaros del polvo. Tales péptidos son particularmente útiles como agentes terapéuticos.

Otros péptidos preferidos comprenden una secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 7) (Der f VII). En una realización se aportan péptidos que tienen actividad antigénica de Der f VII y comprenden una parte de la secuencia de aminoácidos de la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 7). Tales péptidos son de una longitud de al menos 8-30 aminoácidos, preferiblemente de una longitud de 10-20 aminoácidos, y con la máxima preferencia, de una longitud de 10-16 aminoácidos.

Otro aspecto de la invención aporta anticuerpos que son específicamente reactivos con un péptido que tiene actividad antigénica del Der f VII. Puede ser utilizado en composiciones adecuadas para administración farmacéutica un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII. Tales composiciones pueden ser utilizadas de una manera similar a como se utilizan los extractos de ácaros del polvo para tratar o prevenir las reacciones alérgicas a un alergeno de los ácaros del polvo en un sujeto. Pueden ser también utilizados para diagnosticar la sensibilidad de un sujeto a un alergeno de los ácaros del polvo ácidos nucleicos de la invención y péptidos que tengan la actividad antigénica del Der f VII.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 ilustra la frecuencia de fijación de la IgE de sueros alérgicos con placas de \lambdagt11-HD6.

La Fig. 2 muestra la reactividad de la IgE y del anticuerpo de conejo antiácaros del polvo doméstico frente al producto de fusión del inserto HD6 clonado en pGEX-1 glutatión-S-transferasa purificada.

La Fig. 3A y la Fig. 3B es la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon de Der p VII HD6.

La Fig. 4 muestra extractos de ácaros de polvo doméstico caracterizados por electroforesis en un SDS-PAGE (SDS-PAGE = procedimiento de caracterización por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico) al 8-18%, con electrotransferencia a nitrocelulosa y reacción con suero alérgico combinado absorbido con lisados de E. coli que contienen un control vectorial pGEX-1 (carril 1) o HD6 de pGEX-1 (carril 2).

La Fig. 5 muestra la reactividad de anticuerpos anti-HD6 purificados según afinidad para con extractos de D. Pteronyssinus. Anticuerpos de conejo fueron purificados según afinidad sobre nitrocelulosa, y fueron utilizados para servir de sonda en un análisis Western blot de extractos de ácaros, con electroforesis en SDS-PAGE al 8-18%, y fueron revelados con A proteínica-^{125}I.

La Fig. 6A y la Fig. 6B es la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida de Der f VII.

La Fig. 7A, 7B, 7C, 7D y 7E es una comparación de la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida entre Der f VII y Der p VII. Los puntos indican igualdad en la secuencia de nucleótidos Der f VII y Der p VII. Se indican las bases de nucleótidos que difieren entre Der f VII y Der p VII, junto con cualquier diferencia en los aminoácidos correspondientes.

Descripción detallada de la invención

Esta invención es relativa a ácidos nucleicos aislados que codifican péptidos que tienen la actividad antigénica del Der f VII, que es un alergeno de la especie Dermatophagoides farinae. Preferiblemente, el ácido nucleico es un cDNA que comprende una secuencia de nucleótidos ilustrada en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 6) (Der f VII).

El cDNA ilustrado en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 6) codifica un péptido de Der f VII. Dicho péptido de Der f VII es codificado por las bases 43 a 681 de esta secuencia de cDNA. La secuencia de aminoácidos deducida de Der f VII basada en este cDNA está también ilustrada en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 7). Dicho péptido de Der f VII puede contener una secuencia de cabeza no encontrada en la proteína madura.

Una célula huésped transfectada con un vector de expresión que contenía una secuencia de nucleótidos que codificaba Der f VII fue depositada según el Tratado de Budapest en los Laboratorios Analíticos del Estado Australiano el 10 de mayo de 1994, y a dicha célula le fue dado el número de registro de entrada N94/8705.

En consecuencia, un aspecto de esta invención es relativo a ácidos nucleicos aislados que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican Der f VII, a fragmentos de los mismos que codifican péptidos que tienen la actividad antigénica del Der f VII, y a equivalentes de tales ácidos nucleicos. En el sentido en el que se la utiliza en la presente, se entiende que la expresión ácido nucleico incluye tales fragmentos y equivalentes. El vocablo "equivalente" es utilizado con la intención de incluir secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de Der f VII funcionalmente equivalentes o péptidos funcionalmente equivalentes que tienen la actividad antigénica del Der f VII. En el sentido en el que se le define en la presente, un péptido que tiene una actividad de Der f VII tiene al menos una actividad biológica del alergeno Der f VII. Las secuencias nucleotídicas equivalentes incluirán secuencias que difieran en una o varias sustituciones, adiciones o deleciones nucleotídicas, tales como variantes alélicas, e incluirán también secuencias que difieran de la secuencia nucleotídica que codifica Der f VII ilustrada en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 6) debido a la degeneración del código genético. Los equivalentes incluirán también secuencias de nucleótidos que hibriden bajo condiciones estrictas (es decir, equivalentes a aproximadamente 20-27ºC por debajo de la temperatura de fusión (T_{m}) y a sal aproximadamente 1M) para formar la secuencia de nucleótidos del Der f VII ilustrada en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 6).

Los péptidos a los que se alude en la presente como péptidos que tienen la actividad antigénica del Der f VII o que tienen una actividad de Der f VII son definidos en la presente como péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que corresponde en sustancia a la totalidad o a una parte de la secuencia de aminoácidos del Der f VII ilustrada en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 7), cuyo péptido tiene la actividad antigénica del Der f VII. Por ejemplo, un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII puede tener la capacidad de inducir una respuesta en células T restringidas por Der f VII, tal como la estimulación (p. ej. la proliferación de células T o la secreción de citoquina), o de inducir la incapacidad de respuesta de las células T. Como alternativa, o bien adicionalmente, un péptido que tenga una actividad de Der f VII puede tener la capacidad de fijar (de ser reconocido por) anticuerpos de inmunoglobulina E (IgE) de los sujetos alérgicos a los ácaros del polvo. Los péptidos que fijan la IgE son útiles en los métodos para detectar la sensibilidad alérgica al Der f VII en un sujeto. Los péptidos que no fijan la IgE, o que fijan la IgE en menor grado en comparación con el grado en que una proteína de Der f VII nativa purificada fija la IgE, son particularmente útiles como agentes terapéuticos.

En una realización, el ácido nucleico es un cDNA que codifica un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII. Preferiblemente, el ácido nucleico es una molécula de cDNA que comprende al menos una parte de la secuencia de nucleótidos que codifica Der f VII ilustrada en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 6). Una parte preferida de las moléculas de cDNA de la Figura 6A y 6B incluye la región codificadora de la molécula.

En otra realización, el ácido nucleico de la invención codifica un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII, y comprende una secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 7) (Der f VII). Los ácidos nucleicos preferidos codifican un péptido que tiene actividad antigénica de Der f VII y al menos aproximadamente un 50%, con más preferencia al menos aproximadamente un 60%, y con la máxima preferencia al menos aproximadamente un 70%, de homología con una secuencia expuesta en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 6) (Der f VII). Están también comprendidos dentro del alcance de la invención ácidos nucleicos que codifican péptidos que tienen actividad antigénica de Der f VII y tienen al menos aproximadamente un 90%, con más preferencia al menos aproximadamente un 95%, y con la máxima preferencia al menos aproximadamente un 98-99%, de homología con una secuencia expuesta en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 7) (Der f VII). El vocablo homología se refiere a la similitud de secuencias entre dos péptidos que tienen una actividad de Der f VII o entre dos moléculas de ácido nucleico. La homología puede ser determinada a base de comparar una posición en cada secuencia, cuyas secuencias pueden ser alineadas a efectos comparativos. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base o por el mismo aminoácido, las moléculas son entonces homólogas en esa posición. Un grado de homología entre secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las secuencias.

Otro aspecto de la invención aporta un ácido nucleico que hibrida bajo condiciones muy o poco estrictas para formar un ácido nucleico que codifica un péptido que tiene la totalidad o una parte de una secuencia de aminoácidos ilustrada en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 7) (Der f VII). Las condiciones de exigencia apropiadas que favorecen la hibridación, como por ejemplo 6,0 x de cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por un lavado a 2,0 x SSC a 50ºC, son bien conocidas por los expertos en la materia o bien se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado se puede seleccionar desde unas condiciones poco estrictas, de aproximadamente 2,0 x SSC a 50ºC, hasta unas condiciones muy estrictas, de aproximadamente 0,2 x SSC a 50ºC. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentar desde unas condiciones poco estrictas, a temperatura ambiente (aproximadamente 22ºC), hasta unas condiciones muy estrictas, a aproximadamente 65ºC.

Están también dentro del alcance de la invención ácidos nucleicos aislados que codifican péptidos que tienen la actividad antigénica del Der f VII, según se describe en la presente, y que tienen una secuencia que difiere de las secuencias de nucleótidos ilustradas en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 6) debido a degeneración en el código genético. Tales ácidos nucleicos codifican péptidos funcionalmente equivalentes (es decir, un péptido que tiene una actividad de Der f VII) pero difieren en cuanto a la secuencia de las secuencias de la Figura 6A y 6B debido a la degeneración del código genético. Por ejemplo, un número de aminoácidos están designados por más de un triplete. Los codones que especifican el mismo aminoácido, o sinónimos (por ejemplo, CAU y CAC son sinónimos para la histidina), pueden redundar en mutaciones "silenciosas" que no afectan la secuencia de aminoácidos de la proteína de Der f VII. Sin embargo, es de esperar que existan dentro de la población de ácaros del polvo polimorfismos de la secuencia de DNA que den lugar a modificaciones de la secuencia de aminoácidos del Der f VII. Un experto en la materia será consciente de que estas variaciones en uno o varios nucleótidos (en hasta aproximadamente un 3-4% de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican péptidos que tienen una actividad de Der f VII pueden existir entre los distintos ácaros del polvo debido a la variación alélica natural. Están dentro del alcance de esta invención todas y cualesquiera de tales variaciones de los nucleótidos y de los resultantes polimorfismos de los aminoácidos. Además, puede haber una o varias isoformas o uno o varios miembros emparentados e interreaccionantes de la familia del Der f VII. Tales isoformas o miembros de la familia son definidas(os) como proteínas emparentadas en cuanto a la función y a la secuencia de aminoácidos con el Der f VII pero codificadas por genes en loci distintos.

