PL84081B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki przeciwko pryszczycy bydlecej, umozli¬ wiajacy osiagniecie w warunkach wielkoprzemyslo¬ wych szczepionki o najwyzszej aktywnosci biolo¬ gicznej przy zachowaniu zwiekszonej wydajnosci produkcji.

Znany, obecnie stosowany sposób wytwarzania szczepionki przeciwko pryszczycy bydlecej polega ;'na tym, ze na odpowiedniej pozywce nablonków z jezyków bydlecych, hoduje sie szczep wirusa tej zarazy, a nastepnie po wyhodowaniu i roztarciu tych nablonków — otrzymuje sie ciekly ekstrakt, pozwalajacy na uzyskanie zawiesiny wirusa, która z kolei dla otrzymania szczepionki dezaktywizuje sie.

Sposób wytwarzania szczepionki przeciwko pry¬ szczycy bydlecej zgodny z wynalazkiem, w którym wykorzystuje sie wirusy uzyskane w wyniku wyho¬ dowania na nablonkach z jezyków bydlecych w cieklej pozywce, charakteryzuje sie tym, ze po prze¬ prowadzeniu pierwszej hodowli, zbiera sie pierwsza pozywke, po czym dodaje sie nowej pozywki do nablonków, które posluzyly do pierwszej hodowli, przeprowadza sie druga hodowle i zbiera druga po¬ zywke, powtarza sie ewentualnie trzeci raz ten sam proces, po czym wykorzystuje sie zebrane pozywki, przygotowujac je w znany sposób w celu wytwo¬ rzenia z nich szczepionki.

Zgodnie z wynalazkiem hodowle prowadzi, sie w temperaturze okolo 37°C, przy czym pierwsza ho- dowle prowadzi sie w ciagu okolo 15:—20 godzin, a druga hodowle prowadzi sie w ciagu okolo 3—12 godzin. Do hodowli wykorzystuje sie okolo 6 na¬ blonków jezycznych na jeden litr pozywki, posiew pozywki wirusem pryszczycy bydlecej przeprowadza sie w ilosci 0,2 X 1010 DECP50 na jeden litr pozywki, wykorzystujac mieszanine pozywek uzyskanych w wyniku hodowli, przy czym w trakcie hodowli po¬ zywke poddaje sie ciaglemu dotlenianiu. Tak wiec cecha charakterystyczna sposobu wytwarzania szcze¬ pionki wedlug wynalazku jest wykorzystanie po¬ jedynczej porcji nablonków z jezyków bydlecych dla otrzymania kilku kolejnych hodowli wirusa w róznych pozywTkach i hodowle te zbiera sie i uzy¬ skuje sie z nich szczepionki znanym sposobem dez- aktywizacji wirusa.

Chociaz w wybranym przykladzie wytwarzania szczepionki wedlug wynalazku, stosuje sie dwie nastepujace po sobie hodowle przy wykorzystaniu tego samego preparatu z nablonków z jezyków by¬ dlecych, mozna w ramach wynalazku w taki sam sposób stosowac wiele kolejnych hodowli wirusa.

Mozliwe jest równiez dokonanie ekstrakcji wirusa, znajdujacego sie w nablonkach z jezyków bydlecych — po zakonczeniu hodowli, ale ta ekstrakcja z na¬ blonków z jezyków nie stanowi nieodzownej fazy sposobu wytwarzania wedlug wynalazku, poniewaz czesc najbardziej interesujaca w hodowli wirusa znajduje sie w cieklych pozywkach, a nie w pre¬ paracie z nablonków. 84 08184 OSI Wedlug wynalazku mozna stosowac klasyczna po¬ zywke znana pod nazwa pozywki FrenkeFa. Czas rozwoju kolejnych hodowli zalezy od zastosowa¬ nych szczepów wirusa. Ogólnie — dobre rezultaty uzyskuje sie przy prowadzeniu pierwszej hodowli w czasie od 15 do 20 godzin, natomiast druga ho¬ dowla dojrzewa w czasie okolo 3 do 12 godzin. W kazdym szczególnym przypadku mozna okreslic optymalny czas dojrzewania hodowli przez zbadanie aktywnosci otrzymanej szczepionki. Dla dokladniej¬ szego objasnienia istoty wynalazku zostana dalej opisane liczne sposoby wytwarzania, nie ograni¬ czajace jednak zakresu wynalazku.

