PT100640A

PT100640A - Variantes da hirudina ou seus sais, metodo para a sua producao e anticoagulantes tendo os referidos compostos como ingredientes activos

Info

Publication number: PT100640A
Application number: PT10064092A
Authority: PT
Inventors: Satoru Misawa; Ryo Muramatsu; Akiko Sukesada; Eriko Nukui; Koichi Wada; Masaharu Nakano; Tadanori Morikawa; Kyoichi Kobashi
Original assignee: Nippon Mining Co
Priority date: 1992-03-04
Filing date: 1992-06-29
Publication date: 1993-10-29

Description

V. 3

Campo técnico 0 presente invento está relacionado com variantes de hirudina ou seus sais, método para a sua produção* e-, anti-coagu-lantes tendo os referidos compostos como ingredientes activos. As variantes de hirudina ou seus sais no prsesente invento são úteis como drogas para terapia farmacológica de trombose aguda de veias profundas, tromboembolísmo pulmonar, embolismo arterial agudo dos membros, enfarte do miocãrdio e coagulação intravascular durante a infecção.

Trabalhos anteriores A hirudina natural é uma mistura de peptídeos compostos por 65 ou 66 aminoácidos e é secretada pelas glândulas salivares da sanguessuga medicinalem quantidades muito pequenas. Uma variante designada HV-1 é a primeira hirudina isolada a partir de sanguessuga. Uma variante designada HV-2 difere da referida HV-1 em 9 aminoácidos e HV-3 é idêntica a HV-2 até à serina 32 e difere em 10 aminoácidos incluindo uma alanina adicional na posição 63 no extremo c.

Ainda, a existência de . tirosina na qual o resíduo hidroxilo fenólico está sulfatado como se mostra na fórmula seguinte NH-

HO—S02—O \ /

CH2—CH

CO ou -[Tir(S03H)]- foi confirmada.

Descreveu-se que a actividade anti-trombina aumenta cerca de 10 vezes pela existência de sulfato no resíduo de tirosina.

Até agora tem sido muito díficil produzir polipeptídeos tendo tirosina sulfatada na molécula. Quando é considerada a introdução química do grupo sulfato no resíduo de tirosina do polipetídeo obtido por métodos tais como tecnologia de DNA recombinante, na qual a sequência de aminoácidos é longa, é muito díficil sulfatar a tirosina alvo selectivamente sem ter qualquer influência noutros aminoácidos. Também é necessário condições drásticas de reacção que muitas vezes causam destruição de ligações petídicas e é díficil obter o composto sulfatado com um rendimento satisfatório. Por este motivo, as hirudinas em desen-volvimentono presentemente como anticoagulantes não são sulfatadas e têm actividades baixas.

Se bem que a aplicação terapêutica de hirudina como anticoagulante se pense ser eficaz, sendo um composto estranho são bem possíveis sintomas alérgicos tais como choque e equizema. No entanto, pensa-se que seja possível reduzir a resposta alérgica diminuindo a dose administrada ou encurtando a sequência de aminoácidos do polipeptídeo. 0 objectivo do presente invento é proporcionar variantes de hirudina com uma actividade anti-trombina mais elevada por sulfatação do grupo hidroxilo do resíduo tirosina na molécula.

Divulqacao do invento 0 presente invento está relacionado com variantes de hirudina ou seus sais tendo a sequência de aminoácidos que se segue na fórmula (I) como uma parte da sua sequência ou como sequência total.

Fen - Glu - A - Ile - Pro - B - Tir(R) - Tir(R) (I) [Na fórmula, A significa Glu ou Pro, B significa Glu, Tir(R),

Glu-Asp ou Glu-Tir(R) e (R) indica o grupo hidroxilo ou o éster sulfatado (-0-S03H) do resíduo tirosina.]

Ainda, o presente invento está relacionado com o método de produção das variantes de hirudina ou seus sais caracterizados pela sulfatação do grupo hidroxilo do resíduo tirosina na sequência de aminoácidos das variantes de hirudina ou seus sais tendo a fórmula que se segue (II) como parte ou totalidade da sequência de aminoácidos.

Fen - Glu - A - Ile - Pro - B - Tir - Tir (II) [Na fórmula, A significa Glu ou Pro, B significa Glu, Tir, Glu-Asp ou Glu-Tir, respectivamente.] A sulfatação no presente invento pode ser realizada reagindo variantes de hirudina ou seus sais com aril-sulfotrans-ferase na presença de dadores de grupo sulfato, com o complexo tróxido de enxofre ou com ácido sulfúrico e cdiciclo-hexilcarbo-diimida.

Um dos pontos importantes do presente invento é que o reconhecimento da hirudina natural como substrato por 6

aril-sulfotransferase foi melhorado substituindo 1 ou 2 aminoáci-dos adjacentes ao resíduo de tirosina no extremo C por tirosina. Com os polipeptídeos usados no presente invento, os presentes inventores confirmaram que a reacção de sulfatação por aril-sul-fotransferase dificilmente terá efeito sem o referido tratamento.

Um outro ponto importante do presente invento é que se um peptídeo possuir uma sequência de 8 aminoácidos começando no aminoácido 56 do extremo N para o extremo C da hirudina natural ou se for composto apenas pela sequência referida atrás de 8 aminoácidos ou se ambos os extremos dele estiverem substituídos pelo grupo protector como seja o grupo succinilo ou grupo amina, deve mostrar uma elevada actividade anti-trombina desde que esteja sulfatado. Particularmente, um composto tendo apenas 8 aminoácidos de acordo com a fórmula (I), tendo o extremo N protegido pelo grupo succinilo e os dois grupos hidroxilo dos dois resíduos de tirosina sulfatados, foi confirmado como tendo uma actividade anti-trombina extremamente elevada.

As variantes de hirudina no presente invento são os peptídeos tendo a sequência de aminoácidos referi atrás e tendo actividade anti-trombina elevada. 0 extremo C dos compostos no presente invento são -Tir(R), -Tir(R)-Leu ou -Tir(R)-Asp atrás referidos. Ainda, -Tir(R), -Tir(R)-Leu ou -Tir(R)-Asp referidos atrás podem ter ligados os substituintes que se seguem.

Amida, amida de alquilo inferior (C1-C5), [e.g. -NHCH3--NHC2H5], aminoácidos [e.g. aminoávcidos naturais, D-Glu, ácido α-amino adípico, ácido α-amino subérico (Asu)], éster de alquilo inferior (C1-C5) de aminoácidos [e.g. Glu-OC2H5, Glu(OC2H5)OC2H5, Asu (OMe)-OMe], amida de aminoácido [e.g. Glu-NH2, -Gln-NH2, 7

Asu(NH2)NH2], amida de alquilo inferior (C1-C5) de aminoácidos [e.g. G1U-NHC2H5, -Gln-NHC2H5] ácidos aminossulfónicos [e.g. -NH-CH2-S03H, taulino (Tau), -NH-(CH2)3-S03H], amida de aminossulf ona [e.g. -NH-CH2-S02NH2, Tau-NH2] amino-alcoól [e.g. -NH(CH2)2-OH, -NH(CH2)3-OH, Leu-ol], ácido aminossulfónico [e.g. -NHPO(OH)3], éster de ácido aminossulfónico [e.g. -NHPO(OC2H5) 3, -NHP0(0Ph)2] ou amida de aminossulfona [e.g. -NHPO-(NH2)2].

Como grupos protectores do grupo amina terminal podem ser usados os grupos acilo que se seguem.

Alcanoílo [e.g.acetilo (CH3CO-), butirilo (CH3CH2CH2CO-), isobutirilo ((CH3)2CHC0-)], alcanoílo substituído [e.g. lactinilo (CH3CH(OH)CO-)], carboxi-alcanoilo [e.g. succini-lo (HOOCCH2CH2CO-), glutarilo (HOOC(CH2)3CO-)], carboxi-alca-noílo substituído [e.g. malicilo (HOOCCH(OH)CH2CO-)], alcoxicar-bonilo alcanoílo [e.g. etoxicarbonilopropionilo (EtOOCCH2CH2CO-)], carbamoilalcanoílo [e.g. carbamoilpropionilo (H2NOCCH2CH2CO- )], alcenilo [e.g. acrilo (CH2=CHCO~), oleinilo (CH3(CH2)7 CH=CH(CH2)7 C0-)], carboxi-alcenilo [e.g. maleinilo, fumarilo (HOOCCH=CHCO-)], alcoxicarbonil-alcenilo [e.g. etoxicar-bonilacrilo (EtOOCCH=CHCO-)] ou carbamoilacenilo [e.g. carbamoil-acrilo (H2N0CCH=CHC0-)].

As variantes de hirudina do presente invento formam sais com ácidos ou bases etc.

Os sais no presente invento podem ser os seguintes: sal do ácido clorídrico, sla sulfato, sal do ácido p-toluenossulfónico, sal do ácido fosfórico, sal do ácido fórmico, sal do ácido malónico, sal do ácido succinico, sal do ácido lático, sal do ácido oxálico, sal do ácido tartárico, sal do ácido acético, sal do ácido trifluoroacético, sal sódico, sal de potássio, sal de 8 8

magnésio, sal de bário, sal de cálcio, sal de amónio, sal de piperidina, sal morfolínico, sal de dimetilamina, sal de dietil-amina, etc.

Os polipeptídeos incluindo a sequência de aminoácidos mostrada na fórmula (II) referida atrás podem ser facilmente produzidos por vários métodos conhecidos. Tais métodos incluem métodos de síntese química como seja o método em fase sólida e o método em fase líquida, método de DNA recombinante ecombinação destes métodos. 0 método de sulfatação usando arilsulfotransferase no presente invento tem a vantagem de poder sulfatar resíduos de tirosina especificamente em polipeptídeos de sequência de aminoã-cidos longa em condições suaves de forma a não afectar outros aminoácidos. Não existe qualquer limitação particular à enzima usada para a sulfatação desde que tenha actividade de aril-sulfo-transferase, por exemplo a derivada de enterobactérias humanas (Eubacterium A-44).

