Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania na drodze mikrobiologicznej redukcji zwiazków o wzorze ogólnym 2, optycznie czynnego 3-metoksy-8/14/-seco-1,3,5/10/#9/11/-estratetraen-17j8-ol-14-onu (wzór 2a) (zwanego dalej seco-ketoalkoholem) z achiralnego 3-metoksy-8/14/-secb-1,3,5/10/,9/11/-estratetraen-14,17-d- ionu (1a) (zwanego dalej seco-dionem) oraz optycznie czynnego 130-etylo-3-metoksy-8/14/-seco-1,3,5/1O/,9/11/- estratetraen-170-ol-14-onu (wzór 2b) (zwanego dalej 130-etylo-seco-ketoalkoholem) z achiralnego 13-etylo-3-mettr ksy-8/14/-seco-1,3,5/10/,9/11/-ekstratetraen-14,17-dionu (1b) (zwanego dalej 13-etylo-seco-dionem).Zwiazki te stanowia wazne pólprodukty w totalnej syntezie 19-nor-steroidów posiadajacych dzialanie hormonalne, stosowane równiez jako doustne srodki antykoncepcyjne. « Istota tej redukcji mikrobiologicznej jest selektywna redukcja jedynie grupy ketonowej na C-17 z dwu mozliwych do redukcji grup ketonowych na C-14 i C-17 i otrzymywanie na C-17 jednej tylko grupy alkoholowej o konfiguracji wylacznie 17/3. Selektywnosc tej redukcji pozwala na otrzymywanie produktu o wzorze ogól¬ nym 2 optycznie czynnego o konfiguracji 130-metylo (dla 2a) i 13/J-etylo (dla 2b) zgodnie z konfiguracja szeregu naturalnego steroidów. Pozwala to w dalszych syntezach na cyklizacje prowadzaca do jednego tylko ukladu pierscieni w szkielecie steroidowym, takiego jaki jest w produktach naturalnych.Znane sa chemiczne jak i mikrobiologiczne sposoby otrzymywania z achiralnych dwuketonów o wzorze 1 optycznie czynnych seco-ketoalkoholi o wzorze 2. Metody chemiczne ze wzgledu na trudnosci techniczne i niskie wydajnosci rozszczepienia racemicznycrT pólproduktów wzglednie gotowych produktów sa ekonomicznie nieoplacalne. < Stosowane metody mikrobiologiczne prowadzace do otrzymania seco-ketoalkoholu (2a) i 13/J-etylo-seco- ketoalkoholu (2b) opieraja sie na redukcji w standardowych warunkach achiralnych substratów seco-dionu (1a) i 13-etylo-seco-dionu (Ib) przy uzyciu przewaznie objetych ochrona patentowa szczepów róznych mikroorga¬ nizmów, wzglednie izolowanych preparatów enzymatycznych. ; Sposród mikroorganizmów przydatnych do redukcji nalezy wymienic miedzy innymi drozdze z rodzaju Saccharomyces. Do najobszerniejszych opisów patentowych z tej dziedzinynalezy opis jatentowy NRD nr 55014 z dnia 12. IV. 1966 i opis patentowy angielski nr 1 165 143 z dnia 2JX.1966 9raz%pis patentowy francuski numer 2 007 270 z dnia 18. IV. 1969.2 87104 W dwóch pierwszych redukcje seco-dionu (1a) do seco-ketoalkoholu (2a) przeprowadza sie przy pomocy gatunków Saccharomyces ellipsoides (Stamm Toksyer-S 22, Berlin), S. carlsbergergensis (CBS 2354), S. uvarum (CBS 1508) iCurvularia lunata (NRRL 2434). Trzeci opis patentowy — francuski, podaje kolejno gatunki: Rhodotorula glutinis (ATCC 10788), Torulopsis utilis (NRRL Y-900) i Cryptococcus laurentii (Rhodotorula aurea) (QM 8412) jako zdolne do tego samego przeksztalcenia. Jedynie w obu pierwszych opisach patentowych podano wydajnosc reakcji w przypadku uzycia S. uvarum siegajaca 71% seco-ketoalkoholu (1a).Wsród publikacji praca N.KOSMOLA, K. KIESL|CHA i innych w Ann. Chem. 701, 198 (1967) opisuje redukcje omawiana przeprowadzana