Przyklad I. Jezyki zabitych nie wczesniej jak przed godzina bydlat, myje sie woda, a nastepnie alkoholem i napromieniowuje promieniami ultra¬ fioletowymi, a nastepnie zdejmuje sie z nich na¬ blonki. Po tym scina sie nablonki przy pomocy urzadzenia, podobnego do maszyny do krajania szynki. Otrzymane w ten sposób platki nablonków umieszcza sie w cieczy konserwujacej z dodatkiem antybiotyków i trzyma sie w temperaturze okolo 4°C. Moga one byc tak zakonserwowane maksy¬ malnie 48 godzin — przewaznie mniej niz 48 go¬ dzin. Hodowla wirusa powstaje przez umieszcze¬ nie nablonków z jezyków bydlecych w cieklej po¬ zywce, a mianowicie 6 platków nablonków na litr cieklej pozywyiki. Pozywke w trakcie hodowli stale dotlenia sie. Pozywka dojrzewa w temperaturze stalej 37°C. Temperatura ta jest utrzymywana za pomoca wody, przeplywajacej przez podwójny plaszcz, otaczajacy zbiornik z nierdzewnej stali, w którym dojrzewa hodowla lub za pomoca dowolnego innego urzadzenia do regulacji temperatury. W tym sposobie wytwarzania stosuje sie pozywke o na¬ stepujacym skladzie, odpowiadajacym klasycznej pozywce Frenkel'a.

Pepton Cysteina chlorowodorowa Hemina Insulina Tyroksyna Glukoza Glutation Na CL KCL Ca CL2 Mg CL2, 6 Na H2 P04, Na2 HP04, Na H COs Na OH (N) Niacyna Lizyna Arginina Metionina Leucyna H20 , 2H20 2H2O Kwas pantotenowy Fenyloalanina Treonina Tryptofan Histydyna woda do objetosci 3000 g 0,096 g 0,036 mg 0,9 jednostki miedzyn; rodowej 0,09 mg 1,000 mg 0,01 g 7,2 g 0,18 g 0,18 g 0,09 g 0,076 g 0,524 g 1 g 1,25 g 0,001 g 0,200 g 0,041 g 0,200 g 0,130 g 0,250 mg 0,025 g 0,0425 g 0,05 g 0,0305 g 1000 ml 40 (porównaj: Dubouclard, Rumiancef, Fontaine i Mac¬ kowiak in Buli. Soc. Sci. Vet. Lyon, 1966, 68(3), S. 243-53.) Zaszczepiono hodowle wirusem „C Vosges", a mianowicie w Ilosci 1010 DECP 50 na 30 jezorów.

Wyrazeniem DECP 50 oznaczono ilosc wirusa, wy¬ wolujaca zjawiska chorobotwórcze komórek w 50% przypadków w 1 mililitrze hodowli jednokomórko¬ wej z komórek nerki swinskiej. Pozywke dopro¬ wadza sie do temperatury 37°C i w tej tempera¬ turze prowadzi pierwsza hodowle przez 15 godzin.

Nastepnie odprowadza sie pierwsza ciekla pozywke hodowli z pojemnika, przy czym pozostawia sie zakazone nablonki w pojemniku i napelnia sie zno¬ wu pojemnik taka sama iloscia tej samej cieklej swiezej pozywki, podgrzanej uprzednio do 37°C, powodujac dojrzewanie drugiej hodowli w ciagu 4 godzin. Hodowle nastepnie chlodzi sie i odprowa¬ dza sie druga ciekla pozywke.

Stosowane pozywki posiadaja nastepujace wla¬ sciwosci : Ciecz powierzchniowa, odprowadzona po dojrze¬ niu pierwszej hodowli: Stopien zwiazania Stopien zakazenia DVC 50 = 0,20 ml.

: V4 : 10 8,4 DECP 50/ml Ciecz powierzchniowa, odprowadzona po dojrzeniu drugiej hodowli: Stopien zwiazania Stopien zakazenia nie mniejszy DVC 50 = 0,11 ml.

V2 : 10 9,1 DECP 50/ml Mieszanina polaczonych obu powierzchniowych cie¬ czy: Stopien zwiazania Stopien zakazenia nie mniejszy DVC 50 = 0,08 ml : V4 : 10 9,1 DECP 50/ml Przez DVC 50 rozumie sie ilosc szczepionki, która 45 uodparnia 50% zaszczepionych swinek morskich.

(Porównaj M. Rumiancef, J. Fontaine, C. Stellmanu i C. Mackowiak — Ext. Rev. Med. Vet., sierpien — wrzesien 1965, 116, S. 597—607).

