PL90211B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania bardzo uzytecznej kompozycji enzymatycznej, która mozna stosowac w srodkach pioracych.

Kompleksy enzymów sa znane i na przyklad opisano je w Chem.Abstr. 65 (1966) 14394e/f, gdzie omówiono patent japonski Nr 7833/66, obejmujacy kompleks enzymu i taniny. Kompleks ten jest jednak raczej nietrwaly i trudno jest go przemywac, co powoduje, ze oczyszczanie enzymu po oddzieleniu z pozywki hodowlanej jest trudne.

Znane sa takze pochodne enzymów z wysokoczasteczkowymi zwiazkami, jak na przyklad zwiazek otrzymywany poprzez reakcje rozpuszczonego enzymu zawierajacego wolne grupy aminowe z reaktywnym estrem bedacym produktem reakcji soli 3*(niepodstawionej)izoksazoliowej i polimeru zawierajacego grupy karboksylowe. Metode te opisano w patencie brytyjskim nr 1191149. Zwiazek otrzymany wedlug tego patentu jest jednak zwiazkiem, w którym polimer jest chemicznie zwiazany wiazaniami kowalencyjnymi z enzymem. Jest to zwiazek nierozpuszczalny i dlatego nie nadaje sie do zastosowania w srodkach pioracych, gdyz po plukaniu moze dawac pozostalosc po praniu.

Przedmiotem tego wynalazku jest sposób wytwarzania kompozycji enzymatycznej, która mozna latwo oczyszczac prosta metoda mycia, najlepiej bezposrednio z bulionu fermentacyjnego, przy czym kompozycja ta jest tylko nieznacznie zabarwiona, wykazuje tylko slaby zapach i ponadto mozna ja stosowac w srodkach pioracych takim samym, typowym sposobem jak niezwiazane enzymy.

Opracowano metode wytwarzania kompozycji enzymatycznej polegajaca na tym, ze wodny roztwór enzymu kontaktuje sie z rozpuszczonym polimerem rozpuszczalnym w wodnym roztworze lugu i posiadajacym prosty lub rozgaleziony lancuch wegiel—wegiel z odpowiednio rozmieszczonymi w tym lancuchu grupami karboksylowymi. Polimer ten moze jako dodatkowe podstawniki zawierac ewentualnie grupy weglowodorowe, a lancuch weglowy i/lub podstawniki weglowodorowe moga ewentualnie zawierac heteroatomy, a zwlaszcza atomy tlenu, pomiedzy atomami wegla. Sredni ciezar czasteczkowy tego polimeru wynosi co najmniej 10000, pH uzyskanej mieszaniny ustala sie pomiedzy okolo 2—9 w taki sposób, zeby wytracil sie osad i osad ten oddziela sie. Korzystne jest, aby wodny roztwór enzymu pochodzil z przesaczonego bulionu lub ekstraktu komórkowego.

W celu uzyskania dajacego sie dobrze plukac osadu korzystne jest ustalenie pH t okolo 2—6. Produkt2 90 211 otrzymywany wedlug sposobu tego wynalazku mozna stosowac w srodkach pioracych tak samo jak nie zwiazane enzymy.

Jako polimer w sposobie wedlug wynalazku mozna stosowac dowolny polimer zawierajacy grupy —CHXCY(COOH)—, w których X oznacza atom wodoru lub grupe karboksylowa, a Y oznacza atom wodoru lub grupe metylowa. Polimer ten moze byc skopolimeryzowany z jednym lub wiecej innymi monomerami lub ich czesciowymi, nizszymi estrami lub amidami alkilowymi. Dobrymi polimerami sa tu polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego z grupami karboksylowymi lub kopolimery kwasu akrylowego, metakrylowego lub maleino¬ wego z grupami karboksylowymi z takimi konomerami jak styren, etylen lub eter metylowinylowy. Szczególnie uzyteczny jest polimer skladajacy z merów kwasu maleinowego i styrenu. Czasteczkowy stosunek merów kwasu maleinowego i styrenu wynosi okolo 3 : 1 do 1 : 3, a korzystnie okolo 3 : 2 do 2 : 3. Sredni ciezar czasteczkowy polimeru wynosi powyzej 20000, korzystnie 20000. Szczególnie odpowiednim polimerem jest polimer dostepny na rynku w postaci wodnego roztworu pod nazwa G-942 (E.l. Du Pont de Nemours Co), w którym czasteczkowy stosunek merów styrenu do merów kwasu maleinowego wynosi okolo 1 : 1, a jego sredni ciezar czasteczkowy wynosi powyzej 10000.