przy pomocy szczepu S. uvarum (CBS 1508) z wydajnoscia seco-ketoalkoholu 2a 75%.Reakcja redukcji mikrobiologicznej 13-etylo-seco-dionu (1b)do 13j3-etylo-secoketoalkoholu (2b) przebiega wedlug omawianych opisów patentowych przy pomocy gatunków: Saccharomyces uvarum (CBS 1508) — opis patentowy niemiecki (NRD) i opis patentowy angielski - Rhodotorula glutinis (ATCC 10788), Torulopsis utilis (NRRL Y-900) oraz Cryptococcus laurentii (Rhodotorula aurea) (QM 8412) w opisie patentowym francuskim.Opisano równiez w dwu pierwszych opisach patentowych redukcje seco-dionu (1a) do 130-metylo-3-meto- ksy-1,3,5/10/,9/11/-estratetraen-14a-ol-17-onu przy pomocy gatunku Saccharomyces cerevisiae (NRRL-Y-2250), S. cerevisiae (NCYC 1021), S. carlsbergenisis (CBS 1505), S. pastorianus (Inst. f. Garungsgewerbe) Berlin: kop. 33/i S. uvarum (CBS 1508) (ostatni szczep uzyto w metodzie spoczynkowych kultur i suchego proszku).Celem wynalazku jest znalezienie odpowiedniego szczepu nie objetego ochrona patentowa oraz opracowanie z jego zastosowaniem metody redukcji achiralnych seco-dionu (1a) i 13-etylo-seco-dionu (1b) do optycznie czynnych seco-ketoalkoholu (2a) i 13j3-etylo-ketoalkoholu (2b). Cel ten zostal osiagniety przez uzycie do mikrobiologicznej redukcji szczepu TR 105 nalezacego do gatunku S. cerevisiae, który przeksztalca opisane wyzej substraty 1a i 1b odpowiednio w optycznie czynne produkty o wzorach 2a i 2b.Szczep TR T05 gatunku Saccharomyce* cerevisiae nalezy do drozdzy melasowych. W procesie opisywa¬ nym przenosi sie go z kultury na skosie agarowym do 100 cm3 sterylnej brzeczki slodowej o gestosci 8 do 9°Blg i rozmnaza w temperaturze 28°C przez 48 godzin. Tak rozmnozona kulture przelewa sie do kolby dwulitrowej zawierajacej 1 dm3 pozywki sporzadzonej przez rozpuszczenie widm3 20 g wyciagu slodowego. Wyciag slodowy zawiera 75% wagowych maltozy, 2% dekstryn, 4% substancji bialkowych, 1% soli mineralnych i 18% wody. Dodatek 20 g glukozy do takiej kultury wodnej powoduje zwiekszenie wydajnosci produktu* Sposób wedlug wynalazku polega na wprowadzeniu do przygotowanej — jak opisano wyzej 24-go- dzinnej kultury wodnej — szczepu TR 105 z gat. S. cerevisiae seco-dionu (1a) lub 13-etylo-seco-dionu (1b) i na ich redukcji do odpowiedniego seco-keto-alkoholu (2a) lub 13-etylo-seco-keto-alkoholu (2b). Uklad enzymatycz¬ ny zawarty w zywych komórkach uzytego szczepu powoduje przeksztalcenia substratów. Ilosc dodawanego substratu do 1 dm3 kultury wynosi od 300—2000 mg. Redukcje prowadzi sie przy wstrzasaniu w czasie od dwóch do siedmiu dni w temperaturze od 20 do 28°C i wartosci pH miedzy 4,6 do 6. Korzystnie jest ze wzgledu na wydajnosc reakcji, prowadzic redukcje w temperaturze 27°C, przez 6 dni przy pH o wartosci 5. Redukcje kontroluje sie na drodze chromatografii cienkowarstwowej. Podane parametry reakcji sa najkorzystniejsze z nastepujacych wzgledów: skracanie czasu redukcji powoduje obnizenie wydajnosci produktów, w wyniku zas przedluzania czasu powstaja dodatkowo inne produkty. Temperatura 27°C i wartosci pH 5 stanowia warunki najkorzystniejsze dla rozwoju mikroorganizmu. Zmiana tych wartosci hamuje jego rozwój. Wstrzasanie reagujacej mieszaniny przyspiesza przeksztalcenia