Están también dentro del alcance de la invención fragmentos del ácido nucleico que codifica Der f VII. En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "fragmento del ácido nucleico que codifica Der f VII" se refiere a una secuencia de nucleótidos que tiene menos nucleótidos que la secuencia de nucleótidos que codifica la totalidad de la secuencia de aminoácidos de la proteína de Der f VII y que codifica un péptido que tiene una actividad de Der f VII (es decir, un péptido que tiene al menos una actividad biológica del alergeno Der f VII) según se define en la presente.

Los fragmentos de ácido nucleico preferidos codifican péptidos de una longitud de al menos aproximadamente 7 residuos de aminoácidos, con preferencia de una longitud de aproximadamente 13-40 residuos de aminoácidos, y con mayor preferencia, de una longitud de aproximadamente 16-30 residuos de aminoácidos. Están también dentro del alcance de esta invención fragmentos de ácido nucleico que codifican péptidos que tienen una actividad de Der f VII de una longitud de al menos aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, una longitud de al menos aproximadamente 40 residuos de aminoácidos, una longitud de al menos aproximadamente 60 residuos de aminoácidos, una longitud de al menos aproximadamente 80 residuos de aminoácidos, una longitud de al menos aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, una longitud de al menos aproximadamente 140 residuos, y una longitud de al menos aproximadamente 200 residuos o más. En general, la expresión de los péptidos en una célula huésped transformada es ventajosa al máximo cuando el péptido deseado es de una longitud de más de aproximadamente 20 aminoácidos. Los péptidos más cortos son típicamente sintetizados con mayor facilidad por la vía química.

Los fragmentos de ácido nucleico que están dentro del alcance de la invención incluyen aquéllos que son capaces de hibridar bajo condiciones muy o poco estrictas con ácidos nucleicos de otras especies animales para ser utilizados en protocolos de selección para detectar Der f VII o alergenos que interreaccionen con Der f VII. Generalmente, el ácido nucleico que codifica un péptido que tiene una actividad de Der f VII será seleccionado a partir de las bases que codifican la proteína madura, si bien en algunos casos puede ser deseable seleccionar la totalidad o parte de un péptido a partir de la parte de la secuencia de cabeza de los ácidos nucleicos de la invención. Los ácidos nucleicos que quedan dentro del alcance de la invención pueden también contener secuencias ligadoras, sitios para endonucleasa de restricción modificados y otras secuencias útiles para la clonación molecular, la expresión o la purificación de péptidos recombinantes que tengan una actividad de Der f VII.

Un ácido nucleico que codifique un péptido que tenga una actividad de Der f VII puede ser obtenido de RNAm (RNAm = RNA mensajero) del ácaro del polvo Dermatophagoides farinae. Debería ser también posible obtener del DNA genómico de Dermatophagoides farinae ácidos nucleicos que codifiquen Der f VII. Por ejemplo, el gen que codifica Der f VII puede ser clonado ya sea a partir de un cDNA o bien a partir de una biblioteca genómica según los protocolos que aquí se describen. Puede ser obtenido un cDNA que codifique Der f VII a base de aislar RNAm total del Dermatophagoides farinae. Pueden ser entonces preparados a partir del RNAm total cDNAs de cadena doble. Subsiguientemente, los cDNAs pueden ser insertados en un adecuado vector plasmídico o bacteriofágico utilizando una cualquiera de las de una serie de técnicas conocidas. Pueden ser también clonados genes que codifiquen Der f VII utilizando acreditadas técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (véanse los Ejemplos 1 y 2) de acuerdo con la información de la secuencia de nucleótidos aportada por la invención. Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser DNA o RNA. Un ácido nucleico preferido es un cDNA que codifica el Der f VII que tiene la secuencia ilustrada en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 6) (Der f VII).

Esta invención aporta también vectores de expresión que contienen un ácido nucleico que codifica un péptido que tiene una actividad de Der f VII, ligado operativamente a al menos una secuencia reguladora. La expresión "ligado operativamente" es utilizada para expresar que la secuencia de nucleótidos es ligada a una secuencia reguladora de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos. Las secuencias reguladoras están reconocidas en la técnica y son seleccionadas para dirigir la expresión del péptido que tiene una actividad de Der f VII. En consecuencia, la expresión "secuencia reguladora" incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión. Tales secuencias reguladoras están descritas en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la selección de la célula huésped a transformar y/o el tipo de proteína que se desee expresar. En una realización, el vector de expresión incluye un DNA que codifica un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII. Tales vectores de expresión pueden ser utilizados para transfectar células para con ello producir proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión codificados por ácidos nucleicos aquí descritos.

Esta invención es además relativa a una célula huésped transfectada para expresar un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII. La célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII puede ser expresado en células bacterianas tales como E. coli, células de insectos (baculovirus), levadura o células de mamífero tales como células de ovario de hámster de la China (CHO). Pueden encontrarse otras células huésped adecuadas en Goeddel, (1990) supra, o bien tales células son conocidas para los expertos en la materia.

La expresión en células eucarióticas tales como células de mamífero, de levadura o de insecto, puede dar lugar a una glicosilación parcial o completa y/o a la formación de relevantes enlaces disulfuro intercadenas o intracadena de proteína recombinante. Los ejemplos de vectores para la expresión en levadura S. cerivisae incluyen el PYepSec1 (Baldari. et al., (1987) Embo J., 6: 229 - 234), el pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell, 30: 933 - 943), el pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene, 54: 113 - 123) y el pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (células SF 9) incluyen la serie pAc (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol., 3: 2156 - 2165) y la serie pVL (Lucklow, V.A. y Summers, M.D., (1989) Virology, 170: 31 - 39). Generalmente se utilizan células COS (Gluzman, Y., (1981) Cell, 23: 175 - 182) en conjunción con vectores tales como el pCDM 8 (Aruffo, A. y Seed, B., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8573 - 8577) para la amplificación/expresión transitoria en células de mamífero, mientras que se utilizan células CHO (dhfr- Ovario de Hámster de la China) con vectores tales como el pMT2PC (Kaufman et al., (1987) EMBO J., 6: 187 - 195) para la amplificación/expresión estable en células de mamífero. El DNA vector puede ser introducido en las células de mamífero mediante técnicas convencionales tales como la de la coprecipitación en fosfato cálcico o cloruro cálcico, la transfección mediada por DEAE-dextrano (= dietilaminoetildextrano) o la electroporación. Pueden encontrarse métodos adecuados para transformar células huésped en Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) y en otros libros de texto de laboratorio.

La expresión en procariotas es con la máxima frecuencia llevada a cabo en E. coli con vectores de expresión inducibles de fusión o no de fusión. Los vectores de fusión habitualmente añaden un número de aminoácidos con terminal NH2 al gen objetivo expresado. A estos aminoácidos con terminal NH2 a menudo se les denomina grupo informador. Tales grupos informadores tienen habitualmente las dos finalidades siguientes: 1) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante objetivo; y 2) ayudar a la purificación de la proteína recombinante objetivo actuando como ligando en la purificación según afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión es introducido un sitio de segmentación proteolítica en la unión del grupo informador y de la proteína recombinante objetivo para permitir a la proteína recombinante objetivo separarse del grupo informador a continuación de la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas y sus secuencias de reconocimiento afines incluyen Factor Xa, trombina y enterocinasa. Los típicos vectores de expresión de fusión incluyen el pGEX (Amrad Corp. Melbourne, Australia), el pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y el pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), que fusionan glutationa S-transferasa, proteína fijadora de maltosa E, o A proteínica, respectivamente, con la proteína recombinante objetivo.

Los vectores de expresión no de fusión inducibles incluyen el pTrc (Amann et al., (1988) Gene, 69: 301 - 315) y el pET 11d (Studier et al., Gene Expressión Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). Mientras que la expresión de los genes objetivo se basa en la transcripción de RNA polimerasa huésped desde el promotor de fusión trp-lac híbrido en el pTrc, la expresión de los genes objetivo insertados en el pET 11d se basa en la transcripción desde el promotor de fusión T7 gn10-lac 0 mediada por RNA polimerasa viral coexpresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral es suministrada por las cepas huésped BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago \lambda residente que alberga una T7 gn1 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5.

Nuestra estrategia para maximizar la expresión del Der f VII recombinante en E. coli es la de expresar la proteína en una bacteria huésped con una deteriorada capacidad para segmentar proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Otra estrategia es la de alterar el ácido nucleico que codifica la proteína de Der f VII a insertar en un vector de expresión para que los codones individuales para cada aminoácido sean los preferentemente utilizados en las proteínas de E. coli altamente expresadas (Wada et al., (1992) Nuc. Acids Res., 20: 2111 - 2118). Tal alteración de ácidos nucleicos de la invención puede ser llevada a cabo mediante técnicas de síntesis de DNA estándar.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser también sintetizados químicamente utilizando técnicas estándar. Son conocidos varios métodos para sintetizar químicamente polidesoxinucleótidos, incluyendo la síntesis en fase sólida, que, como la síntesis de los péptidos, ha sido plenamente automatizada en los sintetizadores de DNA que están comercialmente disponibles (véase, p. ej., Itakura et al., Patente U.S. Nº 4.598.049; Caruthers et al., Patente U.S. 4.458.066; e Itakura, Patentes U.S. Núms. 4.401.796 y 4.373.071, incorporadas a la presente por referencia).