Polimery, które mozna stosowac w sposobie wedlug wynalazku podal Graves w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki Pólnocnej 2205882 i Kirk w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki Pólnocnej, nr 2205901.

Kompozycja otrzymywana sposobem wedlug wynalazku jest wzglednie czysta i w stosunku do typowych enzymów ma przyjemniejszy zapach i zabarwienie oraz wyzsza aktywnosc w przeliczeniu na mase. Nieoczekiwa¬ nie, kompozycja nie traci i nie zmienia tych pozadanych i korzystnych wlasciwosci po wprowadzeniu jej do srodków pioracych. Innymi zaletami enzymatycznej kompozycji otrzymywanej sposobem wedlug wynalazku w stosunku do typowych enzymów jest jej mniejsza toksycznosc i slabsze dzialanie alergiczne polaczone z wieksza trwaloscia.

Srodek pioracy zawierajacy kompozycje enzymatyczna otrzymywana sposobem wedlug wynalazku ma co najmniej takie samo dzialanie piorace, jak równowazna ilosc srodka pioracego zawierajacego enzypn wytwarzany typowym sposobem i wykazujacy taka sama aktywnosc enzymatyczna wyrazona w jednostkach „Delft" (jednostki Delft = j.D. oznacza sie opisanym ponizej sposobem).

W sposobie wedlug wynalazku stosuje sie kompozycje pochodzace z enzymów uzywanych powszechnie w srodkach pioracych, takich jak proteazy, na przyklad wytwarzane przez gatunki Bacillus, takie jak MAXATA- SE (rejestrowana nazwa handlowa) lub ALCALASE (rejestrowana nazwa handlowa). Te proteazy wytwarzane przed lub po otrzymaniu kompozycji mozna mieszac zamylazami, lipazami lub podobnymi enzymami.

Wynalazek obejmuje równiez sposób wytwarzania kompozycji z innymi enzymami, nie stosowanymi zazwyczaj w srodkach pioracych, a zwlaszcza typu amylaz, lipaz, jak równiez dehydrogenaz alkoholu, karboksylaz itp.

Jak wykazano powyzej, osad oddziela sie po uregulowaniu wartosci pH roztworu. Oddzielanie osadu przeprowadza sie dowolna znana metoda, jak na przyklad przez odsaczenie lub odwirowanie, przemycie i wysuszenie enzymatycznej kompozycji. Do przemywania mozna stosowac takie rozpuszczalnki lub ich mieszaniny, które w istotny sposób nie rozpuszczaja lub nie rozkladaja kompozycji. Zazwyczaj nadaja sie do tego celu rozpuszczalniki organiczne, takie jak aceton i alkohol etylowy. Wysuszona kompozycje mozna otrzymywac w postaci wolno plynacego proszku, który daje sie latwo wprowadzic do srodków pioracych.

Ilosc polimeru stosowanego do wytworzenia enzymatycznej kompozycji w sposobie wedlug wynalazku zalezy od wlasciwosci enzymu i jego stezenia oraz od wlasciwosci polimeru. Na tworzenie sie kompozycji wplywaja równiez takie czynniki jak pH, obecnosc soli, ladunki elektrostatyczne enzymu i polimeru itp. Ilosc polimeru niezbedna do optymalnego tworzenia sie kompozycji zalezy równiez od innych czynników, jak na przyklad od stezenia roztworu enzymu. W przypadku uzycia na przyklad roztworu G-942 zawierajacego okolo % polimeru i enzymu MAXATASE zaleca sie zastosowanie okolo 0,5 do 3% wagowych polimeru na objetosc enzymu przeliczonego na roztwór o aktywnosci 100000 j.D./g. Do celów specjalnych mozna stosowac inne ilosci polimeru.

Enzymatyczne kompozycje otrzymywane sposobem wedlug wynalazku mozna nastepnie, a zwlaszcza po przemyciu, poddac reakcji z jonem metalu. Odpowiednimi jonami sa jony metali trójwartosciowych, takich jak glin, zelazo i chrom lecz mozna równiez stosowac jony metali o innych wartosciowosciach, takich jak cyrkon.

Produkt otrzymywany sposobem wedlug wynalazku mozna stosowac w srodkach pioracych.