Os exemplos preferidos de dadores de grupos sulfato são sulfatos de arilo ou seus sais, por exemplo, ácido fenilsulfúrico, ácido p- ou m- acetilfenilsulfúrico, ácido tiramino-sulfúrico, ácido p-nitrocatecholsulfúrico, p-nitrocatechol-di-sulfúrico, picossulfato, ácido fenolftaleínadissulfúrico, ácido 4-metil-umberiferrilsulfúrico, ácido 1- ou 2-naftilsulfúrico, ácido 4-nitro-l-naftilsulfúrico, ácido 4-fenantorilsulfúrico ou seus sais de metais alcalinos. A temperatura e pH ad reacção devem ser optimizados dependendo da natureza do polipeptídeo e da arilsulfotransferase, no entanto, os presentes inventores encontraram as condições preferidas à temperatura de 25-37°C e pH de 8-9. 9

Quando a reacção está terminada, o composto sulfatado pode ser facilmente separado e colhido dos marteriais que não reagiram pelo método de cromatografia líquida de alta resolução em condições adequadas. Os materiais recuperados que não reagiram não deverão ser rejeitados e podem ser reutilizados para sulfata-ção de polipeptídeos adicionando-os novamente ao sistema de reacção.

Por outro lado, as cadeias polipeptídicas de aminoáci-dos relativamente curtos incluindo a sequência de aminoácidos mostrada na fórmula (I) atrás são geralmente sintetizados quimicamente pelo método de fase sólida ou de fase líquida. 0 grupo hidroxilo do resíduo de tirosina destes peptídeos pode ser sulfatado pelo método químico usando reagentes de sulfatação. A sulfatação pode ser realizada tratando o polipeptídeo atrás referido à temperatura ambiente, na presença de solventes, tais como piridinaou dimetilformamida, com um excesso de 10 - 500 equivalentes do complexo trióxido de enxofre, como seja trióxido de piridino-enxofre, trióxido de de dioxana-enxofre, trióxido de trimetilamina-enxofre, trióxido de tietilamina-enxofre, trióxido de dimetilaninlina-enxofre, trióxido de tioxana-enxofre, trióxido de bis (2-cloroetil)éter-enxofre, trióxido de 2-metilpiridina-en-xofre, trióxido de quinolina-enxofre, trióxido de dimetilformami-da-enxofre. Como método alternativo, a sulfatação pode ser feita pelo método de condensação por tratamento de excesso de ácido sulfúrico e de dicloro-hexilcarbodiimida com a cadeia polipeptí-dica atrás referida à temperatura ambiente.

Quando os compostos obtidos no presente invento são usados como fármacos, por exemplo, eles podem ser administrados oralmente ou subcutaneamente, intravenosamente, intramuscularmente, intra-arterialmente por injecção ou não oralmente como seja na mucosa. A dose de 0,1 - 1000 mg para um adulto por dia deverá 10 10

ser adequada. A quantidade total deverá ser administrada em 1 a várias vezes. No entanto, naturalmente, a quantidade pode ser adequadamente aumentada ou diminuída quando necessário. Para administração oral, podem ser usados na forma de comprimidos, cápsulas ou grânulos, os quais são preparados usando aditivos farmaceuticamente aceitáveis, diluentes, veículos, excipientes, etc. Para administração não oral os compostos podem ser preparados numa formulação injectável de solução ou suspensão, usando solução esterilizada de água ou óleos, detergentes, outros aditivos farmaceuticamente aceitáveis, diluentes ou veículos farmacologicamente aceitáveis, etc. De forma semelhante usando aditivos, diluentes, veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, etc., os compostos pode ser preparados em supositórios ou numa formulação que permita a absorção através da pele ou mucosa.

Breve Descricão das Figuras

Fig.l Mostra a relação de recuperação do aminoácido sintetizado no exemplo 1 e os seus derivados de feniltio-hidantoina(PTH).

Fig.2 Mostra o perfil do cromatograma por análise de HPLC de cada um dos peptídeos sintetizados no exemplo 1.

Fig.3 Mostra o perfil do cromatograma de análise por HPLC do composto sulfatado descrito no exemplo 2.

Fig.4 Mostra o perfil do cromatograma de aminoácidos do peptídeo (A) sulfatado descrito no exemplo 2 digerido com carboxipeptidase Y.

Fig.5 Mostra o método de construção do vector de expressão da hirudina HV-17 descrito no exemplo 3.

Fig.6 Mostra o perfil do cromatograma de análise por HPLC da hirudina sulfatada HV-17 descrita no exemplo 3.

Na figura, A e B significam peptídeo (A) e peptídeo (B), respectivamente.

Realização mais adequada do invento

Exemplo 1

Produção de (A) Gli - Asp - Fen - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Tir - Tir - Leu - Gin e de (B) Gli - Asp - Fen - Glu -Glu - Ile - Pro - Tir - Tir - Tir - Leu - Gin

Os peptídeos (A) e (B) atrás referidos foram sintetizados. num sintetizador de peptídeos em fase sólida 430A da Applied Biosystems. Após desprotecção do grupo Boc do materialde partida resina Boc-Gln-0CH2-PAM (0,.5 mM) por trifluoroacetato, a elonga-ção da cadeia peptídica foi feita por condensação de aminoácidos por ordem a partir do extremo C pelo método do anidrido simétrico. Assim, foram obtidos os peptídeos que se seguem (A7) e (B'), como se mostra na fórmula seguinte, ligados à resina com grupos protectores. (A') Gli-Asp (OBzl)-Fen-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile-Pro-Glu(OBzl)- -Tir(Br-Z) -Tir(Br-Z)-Leu-Gln-0CH2-resina (Β') Gli-Asp(OBzl)-Fen-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile-Pro-Glu(OBzl)- -Tir(Br-Z) -Tir(Br-Z)-Leu-Gln-OCH2-resina 0,75g de ambas as resinas tendo o peptídeo ligado protegido foram tratadas com 17 ml de anidrido de fluoreto de hidrogénio na presença de 1,9 ml de anisole a 0°C durante 1 hora até desprotecção completa de todos os grupos de protecção. Após desprotecção, retirou-se o fluoreto de hidrogénio por vaporização, seguido de lavagem do resíduo com éter dietílico e secagem com azoto. Após dissolução em 100 ml de ácido acético IN e remoção da resina por filtração, eles foram aplicados numa coluna de permuta aniónica (DOWEX 1-X2) seguido de eluição dos peptídeos por ácido acético. Em seguida, eles foram purificados por croma-tografia líquida de alta resolução (HPLC) nas condições que se seguem.

Equipamento: Coluna: Tampão de corrida: Gradiente: Fluxo: Detecção:

Waters Delta Prep 3000 Prepack C18, 300 A A. 0,05% de trifluoroacetato/ãgua B. acetonitrilo B. 0-100% / 100 min. 80 ml/min. 214 nm 0 tempo de eluição do peptídeo (A) foi de 32 min e do peptídeo (B) foi de 31 min. Em seguida, após remoção do acetonitrilo no processo de concentração, foi feita liofilização. Aqui, o que se segue é o resultado da análise de aminoácidos de (A) e de (B) respectivamente, quando estes peptídeos foram hidrolizados em ácido clorídrico 6N a 110°C durante 24 horas. 13

aminoácido (A) (B) | Asx 1,03(1) 1,01(1) | Glx 4,37(4) 3,24(3) | Gli 1,00(1) 1,00(1) | Ile 1,00(1) 0,99(1) | Leu 1,06(1) 1,05(1) | Tir 2,07(2) 3,09 (3) | Fen 1,03(1) 1,02(1) | Pro ! 1,02(1) 1,01(1)

Os números entre parêntesis mostram o valor teórico. A sequência dos peptídeos atrás referidos (A) e (B) foram confirmadas com um sequenciador de fase gasosa (produto da Applied Biosystems 477 A). A relação do aminoácido identificado e recuperação do derivado de feniltio-hidantoína (PTH) está apresentado na Fig.l. A pureza dos peptídeos (A) e (B) atrás referidos foram ambos.cerca de 99% quando analisado por HPLC [Waters, μ-Bondapak C18 (3,9 x 150 mm)]. 0 perfil do cromatograma de análise por HPLC de cada um dos peptídeos está apresentado na Fig.2.

Exemplo 2

Produção da forma sulfatada de (A) Gli-Asp-Fen-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-Gln e de (B) Gli-Asp-Fen-Glu-Glu-Ile-Pro-Tir-Tir-Tir-Leu-Gln -X Γ A sulfataçãos dos peptídeos (A) e (B) sintetizados no Exemplo 1 foi feita usando enzima de transferência de enxofre derivada de enterobactéria humana, aril-sulfotransferase, nas condições que se seguem. 0, lmM 1,0 mM lOU/ml 25 mM Tampão Tris-HCl 0,1M (pH 8,6) 37 °C 66-96 horas

Peptideo: p-nitrofenilsulfato:

Enzima transferidora e enxofre: Cloreto de magnésio:

Tampão de reacção:

Temperatura de reacção:

Duração da reacção: A separação e colheita dos compostos sulfatados foi feita por HPLC nas condições que se seguem.

Coluna: Waters μ-Bondapak C18 (3,9x150 mm)

Tampão de corrida: A. 0,1% trifluoroacetato / água B. acetonitrilo

Gradiente: B. 10-60% /50 min.

Fluxo: 1,5 ml/min.

Detecção: 230 nm

Nestas condições, o pepptídeo (A) eluiu aos 23,3 min e três tipos de peptideo (B) sulfatado eluiram aos 21,4 min, 23,4 min e 24,6 min, respectivamente Cada uma das fracções do composto sulfatado foi liofilizada após remoção de acetonitrilo no processo de concentração.