zawiesiny substratów, które sa w wodzie nierozpuszczalne. Substraty sa ekstrahowane eterem etylowym a nastepnie oczyszczane przez krystalizacje i chromatografie. Wydajnosci dochodza do 77% dla produktu 2a i 69% dla produktu 2b, obliczone w stosunku do substratów. Zastosowanie chromatografii pozwala na odzyskanie nieprzeksztalconych substratów, które uzyte zostaja ponownie do redukcji, a tym samym podniesione zostaja wydajnosc produktów.W porównaniu z przedstawionymi na wstepie reakcjami mikrobiologicznymi sposób wedlug wynalazku po raz pierwszy wykorzystuje nowy szczep z gatunku Saccharomyces cerevisiae do stereospecyficznej redukcji achiralnych dwuketonów o wzorze 1 do optycznie czynnych ketoalkoholi o wzorze 2, których konfifuracja jest zgodna z naturalnych ukladem steroidów. Hodowle szczepu, jak i redukcje substratów przy jego pomocy przeprowadza sie w prosty sposób, wykorzystujac jako pozywke latwo dostepny wyciag slodowy zawierajacy konieczna do wzrostu ilosc soli mineralnych. Proces redukcji przebiega z wydajnosciami o kilka procent wyzszymi niz w podanych opisach patentowych dla seco-ketoalkoholu (2a), natomiast w przypadku 13/J-etylo-se- co-ketoalkoholu (2b) wydajnosci porównac nie mozna ze wzgledu na brak danych literaturowych. W czasie przebiegu redukcji metoda wedlug wynalazku nie obserwuje sie zjawiska pienienia, które wystepuje w takich procesach. Do ekstrakcji otrzymanych produktów uzywa sie taniego rozpuszczalnika, jak eter etylowy. Jego pózniejsze odparowanie przeprowadza sie latwo w niskich temperaturach w przeciwienstwie do drozszego87104 3 rozpuszczalnika metylo-izobutylo-ketonu uzytego w podanych opisach patentowych. Oczyszczanie otrzymanych produktów w glównej mierze nastepuje na drodze krystalizacji. Stosowanie chromatografii pozwala równiez, obok uzyskania dodatkowo z lugów pokrystalicznych dalszych ilosci produktów, na wydzielenie nieprzereagowa- nych ilosci substratów. Mozna je powtórnie poddac redukcji, co zwieksza efektywnosc opisywanego procesu.W dwóch pierwszych opisach patentowych miesci sie okreslenie o charakterze ogólnym, ze gatunek Saccharomyces cerevisiae jest zdolny do redukcji jednej z grup ketonowych ukladu seco-dionu, jednakze w opisie podano, iz szczepy tego gatunku transformuja seco-dion (1a) jedynie do 3-metoksy-T,3,5/10/,9/11/-seco-estratetr- aen-14a-17-onu, a nie do seco-ketoalkoholu (2a). Szczepy nie transformuja 13 etylo-seco-dionu (1b). Nie ma wiec wsród tych szczepów przypadku, aby redukcja przy pomocy gatunku S. cerevisiae dala otrzymany w metodzie wedlug wynalazku produkt 2a. Wedlug opisu dwu patentów jedynie S. uvarum (CBS 1508) jest zdolny do takiej redukcji z wydajnoscia 71%.Szczep TR 105 z gatunku S. cerevisiae jest nowym oryginalnym szczepem nadajacym sie wedlug opisanej metody do redukcji achiralnych substratów o, wzorze 1 do produktów o wzorze 2.Przyklad I. Otrzymywanie 3-metoksy-8/14/-seco-1,3,5/10/,9/11/-estratetraen-17j3-ol-14-onu (2a) Do kolby o pojemnosci 2 dm3, zawierajacej 1 dm3 sterylnej pozywki otrzymanej przez rozpuszczenie 20 g glukozy i 20 g ekstraktu slodowego (o skladzie podanym wyzej) w 1 dm3, dodaje sie 100 cm3 kultury szczepu TR 105 z gatunku Saccharomyces cerevisiae, która