Aktywnosc enzymatyczna substancji czynnych wyraza sie w jednostkach, przy czym za jednostke przyjmuje sie taka ilosc enzymu, która jest zdolna do przeprowadzenia specyficznej reakcji chemicznej w pewnym okresie czasu. Na oznaczenie aktywnosci duzy wplyw maja warunki reakcji. Korzystnie aktywnosc oznacza sie w takich warunkach, jakie stosuje sie w roztworze pioracym. Poniewaz pewne proteazy stosuje sie w proszkach do prania, dlatego tez oznaczanie prowadzi sie w obecnosci trójpolifosforanu sodowego, znajdujace-90 211 3 go sie w wiekszosci tych proszków. Wartosc pH i temperature dostosowuje sie do warunków prania. Aktywnosc wyrazona w jednostkach „Delft" (j.D.) oznacza sie na kazeinie. Trwalosc wodnego roztworu enzymu okresla sie oznaczajac w odpowiednich odstepach czasu aktywnosc roztworu.

W tym celu 130 g CaCI2 • 6H20 rozpuszcza sie w wodzie destylowanej do objetosci 3000 ml otrzymujac odczynnik 1. 42 g MgCI2 • 6H20 rozpuszcza sie w wodzie destylowanej do lacznej objetosci 3000 ml otrzymu¬ jac odczynnik 2. 63 g NaHC03 rozpuszcza sie w wodzie destylowanej do lacznej objetosci 3000 ml# otrzymujac odczynnik 3. Mieszanine odczynników 1, 2 i 3 w ilosci po 100 ml uzupelnia sie woda destylowana do lacznej objetosci 10000 ml otrzymujac odczynnik 4 o twardosci 15° niemieckich. 36,34 g trój~(hydroksymetylo)amino- metanu rozpuszcza sie w odczynniku 4 do lacznej objetosci 1000 ml otrzymujac odczynnik 5. Mieszanme 1000g trójpolifosforanu sodowego, 500 ml odczynnika 1, 500.ml odczynnika 2 i 500 ml odczynnika 3 rozpusz¬ cza sie w 48,5 litrach wody destylowanej i doprowadza pH roztworu do wartosci 8,5 dodajac odpowiednia ilosc % roztworu HCI, przy czym otrzymuje sie odczynnik 6. 540 g kwasu trójchlorooctowego rozpuszcza sie w wodzie destylowanej do lacznej objetosci 3000 ml, otrzymujac odczynnik 7. 900 g octanu sodowego • 3H20, rozpuszcza sie w wodzie destylowanej do lacznej objetosci 3000 ml otrzymujac odczynnik 8. 900 ml kwasu octowego rozpuszcza sie w wodzie destylowanej do lacznej objetosci 3000 ml otrzymujac odczynnik 9. 2,5 ml Tween«80 rozpuszcza sie w wodzie destylowanej do lacznej objetosci 50 ml otrzymujac odczynnik 10. 100 ml odczynnika 7, 100 ml odczynnika 8, 100 ml odczynnika 9 i 4 ml odczynnika 10 miesza sie razem w podanej kolejnosci i rozciencza woda destylowana do lacznej objetosci 1000 ml otrzymujac odczynniki!. Roztwór substratu kazeiny otrzymuje sie nastepujaco: 36,0 kazeiny (firmy Merck, do celów biochemicznych) rozpuszcza sie w 2,5 litrach odczynnika 4 mieszajac, po czym roztwór miesza sie jeszcze w ciagu 10 minut, dodaje 300 ml odczynnika 5 i calosc miesza sie wciagu 10 minut. Po czym mieszanine miesza sie i ogrzewa do temperatury 40°C na lazni wodnej o temperaturze 70°C. W temperaturze 40°C mieszanine alkalizuje sie do wartosci pH 8,5, dodajac 1n roztwór NaOH, Po ochlodzeniu do temperatury pokojowej objetosc mieszaniny uzupelnia sie do 3 litrów odczynnikiem 4 i calosc miesza sie. Tak otrzymany odczynnik 12 jest trwaly wciagu 1 dnia, przy przechowywaniu w lodówce.

W .celu oznaczenia aktywnosci proteazy odwazona ilosc homogenicznego preparatu enzymatycznego rozpuszcza sie w odpowiedniej ilosci odczynnika 6 i roztwór alkalizuje do pH 8,5, dodajac-w temperaturze pokojowej 1n roztwór NaOH lub HCI. Stezenie enzymu w roztworze dobiera sie tak, aby aktywnosc roztworu wynosila 20—30 jednostek Delft (j.D.) proteazy na mililitr. Roztwór ten jest trwaly w ciagu najwyzej 2 godzin.

Roztwór enzymu, roztwór kazeiny i probówki ogrzewa sie na lazni wodnej do temperatury 40°C±0,1°C. Do probówki dodaje sie wiec 1 ml roztworu enzymu, a gdy osiagnie on temperature 40°C dodaje sie 5 ml roztworu kazeiny i dokladnie miesza. Czas reakcji wynosi dokladnie 40 minut, po czym wkrapla sie 5 ml odczynnika 11 i razem miesza. Probówke umieszcza sie na lazni wodnej na okres 30 minut w celu skoagulowania wytraconego osadu, który nastepnie odwirowuje sie w ciagu 15 minut.