Esta invención es además relativa a métodos para producir péptidos que tienen la actividad antigénica del Der f VII. Por ejemplo, una célula huésped transfectada con un vector de ácido nucleico que dirige la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII puede ser cultivada bajo condiciones apropiadas para permitir que tenga lugar la expresión del péptido. El péptido puede ser secretado y aislado de una mezcla de células y medio que contenga el péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII. Como alternativa, el péptido puede ser retenido citoplasmáticamente, y las células pueden ser recolectadas y lisadas, y puede aislarse la proteína. Un cultivo celular incluye células huésped, medios y otros subproductos. Los medios adecuados para el cultivo celular son bien conocidos en la técnica. El péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII puede ser aislado del medio de cultivo celular, de las células huésped o de ambos utilizando técnicas conocidas en la técnica de purificación de proteínas, incluyendo la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de filtración en gel, la ultrafiltración, la electroforesis y la purificación según inmunoafinidad con anticuerpos específicos de un péptido que tenga una actividad de Der f VII.

Otro aspecto de la invención es relativo a péptidos aislados que tienen la actividad antigénica del Der f VII. Un péptido que tenga una actividad de Der f VII tiene al menos una actividad biológica del alergeno Der f VII. Por ejemplo, un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII puede tener la capacidad de inducir una respuesta en células T específicas de Der f VII, tal como la estimulación (la proliferación de células T o la secreción de citoquina) o de inducir la incapacidad de respuesta de las células T. En una realización, un péptido que tiene una actividad de Der f VII estimula las células T según ponen de manifiesto, por ejemplo, la proliferación de las células T o la secreción de citoquina. En otra realización, péptidos que tienen la actividad antigénica del Der f VII inducen la incapacidad de respuesta de las células T por cuanto que las células T no responden a una subsiguiente confrontación con un péptido de Der f VII al ser expuestas al péptido. Aun en otra realización, un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII tiene una reducida actividad de fijación de IgE en comparación con la proteína de Der f VII nativa purificada. Un péptido que tenga una actividad de Der f VII puede diferir en cuanto a la secuencia de aminoácidos de la secuencia de Der f VII ilustrada en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 7) (Der f VII), pero tales diferencias redundan en una proteína modificada que funciona de la misma manera o de una manera similar a como lo hace la proteína de Der f VII nativa, o que tiene características iguales o similares a las de la proteína de Der f VII nativa. Están descritas en detalle en la presente varias modificaciones de la proteína de Der f VII para producir estos péptidos y otros péptidos funcionalmente equivalentes. En el sentido en el que se le utiliza en la presente, el vocablo "péptido" se refiere a proteínas de longitud completa y a polipéptidos o a fragmentos peptídicos de los mismos.

Un péptido puede ser producido por modificación de la secuencia de aminoácidos de la proteína de Der f VII ilustrada en la Figura 6A y 6B (ID SEC Nº: 7) (Der f VII), tal como una sustitución, adición o deleción de un residuo de aminoácidos que no está directamente implicado en la función de la proteína. Los péptidos de la invención pueden ser de una longitud de al menos aproximadamente 10 residuos de aminoácidos, con preferencia de una longitud de aproximadamente 10-20 residuos de aminoácidos, y con mayor preferencia, de una longitud de aproximadamente 10-16 residuos de aminoácidos. Están también incluidos dentro del alcance de esta invención péptidos que tienen la actividad antigénica del Der f VII y que son de una longitud de al menos aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, de una longitud de al menos aproximadamente 40 residuos de aminoácidos, de una longitud de al menos aproximadamente 60 residuos de aminoácidos, de una longitud de al menos aproximadamente 80 residuos de aminoácidos, y de una longitud de al menos aproximadamente 100 residuos de aminoácidos.

Otra realización de la invención aporta una preparación en sustancia pura de un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII. Tal preparación está en sustancia exenta de las proteínas y de los péptidos con los cuales el péptido se da de manera natural (es decir, otros péptidos de los ácaros del polvo) ya sea en una célula o bien al ser secretado por una célula.

En el sentido en el que se le utiliza en la presente, el vocablo "aislado" se refiere a un ácido nucleico o péptido que está en sustancia exento de material celular o medio de cultivo cuando es producido por técnicas de DNA recombinante, o de precursores químicos o de otras sustancias químicas cuando es sintetizado químicamente. Tales proteínas o péptidos están también caracterizadas(os) por el hecho de estar exentas(os) de todas las otras proteínas de los ácaros del polvo. En consecuencia, un péptido aislado que tiene la actividad antigénica del Der f VII es producido por recombinación o síntesis y está en sustancia exento de material celular y medio de cultivo o está en sustancia exento de precursores químicos o de otras sustancias químicas y está en sustancia exento de todas las demás proteínas de los ácaros del polvo. Un ácido nucleico aislado está también exento de las secuencias que de manera natural flanquean al ácido nucleico (es decir, de las secuencias situadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el organismo del cual se deriva el ácido nucleico.

Péptidos que tengan la actividad antigénica del Der f VII pueden ser obtenidos, por ejemplo, a base de someter a selección los péptidos producidos por recombinación a partir del correspondiente fragmento del ácido nucleico de Der f VII que codifica tales péptidos. Además, los fragmentos pueden ser sintetizados químicamente utilizando técnicas conocidas en el ramo tales como la química f-Moc o t-Boc en fase sólida de Merrifield convencional. Por ejemplo, la proteína de Der f VII puede ser dividida arbitrariamente en fragmentos de la longitud deseada sin superposición de los fragmentos, o bien puede ser preferiblemente dividida en fragmentos superpuestos de una longitud deseada. Los fragmentos pueden ser producidos (por recombinación o por síntesis química) y pueden ser analizados para identificar aquellos péptidos que tengan la actividad del Der f VII (es decir, la capacidad de inducir una respuesta de las células T tal como la estimulación (proliferación, secreción de citoquina), la incapacidad de respuesta y/o la reducida actividad de fijación de IgE).

En una realización, los péptidos que tienen la capacidad antigénica del Der f VII pueden ser identificados por la capacidad del péptido para estimular las células T o para inducir la incapacidad de respuesta de las células T. Los péptidos que estimulan las células T, según determina, por ejemplo, la proliferación de células T o la secreción de citoquina, son definidos en la presente como péptidos que comprenden al menos un epítope para células T. Se cree que los epítopes para células T intervienen en la iniciación y perpetuación de la respuesta inmune al alergeno proteínico que es responsable de los síntomas clínicos de la alergia. Se piensa que estos epítopes para células T disparan los eventos iniciales a nivel de la célula T colaboradora a base de fijarse a una apropiada molécula de HLA (HLA = antígeno linfocítico humano) sobre la superficie de una célula que presenta el antígeno, estimulando con ello la subpoblación de células T con el correspondiente receptor de las células T para el epítope. Estos eventos conducen a la proliferación de células T, a la secreción de linfocinas, a reacciones inflamatorias locales, al reclutamiento de adicionales células inmunes con destino al sitio de interacción entre el antígeno y las células T, y a la activación de la cascada de células B, conduciendo a la producción de anticuerpos. Un isótopo de estos anticuerpos, la IgE, es fundamentalmente importante para el desarrollo de los síntomas alérgicos, y su producción es influenciada tempranamente en la cascada de eventos a nivel de la célula T colaboradora por la naturaleza de las linfocinas secretadas. Un epítope para células T es el elemento básico, o la menor unidad de reconocimiento por un receptor de célula T, comprendiendo el epítope aminoácidos esenciales para el reconocimiento por parte del receptor. Están dentro del alcance de esta invención secuencias de aminoácidos que imitan las de los epítopes para células T y modifican la respuesta alérgica a los alergenos proteínicos.

La selección de los péptidos para distinguir aquéllos que conservan la actividad antigénica del Der f VII según se describe en la presente puede ser llevada a cabo utilizando uno o varios de diversos análisis distintos. Por ejemplo, in vitro, la actividad estimuladora de las células T por parte del Der f VII es analizada a base de poner a un péptido del que se sepa o se sospeche que tiene la actividad antigénica del Der f VII en contacto con una célula que presente el antígeno y que presente apropiadas moléculas de MHC en un cultivo de células T. La presentación de un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII en asociación con apropiadas moléculas de MHC a células T en conjunción con la necesaria coestimulación tiene el efecto de transmitir a la célula T una señal que induce la producción de niveles incrementados de citoquinas, y particularmente de interleuquina-2 e interleuquina-4. El supernatante del cultivo puede ser obtenido y analizado para detectar la presencia de interleuquina-2 o de otras citoquinas conocidas. Por ejemplo, puede emplearse cualquiera de varios análisis convencionales para la determinación de la interleuquina-2, tal como el análisis descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1333 (1989), cuyas partes pertinentes quedan incorporadas a la presente por referencia. Puede ser también adquirido a la Genzyme Corporation (Cambridge, MA) un conjunto de materiales y utensilios para la ejecución de un análisis de la producción de interferón.

Como alternativa, un análisis común para determinar la proliferación de células T supone medir la incorporación de timidina tritiada. La proliferación de las células T puede ser medida in vitro a base de determinar la cantidad de timidina marcada con ^{3}H incorporada al DNA replicante de las células cultivadas. Por consiguiente pueden cuantificarse la velocidad de síntesis de DNA, y a su vez, la velocidad de división celular.