Os perfis do cromatograma de análise por HPLC década um dos peptídeos, sulfatado enzimaticamente nas condições atrás referidas estão apresentados na Fig. 3 (A) e (B) respectivamente. 15

Identificação do sítio sulfatado A identificação do sítio sulfatadodos peptídeos sulfatados atrás referidos (A) e (B) foi feita usando a aminopeptidase M, carboxipeptidase Y, quimotripsina e protease V8. (1) Identificação do sítio sulfatado do peptídeo (A)

a. Análise de aminoácidos após digestão com aminopeptidase M A 10 μΐ de substrato 1M, adicionou-se 5 μΐ (250 ng) de α-quimotripsina (Pproduto da Sigma, tratado com TLCK) com arrefecimento em gelo, seguido de 4 horas de digestão em tampão fosfato de sódio 0,1M (pH 7,0) à temperatura de 37°C. A esta mistura de reacção adicionou-se 5 μΐ de aminopeptidase M (produto Pierce, 5 mg/ml) a realizou-se mais 18 horas de hidrólise. O peptídeo sulfatado (A) foi confirmado como sendo um composto mono-sulfatado pelos valores da análise da composição em aminoácidos após a hidrólise.

b. Digestão por carboxipeptidase Y A 10 gl de substrato lmM, adicionou-se 1 mg/ml de carboxipetidase Y (produto Boehringer Mannheim) com arrefecimento em gelo, seguido de 30 min. de digestão em tampão de fosfato de sódio 0,1M (pH 7,0) à temperatura de 37°C. Após a digestão, a análise foi feita usando um analisador de aminoácidos (método ortoftalaldeído). Pelo cromatograma na Fig. 4, confirmou.-se que os aminoácidos Gin, Leu, Tir(S03H) foram libertados do sítio do extremo C do peptídeo (A) sem ter sido libertada Tir.

Dos resultados em a. e b. atrás, o peptídeo sulfatado (A) foi confirmado como sendo um composto mono-sulfatado do qual o sítio Tir do extremo C foi sulfatado. (2) Identificação do sítio sulfatado do peptídeo (B)

a. Análise de aminoácidos após digestão com aminopepti-dase M

Três tipos de peptídeo (B) sulfatado (picos 1-3 na Fig.3) foram hidrolisados usando aminopeptidase M como descrito em (l)-a. A partir dos valores da análise de aminoácidos após hidrólise, o pico 1 foi confirmado como sendo um composto dissul-fatado, os picos 2 e 3 foram confirmados como sendo compostos mono-sulfatados. b. Mapeamento de peptídeos por digestão com quimotripsi- na A 10 μΐ de substrato 1 mM, adicionou-se 5 μΐ (250 ng) de α-quimotripsina com arrefecimento em gelo, seguido de 24 horas de digestão em tampão de fosfato de sódio 0,1M (pH 7,0) à temperatura de 37°C. Esta mistura de reacção foi aplicada em HPLC de fase reversa tendo Nucleosil 5C18 (4 x 150 mm) como fase estacionária e os pontos de eluição dos peptídeos digeridos foram confirmados. Como resultado quando o substrato era o petídeo não sulfatado (B), dois fragmentos compostos 8 aminoácidos e 4 aminoácidos foram gerados por clivagem da ligação amida a seguir à Tir no extremo N. De forma semelhante, os três tipos de compostos sulfatados dos picos 1-3 foram tratados do mesmo modo e em todos os casos, o ponto de eluição do fragmento composto pelos 8 aminoácidos era idêntico ao do peptídeo não sulfatado. Este resultado mostra que nos três tipos de peptídeos sulfatados, tir do lado N-terminal não estava sulfatada. Assim, considerando este resultado e o resultado de a., o pico l foi confirmado como sendo um composto dissulfatado tendo 2 Tir no lado C-terminal sulfatadas . c. Digestão por protease V8 A 10 μΐ de substrato 1 mM, adicionou-se 5 μΐ (2,5 unidades) de protease V8 (produto da Sigma) com arrefecimento em gelo, seguido de 1 hora de digestão em tampão de fosfato de sódio 0,1M (pH 7,0) à temperatura de 37°C. Esta mistura de reacção foi aplicada em HPLC de fase reversa tendo Nucleosil 5C18 (4 x 150 mm) como fase estacionária e os pontos de eluição dos peptídeos digeridos foram confirmados. Como resultado, quando o substrato é o peptídeo (A) sulfatado, 2 fragmentos compostos por 8 aminoáci-dos e 4 aminoácidos foram gerados por clivagem da ligação amida entre Glu e Tirno lado N-terminal. Entre eles, o ponto de eluição do fragmento composoto por 4 aminoácidos ou seja Tir-Tir(S03H)--Leu-Gln, foi encontrado como sendo idêntico ao ponto de eluição do fragmento composto oelos 4 aminoácidos gerados por digestão do pico 3, o qual é um dos fragmentos gerados por ddigestão com quimiotripsina dos picos 1-3 em b. actima. Deste resultado, o pico 3 foi confirmado como sendo um composto monossulfatado tendo Tir sulfatada no lado C-terminal. e uma vez que o pico 2 tendo um ponto de eluição diferente foi observado como sendo um composto monossulfatado tal como o pico 3 de a. atrás, ele foi identificado como sendo -Tir-Tir(S03H)-Tir-.

Os resultados acima em (1) e (2) sobre identificação do sítio de sulfatação estão resumidos abaixo. 18

Estrutura

Gli-Asp-Fen-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir(S03H)-Leu-Gln I Composto Sulfatado |- |Peptídeo (A):

Peptídeo (B)

Exemplo 3 Produção de (C) Suc-Gli-Asp-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-Gln-OH. (D) Suc-Gli-Asp-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-Gln-NH2. (E) Suc-Gli-Asp-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Tir-Tir-Tir-Leu-Gln-OH. (F) Suc-Asp-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-Gln-OH. (G) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-Gln-OH e

(H) Suc-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-Gln-OH A resina Boc-Gln-0CH2-PAM (0,5mM) foi usada como material de partida para os peptídeos atrás referidos (C), (E),

(F) , (G) e (H) e a resina p-metil BHA (0,5 mM) para (D). A síntese foi realizada de acordo com o método descrito no Exemplo 1 e após a elongação da cadeia peptídica, a succinilização N-terminal foi feita com anidrido do ácido succínico para se obter peptídeos protegidos ligados à resina. Os peptídeos ligados 19

à resina foram desprotegidos e purificados de acordo com o método descrito no Exemplo 1 para dar os peptídeos atrás referidos (C), (D), (E), (F) , (G) e (H). Os peptídeos assim obtidos foram hidrolisados com acido clorídrico 6N a 110°C durante 24 horas seguido de análise de aminoácidos e o resultado na tabela que se segue mostra os peptídeos como sendo os peptídeos pretendidos. 1 |Aminoácido 1 1 (c) I (D) (E) (F) (G) -1 (H) | | Asx 1 |i,oi(i) 0,97(1) 1,01(1) 1,01(1) | Glx | 3,25(3) 2,70(3) 2,13(2) 3,06(3) 3,05(3) 3,06(3)| | Gli |1,00(1) 1,00(1) 1,00(1) | Ile Ii,oo(i) 0,92(1) 0,95(1) 0,97(1) 0,98(1) 0,98(1) | | Leu 11,05(1) 0,96(1) 1,01(1) 1,03(1) 1,04(1) 1,03(1) | [ Tir 12,07(2) 1,86(2) 2,91(3) 1,97(2) 1,98(2) 1,97(2)| | Fen | 1,02(1) 0,95(1) 0,98(1) 1,01(1) 1,00(1) | Pr o 1_ I1,71(2) J_ 1,75(2) 1,93 (2) 1,96(2) 1,95(2) 1,95(2)| _1

Os números entre parêntesis mostram o valor teórico Exemplo 4

Produção da forma sulfatada de (C) Suc-Gli-Asp-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-Gln-OH. (D) Suc-Gli-Asp-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-Gln-NH2. (E) Suc-Gli-Asp-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Tir-Tir-Tir-Leu-Gln-OH. (F) Suc-Asp-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-Gln-OH. (G) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-Gln-OH e

(H) Suc-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-Gln-OH 20 20

50 mg de cada um dos peptídeos (C) ,' (D), (F), (G) e (H) produzidos no Exemplo 3 foram dissolvidos em 4 ml de 20% piridina / dimetilformaldeído, seguido de sulfatação pela adição de l,05g (225 equivalentes) de piridina-sulfurtrióxido à temperatura ambiente (25°C) e 4 horas de reacção.

Por outro lado o peptídeo (E) foi sulfatado pelo método de condensação usando dicloro-hexilcarbodiimida (DCC). Ou seja, a 1 μιηοΐ deste peptídeo, adicionou-se 10 μΐ de dimetilformamida contendo 40 μιηοΐεε de ácido sulfúrico concentrado e a sulfatação foi feita à temperatura ambiente (25°C) durante 1 min. com agitação.

Os compostos sulfatados obtidos pelo processo atrás referido foram purificados usando HPLC em fase reversa nas condições que se seguem.

Equipamento: Shimazu LC-6A

Coluna: Waters μ-Bondapak C18 (3,9 x 300 mm)

Tampão de corrida:0,1% trifluoroacetato, acetonitrilo

Gradiente: acetonitrilo 10-60% / 50 min.

Fluxo: 1,5 ml / min.

Detecção: 230 nm

Nestas condições, o peptídeo (D) sulfatado eluiu a 18,7 min, (E) sulfatado a 17,6 min, (F) sulfatado a 18,0, (G) sulfatado a 19,3 min e (H) sulfatado a 13,6 min. respectivamente. Cada um dos compostos sulfatados foi colhido, concentrado, retirado o sal por filtração em gel (produto da Pharmacia, Sephadex G-10), pH ajustado a 7,0-7,5 com amónia aquosa a 10% e liofilizado. Por este método, compostos sulfatados estáveis foram recuperados como sais de amónio. 21

Identificação do sítio de sulfatacão

De acordo com o método de identificação do sítio sulfatado descrito no exemplo 2, foram identificados os sítios sulfatados dos peptídeos sulfatados atrás referidos. Como resultado, a estrutura de cada composto sulfatado tornou-se clara como se mostra abaixo.

Estrutura

Composto Sulfatado

Exemplo 5 Produção de (I) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-OH. (J) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-NH2. (K) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-NH(CH2)2C00H. (L) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-NH(CH2)4COOH. (M) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Tau-NH2. 22

(N) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-NH(CH2)30Η e (O) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-(L)AsufOMe^OMe.