Dla wszystkich roztworów enzymów przeprowadza sie próbe slepa, dodajac do probówki 5 ml odczynni¬ ka 11 i ogrzewajac go do temperatury 40°C, a nastepnie dodajac 1 ml roztworu enzymu oraz 5 ml roztworu kazeiny. Zawartosc probówki miesza sie dokladnie i po skoagulowaniu osadu VUcieplej lazni wodnej wciagu minut odwirowuje sie go wciagu 15 minut. Nastepnie mierzy sie gestosc ^optyczna roztworu w swietle ultrafioletowym przy dlugosci fali 275 milimikronów w odniesieniu do wody destylowanej na spektrofotome¬ trze. Róznica gestosci optycznych badanego roztworu i slepej próby (OD) powinna wynosic okolo 0,4—0,6.

W przypadku, gdy ta róznica jest wieksza lub mniejsza oznaczenie powtarza sie, stosujac bardziej rozcienczony lub stezony roztwór enzymu. Aktywnosc enzymu, wyrazona w jednostkach Delft, j.D./gram substancji zawieraja¬ cej enzym oblicza sie wedlug nastepujacego wzoru: j.D./g = OD X 11 X wspólczynnik rozcienczenia X 4,545, w którym 11 oznacza stopien rozcienczenia roztworu enzymu przez roztwór kazeiny i odczynnik 11, wspólczynnik rozcienczenia oznacza iloraz calkowitej liczby mililitrów roztworu enzymu i wagi próbki w gramach, a 4,545 oznacza wspólczynnik przemiany.

Sposób wedlug wynalazku przedstawiono w przykladach wykonania.

Przyklad I. Surowa proteaze wytworzona przez Bacillus subtilis rozpuszcza sie w wodzie w takiej ilosci, aby uzyskac roztwór o stezeniu 100000 j.D./ml i zobojetnia do pH 7. Do roztworu tego dodaje sie 10% objetosciowych (15% wagowych) wodnego roztworu polimeru o nazwie handlowej G-942 stanowiacego 24—26% wodny roztwór kopolimeru, kwasu maleinowego i styrenu w stosunku 1 : 1. Po dodaniu roztworu kopolimeru do roztworu enzymu wytwarza sie niewielka ilosc osadu. Mieszanine miesza sie i zakwasza do pH 5, dodajac rozcienczony roztwór HCI, w wyniku czego powstaje duzo osadu stanowiacego kompleks proteazy i polimeru.

Otrzymana zawiesine miesza sie w ciagu 1 godziny, osad odsacza sie. Otrzymany osad przemywa sie mieszajac z odpowiednia iloscia acetonu i ponownie odsacza. Po wysuszeniu otrzymuje sie kompozycje proteazy o czystos¬ ci 2—4 razy wiekszej niz kompozycja otrzymana z surowego materialu wyjsciowego.4 90 211 Ponizej przedstawiono róznice wlasnosci kompozycji p.oteazy otrzymanej sposobem wedlug wynalazku i proteazy otrzymanej w sposób konwencjonalny.

Kazda z kompozycji rozpuszcza sie w wodzie w takiej ilosci, aby otrzymac roztwór o aktywnosci enzymatycznej równej 100000 j.D./ml, dodajac równoczesnie rozcienczony roztwór wodorotlenku sodowego tak, aby utrzymac wartosc pH 9. Nastepnie dodaje sie rozcienczony roztwór chlorku N,N-dwumetylo-N-benzylo-N-(t- -oktylofenoksyetoksyetylol-amoniowego o nazwie handlowej Hyamine 1622.Z roztworu kompozycji otrzymanej w sposób^opisany powyzej wytraca sie osad, podczas gdy w roztworze enzymu otrzymanego w inny sposób osad sie nie tworzy. W slepej próbie zawierajacej srodek garbujacy, a nie zawierajacej enzymu, po dodaniu Hyamine 1622 osad wytraca si§ równiez. Pozwala to na przypuszczenie, ze srodek garbujacy stanowi czesc kompozycji proteazy otrzymanej zgodnie ze sposobem opisanym w tym przykladzie.

Kompozycje proteazy otrzymanej w powyzszy sposób porównywano z preparatem konwencjonalnym za pomoca testu elektroogniskowania opisanym przez H. Haglund'a w Science Tools 14, Nr 2, str. 17 (1967).