En una realización, los péptidos que tienen actividad de estimulación de células T del Der f VII (es decir que el péptido comprende al menos un epítope para células T) pueden ser identificados utilizando un algoritmo que pronostica la presencia de epítopes para células T en una secuencia proteínica, tal como el algoritmo descrito por Hill et al., Journal of Immunology, 147: 189-197 (1991). El algoritmo de Hill et al. pronostica la situación de los epítopes para células T en una proteína por medio de la presencia de determinadas configuraciones dentro de la secuencia que probablemente fijarán MHC y por consiguiente pueden contener epítopes para células T.

A fin de determinar los precisos epítopes para células T mediante, por ejemplo, técnicas de trazado preciso de mapas, un péptido que tiene actividad de estimulación de células T del Der f VII, y que por consiguiente comprende al menos un epítope para células T según determinación mediante técnicas de biología de las células T, es modificado mediante adición o deleción de residuos de aminoácidos en el terminal amino o en el terminal carboxi del péptido, y es sometido a ensayo para determinar una modificación de la reactividad de las células T al péptido modificado. Siguiendo esta técnica, los péptidos son seleccionados y producidos por recombinación o por síntesis. Los péptidos son seleccionados sobre la base de varios factores, entre los que se incluyen la fortaleza de la respuesta de las células T al péptido (p. ej. el índice de estimulación), la frecuencia de la respuesta de las células T al péptido en una población de individuos sensibles a los alergenos de los ácaros del polvo, y la interreactividad potencial del péptido con otros alergenos de los ácaros del polvo. Las propiedades físicas y químicas de estos péptidos seleccionados (p. ej. la solubilidad y la estabilidad) son examinadas para determinar si los péptidos son adecuados para ser utilizados en composiciones terapéuticas, o si los péptidos requieren modificación según se describe en la presente. Entonces se determina según se describe en la presente la capacidad de los péptidos seleccionados o de los péptidos modificados seleccionados para estimular las células T humanas (p. ej. para inducir la proliferación o la secreción de linfocinas).

En otra realización, un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII es sometido a selección para determinar la capacidad de inducir la incapacidad de respuesta de las células T. La capacidad de un péptido del que se sepa que estimula las células T (según se haya determinado por medio de uno o varios de los análisis anteriormente descritos) para inhibir o bloquear por completo la actividad del Der f VII nativo purificado o de una parte del mismo y para inducir un estado de incapacidad de respuesta puede ser determinada utilizando subsiguientes intentos de estimulación de las células T con células que presenten antígeno y que presenten Der f VII nativo o péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII a continuación de la exposición al péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII. Si las células T no responden a los subsiguientes intentos de activación, según se determine por síntesis de interleuquina-2 y/o por proliferación de las células T, ha sido inducido un estado de incapacidad de respuesta. Con respecto a sistemas de análisis que pueden ser utilizados como la base para un análisis según la presente invención, véase, p. ej., Gimmi et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6586 - 6590, y Schwartz (1990) Science, 248: 1349 - 1356.

Aun en otra realización, los péptidos que tienen la actividad antigénica del Der f VII son identificados por medio de la actividad de fijación de IgE. A efectos terapéuticos, los péptidos de la invención preferiblemente no fijan IgE específica para un alergeno de los ácaros del polvo, o bien fijan tal IgE en considerablemente menor grado (p. ej. al menos 100 veces menos, y con más preferencia al menos 1000 veces menos) en comparación con el grado en que el correspondiente alergeno de los ácaros del polvo nativo purificado fija tal IgE. La reducida actividad de fijación de IgE se refiere a una actividad de fijación de IgE que es menor que la de la proteína de Der f VII nativa purificada. Si un péptido que tiene actividad antigénica de Der f VII debe ser utilizado como reactivo de diagnosis, no es necesario que el péptido tenga una reducida actividad de fijación de IgE en comparación con el alergeno Der f VII nativo. La actividad de fijación de IgE de los péptidos puede ser determinada mediante, por ejemplo, un inmunoanálisis ligado a enzimas (ELISA) utilizando, por ejemplo, suero obtenido de un sujeto (es decir, de un sujeto alérgico) que ha sido previamente expuesto el alergeno Der f VII nativo. Brevemente, el péptido del que se sospecha que tiene actividad antigénica de Der f VII es aplicado como recubrimiento a cavidades de una placa de cultivo de microtitulación. Tras haber lavado y bloqueado las cavidades, es incubada en las cavidades solución de anticuerpos consistente en el plasma de un sujeto alérgico que ha sido expuesto a un péptido del que se sospecha que tiene actividad antigénica de Der f VII. Al plasma se le retira generalmente la IgG antes de la incubación. Es añadido a las cavidades e incubado un anticuerpo secundario marcado. La cantidad de fijación de IgE es entonces cuantificada y comparada con la cantidad de IgE fijada por una proteína de Der f VII nativa purificada. Como alternativa, la actividad de fijación de IgE de un péptido puede ser determinada mediante análisis Western blot. Por ejemplo, un péptido del que se sospeche que tiene actividad antigénica de Der f VII es pasado por un gel de poliacrilamida utilizando el SDS-PAGE (SDS-PAGE = procedimiento de caracterización por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico). El péptido es entonces transferido a nitrocelulosa y es subsiguientemente incubado con suero de un sujeto alérgico. Tras la incubación con un anticuerpo secundario marcado, es entonces determinada y cuantificada la cantidad de IgE fijada.

Otro análisis que puede ser utilizado para determinar la actividad de fijación de IgE de un péptido es un análisis ELISA competitivo. Brevemente, es generada una combinación de anticuerpos de IgE a base de combinar plasma de sujetos alérgicos a los ácaros del polvo de los que se ha comprobado mediante ELISA directo que tienen IgE que es reactiva con el Der f VII nativo. Esta combinación es utilizada en análisis competitivos ELISA para comparar la fijación de IgE del Der f VII nativo y de un péptido del que se sospecha que tiene una actividad de Der f VII. Es determinada y cuantificada la fijación de IgE para la proteína de Der f VII nativa y para un péptido del que se sospecha que tiene actividad antigénica de Der f VII.

Si un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII fija IgE y debe ser utilizado como agente terapéutico, es preferible que tal fijación no redunde en la liberación de mediadores (p. ej. histaminas) desde mastocitos o basófilos. Para determinar si un péptido que fija IgE redunda en la liberación de mediadores, puede ser llevado a cabo un análisis de liberación de histamina utilizando reactivos y protocolos estándar obtenidos, por ejemplo, de la Amac, Inc. (Westbrook, ME). Brevemente, una solución tamponada de un péptido del que se sospecha que tiene actividad antigénica de Der f VII es combinada con un volumen igual de sangre total heparinizada de un sujeto alérgico. Tras la mezcla y la incubación, las células son granuladas y los supernatantes son procesados y analizados utilizando un radioinmunoanálisis para determinar la cantidad de histamina liberada.

Los péptidos que tienen la actividad antigénica del Der f VII y que deben ser utilizados como agentes terapéuticos son preferiblemente probados en modelos de atopia a los ácaros del polvo en mamíferos, tales como el modelo del ratón descrito en Tamura et al., (1986) Microbiol. Immunol., 30: 883 - 896, o en la Patente U.S. 4.939.239, o en el modelo del primate descrito en Chiba et al., (1990) Int. Arch. Allergy Immunol., 93: 83 - 88. La selección inicial para determinar la fijación de IgE a un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII puede ser llevada a cabo mediante pruebas de rascado o pruebas cutáneas intradérmicas en animales de laboratorio o voluntarios humanos, o bien en sistemas in vitro tales como la RAST (RAST = prueba radioalergosorbente), la inhibición en la RAST, el análisis ELISA, RIA (radioinmunoanálisis), o un análisis de la liberación de histamina, según se ha descrito anteriormente.

Es posible modificar la estructura de un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII con finalidades tales como las de incrementar la solubilidad o potenciar la eficacia terapéutica o profiláctica o la estabilidad (p. ej. la duración de conservación ex vivo y la resistencia a la degradación proteolítica in vivo). Tales péptidos modificados son considerados equivalentes funcionales de los péptidos que tienen la actividad antigénica del Der f VII según se define en la presente. Puede ser producido un péptido modificado en el cual ha sido alterada la secuencia de aminoácidos por procedimientos tales como los de sustitución, deleción o adición de aminoácidos, para modificar la inmunogenicidad y/o reducir la alergenicidad, o al cual ha sido añadido un componente con la misma finalidad.

Por ejemplo, un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII puede ser modificado para que conserve la capacidad de inducir la incapacidad de respuesta de las células T y fijar proteínas de MHC sin capacidad para inducir una fuerte respuesta proliferativa o posiblemente respuesta proliferativa alguna al ser administrado en forma inmunogénica. En este caso, los residuos fijadores decisivos para la función receptora de las células T pueden ser determinados mediante la utilización de técnicas conocidas (p. ej. la sustitución de cada residuo y la determinación de la presencia o ausencia de reactividad de las células T). Aquellos residuos de los que se haya comprobado que son esenciales para interactuar con el receptor de la célula T pueden ser modificados a base de sustituir el aminoácido esencial por otro residuo de aminoácido preferiblemente similar (una sustitución conservadora) cuya presencia se compruebe que potencia, disminuye pero no elimina la reactividad de la célula T o no la afecta. Además, aquellos residuos de aminoácidos que no sean esenciales para la interacción con el receptor de la célula T pueden ser modificados a base de ser sustituidos por otro aminoácido cuya incorporación pueda potenciar, disminuir pero no eliminar la reactividad de la célula T o no afectarla, pero no elimine la fijación al correspondiente MHC.