Como material de partida usado para todos os peptídeos atrás referidos (I), (J), (K) , (L) , (Μ), (N) e (0), o peptídeo protegido mostrado na fórmula (i) que se segue foi primeiro produzido pelo método de fase líquida. (i) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-C12)-Tir(Bzl-C12)-oh 0 peptídeo (i) foi obtido pelos processos que se seguem. Após remoção do grupo Boc do material de partida Boc-Tir(Bzl-C12)Opac (Opac significa éster de fenacilo) usando trifluoroacetato, a condensação foi feita com Boc-Tir(Bzl-Cl2)-OH pelo método DCC-HOBt e obteve-se Boc-Tir(Bzl-Cl2)-Tir(Bzl-Cl2) -OPac. Em seguida, partindo de Boc-Tir(Bzl-C12)-Tir(Bzl-C12)-OPac de acordo com o método atrás referido a elongação do peptídeo foi feita por desprotecção repetida e condensação dos aminoácidos protegidos por ordem e obtido o peptídeo protegido mostrado na fórmula (ii) que se segue. (ii) Boc-FenGlu-(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(0Bzl-C12)-Tir(Bzl-C12)-OPac

Após dissolução do peptídeo (ii) em acetato num recipiente mergulhado em água, adicionou-se pó de zinco, agitou-se durante 2 horas, removeu-se o pó de zinco da mistura de reacção, concentrou-se sob vácuo e obteve-se o peptídeo (i) atrás referido. O peptídeo (I) atrás referido foi sintetizado pelo processo que se segue usando (i) como material de partida. -s/> \ 23

“vT '

Primeiro, o grupo Boc foi removido do peptídeo (i) com trifluoroacetato, seguido de tratamento com anidrido do ácido succinico na presença de base e obtido o peptídeo protegido (iii) mostrado na fórmula abaixo.

(iii) Suc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-ProGlu(OBzl)-Tir(Bzl-C12)-Tir(Bzl-C12)-OH 0 peptídeo (iii) foi tratado com hidrogenofluoreto a 0°C durante 1 hora na presença de anisole para remover todos os grupos protectores. Após a remoção, eliminou-se o hidrogenofluoreto sob vácuo, o resíduo foi lavado com éter dietílico e dissolvido em acetato IN, colocado em colunas de permuta iónica altamente básica (Diaion PA-308) e o peptídeo foi eluido por ácido acético a 50%.

Em seguida a purificação foi feita por filtração em gel nas condições que se seguem.

Coluna: Tampão de corrida: Fluxo: Detecção:

Sephadex LH-20(2.2 x 97 cm) 50% MeOH / H20 0,8 ml/min. UV 230 nm, 280 nm A fracção adequada foi colhida e liofilizada para se obter o composto pretendido (I). O peptídeo (J) atrás referido foi sintetizado pelo processo que se segue usando o peptídeo (i) como material de partida.

Primeiro, DCC-HOSu reagiu com solução de clorofórmio do peptídeo (i) para converter o peptídeo (i) em éster activado. •1 '' ."% 24

Nesta solução, introduziu-se gás de amónio, seguido de concentração sob vácuo, remoção do grupo Boc a partir do resíduo obtido com um processo semelhante à síntese de (I), succinilação e obtido o peptídeo protegido (iv) mostrado na fórmula abaixo. (iv) Suc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-C12)-Tir(Bzl-Cl2)-NH2 0 peptídeo (iv) foi tratado com fluoreto de hidrogénio a 0°C durante 1 hora na presença de anisole para remover todos os grupos protectores. Após a remoção, o fluoreto de hidrogénio foi retirado sob vácuo, o resíduo foi lavado com éter dietílico e dissolvido em ácido acético IN, colocado numa coluna de permuta iónica altamente básica e o peptídeo foi eluido por ácido acético a 50%. Em seguida a purificação foi feita por filtração em gel nas condições que se seguem. A fracção adequada foi colhida e lliofilizada para se obter o composto pretendido (J). 0 peptídeo atrás referido (K) foi sintetizado pelo processo que se segue usando o peptídeo (i) como material de partida.

Primeiro, a condensação do peptídeo (i) e NH2(CH2)2C00Bzl.HClfoi feita pelo método de DCC-HOBt e obtido o peptídeo protegido (v) que se segue. (v) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBz1)-Tir(Bz1-C12)-Tir(BZ1-C12)-NH(CH2)2C00Bzl 0 grupo Boc fdo peptídeo (v) foi removido pelo método semelhante ao descrito na síntese atrás referida de (I), seguido de succinilização do extremo N-termina, desprotecção do peptídeo protegido obtido pelo método semelhante ao descrito na síntese atrás referida de (I), purificação e obtenção do composto pretendido (K) . 0 peptídeo atrás referido (L) foi sintetizado pelo processo que se segue usando o peptídeo (i) como material de partida.

Primeiro, usando o peptídeo (i) e NH2(CH2)4C00Bzl.HCl, seguindo um método semelhante ao usado para o peptídeo atrás referido (K). (vi) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-CL2)-Tir(BZ1-C12)-NH2(CH2)4C00Bzl

Por um método semelhante ao usado para o peptídeo atrás referido (K), o extremo N-terminal do peptídeo (vi) foi succini-lado, seguido de desprotecção do peptídeo protegido pelo método semelhante ao descrito na síntese atrás referida de (K), purificação e obtenção do composto pretendido (L). o peptídeo atrás referido (M) foi sintetizado pelo processo que se segue usando o peptídeo (i) como material de partida.

Primeiro, usando o peptídeo (i) e Tau-NH2.HC1, obteve--se o peptídeo protegido (vii) pelo método semelhante ao peptídeo (K) atrás referido. (vii) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-C12)-Tir(Bzl-Cl2)-Tau-NH2.

Por um método semelhante ao usado para o peptídeo (K) atrás referido, o extremo N-terminal do peptídeo (vii) foi succinilado, seguido de desprotecção do peptídeo protegido obtido por um método semelhante ao descrito na síntese de (K) atrás referida, purificação e obtenção do composto pretendido (M). 0 peptídeo (N) atrás referido foi sintetizado pelo processo que se segue usando o peptídeo (i) como material de partida.

Primeiro, usando o peptídeo (i) e H2N(CH2)30H, obteve--se o peptídeo protegido que se segue (viii) por um método semelhante ao peptídeo (K) atrás referido.

(viii) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-C12)-Tir(Bzl-Cl2)-HN(CH2)30H

Seguindo um método semelhante ao usado para o peptídeo (K), o extremo N-terminal do peptídeo (viii) foi succinilado, seguido de desprotecção do peptídeo protegido obtido pelo método semelhante ao descrito na síntese atrás referida de (K), purificação e obtenção do composto pretendido (N). 0 peptídeo atrás referido (0) foi sintetizado pelo processo que se segue usando o peptídeo (i) como material de partida.

Primeiro, usando o peptídeo (i) e (L)Asu(OMe)OMe.HCl, obteve-se o peptídeo protegido que se segue (ix) por um método semelhante ao do peptídeo atrás referido (K). (ix) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-Cl2)-Tir(BZ1-C12)-(L)Asu(OMe)OMe

Pelo método semelhante ao usado para o peptídeo atrás referido (K), o extremo N-terminal do peptídeo (ix) foi succinilado, seguido de desprotecção do peptídeo protegido obtido por um método semelhante ao descrito na síntese atrás referida de (K), purificação e obtenção do composto pretendido (0).

Seguem-se os resultados obtidos da análise de aminoáci-dos após hidrólise destes peptídeos em ácido clorídrico 6N durante 24 horas e o valor de Rf da cromatografia em camada fina. Os resultados mostram que foram obtidos os peptídeos pretendidos atrás referidos. |Amino-|ácido (I) (J) (K) (L) (M) (N) 1 (0) | |Glu 2,17(2) 2,13(2) 2,12(2) 2,14(2) 2,15(2) 2,19(2) 2,15(2)| | Pro 2,08(2) 1,89 (2) 2,00(2) 1,83(2) 1,84(2) 1,83 (2) 2,09(2)| | Ile 0,98(1) 0,96(1) 0,91(1) 0,95(1) 0,99(1) 1,00(1) 0,93(1)| | Tir 1,92(2) 2,12(2) 2,01(2) 2,11(2) 2,13(2) 2,15(2) 2,H(2) | | Fen 1,00(1) 1,00(1) 1,00(1) 1,00(1) 1,00(1) 1,00(1)| |Tau-NH2 1,11(1) | Asu 0,98(1)| 1NH2(CH2)2 COOH+Fen 1,93(2) |NH2(CH2)4C00H 0,89(1) _1

Os números entre parêntesis mostram o valor teórico. 1 TLC | I I (I) (J) (K) (L) (M) (N) (0) 1 1 1 I 1 0,63 1,71 0,71 0,66 0,68 0,72 0,84 1 II 1 0,54 0,59 0,55 0,52 0,59 0,59 0,64 28 28

Placas de vidro Merck 20 x 20 com silica gel 60 F254, 0,25 mm de espessura I; CHC13 / MeOH / AcOH (5/2/1) II; n-BuOH / AcOH / H2= / Piridina (15/3/12/10)

Exemplo 6

Produção da forma sulfatada de (I) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-OH. (J) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-NH2, (K) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-NHÍCH2)2COOH. (L) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-NH(CH2)4COOH. (M) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Tau-NH2 f (N) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-NH(CH2^ 3QH e (O) Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-ÍL)Asu(OMet OMe. 50 mg de cada um dos peptídeos (I), (J) , (K), (L), (M), (N) e (O), produzidos no Exemplo 5, foram dissolvidos em 20 ml de piridina/dimetilformamia (1:1), l,29g (200 equivalentes) de trióxido de piridina enxofre foram foram adicionados à temperatura ambiente (25°C) e fez-se 4 horas de reacção para a sulfatação. Em seguida os compostos sulfatados foram controlados a pH 7,0 com solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio. Os precipitados foram filtrados e o material concentrado sob pressão reduzida.

Os compostos sulfatados atrás referidos foram purificados por HPLC em fase reversa nas condições que se seguem.

Equipamento: Nihon Bunkou 808-SC

Coluna: Waters μ-Bondapak 5C18 (3,9 x 300 mm)

Tampão de corrida:Metanol, solução aquosa de acetato de amónio lOmM (pH 6,0)

Gradiente: Metanol 1-60% / 60 min.