Badajac kompozycje otrzymana sposobem opisanym w niniejszym przykladzie otrzymuje sie cialo stale w obszarze nizszego pH, które to cialo stale poyoddzieleniu i rozpuszczeniu w wodzie o wyzszym pH daje osad z Hyamine 1622. Widmo w swietle ultrafioletowym dla tego roztworu jest identyczne z widmem rozcienczonego roztworu polimeru G-942. Stwierdzono, ze w przypadku enzymu konwencjonalnego nie otrzymuje sie wdanym zakresie pH ciala stalego i dodanie Hyamine 1622 nie powoduje wytracenia sie osadu. Test powyzszy wykazuje, ze kompozycja otrzymana -w tym przykladzie rózni sie od znanych preparatów enzymatycznych tym, ze enzym jest w niej zwiazany w kompleks z polimerem. ¦ ¦ • Kompozycje enzym—polimer otrzymana opisywanym sposobem dodaje sie w ilosci 2000 j.D./g do srodka pioracego zawierajacego 54 czesci wagowe bezwodnego siarczanu sodowego, 24 czesci wagowe trójpolifosforanu sodowego, 6 czesci wagowych pirofoeforanu sodowego, 10 czesci wagowych kwasnego weglanu sodowego, 2 czesci wagowe karboksymetylocelulozy, 4 czesci wagowe dwualkilofenoksypolh(etylenoksy)-etanolu. Tak otrzy¬ many srodek pioracy ma takie same wlasnosci piorace jak srodek, w którym kompozycje enzymu zastapiono preparatem enzymatycznym otrzymanym w sposób konwencjonalny. Srodek pioracy o skladzie podanym powyzej zawierajacy kompozycje enzymu jest .bardziej klarowny i pachnie mniej niz podobny preparat pioracy zawierajacy enzymy otrzymane w sposób konwencjonalny.

W celu oznaczenia wlasnosci pioracych przeprowadzono test prania stosujac srodek pioracy o wyzej wymienionym skladzie, ale ze zmienna iloscia kompozycji enzymatycznej. Przygotowano serie próbek zawieraja¬ cych 0, 250, 500, 1000 i 2000 j.D./g kompozycji enzymatycznej otrzymanej sposobem opisanym w niniejszym przykladzie oraz druga serie próbek zawierajacych 0, 250, 500, 1000 i 2000 j.D./g enzymu przygotowanego w sposób konwencjonalny. Do prania uzyto kawalki tkaniny EMPA-116, otrzymane z Eidgenóssische Material Prufungs-und Versuchsanstalt fur Industrie, Bauwesen und Gewerbe, Skt. Gallen, Szwajcaria, o wymiarach 5x5 cm ubrudzone krwia, mlekiem i sadza. Roztwór pioracy przygotowano rozpuszczajac 4 g srodka pioracego w sprepa¬ rowanej wodzie bedacej odczynnikiem 4 uzupelniajac te wode do objetosci 1 litra. Kolby Erlenmeyera o pojemnosci 300 ml, zawierajace 250 ml roztworu pioracego umieszcza sie na lazni wodnej w temperaturze 45°C. Do kazdej kolby wklada sie kawalek tkaniny pozostawiajac ja do zamoczenia w ciagu dokladnie 1 godziny w temperaturze 45°C, mieszajac kolby w odstepach 10 minutowych. Po usunieciu roztworu pioracego dolewa sie 250 ml standardowej wody biezacej, nastepnie kolby zamyka sie korkiem gumowym i energicznie wytrzasa w ciagu 1 minuty. Nastepnie wszystkie kawalki tkaniny zbiera sie w zlewce i plucze pod wolno splywajaca woda biezaca wciagu co najmniej 10 minut. Wyplukane kawalki tkaniny ukladano pomiedzy recznikami i suszono wciagu 12 godzin nie wyciskajac. Wlasnosci piorace oceniono mierzac przy filtrze nr 1 remisje na aparacie Elrepho stosujac jako wskaznik tlenek magnezowy. Remisje obliczono jako procent remisji doskonale czystego kawalka tkaniny, tego samego gatunku. Otrzymane wyniki podano w tablicy I. Z uzyskanych wyników widac, ze wartosci remisji nie róznia sie w sposób znaczny, a wiec mozna wywnioskowac, ze wlasnosci piorace próbek zawierajacych kompozycje enzymatyczna sa takie same, jak wlasnosci piorace próbek zawierajacych enzym przygotowany w sposób konwencjonalny.