Adicionalmente, un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII puede ser modificado a base de sustituir un aminoácido del que se haya comprobado que es esencial para interactuar con el complejo proteínico MHC por otro residuo de aminoácido preferiblemente similar (sustitución conservadora) cuya presencia se haya comprobado que potencia, disminuye pero no elimina la actividad de la célula T o no la afecta. Además, los residuos de aminoácidos que no son esenciales para la interacción con el complejo proteínico MHC pero que sin embargo fijan el complejo proteínico MHC pueden ser modificados a base de ser sustituidos por otro aminoácido cuya incorporación pueda potenciar, no afectar o disminuir pero no eliminar la reactividad de las células T. Las preferidas sustituciones de aminoácidos para los aminoácidos no esenciales incluyen sustituciones con alanina, ácido glutámico o un metilaminoácido, pero no están limitadas a éstas.

Otro ejemplo de modificación de un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII es la sustitución de residuos de cisteína preferiblemente con residuos de alanina, serina, treonina, leucina o ácido glutámico para minimizar la dimerización a través de enlaces disulfuro. Además pueden ser modificadas químicamente las cadenas laterales de aminoácidos de fragmentos de la proteína de la invención. Otra modificación es la ciclización del péptido.

A fin de potenciar su estabilidad y/o reactividad, un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII puede ser modificado para que incorpore uno o varios polimorfismos en la secuencia de aminoácidos del alergeno proteínico resultante de cualquier variación alélica natural. Adicionalmente, pueden ser sustituidos o añadidos D-aminoácidos, aminoácidos no naturales o análogos no aminoácidos para producir una proteína modificada que quede dentro del alcance de esta invención. Además, un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII puede ser modificado utilizando polietilenglicol (PEG) según el método de A. Sehon y colaboradores (Wie et al., supra) para producir una proteína conjugada con PEG. Además puede ser añadido PEG durante la síntesis química de la proteína. Otras modificaciones de un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII incluyen la reducción/alquilación (Tarr, Methods of Protein Microcharacterization, J. E. Silver ed., Humana Press, Clifton NJ 155-194 (1986)); la acilación (Tarr, supra); el acoplamiento químico a un soporte apropiado (Mishell y Shiigi, eds, Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman, San Francisco, CA (1980), Patente U.S. 4.939.239); o el tratamiento con formalina de baja concentración (Marsh, (1971) Int. Arch. Of Allergy and Appl. Immunol., 41: 199 -
215).

Para facilitar la purificación e incrementar potencialmente la solubilidad de un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII, es posible añadir una mitad de fusión de aminoácidos a la cadena principal del péptido. Por ejemplo, puede ser añadida hexa-histidina a la proteína para la purificación por cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (Hochuli, E. et al., (1988) Bio/Technology, 6: 1321 - 1325). Además, para facilitar el aislamiento de los péptidos exentos de secuencias irrelevantes, pueden ser introducidos sitios de segmentación por endoproteasa específica entre las secuencias de la mitad de fusión y del péptido. A fin de desensibilizar con éxito a un sujeto al alergeno proteínico Der f VII o al alergeno emparentado con el mismo, puede ser necesario incrementar la solubilidad de la proteína a base de añadir grupos funcionales a la proteína, o bien a base de omitir regiones hidrofóbicas de la proteína. Grupos funcionales tales como aminoácidos con carga eléctrica y pares de aminoácidos con carga eléctrica son adecuados para incrementar la solubilidad al ser añadidos al terminal amino o carboxi del péptido.

Para ayudar potencialmente al correcto procesamiento antigénico de los epítopes para células T dentro del Der f VII, pueden ser introducidos entre regiones sitios canónicos sensibles a la proteasa que comprendan cada uno al menos un epítope para células T utilizando métodos de recombinación o síntesis. Por ejemplo, pares de aminoácidos con carga eléctrica, tales como KK o RR, pueden ser introducidos entre regiones dentro de una proteína o de un fragmento durante la construcción recombinante de la misma o del mismo. Al péptido resultante puede hacérsele sensible a la segmentación por catepsina y/u otras enzimas análogas a la tripsina, que generarían partes de la proteína que contendrían uno o varios epítopes para células T. Además, tales residuos de aminoácidos cargados eléctricamente pueden redundar en un incremento de la solubilidad del péptido.

La mutagénesis específica de sitio de un ácido nucleico que codifique un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII puede ser utilizada para modificar la estructura del péptido por métodos conocidos en la técnica. Tales métodos pueden incluir, entre otros, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores oligonucleotídicos que lleven una o varias mutaciones (Ho et al., (1989) Gene, 77: 51 - 59) o la síntesis total de genes mutados (Hostomsky, Z. et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm, 161: 1056 - 1063). Para potenciar la expresión de la proteína recombinante, los métodos anteriormente mencionados pueden ser aplicados para cambiar los codones presentes en la secuencia de cDNA de la invención por los preferiblemente utilizados por la célula huésped en la cual es expresada la proteína recombinante (Wada et al., supra).

Otro aspecto de la invención es relativo a un anticuerpo que es específicamente reactivo con un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII. Los anticuerpos de esta invención pueden ser utilizados para estandarizar extractos de alergeno o para aislar la forma que se da de manera natural o forma nativa del Der f VII. Por ejemplo, a base de utilizar péptidos que tengan una actividad de Der f VII basada en la secuencia de cDNA del Der f VII pueden hacerse antisueros antiproteínicos/antipeptídicos o anticuerpos monoclonales a base de utilizar métodos estándar. Un mamífero tal como un ratón, un hámster o un conejo puede ser inmunizado con una forma inmunogénica del péptido (p. ej. proteína de Der f VII o un fragmento antigénico que sea capaz de provocar una respuesta de los anticuerpos). La técnicas para conferir inmunogenicidad a una proteína o a un péptido incluyen la conjugación con soportes u otras técnicas bien conocidas en el ramo. Un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII puede ser administrado en presencia de adyuvante. El progreso de la inmunización puede ser supervisado mediante la detección de los títulos de anticuerpos en el plasma o en el suero. El inmunoanálisis ELISA estándar u otro inmunoanálisis puede ser utilizado con el inmunógeno como antígeno para evaluar los niveles de anticuerpos.

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A continuación de la inmunización puede ser obtenido antisuero anti-Der f VII, y, si se desea, pueden ser aislados del suero anticuerpos anti-Der f VII policlonales. Para producir anticuerpos monoclonales, células productoras de anticuerpos (linfocitos) pueden ser recolectadas de un animal inmunizado y fusionadas por procedimientos de fusión celular somática estándar con células inmortalizadoras tales como células de mieloma para obtener células de hibridoma. Tales técnicas son bien conocidas en el ramo, como por ejemplo la técnica del hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975) Nature, 256: 495 - 497), así como otras técnicas tales como la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72) y la técnica del hibridoma de EBV (EBV = virus de Epstein-Barr) para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96). Las células de hibridoma pueden ser sometidas a selección inmunoquímica para la producción de anticuerpos específicamente reactivos con un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII, y los anticuerpos monoclonales pueden ser aislados.

En el sentido en el que se le utiliza en la presente, el vocablo "anticuerpo" es utilizado para incluir fragmentos del mismo que sean también específicamente reactivos con el péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII. Los anticuerpos pueden ser fragmentados utilizando técnicas convencionales, y los fragmentos pueden ser sometidos a selección con respecto a su utilidad de la misma manera como se ha descrito anteriormente para los anticuerpos totales. Por ejemplo, pueden ser generados fragmentos F(ab')_{2} a base de tratar al anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')_{2} resultante puede ser tratado para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos Fab'. Se entiende además que el anticuerpo de la presente invención incluye moléculas biespecíficas y quiméricas que tienen una porción anti-Der f VII.

Otro aspecto de esta invención aporta clones de células T y receptores de células T solubles específicamente reactivos con un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII. Poblaciones de células T monoclonales (es decir, de células T genéticamente idénticas entre sí y que expresan idénticos receptores de células T) pueden ser obtenidas de un individuo sensible al Der f VII, efectuándose a continuación estimulación repetitiva in vitro con una proteína o péptido de Der f VII que tenga la actividad antigénica del Der f VII en presencia de células que presenten el antígeno en emparejamiento con MHC. Las distintas células que con el MHC responden al Der f VII pueden ser entonces clonadas por dilución limitativa, y las líneas permanentes pueden ser expandidas y mantenidas por reestimulación in vitro periódica. Como alternativa, pueden ser producidos hibridomas T-T específicos de Der f VII por una técnica similar a la de la producción de hibridomas de células B. Por ejemplo, un mamífero tal como un ratón es inmunizado con un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII, y las células T son entonces purificadas y fusionadas con una línea tumoral de células T de crecimiento autónomo. A partir de los hibridomas resultantes, se seleccionan y clonan las células que respondan a un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII. Procedimientos para propagar poblaciones de células T monoclonales están descritos en Cellular and Molecular Immunology (Abul K. Abbas et al. ed.), W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA (1991), página 139. Receptores de células T solubles específicamente reactivos con un péptido que tiene una actividad de Der f VII pueden ser obtenidos por inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo contra el receptor de célula T según se describe en Immunology: A Synthesis (Segunda Edición), Edward S. Golub et al., ed., Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1991), páginas 366-269.

Clones de células T específicamente reactivos con un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII pueden ser utilizados para aislar y clonar molecularmente el gen que codifica el correspondiente receptor de célula T. Además, un receptor de célula T soluble específicamente reactivo con un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII puede ser utilizado para interferir con o inhibir la activación antígenodependiente de la relevante subpoblación de células T, por ejemplo, mediante administración a un individuo sensible al Der f VII. Anticuerpos específicamente reactivos con tal receptor de célula T pueden ser producidos según las técnicas aquí descritas. Tales anticuerpos pueden ser utilizados para bloquear o interferir la interacción de las células T con los péptidos presentados por
los MHC.