Detecção: 230 nm e 280 nm

Nestas condições, os compostos sulfatados individuais foram colhidos e liofilizados e o pó obtido foi dissolvido em ácido acético 0,05N e retirado o sal numa coluna de Sephadex G-10. Fracções adequadas foram colhidas e liofilizadas para se obter os compostos sulfatados pretendidos como sais de sódio.

Identificação do sítio de sulfatacão

Os sítios de sulfatação dos peptídeos sulfatados atrás referidos foram identificados de acordo com o método de identificação do sítiod e sulfatação descrito no Exemplo 2. Como resultado tornou-se clara a estrutura de cada um dos compostos sulfatados como se mostra abaixo. 30--

Exemplo 7 Produção de (Ρ) (Q) (R) (S) (T) (U) (V) (W) (W) 00

Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-ol. Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tír-Tir-Leu-OH. Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-NHEt. Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-Tau-NH2. Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-Glu-OH. Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-(D)Asu(OMe)OMe. Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-(L)Asu(OMe)OMe. Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-(D)Asu(NH2)NH2. Suc-Fen-Glu-Pro-lle-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-(L)Asu(NH2)NH2 e Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-NHPO(OH)2 31

Como o material de partida para todòs os peptídeos atrás referidos (Q), (R), (S), (T), (U), (V), (W) e (X), o peptídeo protegido mostrado na fórmula (x) que se segue foi primeiro produzido pelo método da fase líquida.

(x) Boc-Fen-Glu(OBzl) -Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl) -Tir(Bzl-CL2)-Tir(BZ1-C12)-Leu-OH A síntese do peptídeo (x) foi realizada como se segue. Primeiro, por condensação do peptídeo protegido (i) sintetizado no Exemplo 5 e TosOH.Leu-OTce (OTce significa éster 2,2,2-triclo-roetilico) realizada segundo o método de WSCI-HOBt e o peptídeo (xi) mostrado na fórmula abaixo foi sintetizado. (xi) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-Cl2)-Tir(Bzl-C12)-Leu-OTce

Em seguida, após o peptídeo ser dissolvido em acetato num recipiente mergulhado em água, adicionou-se pó de zinco, agitou-se durante 2 horas para desprotecção de Tce, removeu-se o pó de zinco da mistura de reacção, concentrado sob vácuo e obtido o peptídeo (x) atrás referido. 0 peptídeo atrás referido (P) foi sintetizado pelo processo quese segue usando o peptídeo (i) como material de partida.

Primeiro, a condensação do peptídeo (i) e Leu-ol foi feita segundo o método de WSCI-HOBt e obtido o peptídeo protegido (xii) mostrado na fórmula abaixo. (xii) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-Cl2)-Tir(Bzl-Cl2)-Leu-ol 32 32

0 grupo Boc foi removido do peptídéo (xii) de acordo com o método de síntese de (I) , o extremo N-terminal do peptídeo (xii) foi succinilado, seguido de desprotecção do peptídeo protegido obtido pelo método semelhante ao descrito na síntese atrás referida de (I), purificação e obtenção do composto (P) pretendido. 0 peptídeo (Q) atrás referido foi sintetizado pelo processo que se segue usando o peptídeo (x) como material de partida.

Primeiro o grupo Boc foi removido do peptídeo (x) com trifluoroacetato, seguido de tratamento com anidrido de ácido succínico na presença de base e obtido o peptídeo protegido (xiii) mostrado na fórmula seguinte abaixo.

(xiii) Suc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-Cl2)-Tir(Bzl-C12)-Leu-OH 0 peptídeo (xiii)· foi tratado com fluoreto de de hidrogénio anidro a o°C durante 1 hora na presença de anisole para remover todos os grupos protectores. Após remoção, o fluoreto de hidrogénio foi removido sob vácuo, o resíduo foi lavado com éter dietílico e dissolvido em acetato IN, colocado numa coluna de permuta iónica altamente básica e o peptídeo foi eluido por 50% de acetato. Em seguida a purificação foi feita por filtração em gel nas condições descritas anteriormente e obtido o composto (Q) pretendido. O peptídeo(R) atrás referido foi sintetizado pelo processo que se segue usando o peptídeo (x) como material de partida. 33 33

Primeiro a condensação do peptídeo" (x) e NH2Et foi feita pelo método de WSCI-HOBt e obteve-se depois o peptídeo protegido (xiv) mostrado na fórmula abaixo. (xiv) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-Cl2)-Tir(Bzl-C12)-Leu-NH2Et 0 grupo Boc foi removido do peptídeo (xiv) de acordo com o método de síntese de (Q), seguido de succinilização N-ter-minal, desprotecção do peptídeo protegido obtido de acordo com o método de síntese de (Q), purificação e obtenção do composto pretendido (R). 0 peptídeo atrás referido (S) foi sintetizado pelo processo que se segue usando o peptídeo (x) como material de partida.

Primeiro, o peptídeo protegido (xv) apresentado na fórmula abaixo foi obtido usando o peptídeo (x) e Tau-NH2.HC1 com um método semelhante ao usado para o peptídeo (M). (xv) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-Cl2)-Tir(Bzl-Cl2)-Leu-Tau-NH2 A succinilização N-terminal do peptídeo (xv) foi feita de acordo com o método seguido para o peptídeo (M), a desprotecção do peptídeo protegido obtido foi realizada de acordo com o método de síntese de (M) e após purificação obteve-se o composto pretendido (S). o peptídeo atrás referido (T) foi sintetizado pelo processo que se segue usando o peptídeo (x) como material de partida. 34

Primeiro o peptideo protegido (xvi) apresentado na fórmula abaixo foi obtido usando o peptideo (x) e (D)Glu(OBzl)OBzl.HCl com um método semelhante ao usado para o peptideo (S). (xvi) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-Cl2)-Tir(Bzl-C12)-Leu-(D)Glu(Obzl)OBzl A succinilização N-terminal do peptideo (xvi) foi feita de acordo com o método seguido para o peptideo (S), a desprotec-ção do peptideo protegido obtido foi realizada de acordo com o método de síntese de (S) e após purificação obteve-se o composto pretendido (T). O peptideo atrás referido (U) foi sintetizado pelo processo que se segue usando o peptideo (x) como material de partida.

Primeiro o peptideo protegido (xvii) apresentado na fórmula abaixo foi obtido usando o peptideo (x) e (D)Asu(OMe)OMe.HC1 com um método semelhante ao usado para o peptideo (S). (xvii) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-C12)-Tir(Bzl-C12)-Leu-(D)Asu(OMe)OMe A succinilização N-terminal do peptideo (xvii) foi feita de acordo com o método seguido para o peptideo (S), a desprotecção do peptideo protegido obtido foi realizada de acordo com o método de síntese de (S) e após purificação obteve-se o composto pretendido (U). 35

0 peptídeo atrás referido (V) foi sintetizado pelo processo que se segue usando o peptídeo (x) como material de partida.

Primeiro o peptídeo protegido (xviii) apresentado na fórmula abaixo foi obtido usando o peptídeo (x) e (L)Asu(OMe)OMe.HCl com um método semelhante ao usado para o peptídeo (S). (xviii) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-cl2)-Tir(Bzl-Cl2)-Leu-(L)Asu(OMe)OMe A succinilização N-terminal do peptídeo (xviii) foi feita de acordo com o método seguido para o peptídeo (S), a desprotecção do peptídeo protegido obtido foi realizada de acordo com o método de síntese de (S) e após purificação obteve-se o composto pretendido (V). 0 peptídeo atrás referido (W) foi sintetizado pelo processo que se segue usando o peptídeo (x) como material de partida.

Primeiro o peptídeo protegido (xix) apresentado na fórmula abaixo foi obtido usando o peptídeo (x) e (D)Asu(NH2)NH2.HCl com um método semelhante ao usado para o peptídeo (S). (xix) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-Cl2)-TÍr(Bzl-Cl2)-Leu-(L)Asu(NH2)NH2 A succinilização N-terminal do peptídeo (xix) foi feita de acordo com o método seguido para o peptídeo (S), a desprotecção do peptídeo protegido obtido foi realizada de acordo com o método de síntese de (S) e após purificação obteve-se o composto pretendido (W). O peptídeo atrás referido (X) foi sintetizado pelo processo que se segue usando o peptídeo (x) como material de partida.

Primeiro o peptídeo protegido (xx) apresentado na fórmula abaixo foi obtido usando o peptídeo (x) e (L)Asu(NH2)NH2.HC1 com um método semelhante ao usado para o peptídeo (S). (xx) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-Cl2)-Tir(Bzl-C12)-Leu-(L)Asu(NH2)NH2 A succinilização N-terminal do peptídeo (xx) foi feita de acordo com o método seguido para o peptídeo (S), a desprotec-ção do peptídeo protegido obtido foi realizada de acordo com o método de síntese de (S) e após purificação obteve-se o composto pretendido (X). 0 peptídeo atrás referido (Y) foi sintetizado pelo processo que se segue usando o peptídeo (x) como material de partida. Primeiro o peptídeo protegido (xxi) apresentado na fórmula abaixo foi obtido usando o peptídeo (i) e

Leu-NHPO(OH)2.HC1 com um método semelhante ao usado para o peptídeo (S). (xxi) Boc-Fen-Glu(OBzl)-Pro-Ile-Pro-Glu(OBzl)-Tir(Bzl-C12)-Tir(BZ1-C12)-Leu-NHPO(OH)2 a A succinilização N-terminal do peptídeo (xxi) foi feita de acordo com o método seguido para o peptídeo (S), 37 37

desprotecção do peptídeo protegido obtido foi realizada de acordo com o método de síntese de (S) e após purificação obteve-se o composto pretendido (Y) .

