PL69885B1 - Antibiotic production utilizing streptomyces venezuelae var. fulvofurvescens [us3627641a] - Google Patents

Description

Sposób wytwarzania antybiotyku 11.837 RP Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania antybiotyku, oznaczonego dalej symbolem 11.837 RP. W opisie patentowym nr 58131 opisano sposób wytwarzania antybiotyku 11.837 RP, polegajacy na hodowaniu szczepu Streptomyces viridans DS 9466 5 (NRRL 3.087) na podlozu sztucznym.Poslugujac sie metoda chromatografii bibulowej, cienkowarstwowej i elektroforezy przy wywolywa¬ niu mikrobiologicznym stwierdzono, ze antybiotyk 11.837 RP jest mieszanina róznych skladników 10 o podobnych wlasciwosciach biologicznych i fizy¬ ko-chemicznych.Sposobem wedlug wynalazku antybiotyk 11.837 RP wytwarza sie przez dwa nowe drobnoustroje, których blizsza charakterystyke podano dalej, ho¬ dujac je w warunkach tlenowych.Drobnoustroje, o których mowa maja bardzo podobne cechy i naleza do rodzaju Streptomyces, gatunku Streiptomyces yenezuelae, tworzac odmia- 20 ne, która nazwano Streptomyces yenezuelae, var. fulvofurvescens. Zostaly one nazwane odpowiednio „S. yenezuelae, var. fulvofurvescens DS 7.103" (NRRL 3354) i „S yenezuelae, var fulvofurvescens DS 11.355 (NRRL 3355). „Streptomyces yenezuelae, 25 var, fulvofurvescens DS 7.103" wydzielono z próbek ziemi pochodzacych z Algerii, a „Streptomyces yenezuelae, var fulvofurvescens DS 11.355" wydzie¬ lone z próbki ziemi pochodzacej z okolic Gloucester (Anglia). 30 Wyodrebnianie tych dwóch szczepów przeprowa¬ dzono metoda klasyczna, postepujac w sposób na¬ stepujacy: Próbke ziemi zawieszono w wyjalowio¬ nej wodzie destylowanej, a nastepnie sporzadzono rózne rozcienczenia tej zawiesiny. Niewielkie ilosci kazdego z rozcienczen wprowadzano na plytki Petriego, zawierajace jako pozywke agar. Po kil¬ kudniowej inkubacji w temperaturze 26°C kolenie mikroorganizmów przeznaczonych do wyizolowania przenoszono na swieze podloze w celu zintensyfi¬ kowania ich wzrostu.Oba drobnoustroje, produkujace antybiotyk 11..837 RP, zaliczone zostaly do rodzaju Strepto¬ myces, gatunku S. yenezuelae, bowiem wykazuja one cechy charakterystyczne dla tego gatunku.Wiekszosc cech omawianych drobnoustrojów od¬ powiada ogólnie przyjetym kryteriom, okreslaja¬ cym ten gatunek (S. A. Waksman The Actinomy- cetes, vol. 2, The Williams and Wilkins Co., Balti¬ more, 1961, 280—181; Bergey's Manual of Determi- native Bacteriology, 7th edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1957, 780—781). Do cech tych naleza: wytwarzanie pigmentu melaninowego na podlozu tyrozynowym, wytwarzanie rozpusz¬ czalnego brazowo-czarnego barwnika na niemal wszystkich podlozach organicznych, zólto-brazowe do ciemno-brazowego zabarwienie grzybni wege¬ tatywnej kultur; rózowe zabarwienie grzybni po¬ wietrznej, zarodnikujacej, budowa aparatu