Tablica I I J.D./g próbki 0 250 500 1000 2000 : 1 Próbka kompozycji enzymatycznej wedlug wynalazku 45 58 66 69 75 , . — Próbka enzymujotrzymanego w sposób kcnwencjonamy 45 59 66 70 7390 211 Przyklad II. Do stezonego przesaczu hodowli bakteryjnej uzyskanego poprzez fermentacje Bacillus subtilis o wartosci pH = 7 i aktywnosci okolo 100000 j.D./ml dodaje sie 10% objetosciowych roztworu polimeru G-942 zawierajacego 25% kopolimeru w wodzie, po czym wytraca sie niewielka ilosc osadu. Nastepnie mieszanine zakwasza sie do wartosci pH 4 dodajac rozcienczony roztwór kwasu siarkowego, co powoduje wytracenie duzej ilosci osadu stanowiacego kompozycje proteaza—polimer. Osad oddziela sie w sposób analogicz¬ ny do opisanego w przykladzie I. Otrzymana kompozycja proteazy jest 2—4 razy czysciejsza niz preparaty konwencjonalne. Powyzej opisanym sposobem otrzymuje sie kompozycje z wydajnoscia 90% w przeliczeniu na aktywnosc proteazy, w roztworze wyjsciowym. Srodek pioracy zawierajacy kompozycje enzymatyczna ma podobne wlasnosci piorace, jak srodek pioracy zawierajacy porównywalne ilosci tego samego enzymu otrzymane¬ go w sposób konwencjonalny.

Przyklad III. Przeprowadzono doswiadczenie z równowaznymi polimerami dodajac wodne roztwory badanych polimerów do roztworu proteazy zawierajacego 80000—100000 j.D./ml i zakwaszajac do wartosci pH 4. Wytracone osady odsacza sie lub odwirowuje, przemywa i suszy w sposób analogiczny do opisanego powyzej. Uzyskane wyniki przedstawiono w tablicyII. * Ta b I i ca II Polimer 1 Kwas poliakrylowy Kopolimer kwas akrylowy—styren, 2 : 1 Kwas pol i metakry Iowy Kopolimer kwas metakryIowy—styren, 2 : 1 Kopolimer kwas maleinowy—styren, 1 : 1 (Kopolimer kwas maleinowy—styren, 1 : 1 Kopolimer kwas maleinowy—styren, 1 : 2 jUsieciowany kopolimer ! etylen—kwas maleinowy, 1:1 j Kopolimer etylen—kwas maleinowy, 1 : 1 Mieszanina kopolimerów 1:1, etylen—kwas maleinowy —1:1 | i kwas maleinowy—styren — 1:1 Kopolimer kwas maleinowy—styren —1:1 Kopolimer monoestru butylowego i eteru metylowinylowego —1:1 Ciezar czasteczkowy 2 21000 50000 26000 21000 44000 31000 44000 1 Dawka i %l) $ Wydajnosc 3 4' 1 0,5 0,5 0,75 1,25 0,5 0,25 0,5 0,16 0,15 0,5 0,5 0,6* 38 67 75 66 83 83 79 57 55 98 95 Aktywnosc J.D./g I 3520000 I 4740000 4560000 4480000 4220000 4200000 3850000 4860000 4700000 3320000 4320000 3780000 1) % wagowy/objetosc w przeliczeniu na'sucha mase skladników.

Przyklad IV. Badano wplyw ilosci roztworu polimeru G-942 na wydajnosc osadu. Do badan stosowane roztwór proteazy otrzymany z Bacillus subtilis o aktywnosci okolo 70000 j.D./ml. Wydajnosc osadu oznaczono rozpuszczajac mokry osad i okreslajac jego aktywnosc proteolityczna. Osad przemywano i suszono w sposób juz opisany i oznaczono zawartosc polimeru w suchym osadzie. Uzyskane wyniki przedstawiono w tablicy III. Optymalna wydajnosc osadu otrzymano stosujac dawke 4-8% handlowego roztworu G-942.

Tablica III f i Dawka ) % handlowego roztworu G-942 i 0,25 0,5 1 2 4 8 16 Wydajnosc osadu % 31 63 80 85 89 89 77 Zawartosc polimeru G-942 | w suchym preparacie | % J I 18 I ,56 90 211 Przyklad V. Kompozycje Alcalase z kopolimerem kwas maleinowy—styren.

Do roztworu Alcalase stanowiacej enzym produkowany przez Bacillus subtilis dodaje sie 5% obj. rozcien¬ czonego w stosunku 1 :5 roztworu G-942, Nast^onie zakwasza sie roztwór do wartosci pH 4,2 dodajac 4n roztwór kwasu octowego. Wytracony osad odsacza sie, przemywa acetonem i suszy, otrzymujac bezwodna kom¬ pozycje Alcalase—kopolimer kwasu maleinowego i styrenu o aktywnosci 2420000 j.D./g z wydajnoscia 92%.