uzyskuje sie po 2 dniach jej wzrostu w temperaturze 28°C na brzeczce slodowej o gestosci 9°Blg. Po 24 godzinach wzrostu kultury przy wstrzasaniu (80 obr/min) i w tempera¬ turze 27°C dodaje sie w warunkach sterylnych 1500 mg seco-dionu (1a) rozpuszczonego w mieszaninie 2 cm3 acetonu i 20 cm3etanolu. Redukcje prowadzi sie przy wstrzasaniu przez 6 dni w temperaturze 27°C. Przebieg reakcji kontroluje sie przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym (benzen : eter etylowy 85 :15). Zawartosc kolby ekstrahuje sie 3-krotnie eterem etylowym w porcjach po 0,5 dm3. Powstajace podczas ekstrakcji emulsje likwiduje sie przez dodanie bezwodnego siarczanu sodu. Polaczone ekstrakty eterowe zageszcza sie do objetosci 30 cm3. Do tak uzyskanego ekstraktu dodaje sie 10 cm3 metanolu i ponownie zageszcza roztwór, który po przesaczeniu przez wegiel aktywny pozostawia sie do krystalizacji w temperaturze 0°C. Osad odsacza sie od lugów i ponownie krystalizuje z metanolu. Otrzymuje sie 828 mg seco-keto-alkoholu (2a) o tt. 109—110°C. Lugi pokrystaliczne po usunieciu metanolu chromatografuje sie na 20-krotnej ilosci zelu krzemionkowego I akt. mieszanina eteru naftowego i acetonu w stosunku 9 : 1. Po rozdziale chromatograficznym uzyskuje sie 140 mg sceo-dionu (1a) (8%), 326 mg seco-ketoalkoholu (2a) o tt. 110-111°C oraz 95 mg (6%) zwiazku o tt. 131-133°C posiadajacego w widmie IR wiazanie OH i niewykazujacego obecnosci grupy karbony- lowej. Polaczone produkty 2a uzyskane z krystalizacji i chromatografii wykazuja jednorodnosc chromatograficz¬ na, tt. 110-111°C, (cc)2D° -39° (C = 1 w dioksanie); IR: 3585, 3440, 1715, 1635, 1605, 1500 oraz NMR 6 (CDCI3) —5,82 tryplet. Znalezione dane sa identyczne z literaturowymi. Wydajnosc laczna seco-ketoal¬ koholu (2a) wynosi 1154 mg, co stanowi 77% w stosunku do dodanego secodionu 1a.Przyklad II. Otrzymywanie 130-etylo-3-metoksy-8/14/-seco-1,3,5/1O/,9/11/-estratetraen-170-ol 14-on- u (2b).Do kolby o pojemnosci 2 dm3 zawierajacej 1 dm3 sterylnej pozywki otrzymanej przez rozpuszczenie 20 g ekstraktu slodowego o skladzie podanym wyzej w 1 dm3 wody, dodaje sie 100 cm3 kultury szczepu TR 105 z gatunku S. cerevisiae, która uzyskuje sie jak opisano w przykladzie I. Po 24 godzinach wzrostu tej kultury przy wstrzasaniu (80 obr/min) dodaje sie do niej 1000 mg 13-etylo-seco-dionu (1b) rozpuszczonego w 2 cm3 acetonu i 10 cm3 etanolu. Redukcje przeprowadza sie 6 dni przy wstrzasaniu w temperaturze 27°C. Zawartosc kolby ekstrahuje sie eterem etylowym 3-krotnie o lacznej objetosci 2 dm3. Roztwór eterowy suszy sie bezw. Na2S04.Po usunieciu rozpuszczalnika uzyskuje sie 1080 mg mieszaniny produktów.Rozdzial mieszaniny produktów nastepuje na 20-krotnej ilosci zelu krzemionkowego I akt. przy pomocy mieszaniny benzenu i octanu etylu w stosunku 10 :3. W wyniku chromatografii uzyskuje sie 690 mg l3|3-etylo- seco-ketoalkoholu (2b) (69%) wydajnnosci w stosunku do materialu wyjsciowego oraz 230 mg (23%) 13-etylo-se¬ co-dionu (1b). Otrzymany produkt (2b) posiada tt. 88-89°C, (a)™ + 10 (C = 2 w dioksanie) oraz IR: 3500, 1822 cm"1. Dane uzyskane sa zgodne z literaturowymi. mikroorganizmu wiór 1 Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 10 zl PL