Seguem-se os resultados da análise de aminoácidos após hidrólise destes peptídeos em ácido clorídrico 6N a 110°C durante 24 horas e o valor de Rf da cromatografia em camada fina. Os resultados mostram a obtenção dos peptídeos pretendidos atrás referidos. 38

1 |Aminoácido 1- 1 (P) I (Q) (R) (S) 1 (T) | I | Glx 1 | 2,15(2) 2,12(2) 2,21(2) 2,13(3) 1 3,16(3)| | Pro | 2,02(2) 2,11(2) 1,89(2) 2,08(2) 2,13(2) | | Ile | 0,95(1) 0,94(1) 0,96(1) 0,97(1) 0,94(1)| | Leu 1 1,03(1) 1,03(1) 1,03(1) 1,02(1)| | Tir | 2,12(2) 2,06(2) 2,11(2) 2,05(2) 2,10(2) | | Fen | 1,00(1) 1,00(1) 1,00(1) 1,00(1) 1,00(1)| | Tau-NH2 1 1 1 1,08(1) 1 _1 Os números entre parêntesis mostram o valor teórico. r |Aminoácido 1 (U) I (V) (W) (X) 00 i | Glx 1 | 2,23(2) 2,18(2) 2,25(2) 2,13(2) 2,08(2)| | Pro | 1,81(2) 2,18(2) 1,83 (2) 2,12(2) 1,83 (2) | | Ile | 0,93(1) 0,98(1) 0,97(1) 0,94(1) 0,94(1)| | Leu | 0,92(1) 0,95(1) 1,02(1) 1,03(1) 1 | Tir | 2,13(2) 2,09(2) 2,13(2) 2,01(2) 2,19(2) | | Fen | 1,00(1) 1,00(1) 1,00(1) 1,00(1) 1,00(1)| j Asu 1_ | 1,06(1) 1 1,10(1) 1,12(1) 1,09(1) _1

Os números entre parêntesis mostram o valor teórico 39 39 Τ TLC | _l_ (P) (Q) (R) (S) (T) | I 1 i | 0,77 0,71 0,89 0,74 1 0,56 | 11 1 _1_ 0,60 0,57 0,62 0,62 0,48 | _1

—- Γ 1 L 1 TLC | _I_ (U) (V) (W) (X) 1 (Y) 1 1 Γ 1 1 1 1 0,93 0,85 0,75 0,71 1 1 —" 1 ii | 0,63 0,62 0,58 0,60 I

Placas de vidro 20x20 com silica gel F254, 0,25 mm de espessura. I; CHC13/MeOH/AcOH (5/2/1), II; n-BuOH / AcOH / H20 /

Piridina (15/3/12/10)

Exemplo 8 (P) (Q) (R) (S) (T) (U) (V) (W) (W) (Y)

Produção da forma sulfatada de Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-ol. Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-OH. Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-NHEt. Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-Tau-NH2. Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu- f Glu-OH. Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu- f m Asu (ΟΜβϊ OMe. Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu- fLl Asu(OMe 1 OMe. Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-(D^ Asu (NH2)NH2. Suc-Fen-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-(L) Asu (NH2) NH2 e Suc-Fen-Glu-Pro-lle-Pro-Glu-Tir-Tir-Leu-NHPO (OH) 2 40 40

50 mg de cada um dos peptídeos (P), (Q), (R), (S), (T), (U), (V), (W), (X) e (Y) , produzidos no Exemplo 7, foram dissolvidos em 20 ml de piridina/dimetilformamia (1:1), l,29g (200 equivalentes) de trióxido de piridina enxofre foram foram adicionados à temperatura ambiente (25°C) e fez-se 4 horas de reacção para a sulfatação. Em seguida os compostos sulfatados foram ajustados a pH 7,0 com solução aquosa saturada de hidrogenocarbo-nato' de sódio, seguido da remoção dos precipitados por filtração e condensação dos filtrados sob vácuo.

Equipamento: Nihon Bunkou 808-SC

Coluna: Waters μ-Bondapak 5C18 (3,9 x 300 mm)

Gradiente: Metanol 1-60% /60 min.

Fluxo: lml/min.

Detecção: 230 nm e 280 nm

Identificação do sítio de sulfatação

Os sítios de sulfatação dos peptídeos sulfatados atrás referidos foram identificados de acordo com o método de 41 41

Exemplo 9 (11 Método de mutaaenizacão da hirudina HV1 de Glu 61-62 para Tir61-62 O iniciador da mutagenização tendo a sequência de DNA mostrada na fórmula (III)abaixo foi sintetizado pelo método de fosfoamideto usando um sintetizador de DNA (Applied Biosystems 380B). GAA ATC CCG TAC TAC TAC CTG CAG (III) lμg de DNA do fago M13 mpi9 de cadeia dupla comercial (produto da Toyobo) foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI (10 unidades) e HindIII (10 unidades) e purificado por electroforese em gel de agarose.

Por outro lado, 10 /Ltg do vector pUCHVl (referência: patente Japonesa 3-164184) em que o gene de HIV-1 foi clonado no plasmideo comercial pUC18, foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI (30 unidades) e HindIII (30 unidades) para se obter um fragmento de DNA de 210 pb codificador de HV-1. 100 ng deste fragmento e 100 ng do fragmento EcoRI--HindlII atrás purificado do fago M13 mpl9 foram ligados a 16°C durante a noite usando DNA-ligase de T4. Esta mistura de reacção foi usada para transformar E. coli JM101 de acordo com o método de J. Messing [Methods in Enzymology, 101. 21-78 (1983)]. A partir de cada placa obtida preparou-se DNA de cadeia simples (M13HV1) de acordo com o método de J. Messing (a mesma referência de atrás). Estes foram dissolvidos em tampão TE (pH 8,0) para uma concentração final de 1 mg/ml. 43 43

50 pmoles do iniciador de mutagenização mostrado na fórmula (III) atrás foi fosforilado em tampão de cinase (tampão 0,1M Tri-hidrocloreto pH 8,0, 0,1M MgCl2, 7 mM ditiotreitol, 1 mM ATP) contendo 2 unidades de polinucleótido-cinase de T4 a 37°C durante 15 minutos, seguido de aquecimento a 70°C durante 10 minutos para parar a reacção. O DNA mutagenizado de M13HV17 foi construído usando 5 Mg de M13HV1 atrás referido e 4 pmoles do oligodesoxirribonucleó-tido de mutação fosforilado obtido atrás, de acordo com o método do kit "Oligonucleotide-directed in vitro mutagnesis" da Amersham, o qual é uma aplicação do método de Eckstein et al., [Nycleic Acid Research, 13, 8764 (1985)] (2) Preparação do gene mutagenizado e construção do plasmídeo codificador da proteína mutagenizada 20 μΐ de solução contendo DNA mutagenizado M13HV17 obtido atrás em (1), foi usado para transformar células competentes de E. coli TG1 e obtidas placas. Preparou-se DNA de cadeia dupla a partir destes transformantes. 30 Mg do DNA de cadeia dupla atrás referido foi digerido com as enzimas de restrição Accl e HindIII e purificado o fragmento de DNA 200 pb tendo uma região codificadora de aminoá-cidos N-terminais eliminada.

Por outro lado, o vector de expressão da hirudina pMTSHVl (Referência: Patente Japonês 2-303096) foi digerido com as enzimas de restrição Accl e HindIII como descrito abaixo e purificado o fragmento de DNA de 2,75 Kb incluindo DNA codificador do peptideo sinal phoA. 44 44

0 fragmento de DNA mutagenizado de 20Qpb"atrás referido e o fragmento do vector de expressão pMTSHVl foram ligado com DNA-ligase de T4 (Fig. 5), o qual foi usado para transformar E. coli JM109 e obtido o plasmídeo de expressão mutante pMTSHV17. A sequência de DNAdeste plasmídeo foi confirmada pelo método de Sanger et. al. Ainda, a estirpe E. coli RR1 foi transformada usando este plasmídeo e foi observada maior expressão do que a observada com a estirpe JM109. (3) Produção de secreção de hirudina HV-17 pelo plasmídeo codificador da hirudina mutante HV-17 E. coli RRl transformada com o plasmídeo pMTSHVl7 [FERM BP-3268, depositado no Fermentation Research Institute como E. coli RRl/pMTSHVl7], purificado em (2), foi cultivada em meio 2x TY (16 g/1 de bactotriptona, 10g/l de extracto bacto de levedura e 5 g/1 de NaCl, pH 7,2) contendo 100 βq/ml de ampicilina. Após cultura a 37°C durante 24 horas, colheu-se 1 ml de meio de cultura. As células precipitadas foram suspensas em 1 ml de 30 mM Tris-HCl (pH 7,4) contendo 25% de sucrose e lmM EDTA, seguido de tratamento à temperatura ambiente durante 10 minutos. Após colheita das células por centrifugação, as células foram suspensas em 1 ml de água fria para libertar a substância presente no espaço periplasmático da célula por choque osmótico.

Em seguida as células foram removidas por centrifugação e preparado o sobrenadante. A quantidade de hirudina mutante secretada acumulada foi determinada medindo a sua actividade anti-trombina no sobrenadante.

A actividade anti-trombina foi medida por colorimetria quantitativa do grau de inibição da actividade hidrolítica da trombina no substrato sintético cromogénico ChromozynmeTH (Tocylglycil-prolyarginine-4-nitroanilideacetate;Bòehringer-Mann-heim).

Esta reacção foi realizada como se segue. Ao tampão de medição (100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 150 mM NaCl e 0,1% polietile-noglicol 6000), adicionou-se 0,5U de trombina humana (produto da Sigma), a hirudina mutante foi adicionada e pré-incubada a 37°C durante 3 minutos. A este substrato adicionou-se 100 μΐ de ChromozymeTH (produto da Boehringer Mannheim) para medir a variação da D0405nm/min.

Desenhou-se um gráfico com a quantidade de hirudina mutante adicionada nas abcissas e com a variação da D0405nm/min nas ordenada e determinada apartir do gráfico a quantidade de hirudina que dá 100% de inibição da actividade trombina, valor esse que foi definido como 0,5 unidades de anti-trombina (ATU).