La exposición de sujetos alérgicos a péptidos que tengan la actividad antigénica del Der f VII y que tengan la actividad estimuladora de las células T puede hacer que las apropiadas subpoblaciones de células T devengan incapaces de responder al respectivo alergeno proteínico (p. ej. no logrando estimular una respuesta inmune al tener lugar tal exposición). Además, tal administración puede modificar el perfil de secreción de linfocinas en comparación con la exposición al alergeno proteínico que se da de manera natural o a una porción del mismo (redundando, p. ej., en una disminución de IL-4 y/o un incremento de IL-2). Además, la exposición a péptidos que tengan la actividad antigénica del Der f VII y que tengan la actividad estimuladora de las células T puede influenciar a las subpoblaciones de células T que normalmente participan en la respuesta al alergeno de forma tal que estas células T sean alejadas del sitio o de los sitios de exposición normal al alergeno (p. ej. la mucosa nasal, la piel y el pulmón) siendo llevadas hacia el sitio o los sitios de administración terapéutica de la proteína o del fragmento derivado de la misma. Esta redistribución de las subpoblaciones de células T puede mejorar o reducir la capacidad del sistema inmune de un individuo para estimular la respuesta inmune habitual en el sitio de exposición normal al alergeno, redundando en una disminución de los síntomas alérgicos.

Al ser administrado a un sujeto sensible a los alergenos de los ácaros del polvo, un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII es capaz de modificar la respuesta de las células B, la respuesta de las células T o tanto la respuesta de las células B como la respuesta de las células T del sujeto al alergeno. En el sentido en el que la expresión es utilizada en la presente, la modificación de la respuesta alérgica de un sujeto a un alergeno de los ácaros del polvo puede ser definida como una incapacidad de respuesta o disminución de síntomas al alergeno según determinación efectuada por procedimientos clínicos estándar (véase, p. ej., Varney et al., (1990) British Medical Journal, 302: 265 - 269), incluyendo una disminución de los síntomas asmáticos inducidos por los ácaros del polvo. En el sentido en el que se alude a la expresión en la presente, una disminución de síntomas incluye toda reducción de la respuesta alérgica de un sujeto al alergeno a continuación de un régimen de tratamiento con un péptido de la invención. Esta disminución de síntomas puede ser determinada subjetivamente (p. ej. el paciente se siente más cómodo tras haber sido expuesto al alergeno) o bien clínicamente, tal como con una prueba cutánea estándar.

Los péptidos o anticuerpos de la presente invención pueden ser también utilizados para detectar y diagnosticar la sensibilidad al Der f VII. Por ejemplo, esto puede hacerse in vitro a base de combinar sangre o productos sanguíneos obtenidos de un sujeto para el que deba evaluarse la sensibilidad con péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII bajo condiciones apropiadas para la fijación de componentes de la sangre (p. ej. anticuerpos, células T, células B) con el péptido o con los péptidos y a base de determinar el grado en que tiene lugar tal fijación. Otros métodos de diagnosis de enfermedades alérgicas en los que pueden ser utilizados los péptidos o anticuerpos de la presente invención incluyen la prueba radioalergosorbente (RAST), la prueba radioinmunosorbente sobre papel (PRIST), el inmunoanálisis ligado a enzimas (ELISA), los radioinmunoanálisis (RIA), los análisis inmunorradiométricos (IRMA), los inmunoanálisis por luminiscencia (LIA), los análisis de liberación de histamina y las inmunotransferencias
de IgE.

La presente invención aporta además métodos para detectar y tratar la sensibilidad de un sujeto al Der f VII. La presencia en los sujetos de IgE específica para Der f VII y la capacidad de las células T de los sujetos para responder a los epítopes de Der f VII para las células T pueden ser determinadas a base de administrar al sujeto una prueba de Hipersensibilidad de Tipo Inmediato y/o una prueba de Hipersensibilidad de Tipo Retardado (véase, p. ej., Immunology (1985) Roitt, I.M., Brostoff, J., Male, D.K. (eds), C.V. Mosby Co., Gower Medical Publishing, London, NY, pp. 19.2-19.18; pp. 22.1-22.10) utilizando un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII o una forma modificada de un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII, cada uno de los cuales fije IgE específica para el alergeno. A los mismos sujetos se les administra una prueba de Hipersensibilidad de Tipo Retardado antes de, simultáneamente a o subsiguientemente a la administración de la prueba de Hipersensibilidad de Tipo Inmediato. Naturalmente, si la prueba de Hipersensibilidad de Tipo Inmediato es administrada antes de la prueba de Hipersensibilidad de Tipo Retardado, la prueba de Hipersensibilidad de Tipo Retardado sería administrada a aquellos sujetos que presentasen una reacción de Hipersensibilidad de Tipo Inmediato Específica. La prueba de Hipersensibilidad de Tipo Retardado utiliza un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII, tiene actividad de estimulación de células T humanas y no fija IgE específica para el alergeno en un considerable porcentaje de la población de sujetos sensibles al alergeno (p. ej. de al menos aproximadamente un 75%). A aquellos sujetos que resulten tener tanto una reacción de Hipersensibilidad de Tipo Inmediato específica como una Reacción de Hipersensibilidad de Tipo Retardado específica se les administra una cantidad de una composición adecuada para la administración farmacéutica. La composición comprende el péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII según se le utiliza en la prueba de Hipersensibilidad de Tipo Retardado y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII puede ser utilizado en métodos para diagnosticar, tratar o prevenir las reacciones alérgicas a un alergeno de los ácaros del polvo o a un alergeno proteínico interreactivo. Así, la presente invención aporta composiciones adecuadas para el uso in vitro y para la administración farmacéutica que comprenden una cantidad de al menos un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII. Las composiciones farmacéuticas serán típicamente formuladas con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Cuando una composición según la invención está destinada a ser administrada a un sujeto a desensibilizar, tal administración puede ser llevada a cabo utilizando procedimientos conocidos y con dosificaciones y por espacio de períodos de tiempo que resulten eficaces para reducir la sensibilidad (es decir, para reducir la respuesta alérgica) del sujeto a un alergeno de los ácaros del polvo. El vocablo "sujeto" es utilizado con la intención de incluir organismos vivientes en los cuales pueda ser provocada una respuesta inmune, como son p. ej. los mamíferos. Los ejemplos de sujetos incluyen los seres humanos, los perros, los gatos, los ratones, las ratas y las especies transgénicas de los mismos. Una cantidad de al menos un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII necesaria para lograr un efecto terapéutico puede variar según factores tales como el grado de sensibilidad del sujeto a los ácaros del polvo, la edad, el sexo y el peso del sujeto, y la capacidad de un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII para provocar una respuesta antigénica en el sujeto. Los regímenes de dosificación pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden ser administradas diariamente varias dosis divididas, o bien la dosis puede ser reducida proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación
terapéutica.

El compuesto activo (es decir, un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII) puede ser administrado de una manera conveniente tal como por inyección (subcutánea, intravenosa, etc.), administración oral, inhalación, aplicación transdérmica o administración rectal. En dependencia de la ruta de administración, el compuesto activo puede estar recubierto con un material para proteger al compuesto contra la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto.

Para administrar un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII por una vía distinta de la administración parenteral, puede ser necesario recubrir al péptido con, o coadministrar el péptido con, un material para impedir su inactivación. Por ejemplo, un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII puede ser administrado a un individuo en un apropiado vehículo, diluyente o adyuvante, o bien puede ser coadministrado con inhibidores enzimáticos o en un apropiado vehículo tal como liposomas. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones salinas y soluciones tampón acuosas. El vocablo "adyuvante" es utilizado en su sentido más amplio e incluye todo compuesto estimulante inmune tal como el interferón. Los adyuvantes contemplados en la presente incluyen resorcinoles y agentes superficiactivos no iónicos tales como éter polioxietilenoleílico y éter de n-hexadecilpolietileno. Los inhibidores enzimáticos incluyen inhibidor de tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DEP) y trasilol. Los liposomas incluyen emulsiones CGF de agua en aceite en agua, así como liposomas convencionales (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol., 7: 27). A efectos de inducir la incapacidad de respuesta de las células T, la composición es preferiblemente administrada en forma no inmunogénica, y p. ej. en una forma que no contenga
adyuvante.

El compuesto activo puede ser también administrado parenteralmente o intraperitonealmente. Las dispersiones pueden ser también preparadas en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un preservativo para impedir el desarrollo de microorganismos.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones (cuando sean solubles en agua) o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida necesaria para que la composición pueda ser fácilmente inyectada con una jeringa. La composición debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe ser preservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), adecuadas mezclas de los mismos y aceites vegetales. La correcta fluidez puede ser mantenida, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del requerido tamaño de partículas en el caso de la dispersión, y mediante la utilización de agentes superficiactivos. La evitación de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, como por ejemplo parahidroxibenzoatos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos será preferible incluir en la composición agentes isotónicos como por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada a base de incluir en la composición un agente que retrase la absorción, como por ejemplo monoestearato de aluminio y
gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas a base de incorporar el agente activo (es decir, un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno de los ingredientes o con una combinación de los ingredientes anteriormente enumerados, según se requiera, efectuando a continuación esterilización con filtración. Generalmente, las dispersiones son preparadas a base de incorporar el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos seleccionados de entre los anteriormente enumerados. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el vacuosecado y la liofilización, que da un polvo del ingrediente activo (es decir, al menos un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII) más cualquier deseado ingrediente adicional a partir de una solución previamente filtrada en condiciones
estériles.