Stopien zwiazania wyrazony jest rozcienczeniem 50 granicznym, jakie uzyskuje sie przez calkowite zwia¬ zanie metoda pólilosciowa Kolmer'a (Badania sero¬ logiczne typów i odmian pryszczycy na drodze re¬ akcji wiazania — These Doct. Vet, R. Camand, Lyon, 1953, Bose. edit.) 55 Stwierdzono wiec, ze wlasciwosci uzytkowe cie¬ czy powierzchniowej powstalej z drugiej hodowli sa lepsze, niz cieczy, pochodzacej z pierwszej ho¬ dowli, a mieszanina tych obu cieczy posiada rów¬ niez korzystniejsze wlasnosci, przewyzszajace pier- 60 wsza pozywke.

Przyklad II. Dla porównania i stwierdzenia wyzszosci sposobu wedlug wynalazku — w porów¬ naniu do sposobu wedlug istniejacego stanu techni¬ ki, przeprowadzono w podanych nizej warunkach 65 hodowle wirusa „O Flandros" przez okres 18 go-84 dzin. Po tej jednej jedynej hodowli dokonano ekstrakcji nablonków ciecza buforowa po uprzed¬ nim roztarciu tych nablonków. Otrzymano nastepu¬ jace dane: Sama ciecz z hodowli: Stopien zwiazania : Vs Stopien zakazenia : 10 8,3 DECP 50/ml DVC 50 = 0,3 ml Ciecz z hodowli z dodatkowa ciecza ekstraktowa: Stopien zwiazania : Vs Stopien zakazenia : 10 8,2 DECP 50/ml DVC 50 = 0,5 ml.

Ustalono wiec, ze domieszka ekstraktu nablonku jezycznego do cieczy powierzchniowej hodowli, ob¬ niza wlasciwosci zawiesiny wirusa.

W przeciwienstwie do tego dodanie zgodnie z wy¬ nalazkiem do cieczy zebranej z pierwszej hodowli — cieczy pochodzacej z hodowli drugiej, poprawia wlasciwosci tej pierwszej cieczy powierzchniowej.

Zakazona ciecz, otrzymana sposobem wedlug wy¬ nalazku, po ochlodzeniu do temperatury okolo 4°C moze byc korzystnie zadana chloroformem, z któ¬ rym pozostaje w kontakcie przez 12 do 24 godzin.

Osad oddziela sie nastepnie przez odwirowanie, a wirus poddaje klarowaniu na plytkach filtru „C5".

Moze on byc nastepnie poddany dezaktywizacji w celu przygotowania szczepionki. Czynnosc przygo¬ towania ma przebieg zwyczajny. Moze ona naste¬ powac na przyklad przez adsorpcje wirusa za po¬ moca wodorotlenku aluminium i dezaktywizacje przez wspólne dzialanie ciepla i formaliny. Jak widac — sposób wedlug wynalazku wykazuje zalete znacznego zwiekszenia wydajnosci produkcji szcze¬ pionki przeciw pryszczycy. W efekcie uzyskuje sie z tej samej ilosci nablonków jezycznych bydla dwu- 081 6 krotnie wieksza ilosc szczepionki w porównaniu do zwyklej metody i to szczepionki, wykazujacej lepsze wlasciwosci.

Claims (8)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania szczepionki przeciwko pryszczycy bydlecej poprzez hodowle wirusa pry- 10 szczycy na nablonkach z jezyków bydlecych w cie¬ klej pozywce, znamienny tym, ze po przeprowadze¬ niu pierwszej hodowli, zbiera sie pierwsza po¬ zywke, po czym dodaje sie nowej pozywki do na¬ blonków, które posluzyly do pierwszej hodowli, 15 przeprowadza sie druga hodowle i zbiera druga pozywke, powtarza sie ewentualnie trzeci raz ten sam proces, po czym wykorzystuje sie zebrane po¬ zywki, przygotowujac je w znany sposób w celu wytworzenia z nich szczepionki. 20

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w temperaturze okolo 37°C.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym. ze pierwsza hodowle prowadzi sie w ciagu okolo 15— 20 godzin. 25

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze druga hodowle prowadzi sie w ciagu okolo 3—12 godzin.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie okolo 6 nablonków jezycznych na jeden 30 litr pozywki.

6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze posiewa sie pozyki wirusem pryszczycy bydlecej w ilosci 0,2 X 1°10 DECP 50 na jeden litr pozywki.

7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 35 wykorzystuje sie mieszanine pozywek, uzyskanych w wyniku hodowli.

8. Sposób wedlug jednego z zastrz. 1, znamienny tym, ze w trakcie hodowli pozywke *poddaje sie ciaglemu dotlenianiu.