PL76481B2 - Sposób wytwarzania ryboflawiny metodą biosyntezy - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: 18.02.1971 (P. 146317) Zgloszenie ogloszono: 30.05.1973 Opis patentowy opublikowano: 10.03.1975 76481 KI. 30h, 2/20 MKP C12d 5/04 Twórcywynalazku: Tadeusz Szczesniak, Leonard Karabin, Maria Szczepankowska, Krystyna Wituch, Bogdan Rakowski, Halina Wosko, Jerzy Meller, Zofia Oliriska Uprawniony z patentu tymczasowego: Instytut Przemyslu Farmaceutycznego, Warszawa(Polska) Sposób wytwarzania ryboflawiny metoda biosyntezy Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ryboflawiny (witaminy B2) metoda biosyntezy wpod- powierzchniowej hodowli grzyba Ashbya gossypii.Znane jest z opisu patentowego brytyjskiego nr 760072 wytwarzanie ryboflawiny w podpowierzchniowej hodowli grzyba Ashbya gossypii na pozywkach zawierajacych jako zródlo wegla olej smakowy, olej kukurydziany i olej sojowy. Uzyskiwane ta metoda wydajnosci ryboflawiny wynosily 2280 (jt/g)ml plynu fermentacyjnego.Postepem w tej dziedzinie byl sposób ujawniony w opisie patentowym nr 59792, który polegal na wytwa¬ rzaniu ryboflawiny metoda biosyntezy w podpowierzchniowej hodowli grzyba Ashbya gossypii na pozywkach zawierajacych jako zródlo wegla tluszcz pozelatynowy w ilosci 0,1-10% objetosciowych. Uzyskiwane ta meto¬ da wydajnosci wynosily 3781 (pg)ml.Metody podane w opisie patentowym nr 64983 oraz w opisie patentu dodatkowego nr 66611 stanowily postep w zwiekszeniu wydajnosci produkcyjnej ryboflawiny. Wedlug sposobu opisanego w patencie nr 64983 metoda wytwarzania ryboflawiny na drodze biosyntezy w podpowierzchniowej hodowli grzyba Ashbya gossypii na pozywkach zawierajacych jako zródlo wegla tluszcz pozelatynowy w ilosci 0,1-10% wagowych, polegala na wstepnym pasazowaniu grzyba Ashbya gossypii przez odpowiednio dobrane pozywki stale i plynne, a nastepnie hodowli w plynnej pozywce produkcyjnej zawierajacej jako zródlo azotu klej skórny i/lub klej kostny. Uzyski¬ wane ta metoda wydajnosci ryboflawiny wynosily 5910 (/Ltg)ml.Sposób z opisu patentowego nr 66611 polegal na wytwarzaniu ryboflawiny metoda biosyntezy w pod¬ powierzchniowej hodowli grzyba Ashbya gossypii na pozywkach zawierajacych klej skórny i/lub Wej kostny jako zródlo azotu i tluszcz kostny lub skórny jako zródlo wegla. Uzyskiwane ta metoda wydajnosci ryboflawiny wynosily 6420 (/zg)ml.Obecnie stwierdzono, ze jezeli jako zródlo wegla w pozywkach zastosuje sie tluszcz utylizacyjny i/lub techniczny tran dorszowy uzyskuje sie znaczne podwyzszenie wydajnosci ryboflawiny tj. rzedu do 6930 (pg)ml i7200(/ig)ml.Tluszcz utylizacyjny jest to mieszanina tluszczów, uzyskanych ?