Cuando el péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII está adecuadamente protegido, como se ha descrito anteriormente, el péptido puede ser administrado oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El péptido y los demás ingredientes pueden ser también encapsulados en una cápsula de gelatina de vaina dura o blanda, pueden ser comprimidos formándose con los mismos tabletas, o bien pueden ser incorporados directamente a la dieta del individuo. Para administración terapéutica oral, el compuesto activo puede ser mezclado con excipientes y utilizado en forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y formas similares. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede naturalmente ser variado, y puede estar convenientemente situado entre aproximadamente un 5 y aproximadamente un 80% del peso de la unidad. La cantidad de componente activo en tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una adecuada dosificación.

En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos los y cualesquiera disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y materiales similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla la utilización de los mismos en las composiciones terapéuticas. Pueden ser también incorporados a las composiciones compuestos activos
suplementarios.

Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidades de dosificación para una fácil administración y para lograr una uniformidad de dosificación. En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "en forma de unidades de dosificación" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos a tratar, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el deseado efecto terapéutico en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas de las unidades de dosificación de la invención vienen determinadas por y son directamente dependientes de (a) las características singulares del compuesto activo y el concreto efecto terapéutico a lograr, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de combinar tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los sujetos.

La presente invención aporta también una composición que comprende al menos dos péptidos que tienen la actividad antigénica del Der f VII (p. ej. una mezcla física de al menos dos péptidos) y que tienen cada uno actividad de estimulación de las células T. Por ejemplo, se pueden combinar al menos dos péptidos que tienen cada uno una actividad antígena de Der f VII. Como alternativa, puede ser administrado a un sujeto alérgico un péptido que tenga al menos dos regiones que tengan cada una actividad de estimulación de las células T (es decir, un péptido en el que cada una de tales regiones comprenda al menos un epítope para células T). Tal péptido puede tener al menos dos regiones derivadas del mismo alergeno Der f VII. Puede administrarse a un sujeto una composición de dos péptidos o un péptido que tenga al menos dos regiones, en forma de una composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable según se ha descrito anteriormente. Puede ser administrada simultáneamente o secuencialmente a un sujeto sensible a un alergeno de los ácaros del polvo para tratar tal sensibilidad una cantidad de una o varias de tales composiciones. Tales composiciones pueden ser útiles para la fabricación de un medicamento para tratar la sensibilidad a los ácaros del polvo doméstico en un individuo.

El cDNA (o el RNAm que sirvió de molde durante la transcripción inversa) que codifica un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII puede ser utilizado para identificar similares secuencias de ácidos nucleicos en cualquier variedad o tipo de animal, y por consiguiente para clonar molecularmente genes que tengan homología secuencial suficiente como para hibridarse con el cDNA que codifica un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII. Por consiguiente, la presente invención incluye no solamente péptidos que tienen la actividad antigénica del Der f VII, sino también otras proteínas que pueden ser alergenos codificados por DNA que se hibride con DNA de la presente invención.

Están dentro del alcance de la invención los péptidos aislados que están inmunológicamente emparentados con el Der f VII tal como por interreactividad con los anticuerpos o por interreactividad con las células T, y que son distintos de los ya identificados. Tales péptidos fijan los anticuerpos específicos para la proteína y los péptidos de la invención, o estimulan las células T específicas para la proteína y los péptidos de esta invención.

Un péptido que tenga la actividad antigénica del Der f VII (es decir, de Der f VII producido por recombinación o por síntesis química) está exento de todas las otras proteínas de los ácaros del polvo, y es por consiguiente útil en la estandarización de extractos de alergeno que son reactivos clave para la diagnosis y el tratamiento de la hipersensibilidad a los ácaros del polvo. Además, tal péptido es de una coherente y bien definida composición y actividad biológica para ser utilizado en preparaciones que puedan ser administradas a efectos terapéuticos (p. ej. para modificar la respuesta alérgica e un sujeto sensible a los ácaros del polvo). Tales péptidos pueden ser también utilizados para estudiar el mecanismo de inmunoterapia de la alergia al Dermatophagoides farinae y para diseñar derivados o análogos modificados útiles en inmunoterapia.

Los trabajos realizados por terceros han puesto de manifiesto que generalmente los mejores resultados durante la inmunoterapia (es decir, el mejor alivio de los síntomas) se obtienen con altas dosis de extractos de alergenos. Sin embargo, muchos sujetos son incapaces de tolerar grandes dosis de tales extractos debido a las reacciones sistémicas provocadas por los alergenos y los otros componentes que están en estas preparaciones. Un péptido que tiene la actividad antigénica del Der f VII según la invención tiene la ventaja de estar exento de todas las demás proteínas de los ácaros del polvo, y por consiguiente es más inocuo y más adecuado para las aplicaciones
terapéuticas.

Es ahora también posible diseñar un agente o una droga capaz de bloquear o inhibir la capacidad de un alergeno de los ácaros del polvo para inducir una reacción alérgica en sujetos sensibles. Tales agentes podrían ser diseñados, por ejemplo, de forma tal que se fijasen a las correspondientes moléculas anti-Der f VII, impidiendo así la fijación del alergeno y la IgE y la subsiguiente desgranulación de los mastocitos/basófilos. Como alternativa, tales agentes podrían fijarse a componentes celulares del sistema inmune, redundando en una supresión o desensibilización de las respuestas alérgicas a los alergenos de los ácaros del polvo. Un ejemplo no limitativo de esto es el consistente en la utilización de péptidos que incluyen epítopes de Der f VII para células B o T, o modificaciones de los mismos, basados en la estructura proteínica del cDNA de Der f VII para suprimir la respuesta alérgica a un alergeno de los ácaros del polvo. Esto podría hacerse a base de definir las estructuras de los fragmentos que codifiquen los epítopes para células B y T que afecten el funcionamiento de las células B y T en los estudios in vitro con componentes sanguíneos de sujetos sensibles a los ácaros el polvo.

Se ilustra adicionalmente la invención mediante los ejemplos siguientes, que no deberán ser interpretados como ejemplos que limiten adicionalmente la presente invención. Los contenidos de todas las referencias y solicitudes de patentes publicadas que se citan dentro de toda esta solicitud quedan incorporados a la presente por refe-
rencia.

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Ejemplo 1 Aislamiento del clon de cDNA que codifica Der f VII a partir de una biblioteca de cDNA de \lambdagt11

Se preparó una biblioteca de cDNA de \lambdagt11 a partir de Dermatophagoides farinae adultos vivos adquiridos a la Fa. Commonwealth Serum Laboratories, Parkville, Australia (Thomas, W., et al., Int Arch Allergy Appl Immunol (1988) 85: 127-9). La biblioteca fue preparada según Trudinger et al., (1991) Chem. Exp. Allergy, 21:33-37.

Se utilizó la amplificación de la PCR y la secuenciación del DNA para aislar cDNA de Der f VII a partir de la biblioteca de \lambdagt11. Se realizó un cebador oligonucleotídico (Df1 en la tabla 1) basado en la secuencia N-terminal de Der p VII prevista. Dicho cebador tenía la secuencia GCGAATTCGATCCAATTCACTATGAT-3' (ID SEC Nº: 8). El primer GCGAATTC codifica un sitio EcoRI (GAATTC) y la secuencia GAT codifica los primeros seis residuos de Der p VII. Para el otro cebador se utilizó el cebador directo de \lambdagt11 GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG-3' (ID SEC Nº: 9) (Df2 en la tabla 1) al lado del sitio EcoRI de clonación (New England Biolabs, Beverly, Estados
Unidos).

Las reacciones PCR se efectuaron en un volumen de reacción final de 50 \mul que contiene 20 mM de Tris-HCl a pH 8,2, 10 mM de KCl, 6 mM de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 mM de MgCl_{2}, 0,1% de Triton X-100, 10 ng\mu de BSA libre de nucleasa, 10 mM de dNTPs, 20 pmol de cada cebador y 2,5 unidades de Pfu DNA polimerasa. Esto se obtuvo como conjunto de Stratagene (La Jolla, California, Estados Unidos). Se añadió DNA objetivo (enlaces de cDNA de \lambdagt11 D. farinae, 0,001 \mug) y se mezcló el contenido del tubo y se cubrió con aceite de parafina. Los tubos se desnaturalizaron inicialmente a 95ºC durante 5 minutos, a continuación se templaron a 55ºC durante 2 minutos y se ampliaron a 72ºC durante 2 minutos. Después de esto, se realizó la desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, el enfriamiento a 55ºC durante 1 minuto y la ampliación como antes, a lo largo de 48 ciclos. En el ciclo final (el número 50), la reacción de ampliación aumentó a 10 minutos para asegurar que todos los productos amplificados estaban en su máxima
longitud.

A continuación se buscaron bandas amplificadas por 10 microlitros de la reacción, en un gel de agarosa al 1%. El sobrante de la mezcla reactiva era etanol precipitado antes de la purificación del producto amplificado en un gel de agarosa de bajo punto de fusión (Bio-Rad., Richmond, Estados Unidos).

El producto de PCR purificado se digirió con EcoRI y se ligó al vector mp18 de M13 (ver Messing, supra), se digirió con EcoRI y a continuación se transfirió a células competentes de E. coli de la cepa TG1. Se tomaron placas blancas aisladas y se usaron para preparar almacenes de fago y DNA monocatenario para su secuenciación.

Ejemplo 2 Análisis de la secuencia de DNA del cDNA de Der f VII

La secuenciación del DNA se llevó a cabo mediante el método dideoxinucleótido de terminación de cadena, utilizando la versión 2.0 de Sequenase (USB Corp., Cleveland, Estados Unidos) de acuerdo con el protocolo del suministrador. Entre los cebadores utilizados para la secuenciación cabe citar el cebador M13 de secuenciación (-40) a 17-mer GTTTTCCCAGTCACGAC-3' (ID SEC Nº 10) (Df3 en la Tabla 1), el cebador Df1 (ID SEC Nº 8) utilizado para la reacción PCR descrita en el ejemplo 1 y otros dos cebadores oligonucleótidos, Df4 y Df5, ambos mostrados en la Tabla 1. El cebador Df4 GGTGAATTAGCCATGCG-3' (ID SEC Nº 11) se utilizó previamente para la secuenciación de Der p VII y el cebador Df5 TCAATCTTGGATCCAATTTTTGGC-3' (ID SEC Nº 12) se basó en las secuencias de Der f VII de los nucleótidos 559-582.

