PL93436B1 - - Google Patents

Description

Opis patentowy opublikowano: 30.11.1977 93436 MKPC12d»/14 Int. 01.a C12D 9/14 CZYTELNIA Twórcy wynalazku: Danuta Kotiuszko, Halina Morawska, Krystyna Strzezek, Mieczyslaw Pikala, Andrzej Rafalski, Kaizimierz Czarny, Zygmunt Zaczynski Uprawniony z patentu: Instytut Przemyslu Farmaceutycznego, Warszawa (Polska) Sposób wytwarzania polifunginy Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania polifunginy* antybiotyku przeciwgrzybowego, przy uzyciu mutanta Streptomyces noursei var, polisungmi ATCC £1581 o zwie¬ kszonej zdolnosci do biosyntótyzewaiua antybiotyku.W dotychczas opisanych sposobach wytwarzania poli¬ funginy (opis patentowy nr 71259 oraz opis patentowy nr Si600) stosowano szczep macierzysty (dziki) Streptomyces noursei var. polifungini ATCC 215S1 lub jego klony.W opisie patentowym nr 87664 opisany zostal sporób otrzymywania mutantów Streptomyces noursei var. poli¬ fungini o wielokrotnie zwiekszonej zdolnosci wytwarzania polifunginy. Stwierdzono, ze mutant nr R 851/26/77 tego promieniowca, otrzymany w sposób opisany w w/w opisie patentowym jest szczepem produkcyjnym, rózniacym sie od szczepu macierzystego wieloma wlasciwosciami. Wlasci¬ wosci te zestawiono w ponizszych tabelach 1 i 2.W biosyntezie makrolidowych antybiotyków polienowych jednostkami budulcowymi pierscienia makrolidowego zwiaz¬ ków jest octan i propionian. Za kondensacje jednostek octa¬ nowych odpowiedzialny jest malonylo-CoAj natomiast wlaczanie jednostki trójweglowej (propionianu) odbywa sie po uprzedniej jego aktywacji do propionylo-CoA i karbo- isylacji do metylomalonylo-CoA, Stad wysokoaktywne mutanty powinny posiadac odpo¬ wiednio wysoka czynnosc enzymów aktywujacych octan i propionan oraz wysoka czynnosc enzymów, odpowiedzial¬ nych za wydajnosc procesu polimeryzacji. Mutanta produk¬ cyjnego powinna równiez charakteryzowac niska aktywnosc enzymów odpowiedzialnych za wykorzystanie jednostek 33 budulcowych antybiotyku do innych procesów biochemicz* nych.Aktywnosc enzymatyczna mutanta nr R 851 /2Ó/77 odpe* wiada kryterium biech&nicznym dla mutantów o zwiekszo¬ nej zdolnosci wytwarzania antybiotyku (Raczynska -**• Bc^anowaka K, — Post. Hig. Med, Dosw. 28/1974/499).Wlasciwoacia mutanta R 851/26/77 jest równiez brak zdolnosc wytwarzania aktydionu, co ma wplyw na zwie* kazenie syntezy polifunginy. Brak zdolnosci wytwarzania aktydionu* antybiotyku o wlasciwosciach cytostatycznych, jest istotny równiez z punktu widzenia ochrony zdrowia pracowników, zatrudnionych przy produkcji polifunginy.Obecnie stwierdzono, ze mutant R 851/26/77 dla wy¬ twarzania wysokich stezen polifunginy wymaga obecnosci tluszczów roslinnych lub zwierzecych. Wedlug wynalazku jako jedyne zródlo wegla w pozywce stosuje sie olej sojowy w ilosci co najmniej 5% w stosunku do objetosci pozywki.Sposób wedlug wynalazku wyjasniaja ponizsze przy¬ klady.Przyklad I. Wytwarzanie polifunginy w skali labo¬ ratoryjnej. 1. Hodowla podpowierzchniowa etapu posiewowego.Hodowle podpowierzchniowa etapu posiewowego prowadzi sie na pozywce plynnej w kolbach stozkowych o objetosci 500 ml, zawierajacych po 50 ml pozywek o nastepujacym skladzie: glukoza czysta — 2%, azotan amonowy czysty — 0,5%, WNK (wyciag namokowy kukurydzy) 50% suchej masy — 2%, weglan wapniowy techniczny — 0,5%, woda wodociagowa do 100%. Pozywke wyjalawia sie w auto- 93 4369S436 Tablica 1 Aktywnosc enzymatyczna badanych szczepów Szczep Streptomyces noursei var. polifungini ATCC21581 Mutant nr R 851/26/ /77 Aktywnosc enzymów | Syntetaza cytrynianowa wysoka niska Dehydrogenaza jablczanowa wysoka niska Karboksylotransferaza metylomalonylo-CoA niska wysoka PEP-karboksylaza niska wysoka Tablica 2 Wytwarzanie antybiotyków przeciwgrzybowych Badany szczep Streptomyces noursei var. polifun¬ gini ATCC 21581 Mutant nr R 851/26/77 Wytwarzanie aktydionu Wytwarza Nie wytwarza Wytwarzanie polifunginy 1 Skala laboratoryjna w jednostkach w 1 ml 16569—20760 srednio 64000 Wydajnosc szarzy (fermentory 150 1) w giga jednostkach 0,95—1,75 srednio 7,0 | klawie w ciagu 30 minut w temperaturze 117°C, po ostu¬ dzeniu szczepi sie-zarodnikami mutanta nr R 851/26/77 z hodowli na skosach agarowych z pozywka z wyciagiem ziemniaczanym i glukoza. Hodowle podpowierzchniowa etapu posiewowego prowadzi sie na trzesawce obrotowej o 220 obrotach/minute, w pomieszczeniu termostatowym o temperaturze 28°C w ciagu 30 godzin. 