Como resultado, a estirpe que usa o plasmídeo pMTSHV17 apresentou 1310000 ATU de actividade anti-trombina por litro de meio de cultura, o que significa cerca de 131 mg de HV-17 secre-tada para o preiplasma. f 4 ^ Secreção de HV17 para o fermentador e meio de cultura com a estirpe transformada de E.coli RR1/PMTSHV17

Por um método semelhante ao descrito atrás em (3), E. coli estirpe RR1 transformada com o plasmídeo pMTSHV17 foi incubada em 2 1 de meio 2xTY contendo 100μg/ml de ampicilina e 2% de glucose num fermentador de 5 1 a 37°C durante 24 horas com arejamento e agitação, cerca de 556 mg de HV-17 foram secretadas por litro de meio de cultura. 46

(5) Purificação de hirudina mutante HV17 a partir do meio de cultura

Apôs fermentação, 1,6 1 de meio de cultura foi colhido e centrifugado para separa as células. Após filtração do sobrena-dante através de um filtro de 3,2 jum (adquirido à Pole) para remver totalmente as células, a hirudina mutante HV-17 foi purificada por cromatografia pela ordem que se segue. a) Cromatografia de permuta aniónica

Coluna: Coluna QAE-toyoparl(4,4 x 7 cm)

Tampão de corrida: tampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7,0)

Tampão de eluição: 0,2M NaCl, tampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7,0) b) Cromatografia de filtração em gel

Coluna: Sephacryl S-100 HR (4,4 x 97 cm)

Tampão de corrida: tampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7,0) c) Cromatografia de permuta aniónica

Coluna: coluna DEAE-toyoparl (4,4 x 40 cm)

Tampão de corrida: A. tampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7.0)

B. tampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7.0) , 0,3M NaCl

Gradiente B. 0-100%/12,5 horas d) Cromatografia líquida de alta resolução em fase reversa

Equipamento: Deltaprep 3000, Waters

Coluna: Vydac C4 (4,7 x 30 cm)

Tampão de corrida: A. 0,05% trifluoroacetato/água B. acetonitrilo

Gradiente: Fluxo: B. 10-60%/50 minutos. B. 80 ml/min. 5 nomoles de HV-17 purificada foram hidrolisados com HCl 6N a lio°c durante 24 horas e analizado num analizador de aminoácidos (Beckman 7300). o resultado está apresentado na Tabela 1. Comparado com HV-1, HV-17 foi confirmado como tendo menos 2 ácido glutâmicos e mais duas tirosinas o que foi o objectivo da mutação. A actividade anti-trombina foi medida de acordo com o referido atrás em (3), a actividade especifica foi de 12000 ATU/mg.

Tabela 1 Aminoácido Valor analizado Valor teórico Asx 8,86 9 Tre 3,86 4 Ser 3,64 4 Glx 11,63 11 Gli 8,82 9 Ala — Cis 5,63 6 Vai 3,33 4 Met — Ile 1,95 2 Leu 4,11 4 Tir 4,04 4 Fen 1,00 1 His 1,11 1 Lis 2,73 3 Arg — Pro 3,28 3

Exemplo 10

Produção da forma sulfatada da hirudina mutante HV-17 A hirudina mutante HV-17, preparada no Exemplo 9 por substituição de Glu nas posições 61e 62 por Tir, foi sulfatada enzimaticamente usando aril-sulfotransferase nas condições que se seguem.

0, lmM

Hirudina mutante HV-17: p-nitrofenilsulfato: Enzima da transferência Cloreto de magnésio: Tampão:

Temperatura da reacção: Tempo de reacção: A separação e colheita HPLC nas condições que se seguem.

1,0 mM

de enxofre:10 U/ml 25 mM tampão 0,1M Tris-hidrocloreto (pH8,6)

37 °C 24 horas a forma sulfatada foi feita por

Coluna: Tampão de corrida: Gradiente: Fluxo: Detecção:

Nucleosil 5C18 (4 x 150 mm) A. 0,1% trifluoroacetato/água B. acetonitrilo B. 1-60%/60 min. 1,0 ml/min. 230 nm

Nestas condições as formas sulfatadas da hirudina mutante HV-17 eluiram aos 32,4 minutos, 33,0 minutos e 33,7 minutos respectivamente, como se mostra na Figura 6 (A).

Em seguida após remoção do acetonitrilo durante o processo de concentração,, cada uma das fracções do composto sulfatado foi liofilizada.

No caso do pico 3, devido à sua separação insuficiente do composto não sulfatado, posterior separação e colheita foi feita por HPLC nas condições que se seguem.

Coluna: gelTSK DEAE-5PW (7,5 x 75 mm)

Tampão de corrida: A. tampão Tris-hidrocloreto 20 mM (PH 8,0)

Gradiente: Fluxo: Detecção: B. Tampão Tris-hidrocloreto 20 mM (pH 8,0) + 0,5M NaCl B. 0-100%/50 min. 0,8 ml/min. 23 0 nm

Nestas condições as formas sulfatadas da hirudina mutante HV-17 eluiram aos 40,6 minutos como se mostra na Fig. 6(B). Em seguida, cada uma das fracções do composto sulfatado foi concentrada e removido o sal por HPLC de fase reversa, seguido de liofilização.

Identificação do sítio de sulfatacão A identificação do sítio sulfatado de três tipos de hirudina mutante HV-17 sulfatada e colhida foi feita usando aminopeptidase. M e quimotripsina.

a) Análise de aminoácidos após digestão com aminopeptidase M A 10 μΐ de substrato lmM, adicionou-se 5μ1 (250 ng) de α-quimotripsina (Sigma, tratada com TLCK) com arrefecimento em gelo, seguido de 4 horas de digestão em tampão fosfato de sódio 0,1M (pH 7,0) à temperatura de 37°C. A esta mistura de reacção, adicionou-se 5 μΐ de aminopeptidase (produto da Pierce, 5 mg/ml) e a hidrólise decorreu durante mais 18 horas. A análise da composição em aminoácidos após hidrólise mostrou que o pico 1 é um composto dissulfatado, o pico 2 e o pico 3 são compostos monossulfatados, b) Mapeamento de peptídeos por digestão com quimotripsi na A 10 μΐ de substrato lmM, adicionou-se 5 μΐ (250 ng) de α-quimotripsina com arrefecimento em gelo, seguido de 24 horas de digestão em tampão de fosfato de sódio 0,1M (pH 7,0) à temperatura de 37°C. Esta mistura de reacção foi aplicada numa coluna de HPLC de fase reversa tendo Nucleosil 5C18 (4 x 150 mm) como fase estacionária e os pontos de eluição dos peptídeos digeridos foram confirmados. Como resultado, quando o substrato era hirudina mutante HV-17 não sulfatada, foram gerados 2 fragmentos compostos por 61 aminoácidos e 4 aminoácidos por clivagem da ligação amida a seguir à Tir 61.De forma semelhante, quando os três tipos de compostos sulfatados dos picos 1-3 foram tratados da mesma forma nos três casos, o ponto de eluição do fragmento composto por 61 aminoácidos era idêntico ao do peptídeo não sulfatado. Este resultado mostra que nos três tipos de compostos sulfatados Tir 3 e 61 não estavam sulfatados. Assim, considerando este resultado e o resultado em a), o pico 1 foi confirmado como sendo composto dissulfatado tendo 2 Tir, 62 e 63, sulfatadas. Também, o ponto de eluição do fragmento composto por 4 aminoácidos, obtido por digestão do pico 2 e do pico 3, era idêntico ao ponto de eluição do fragmento composto por 4 aminoácidos gerado por digestão com quimotripsina do pico 2 e do pico 3 para o caso do peptídeo (B), fragmento esse que está entre os fragmentos gerados pela digestão com quimotripsina dos picos 1-3 no caso do peptídeo (B). A partir deste resultado, os picos 2 e 3 foram confirmados como sendo composto monossulfatado na tir 62 e 63 respectivamente.

Os resultados acima sobre a identificação do sítio de sulfatação estão resumidos abaixo.

Composto sulfatado

Estrutura

Pico 1

Pico 2

Pico 3

Val-Val-Tir-Tre-Asp-Cis-Tre-Glu-Ser-Gli-

Gln-Asn-Leu-Cis-Leu-Cis-Glu-Gli-Ser-Asn

Val-Cis-Gli-Gln-Gli-Asn-Lis-Cis-Ile-Leu-Gli

Ser-Asp-Gli-Glu-Lis-Asn-Gln-Cis-Val-Tre-

Gli-Glu-Gli-Tre-Pro-Lis-Pro-Gln-Ser-His-

Asn-Asp-Gli-Asp-Fen-Glu-Glu-Ile-Pro-Tir-

Tir(S03H)-Tir(S03H)-Leu-Gln

Val-Val-Tir-Tre-Asp-Cis-Tre-Glu-Ser-Gli-

Gln-Asn-Leu-Cis-Leu-Cis-Glu-Gli-Ser-Asn

Val-Cis-Gli-Gln-Gli-Asn-Lis-Cis-Ile-Leu-Gli

Ser-Asp-Gli-Glu-Lis-Asn-Gln-Cis-Val-Tre-

Gli-Glu-Gli-Tre-Pro-Lis-Pro-Gln-Ser-His-

Asn-Asp-Gli-Asp-Fen-Glu-Glu-Ile-Pro-Tir-

Tir(S03H)-Tir-Leu-Gln

Val-Val-Tir-Tre-Asp-Cis-Tre-Glu-Ser-Gli-

Gln-Asn-Leu-Cis-Leu-Cis-Glu-Gli-Ser-Asn

Val-Cis-Gli-Gln-Gli-Asn-Lis-Cis-Ile-Leu-Gli

Ser-Asp-Gli-Glu-Lis-Asn-Gln-Cis-Val-Tre-

Gli-Glu-Gli-Tre-Pro-Lis-Pro-Gln-Ser-His-

Asn-Asp-Gli-Asp-Fen-Glu-Glu-Ile-Pro-Tir-

Tir-Tir(S03H)-Leu-Gln

Exemplo ll

Exemplo de testes farmacológicos íactividade anti-trom- bina; ensaio de coagulação) 53

A hirudina liga-se ao factor de coagulação do sangue trombina numa proporção de 1:1 para inibir a coagulação do sangue. Recentemente, a forma de ligação da hirudina e da trombina tornou-se clara por cristalografia [T.J. Rydel et. al. Science, 249, p277-280 (1990)]. Os resultados mostram que a região C-ter-minal da hirudina se liga â trombina de forma envolvente e esta ligação torna-se mais forte quando o grupo hidroxilo da Tir na posição 63 é sulfatado, o que se pensa ser o resultado do aumento de actividade anti-trombina.