P r z y k l a d VI. Kompozycja proteazy z kopolimerem kwas maleinowy—styren.

Do 800 ml przesaczu hodowli Bacillus alkalophilus zawierajacego okolo 28000 j.D./ml dodaje sie 16 ml rozcienczonego w stosunku 1 : 5 polimeru G-942. Nastepnie roztwór zakwasza sie do wartosci pH 4,2 dodajac 4n roztwór kwasu octowego. Wytracony osad odwirowuje sie, przemywa mieszanine alkoholu metylowego i acetonu w stosunku 1 :1 i suszy, otrzymujac kompozycje proteaza—kopolimer kwasu maleinowego ze styrenem o aktyw¬ nosci 10900000 j.D./g z wydajnoscia 86%.

Przyklad VII. Kompozycje amylazy z kopolimerem kwas maleinowy—styren.

Do 200 ml roztworu amylazy wyprodukowanej przez Bacillus subtilis dodaje sie 20 ml rozcienczonego w stosunku 1 :5 roztworu G-942 i doprowadza sie roztwór do wartosci pH za pomoca 1 n roztworu kwasu solnego. Wytracony osad odwirowuje sie i miesza z mala iloscia wody. Mieszanine doprowadza sie do wartosci pH 7 dodajac 1n roztwór wodorotlenku sodowego i dolewa trzykrotna objetosc acetonu. Po odsaczeniu, przemyciu acetonem i wysuszeniu otrzymuje sie kompozycje amylaza—kopolimer kwasu maleinowego ze styrenem z wydajndscia 81%.

Przyklad VIII. Kompozycje lipazy z kopolimerem kwas maleinowy—styren.

Do 20 ml roztworu zawierajacego 600 mg preparatu lipazy (Lipase-My produkowanej przez Meito Sangyo Co., Ltd., Nagoya, Japonia z bulionu hodowli Candida cylindracaea nov. sp.) o wartosci pH 4,5 dodaje sie 2 ml rozcienczonego w stosunku 1 : 5 roztworu G-942. Nastepnie roztwór doprowadza sie do wartosci pH 3,5 dodajac In roztwór kwasu solnego. Wytracony osad odwirowuje sie, przemywa acetonem i suszy, otrzymujac 263 mg kompozycji lipaza—kopolimer kwasu maleinowego ze styrenem o aktywnosci równej 90% poczatkowej aktyw¬ nosci lipazy.

Przyklad IX. Kompozycja laktazy z kopolimerem kwas maleinowy—styren. ' Do 40 ml roztworu zawierajacego 1% preparatu laktazy otrzymanej z drozdzy i 0,5% zelatyny dodaje sie 4,4 ml rozcienczonego w stosunku 1 :5 roztworu G-942 i kwasowosc doprowadza sie do wartosci pH 4.

Utworzony osad kompozycji laktoza—kopolimer kwasu maleinowego ze styrenem wykazuje 61% aktywnosci laktazy w stosunku do roztworu wyjsciowego. W analogiczny sposób przeprowadza sie slepa próbe nie dodajac G-942. Przy zakwaszeniu wytraca sie osad, ale o aktywnosci mniejszej niz 1% poczatkowej aktywnosci laktazy.

Przyklad X. Kompozycja dehydrogenazy alkoholowej z kopolimerem kwas maleinowy—styren.

Do 120 ml przesaczy zawierajacego dehydrogenaze alkoholowa, otrzymana w wyniku autolizy drozdzy piekarniczych o wartosci pH 7 dodaje sie 4% objetosciowych rozcienczonego w stosunku 1 ; 5 roztworu G-942.

Nastepnie doprowadza sie wartosc pH roztworu co wartosci 4,5 dodajac 4n roztwór kwasu octowego.