zarod- 69 88569 885 3 nikujacego o sporoforach wydluzonych, prostych, badz lekko wygietych.Róznice w stosunku do S. venezuelae uwidacz¬ niaja sie w mozliwosciach wykorzystania roz¬ maitych substancji jako zródla wegla niezbednego dla wzrostu- drobnoustroju w wytwarzaniu anty¬ biotyku 11.837 RP zamiast chloramfenikolu, a zwlaszcza polegaja one na wytwarzaniu przez omawiane drobnoustroje duzych ilosci rozpuszczal¬ nego ciemnego pigmentu barwy pomaranczowo- brazowej, który predko ciemnieje przechodzac w czern, zdolnego do zabarwienia zarówno grzybni wegetatywnej, jak równiez samego podloza.S. venezuelae tworzy w niektórych przypadkach podobny barwnik, lecz zazwyczaj w ilosciach umiarkowanych badz tez nie tworzy go wcale w warunkach, w których nowe organizmy produkuja go (dotyczy to zwlaszcza podlozy sztucznych).Z cech tych wywodzi sie nazwa nowych drobno¬ ustrojów — Streptomyces S. venezuelae, var. ful- vofurvescens.Warunki hodowli oraz wlasciwosci biochemiczne S. venezuelae, var. fulvofurvesoens, szczep DS 7.103 sprawdzono na rozmaitych podlozach agarowych i bulionowych, stosowanych zwykle do badania szczepów rodzaju Streptomyces. Wyniki obserwacji podano w tablicy 1. Dotycza one (jezeli nie zazna¬ czono inaczej) dobrze rozwinietych hodowli 2— 4 tygodniowych, inkubowanych w temperaturze 26°C.Niektóre z zastosowanych podlozy sporzadzono wedlug przepisów pochodzacych z podrecznika S. A.Waksmana „The Actinomycetes" Chronoca Botani- ca Company, Waltham, Mass., USA, 1950, 193— 197. Podloza te zostaly oznaczone litera W, jak 10 20 30 35 równiez numerem, którymi zostaly opatrzone w cytowanej ksiazce.Literatura, na której sie opierano, badz sklad pozostalych podlozy przedstawia sie nastepujaco: A) K. L. Jones, Jurnal of Bacteriology 57,142 (1949) B) Podloze wedlug W. 23-=-2°/o agaru C) T. G. Pridham i wspólpraca „Hickey and Tres- ner's Agar", Antibiotics Annual, 1956—57, str. 950 D) T. G. Pridham i wspólpraca „Yeast Extract Agar", Antibiotics Annual, 1956—57, str. 950 E) T. G. Pridham i wspólpraca „Tomato Paste Oatmeal Agar", Antibiotics Annual 1956—57, str. 950 F) S. A. Waksman, The Actinomycetes t. 2, str. 393, Nr 42 The Williams and Wilkins Company, Bal¬ timore, 1961 G) W. E. Grundy i wspólpraca „Antibiotics and Chem." 2, 401, 1952 H) T. G. Pridham i wspólpraca „Inorgenic Stals- Starch Agar" Antibiotics Annual, 1956—57, str. 951 I) Wedlug W 1, z tym, ze 30 g sacharozy zastapio¬ no 15 g glukozy J) Wedlug W 1, z tym, ze 30 g sacharozy zastapio¬ no 15 g gliceryny K) „Plain Gelatin" wedlug „Manual of Methods for Pure Culture Studdy of Bacteria", Society of Amer. Bacterid. Geneva, N. Y. 11—1850 L) Wedlug W 18, z tym, ze sacharoze zastapiono paskami bibuly filtracyjnej zanurzonej czescio¬ wo w roztworze M) H. D. Tresner, F. Danga, Jurnal of Bacteriology, 76, 239^4 (1958) N) Odtluszczone, sproszkowane