Para aislar un cDNA que contiene la región no traducida del lado 5' de Der f VII, se produjo un cebador oligonucleótido basado en la secuencia terminal C de Der f VII. Dicho cebador (Df6 en la Tabla 1) tenía la secuencia GGAATTCTTAATTTTTTTCCAATTCACG-3' (ID SEC Nº 13). La primera GGAATTC codifica un sitio EcoRI. Dicha secuencia y la siguiente (TTA...) son complementarias a las secuencias inversas del codón de parada y los últimos seis residuos de Der f VII. Para el otro cebador se utilizó el cebador inverso de \lambdagt11 TTGACACCAGACCAACTGG
TAATG-3' (ID SEC Nº 14) (Df7 en la Tabla 1), al lado del sitio EcoRI de clonación.

Las reacciones PCR se efectuaron de acuerdo con las condiciones descritas en el ejemplo 1. El producto PCR se purificó en un gel de agarosa de bajo punto de fusión, se digirió con EcoRI y se ligó a pUC 19 digerido con EcoRI, y a continuación se transfirió a células competentes de E. coli de la cepa TG1. Se aisló el DNA plasmídico del E. coli transformante y se usó para su secuenciación.

La secuenciación del DNA se llevó a cabo mediante el mismo método dideoxinucleótido de terminación de cadena, utilizando la versión 2.0 de Sequenase, descrita anteriormente. Sin embargo, antes de la secuenciación, se desnaturalizaron los moldes de DNA plasmídico de cadena doble, mediante el tratamiento con NaOH, y se neutralizaron mediante la adición de acetato sódico y de etanol precipitado de acuerdo con el protocolo del suministrador. Para obtener la región no traducida del lado 5' de cDNA de Der f VII se utilizó el cebador Df8 (ver Tabla 1). Dicho cebador tenía la secuencia ATGACGTTCGAATTTATC-3' (ID SEC Nº 15), que corresponde a la secuencia inversa de Der f VII del nucleótido nº 225-208.

TABLA 1 Oligonucleótidos utilizados para la amplificación y secuenciación por PCR

Nombre	Secuencia	Derivado de las posiciones
		de nucleótido de Der f VII
Df1	GCGAATTCGATCCAATTCACTATGAT-3'	94-111
Df2	GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG-3'	cebador directo \lambdagt11
Df3	GTTTTCCCAGTCACGAC-3'	cebador de secuenciación M13
		(-40)
Df4	GGTGAATTAGACATGCG-3'	247-263
Df5	TCAATCTTGGATCCAATTTTTGGC-3'	559-582
Df6	CGAATTCTTAATTTTTTTCCAATTCACG-3'	684-664
Df7	TTGACACCAGACCAACTGGTAATG-3'	cebador directo \lambdagt11
Df8	ATGACGTTCGAATTTATC-3'	225-208

Equivalentes

Los expertos en la materia podrán reconocer o distinguir, usando únicamente la experimentación rutinaria, numerosos equivalentes a los ejemplos de realización específicos que se han descrito en el presente documento. Se considera que dichos equivalentes están dentro del alcance de la presente invención y cubiertos por las reivindicaciones adjuntas.

(1) Información general:

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(i)

Solicitante

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(A)

Nombre: Western Australian Research Institute for Child Health

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(B)

Calle GPO Box D184

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(C)

Ciudad: Perth

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(D)

Estado: MA

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(E)

País: Australia occidental

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(F)

Código postal (ZIP): 6001

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(ii)

Título de la invención:

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Proteina y péptidos alergénicos de los ácaros del polvo doméstico y aplicaciones para los mismos

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(iii)

Número de secuencias: 15

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(iv)

Dirección postal:

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(A)

Destinatario: Lahive & Cockfield

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(B)

Dirección: 60 State Street

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(C)

Localidad: Boston

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(D)

Estado: MA

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(E)

País: Estados Unidos

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(F)

Código postal (ZIP): 02109

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(v)

Forma de lectura informática:

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(A)

Tipo de soporte: disquete

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(B)

Ordenador: compatible IBM PC

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(C)

Sistema operativo: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

Programa : PatentIn edición n° 1.0, versión n° 1.25

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(vi)

Datos sobre la solicitud actual:

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(A)

Número de solicitud:

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(B)

Fecha de solicitud:

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(C)

Clasificación:

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(vii)

Datos sobre las solicitudes anteriores:

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(A)

Número de solicitud: USSN 08/031 141

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(B)

Fecha de solicitud: 12 Marzo 1993

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(C)

Número de solicitud: USSN 08/081 540

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(D)

Fecha de solicitud: 22 Junio 1993

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(viii)

Información sobre el agente:

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(A)

Nombre: Amy E. Mandragouras

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(B)

Número de registro: 36,207

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(C)

Número de referencia: 053.2 PCT (IMI-032CPPC)

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(ix)

Información de contacto:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Teléfono: 617-227-7400

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Fax: 617-227-5941

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(2) Informaciones para la ID SEC Nº: 1:

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(i)

Características de la secuencia:

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(A)

Longitud: 812 pares de bases

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(B)

Tipo: ácido nucleico

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(C)

Número de hebras: una hebra

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(D)

Topología: lineal

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(ii)

Tipo de molécula: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Características:

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(A)

Nombre/clave: CDS

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(B)

Localización: 68..712

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(xi)

Descripción de la secuencia ID SEC Nº: 1:

1

2

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(2) Informaciones para la ID SEC Nº: 2:

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(i)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 215 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

Tipo de molécula: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia: ID SEC Nº: 2:

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Informaciones para la ID SEC Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Número de hebras: de una hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

Tipo de molécula: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia ID SEC Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCCAATTC ACTATGAT

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Informaciones para la ID SEC Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Número de hebras: de una hebra.

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

Tipo de molécula: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia: ID SEC Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGAATTAG ACATGCG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Informaciones para la ID SEC Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Número de hebras: de una hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

Tipo de molécula: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia: ID SEC Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAATTTTGG ATCCAATTTT CGCT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Informaciones para la ID SEC Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 761 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Número de hebras: una hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

Tipo de molécula: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Características:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/clave: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Localización: 43…681

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia ID SEC Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Informaciones para la ID SEC Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 213 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

Tipo de molécula: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia: ID SEC Nº: 7:

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Informaciones para la ID SEC Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Número de hebras: de una hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

Tipo de molécula: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia ID SEC Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGAATTCGATCCAATTCACTATGAT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Informaciones para la ID SEC Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Número de hebras: de una hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

Tipo de molécula: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia ID SEC Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Informaciones para la ID SEC Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Número de hebras: de una hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

Tipo de molécula: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia ID SEC Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTTCCCAGTCACGAC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Informaciones para la ID SEC Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Número de hebras: de una hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

Tipo de molécula: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia ID SEC Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGAATTAGACATGCG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Informaciones para la ID SEC Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Número de hebras: de una hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

Tipo de molécula: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia ID SEC Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAATCTTGGATCCAATTTTTGGC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Informaciones para la ID SEC Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Número de hebras: de una hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

Tipo de molécula: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia ID SEC Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAATTCTTAATTTTTTTCCAATTCACG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Informaciones para la ID SEC Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Número de hebras: de una hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

Tipo de molécula: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia ID SEC Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGACACCAGACCAACTGGTAATG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Informaciones para la ID SEC Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Número de hebras: de una hebra

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

Tipo de molécula: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de la secuencia ID SEC Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGACGTTCGAATTTATC

\hfill

18

Claims (17)

1. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un alergeno proteínico Der f VII que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 7 o la porción madura de dicho alergeno.

2. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un alergeno proteínico Der f VII que comprende una porción de la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 7, en el que dicha porción no experimenta una reacción cruzada con el alergeno proteínico Der p VII.

3. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1 ó 2, que comprende la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº: 6.

4. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 3, que comprende la región codificadora de la secuencia de nucleótidos de la ID SEC Nº: 6.

5. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1 ó 2, en el que el alergeno proteínico comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 7.

6. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1 ó 2, en el que el péptido tiene una longitud de al menos 10-20 aminoácidos.

7. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1 ó 2, en el que el péptido tiene una longitud de al menos 10-16 aminoácidos.

8. Vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Célula huésped transfectada con el vector de expresión recombinante de la reivindicación 8.

10. Método para producir un alergeno proteínico Der f VII o un péptido que comprende al menos un epítope para células T del mismo, comprendiendo dicho método los pasos de cultivar la célula huésped de la reivindicación 8 en medio para expresar el alergeno o péptido proteínico, y aislar del cultivo el alergeno o péptido proteínico.

11. Alergeno proteínico de Der f VII del Grupo VIII aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 7, o la porción madura del mismo.

12. Alergeno proteínico de Der f VII del Grupo VIII aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº: 7, en el que dicha porción no experimenta una reacción cruzada con el alergeno proteínico Der p VII.

13. Alergeno o péptido proteínico según la reivindicación 11 ó 12, producido por expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica el alergeno o péptido proteínico.

14. Alergeno o péptido proteínico según la reivindicación 11 ó 12, producido por síntesis química.

15. Alergeno o péptido proteínico según la reivindicación 11 ó 12, que es de una longitud de al menos 10-20 aminoácidos.

16. Preparación en sustancia pura de un alergeno o péptido proteínico según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15.

17. Alergeno o péptido proteínico según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 para el tratamiento o la diagnosis de la sensibilidad de un individuo a los ácaros del polvo.