Alguns dos compostos obtidos pelo presente invento têm actividade anti-trombina mais forte comparado com hirudina produzidas pelo método convencional. A medição da actividade anti-trombina foi feita observando a actividade anti-coagulante como índice usando o fibrinogénio como substrato. Ou seja, dissolvidos os compostos em 200 μΐ de 0,lmM Tris-HCl (pH 7,5) contendo 0,1% de polietilenoglicol-6000, adicionado 100 μΐ de trombina humana preparada a 10 NIH unidades/ml no tampão referido atrás, adicionado 200 μΐ de fibrinogénio humano (produto Sigma) preparado a 6 mg/ml no referido tampão tris-hidrocloreto e o tempo de coagulação das misturas de reacção foram medidos. Para medição dos tempos de coagulação, usou-se o analizador do tempo de coagulação (Amelung KC10A). Os valores obtidos foram convertidos em unidades pela curva padrão de trombina previamente preparada. Os gráficos foram preparados colocando os valores convertidos no eixo verticale as concentrações dos compostos no eixo horizontal. Nos gráficos a unidade de trombina foi definida como 100 na concentração de composto 0. A concentração dos compostos correspondendo a 50 unidades foi definida como 50% da concentração inibidora dos compostos. Os resultados estão apresentados na Tabela 2. 54

Tabela 2 i- |Compostos Concentração de 50% de inibição (ng/ml) 1 Potência 1 |HV-1 (54-65) 6608,3 1 1/00 I (A) 14689,8 I 0,45 | (B) 13829,7 I 0,48 |Forma sulfatada de (A) 3396,6 | 1/95 |Forma sulfatada de (B) | -pico 1 493,4 | 13,39 | -pico 2 1018,5 I 6,49 | -pico 3 4029,3 | 1/64 1 (C) 3753,5 I 1/76 |Forma sulfatada de (C) 74,3 | 88,94 |Forma sulfatada de (D) 115,8 | 57,07 [Forma sulfatada de (E) 148,8 | 44,41 |Forma sulfatada de (F) 5015,1 I 1/32 [Forma sulfatada de (G) 60,7 j 108,87 |Forma sulfatada de (H) >200000 | <0,05 1 (i) 20019,4 | 0,83 |Forma sulfatada de (I) 4078,1 I 1/62 1 (J) 98392,6 I 0,07 I (K) 30187,4 I 0,21 |Forma sulfatada de (K) 6451,0 | 1/02 I (L) 15625,1 I 0,42 |Forma sulfatada de (L) 3139,4 | 2,11 I (N) 103092,4 | 0,06 1 (0) 35266,9 | 0,19 I (P) 103888,1 [ 0,06 |Forma sulfatada de (Q) 3568,6 1 1/85 [ (R) 36094,5 1 0,18 55

1 (S) 1 99624,6 o o |Forma sulfatada de (T) 1 793,9 1 8,32 1 (U) 1 47467,1 1 0,14 1 (V) 1 30420,1 | 0,22 I (W) 1 34981,1 ! 0,19 |Forma sulfatada de (X) 1 3206,8 | 2,06 1 (Y) 1 _|_ 153438,6 1 0,04 |Hirudina HV-1 1 1 69,6 1- | 94,95 |Hirudina HV-17 1 70,3 | 94,00 |Forma sulfatada de 1 64,0 | 103,26 | hirudina HV-17 I _1_ 1 J_ _1 nota: a potência foi calculada de acordo com a definiçãode que a potência HV-1 (54-65) é 1. HV1 (54-65): H-Gli-Asp-Fen-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tir-Leu-Gln- -0H hirudina HV-1: Val-Val-Tir-Tre-Asp-Cis-Tre-Glu-Ser-Gli-Gln-Asn--Leu-Cis-Leu-Cis-

Glu-Gli-Ser-Asn-Val-Cis-Gli-Gln-Gli-Asn-Lis-Cis-Ile-Leu-Gli-Ser— Asp-Gli-Glu-Lis-Asn-Gln-Cis-Val-Tre-Gli-Glu-Glu-Gli-Tre-Pro-Lis— Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gli-Asp-Fen-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tir— Leu-Gln

Exemplo 12

Exemplo de testes farmacológicos (actividade anti-trom-bina; ensaio cromoaénico^

Asactividades anti-trombina foram medidas medindo o grau de inibição da actividade hidrolítica da trombina no 56 56

substrato sintético Chromozyme TH (Tocylglycil-prolylarginine-4--nitroanilideacetate). Esta reacção foi realizada como se segue. 350 pM de trombina humana (Sigma) foi adicionado ao tampão contendo tampão 0,1M Tris-HCl (pH 8,5), 150 mM NaCl e 0,1% de polietilenoglicol-6000, seguido da adição de hirudina HV-1, hirudina HV-17 e separada e colhida a hirudina sulfatada HV-17 (pico 1, pico 2, pico 3), pré-incubação a 37UC durante 3 minutos. Aqui, a concentração molar da trombina humana atrás referida foi determinada pelo método de titulação de sítios activos [G.W. Jameson et al., Biochem. J., 131, pl07-117 (1973)] usando como substrato metilunberifenil-p-guanidinobenzoato como substrato. Após a pré-incubação, Chrmozyme TH (produto da Boehringer--Mannheim) foi adicionado para uma concentração final de 100 μΚ e a p-nitroanilida libertada foi medida no comprimento de onda de 405 nm e a velocidade inicial v das reações hidrolíticas foi medida para cada uma das hirudinas atrás referidas a várias concnetrações. A partir desta velocidade inicial das reacções de hidrólise, foi calculada a constante de dissociação Ki' pelo método de S.R. Stone et al. [Biochemistry, 25, p4622-4628 (1986)]. Estes resultados estão apresentados na Tabela 3.

Estes resultados mostram que apesar da hirudina HV-17 ser menos activa do que a hirudina HV-1, a hirudina HV-17 sulfatada mostrou cerca de duas vezes mais actividade do que a hirudina HV-1.

Exemplo 13

Acção inibidora dos peptldeos sulfatados contra a morte induzida por trombina A murganhos macho (20-25 g) não anestesiados, administrou-se trombina (15 unidades NIH / lOg) intravenosamente e a actividade anti-trombina do composto testado foi avaliada pela observação do desaparecimento de reflexos e morte como índices. Todos os compostos testados foram dissolvidos em soro fisiológico e 0,05 ml/lOg foram administrados intravenosamente 5 min antes da injecção de trombina. Os resultados estão apresentados na Tabela 4.

Tabela 4

Composto testado Quantidade administrada (mg/Kg de peso) Pontuação Trombina + soro fisiológico (15 unidades NIH/10g de peso) 1,7 Trombina + HVi 10 1,3 (15 unidades NIH/10g de peso) 20 0,6 50 0,4 Trombina + (C) sulfatado 20 1,2 (15 unidades NIH/10g de peso) 50 0,8 100 0,4 * Pontuação Pontuação 0: ausência de desaparecimento do reflexo de derrube (aparentemente normal)

Pontuação l: desaparecimento do reflexo de derrube, mas ausência de morte dentro de 20 minutos

Pontuação 2: morte dentro de 20 minutos Exemplo 14

Prolongamento do tempo de hemorreaia

As amostras foram injectadas em murganhos macho (20-25 59 59

g) na veia da cauda com anestesia por pentobàrbital (40 mg/Kg i.p.=. Fez-se uma ferida inserindo uma agulha de 21 G (diâmetreo externo 0,85 mm) no outro lado da veia da cauda após 5 minutos da administração dos compostos a testar e o tempo de hemorregia da ferida foi medido.

Colocou-se um papel de filtro na ferida com mudanças de 15 em 15 segundos. O tempo de hemorregia foi definido como o tempo necessário até à não observação de mancha vermelha no papel de filtro. Os resultados estão apresentados na Tabela 5.

Tabela 5

Composto a testar Quantidade administrada (mg/Kg de peso) Tempo de hemorregia (seg) Soro fisiológico 148,5±14,6 HV-1 2 223,7±15,6 5 376,7+20,2 10 501,7+47,1 (C) sulfatado 10 277,5±31,5 20 366,0±23,0 . 50 432,0±33,3

Em geral o prolongamento do tempo de hemorregia é um dos efeitos secundários dos anticoagulantes. Aqui, o composto sulfatado no presente invento foi claramente confirmado como tendo tendência para baixar a hemorregia relativamente à hirudina HV-1. 60

Exemplo 15 Formulação (1) Cápsulas disgeríveis no intestino foram preparadas usando (C) sulfatado e (G) sulfatado obtidos no Exemplo 4 com as composições que se seguem respectivamente. (a) (b) *Ingrediente principal lOg 5g ((C) ou (G) sulfatado) *Lactose 2,5g 7,5g *Hidroxipropilcelulose 0,5g 0,5g

Esta droga oral é administrada a doentes uma a várias vezes ao dia. (2) 5 mg do mutante sulfatado HV-17 da hirudina obtido no Exemplo 10 foi dissolvido em 10 ml de soro fisiológico esterilizado e usado para encher ampolas para produzir uma droga injectável por via intravenosa.

Esta droga foi administrada a doentes uma ou várias vezes ao dia.

Aplicacão Industrial

Entre os peptídeos do presente invento, os compostos sulfatados têm actividades anti-trombina e anti-plaquetas 61 extremamente elevadas, as quais são úteis na terapia e prevenção de trombose venosa profunda aguda, tromboembolismo pulmonar, embolismo arterial agudo dos membro, enfarte do miocárdio, etc., ou seja eles são úteis como anti-coagulantes. Os compostos não sulfatados possuindo eles próprios as referidas actividades anti-trombina e anti-plaquetas, eles também são úteis na obtenção dos peptideos com actividades anti-trombina e anti-plaquetas extremamente elevadas por sulfatação do grupo hidroxilo dos resíduos de tirosina dos referidos peptideos.

Referência do microoroanismo 1. E. coli RRl/pMTSHV17

Organização do depósito:

Fermentation Research Institute,

Agency of Industrial Science and Technology,

Ministry of International Trade and Industry

Endereço: 1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japan

Data do Depósito: 6 de Fevereiro de 1991 Número do Depósito: FERM BP-3268

Lisboa, 29 de Junho de 1992

J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR COROON, 10-A 3“ 1200 LISBOA