Wytracony osad odwirowuje sie, przemywa alkoholem i suszy, otrzymujac 3,3 g suchego kompleksu dehydroge¬ naza alkoholowa—kopolimer kwasu maleinowego ze styrenem o aktywnosci równej 55% poczatkowej aktywnosci przesaczudrozdzowego. > Przyklad XI. Wlasnosci toksyczne próbki enzymu otrzymanego w sposób konwencjonalny przez wytracenie rozpuszczalnikiem organicznym oraz kompozycji enzym-polimer otrzymanej w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie I bada sie w sposób opisany ponizej. Próbki standaryzuje sie siarczanem sodowym tak, aby otrzymac aktywnosc proteolityczna równa okolo 300000 j.D./g, rozpuszcza sie w wodzie i rozprowadza do komór za pomoca rozpylacza, W kazdej komorze znajdowalo sie 5 mysz plci meskiej o wadze 24 g kazda, otrzymanych zCarworth Burope, Alconbury, Huntóngdon, Anglia. W pierwszym doswiadczeniu stezenie enzy¬ mów w powietrzu wynosilo 5000 j.D./litr. Myszy poddawano dzialaniu enzymu w ciagu 5 godzin, a nastepnie obserwowano je w ciagu 7 dni. Pod wplywem dzialania produktu otrzymanego w sposób konwencjonalny padly dwie myszy, natomiast kompozycja enzym—polimer wedlug wynalazku nie spowodowala smierci zadnego zwierzecia.

W drugim doswiadczeniu 8 szczurów, w tym 4 samice i 4 samce, pochodzacych z tego samego zródla poddano dzialaniu enzymów o aktywnosci 800 j.D./litr wciagu 68 godzin. Po trzech dniach obserwacji stwierdzono, ze pod wplywem dzialania enzymu otrzymanego w sposób konwencjonalny padlo 6 szczurów, natomiast kompozycja enzym—kopolimer nie spowodowala smierci zadnego zwierzecia.

W trzecim doswiadczeniu 8 szczurów poddano dzialaniu enzymów o aktywnosci 800j.D./litr wciagu 5 kolejnych dni po piec godzin dziennie. Po 14 dniach obserwacji stwierdzono, ze pod wplywem dzialania enzymu otrzymanego w sposób konwencjonalny padl 1 szczur, natomiast kompozycja enzym—polimer wedlug wynalaz¬ ku nie spowodowala smierci zadnego szczura.90 211 7

Claims (13)

Z astrzezen i a patento we

1. Sposób wytwarzania enzymatycznej kompozycji, znamienny tym, ze wodny roztwór enzymu kontaktuje sie z rozpuszczonym polimerem rozpuszczalnym w wodnym roztworze lugu i posiadajacym prosty lub rozgaleziony lancuch weglowy z grupami karboksylowymi odpowiednio rozmieszczonymi wzdluz tego lancucha, oraz ewentualnie zawierajacy jako kolejne podstawniki podstawione ewentualnie grupy weglowodoro¬ we i jego%lancuch weglowy i/lub podstawniki weglowodorowe ewentualnie zawieraja heteroatomy, a zwlaszcza atomy tlenu pomiedzy atomami wegla, a sredni ciezar czasteczkowy tego polimeru wynosi co najmniej 10000, nastepnie pH mieszaniny ustala sie pomiedzy okolo 2—9 w taki sposób aby wytracil sie osad, który oddziela sie.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie wodny roztwór enzymu pochodzacy z przesaczonego bulionu lub ekstraktu komórkowego.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ustala sie pH mieszaniny pomiedzy okolo 2—6.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie polimer zawierajacy grupy —CHXCY(COOH)—, w których X oznacza atom wodoru lub grupe karboksylowa, Y oznacza atom wodoru lub grupe metylowa oraz polimer ten ewentualnie kopolimeryzuje sie z jednym lub wiecej innymi monomerami lub ich czesciowymi nizszymi estrami lub amidami alkilowymi.

5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze jako polimer stosuje sie polimer kwasu akrylowego lub metakrylowego z grupami karboksylowymi lub kopolimer kwasu akrylowego, metakrylowego lub maleinowego z grupami karboksylowymi z takimi konomerami jak styren, etylen lub eter metylowinylowy.

6. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze stosuje sie polimer skladajacy sie z merów kwasu maleinowego i styrenu.

7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze utrzymuje sie czasteczkowy stosunek merów kwasu maleinowego i styrenu od okolo 3 : 1 do 1 : 3.

8. Sposób wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ze utrzymuje sie czasteczkowy stosunek merów kwasu maleinowego i styrenu od okolo 3 : 2 do 2 : 3.

9. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie polimer o srednim ciezarze czasteczkowym powyzej 20000.

10. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako enzym stosuje sie proteaze, która ewentualnie miesza sie z innym enzymem, takim jak amylaza i/lub lipaza.

11. Sposób wedlug zastrz. 10, znamienny tym, ze stosuje sie proteaze wytwarzana przez gatunki Bacillus.

12. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze enzymatyczna kompozycje odsacza sie, przemywa i suszy.

13. Sposób wedlug zastrz. 12, znamienny tym, ze enzymatyczna kompozycje przemywa sie rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak aceton lub alkohol etylowy.