2. Hodowla podpowierzchniowa etapu produkcyjnego.Hodowle podpowierzchniowa etapu produkcyjnego pro¬ wadzi sie na pozywce plynnej w kolbach stozkowych o ob¬ jetosci 500 ml, zawierajacych po 30 ml pozywki o nastepuja¬ cym skladzie: olej sojowy surowy — 5%, WNK (50% suchej masy) — 1%, drozdze suszone browarnicze — 0,25%, azotan amonowy techniczny — 0,5%, weglan wapniowy — 1%, woda wodociagowa do 100%. Pozywke wyjalawia sie w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 117 °C, a po ostudzeniu pozywki do kazdej kolby dodaje sie, w spo¬ sób jalowy, material posiewowy z hodowli podpowierz- chniowej etapu posiewowego w ilosci 5% w stosunku do ilosci pozywki w kolbie. Hodowle etapu produkcyjnego prowadzi sie na trzesawce obrotowej o 230 obrotach/minute w pomieszczeniu termostatowym o temperaturze 30 °C w ciagu 120 godzin. Stezenie antybiotyku w koncowej godzinie hodowli wynosilo 64 000 jednostek/ml polifunginy wedlug oznaczen metoda mikrobiologiczna.Przyklad II. Wytwarzanie polifunginy w fermento- rach. 1. Hodowla podpowierzchniowa etapu posiewowego w kolbach. Jako material szczepienny dla etapu posiewowe¬ go w hodowli podpowierzchniowej w kolbach stosowano zarodniki mutanta produkcyjnego R 851/26/77, postepujac jak w przykladzie I. Materialem z podpowierzchniowej hodowli posiewowej w kolbach szczepiono pozywke etapu posiewowego w fermentorach. 2. Hodowla podpowierzchniowa etapu posiewowego w fermentorach. W fermentorze o objetosci calkowitej 150 1, zaopatrzonym w uklad mieszania i napowietrzania, przygotowano pozywke posiewowa. Do fermentora wprowa¬ dzono okolo 90 1 wody wodociagowej, a nastepnie skladniki 40 45 50 55 pozywki: WNK (50% suchej masy) — 2 kg; azotan amo¬ nowy techniczny — 0,5 kg; weglan wapniowy techniczny, stracany — 0,5 kg; olej sojowy, surowy, wyjalowiony — 1,5 kg. Po wymieszaniu pozywke wyjalowiono para wodna o cisnieniu 2,5 do 2,8 atm. utrzymujaca temperature 117 ° — 120 °C przez 60 minut, po czym ochlodzono i szczepiono materialem szczepiennym z kolb, wlewajac w sposób jalowy do fermentora 1 litr hodowli etapu posiewowego. Hodowle podpowierzchniowa etapu posiewowego w fermentorze prowadzono w ciagu 18—24 godzin, utrzymujac tempera¬ ture w granicach 28°—30 °C, podajac do fermentora jalowe powietrze w ilosci 110N1/min i utrzymujac prace mieszadla na poziomie 300 obrotów/minute. Brzeczka hodowlana, otrzymana w tak prowadzonym procesie, stanowila material szczepienny dla hodowli podpowierzchniowej etapu pro¬ dukcyjnego w fermentorze. 3. Hodowla podpowierzchniowa etapu produkcyjnego w fermentorach. Do fermentora o objetosci calkowitej 150 1 wprowadzono okolo 90 1 wody wodociagowej, a na¬ stepnie skladniki pozywki: drozdze paszowe suszone — 0,4 kg; azotan amonowy techniczny — 0,6 kg; weglan wapniowy techniczny stracany — 1,2 kg; WNK (50% suchej masy) — 1,2 kg; olej sojowy, surowy, niejalowy — 6,0 kg. Po wymieszaniu pozywke wyjalowiono analogicznie, jak w przypadku pozywki posiewowej. Po schlodzeniu do temperatury 28°—30°C pozywke etapu produkcyjnego szczepiono 10 litrami hodowli etapu posiewowego.' Hodowle podpowierzchniowa etapu produkcyjnego pro¬ wadzono w ciagu 100 godzin w temperaturze 28°—30 °C, podajac do fermentora jalowe powietrze w ilosci 140— —150N1/minute i utrzymujac prace mieszadla na poziomie 360 obrotów/minute.W wyniku tak prowadzonego procesu uzyskano 100 li¬ trów brzeczki, zawierajacej srednio 70000 j/ml polifunginy wedlug oznaczen mikrobiologicznych, co stanowilo 7,0 giga jednostek na 1 szarze. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania polifunginy przy zastosowaniu mutantów Streptomyces noursei var. polifungini ATCC93 436 5 6 21581 o zwiekszonej zdolnosci wytwarzania polifunginy, ne zródla azotu oraz olej sojowy jako jedyne zródlo wegla, znamienny tym, ze proces biosyntezy prowadzi sie przy w ilosci co najmniej 5%, w czasie potrzebnym do wytwarza- uzyciu mutanta nr R 851/26/77 vr tlenowej hodowli pod- nia maksymalnej ilosci antybiotyku, który izoluje sie zna- powierzchniowej na pozywkach, zawierajacych przyswajal- nymi sposobami. PL