/zakladach utylizacyjnych w wyniku przetopienia w tapialni róznych odpadowych tluszczów pochodzenia zwierzecego.2 76 481 Surowcami do uzyskania tluszczu utylizacyjnego moga byc tluszcze: tluszcz rzezniany twardy - tluszcze surowe bydlece i baranie, tluszcz rzezniany miekki — tluszcze surowe wieprzowe i konskie, surowy tluszcz pogarbarski uzyskiwany w garbarni i surowy tluszcz kanalowy.Techniczny tran dorszowy jest produktem odpadowym przy produkcji maczki rybnej i innych przetworów rybnych.Ilosciowy ijakosciowy sklad kwasów tluszczowych w tluszczu utylizacyjnyfn i technicznym tranie dorszo¬ wym podano w tablicy I.Sposób wedlug wynalazku polega na stosowaniu wymienionych wyzej tluszczów, utylizacyjnego i/lub technicznego tranu dorszowego, do pozywek bezposrednio przed ich sterylizacja i podczas hodowli grzyba Ashbya gossypii.Do plynnych pozywek produkcyjnych, bedacych roztworem lub zawiesina nieorganicznych i organicznych skladników pozywki, wprowadza sie tluszcz utylizacyjny i/lub techniczny tran dorszowy przed wyjalowieniem pozywki, w ilosci od 0,1 do 6,0%, w stosunku do objetosci pozywki, koryguje pH do wartosci 6,6—7,2 i wyja¬ lawia. Schlodzone pozywki posiewa sie zawiesina grzybni Ashbya gossypii. Podczas hodowli odpowiedni tluszcz wprowadza sie w sposób jalowy do pozywek, przygotowanych metoda wyzej opisana, pomiedzy 0 i 120 godzina hodowli, w ilosci od 0,1% do 5,0% wagowych w stosunku do objetosci pozywki.Zastosowanie tluszczu utylizacyjnego i/lub technicznego tranu dorszowego do pozywek w podpowierz- chniowej hodowli Ashbya gossypii prowadzi, do zwiekszenia wydajnosci produktów biosyntezy i zmniejszenia stopnia pienienia sie pozywek.Ponadto w wyniku zastosowania tluszczu utylizacyjnego i technicznego tranu dorszowego, które sa bardzo tanimi tluszczami odpadowymi, jak i w wyniku uzyskania z tymi tluszczami wiekszych wydajnosci, obnizono koszt wytwarzania ryboflawiny.Zwiekszona wydajnosc ryboflawiny w pozywkach zawierajacych tluszcz utylizacyjny jest spowodowana mechanizmem dzialania pewnych kwasów tluszczowych wystepujacych w tym tluszczu, anie wystepujacych w tluszczach takich, jak tluszcz pozelatynowy, tluszcz kostny i tluszcz skórny.Kwasy tluszczowe obnizaja napiecie powierzchniowe miedzy membranami komórkowymi i pozywka.W nastepstwie tego zmienia sie przepuszczalnosc sciany komórkowej i tym samym zwieksza sie przenikanie skladników pozywki do wnetrza komórki oraz zwieksza sie takze wydzielenie z komórki do srodowiska zew¬ netrznego ryboflawiny. Kwasy tluszczowe sa równiez bezposrednio zuzywane jako zródlo wegla w wyniku procesu betaoksydacji.Zwiekszona wydajnosc ryboflawiny w pozywkach zawierajacych techniczny tran dorszowy jest spowodo¬ wana zarówno mechanizmem dzialania kwasów tluszczowych wystepujacych w tym tluszczu anie wystepuja¬ cych w innych tluszczach, ich zuzywaniemjako zródlo wegla jak i dzialaniem witamin, które znajduja sie w tym tluszczu w stosunkowo duzej ilosci, mianowicie witamina A okolo 300j.m./g, witamina D okolo 100j.m./g, w mniejszych ilosciach witaminy z zespolu B oraz sladowych ilosciach witamina E.Jak zostanie wykazane najwieksza wydajnosc ryboflawiny otrzymuje sie w pozywce, do której dodawany jest techniczny tran dorszowy dwukrotnie w 72 i 120 godzinie hodowli.W przykladzie I wykazano, ze sposobem wedlug wynalazku mozna otrzymac wysokie wydajnosci rybofla¬ winy stosujac plynne pozywki zawierajace tluszcz utylizacyjny i/lub techniczny tran dorszowy.Wytworzona ryboflawine znajdujaca sie w plynach hodowlanych izoluje sie jedna ze znanych metod chemicznych.Sposób prowadzenia hodowli Ashbya gossypii i wydajnosci ryboflawiny w plynnej pozywce produkcyjnej zawierajacej tluszcz utylizacyjny i/lub techniczny tran dorszowy przedstawia szczególowo przyklad, w którym procenty oznaczaja procenty wagowe o ile nie zaznaczono inaczej.Przyklad. Przygotowano plynna pozywke do otrzymania askospor grzyba Ashbya gossypii o skladzie: Glukoza czysta 1,0% TiaminaHCl 0,1% Woda drozdzowa (0,5% suchej masy) do 100,0% objetosciowych.Wartosc pH pozywki nastawiono na pH = 6,8 roztworem wodorotlenku potasowego. Takprzygotowana pozywke rozlewano po 10 ml do probówek i wyjalawiano w temperaturze 110°C w ciagu 30 minut.Probówki z pozywka szczepiono 5 dniowa kolonia grzyba wyhodowana na pozywce stalej.Przygotowano pozywke stala do otrzymywania kolonii grzyba o nastepujacym skladzie: Glukoza czysta (100,0% suchej masy) 2,0% Agar * ¦' 2,0% Woda drozdzowa (0,5% suchej masy) do 100,0% objetosciowych.16481 3 Wartosc pH pozywki nastawiono roztworem wodorotlenku potasowego dó 7,2 1 WjfjdlawtóHó w tempera¬ turze 110°C w ciagu 30 minut.Pozywke rozlewano do plytek Petrfego po 20 ml. Pozywke stala szczepiono zawiesina askospor wyhodo¬ wana na pozywce plynnej. Inkubaqe przeprowadzano w temperaturze 28°C w ciagu 5 dni.Otrzymane w ten sposób kolonie grzyba stosowano do szczepienia plynnej pozywki posiewowej I.Przygotowano plynna pozywke posiewowa I do otrzymywania zawiesiny grzybni o skladzie: Glukoza czysta (100,0% suchej masy) 1,0% Laktoza czysta (100,0 suchej masy) 0,3% Pepton 0,5% Ekstraktdrozdzowy 0,3% Woda wodociagowa do 100,0% objetosciowych.Wartosc pH pozywki nastawiono na 6,5 roztworeltt wodorotlenku potasowego, rozlewano po 50 ml do kolb Erlenmeyer'a o pojemnosci 500 ml i wyjalawiano W tettiperaturze 110° w ciagu 30 minut.Kazda kolbe z plynna pozywka posiewowa I stadllittl Szczepiono 5 dniowa kolonia grzyba wyhodowana na pozywce stalej.Hodowle prowadzono w zaciemnionym pomieszczeniu, na trzesawce obrotowej o 220 obrotach/minute i mimosrodzie 25 mm w temperaturze 28° w ciagu 24 godzin.Otrzymana w ten sposób zawiesine grzybni stosowano do szczepienia plynnej pozywki posiewowej II.Przygotowana plynna pozywke posiewowa o skladzie: Drozdzepaszowe 2,0% Tluszcz utylizacyjny i/lub techniczny trandorszowy 1,5% Wyciag namkowy kukurydzy (50,0% suchej masy) 3,0% Woda wodociagowa do 100,0% objetosciowych.Wartosc pH pozywki nastawiono na 7,2, rozlewano po 50 ml do kolb Erlenmeyer*a 500 ml i wyjalawiano w temperaturze 110°C w ciagu 30 minut.Kazda kolbe z plynna pozywka posiewowa II szczepiono 1 ml zawiesiny grzybni z plynnej pozywki posie¬ wowej I.Otrzymana w ten sposób zawiesina grzybni szczepiono plynna pozywke produkcyjna.Przygotowano plynna pozywke produkcyjna o skladzie: Klejskórny 3,0% Wyciag namokowy kukurydzy (50,0% suchej masy) 6,0% Glicyna 0,15% KH2P04 0,15% Mg++ 10ug)ml Co++ 2(/ig)ml Mn++ 5(/ig)ml Zn++ 10 0ig)ml Woda wodociagowa do 100,0% objetosciowych.Wartosc pH pozywki^ nastawiono na 6,8 roztworem wodorotlenku potasowego. Pozywke rozlewano po 30 ml do kolb Erlenmeyer'a o pojemnosci 500 ml i do kazdej kolby dodawano tluszcz utylizacyjny iAub tech¬ niczny tran dorszowy w ilosci 3,5% objetosciowych. Pozywki wyjalawiano w temperaturze 110°C w ciagu 3 go¬ dzin.Kazda kolbe z pozywka szczepiono 1 ml zawiesiny grzybni z plynnej pozywki posiewowej II.Hodowle prowadzono w zaciemnionym pomieszczeniu, na trzesawce obrotowej o 220 obrotach/min. i mimosrodzie 25 mm, w temperaturze 28°C, w ciagu 192 godzin.Do kazdej kolby z okreslonej partii pozywki produkcyjnej zawierajacej tluszcz utylizacyjny i/lub technicz¬ ny tran dorszowy w ilosci 3,5% objetosciowych dodawano taki sam tluszcz w ilosci 2,0% o objetosciowych w 72, 96,120 oraz 72 i 120 godzinie hodowli Ashbya gossypii.Zawartosc ryboflawiny po 192 godzinach hodowli w pozywkach do których dodawano tluszcz utylizacyj¬ ny,w róznych godzinach hodowli przedstawione sa w tablicy 2.Jak wykazano powyzej najwieksza wydajnosc ryboflawiny otrzymano w pozywce, do której dodano tluszcz utylizacyjny dwukrotnie w 72, i 120 godzinie hodowli.Zawartosc ryboflawiny po 192 godzinach hodowli .A«bbva gossypii w pozywkach, do których dodawano techniczny tran dorszowy w róznych godzinach hodowli przedstawione ^ w tablicy 3.4 76481 PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania ryboflawiny metoda biosyntezy w podpowierzchniowej hodowli grzyba Ashbya gossypii przez wstepne pasazowanie grzyba Ashbya gossypii przy zastosowaniu pozywek, zawierajacych tluszcze pochodzenia zwierzecego jako zródlo wegla w ilosci 0,1-10% objetosciowych, znamienny tym, ze w plynnej pozywce posiewowej, a nastepnie w plynnej pozywce produkcyjnej jako zródlo wegla stosuje sie tluszcz utyliza¬ cyjny i/lub techniczny tran dorszowy w ilosci od 0,1% do 6,0% objetosciowych, a podczas hodowli Ashbya gossypii w ilosci od 0,1% do 5,0% objetosciowych.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze tluszcz utylizacyjny i/lub techniczny tran dorszowy wpro¬ wadza sie do pozywki produkcyjnej podczas hodowli Ashbya gossypii pomiedzy 0—120 godzina hodowli. Tablica 1 Ilosc i jakosc kwasów tluszczowych w róznych tluszczach odpadowych Wzór sumaryczny kwasu tluszczowego C14H2602 Cj4H2802 C15H30O2 Cl6H3202 Cl 6^30^2 Cl 6^2 8^2 Cj e^26^2 C17H3402 Ci8H3602 C18H3402 CisH3202 Cl8H3o02 ^2 0^4 0^2 C2 o"3 8^2 ^20^56^2 C2 0"32^-'2 C2 2rl44 U2 C2 2 "4 2 ^2 Tluszcz pozela- tynowy 1,4 - 23,5 4,0 0,5 0,5 ,- 10,3 55,0 3,3 - - 1,5 - - - — Zawartosc kwasów tluszczowych w procentach Tluszcz kostny 0,4 1,5 0,4 24,3 3,1 - - 1,1 15,9 47,4 3,2 - 0,4 1,3 - - - — Tluszcz skórny 0,2 1,2 0,3 25,2 2,0 - - 0,9 16,4 40,2 3,2 - 0,3 1,1 - - - — Tluszcz utylizacyjny 2,4- 0,3 0,6- 3,6 0,5- 3,2 15,0-25,5 3,0-12,5 1,2- 2,2 1,3- 2,5 0,8- 1,7 15,5-20,5 38,6-50,0 1,4- 2,9 - 1,1- 1,9 1,8- 3,2 - - - — Techniczny tran dorszowy _ 3,3 0,5 16,9 13,6 - - 0,6 3,3 32,0 5,4 3,0 3,4 1,6 1,1 1,4 1,1 12,6 Tablica 2 Czas dodawania tluszczu utylizacyjnego 72 godzina 96 godzina 120 godzina 72 i 120 godzina jug/ml /ig/ml jtig/ml /ig/ml 3640 3690 3420 693076 481 Tablica 3 Czas dodawania technicznego tranu dorszowego 72 godzina 96 godzina 120 godzina 72 i 120 godzina Mg/ml /ig/ml Mg/ml jLtg/ml 3940 3970 3680 7200 cv< LLHli Unito ** Wp*#*# ..?*. M PL PL