mleko, rekonsty- towane wedlug zalecen producenta Podloze Agar Bennetta Ref. A Agar Emersona Ref. B Agar Hiekeya i Tresnera Ref. C Agar na ekstrak¬ cie dro¬ zdzowym Pridhama Ref. D Wzrost hodowli dobry dobry b. dobry b. dobry Tablica I Grzybnia wegetatywna.Zabarwienie hodowli Intensywne zabarwie¬ nie pomaranczowo- brazowe az do brazo- wo-czarnego Grzybnia zólto-brazo- wa, gesta, pofaldowa¬ na, dobrze rozwinieta Zabarwienie brazowo- -czarne Zabarwienie czarne Grzybnia powie¬ trzna (barwa, spo- rulacja Rózowa Dobrze roz¬ winieta Biala, skapa Rózowa B. dobrze roz¬ winieta Rózowa B. dobrze roz¬ winieta 1 Rozpuszczalny barwnik Pomaranczowo- brazowy prze¬ chodzacy w czarny Pomaranczowo- brazowy b. in¬ tensywny prze¬ chodzacy w bra- zowo-czarny Czarny Czarny Cechy zewnetrzne.Wlasciwosci bioche¬ miczne Sprofory proste lub lekko zgiete, dosc dlugie. Spory cy¬ lindryczne, o zao¬ kraglonych kon¬ cach, o wymiarach 0,3—0,5^/0,8—1,2|L6$ 885 S 6 cd. tabl. i Fodloze Agar z ek¬ straktem z owsa i po¬ midorów Pridhama Ref. E Agar glukozo- peptonowy W-7 Agar odzywczy W-5 Agar tyro- zynowy z ekstraktem drozdzo¬ wym na wytwarza¬ nie mela- niny Ref. F Agar z jablczanem wapnia Kransk'ye- go Ref. G Agargluko- zoasparagi- nowy W-2 Agar gli- cerynowo- asparagi- nowy W-3 Agar ze skrobia Pridhama Ref. H Agar syn¬ tetyczny.Czapka z sacharoza W-1 Agar syn¬ tetyczny Czapka z glukoza | Ref. 1 Wzrost hodowli b. dobry dosc dobry umiar¬ kowany dosc dobry dosc dobry dobry dobry dobry dobry dobry Grzybnia wegetatywna.Zabarwienie hodowli Zabarwienie zóltobra- zowe b. intensywne Zabarwienie pomaran¬ czowo brazowe, b, in¬ tensywne prawie czarne Grzybnia zólto-brazo- wa-szarawa. Dosc do¬ brze rozwinieta Grzybnia czarna.Zabarwienie hodowli czarne Zabarwienie zólto- brazowe, jasne Zabarwienie czarne | Zabarwienie poma¬ ranczowo brazowe przechodzace w bra- zowo-czarne Zabarwienie zólto- | brazowe Zabarwienie czarne.Grzybnia gesta, dobrze rozwinieta Zabarwienie inten¬ sywne, pomaranczo- wobrazowe. Grzybnia gesta dobrze roz¬ winieta Grzybnia powie¬ trzna (barwa, sporulacja) Jasno rózowa, dobrze rozwi¬ nieta Bialo-szara.Umiarkowanie rozwinieta Brak Bialo-rózowa do szarej.Ilosci sladowe Blado rózowa.Umiarkowanie rozwinieta Jasno-rózowa.Umiarkowanie rozwinieta Biala do jasno rózowej. Umiar¬ kowanie rozwi¬ nieta Blado rózowa.Dobrze rozwi¬ nieta Bialo-szara Umiarkowanie rozwinieta Bialo-szara.Umiarkowanie rozwinieta Rozpuszczalny barwnik Brazowawo- czarny Brazowo- czarny Zólto-brazowy Intensywnie czarny Szarobrazowy slaby Brazowo-czarny Intensywnie pomaranczowo- brazowy prawie brazowo-czarny Szaro-brunatny, slaby Intensywnie pomaranczowo- brazowy, pra¬ wie czarny Intensywnie pomaranczowo- brazowy Cechy zewnetrzne.Wlasciwosci bioche¬ miczne Wytwarzanie mela- niny po 48 godz. hodowli Rozkladanie jabl- czanu — dobre Sporofory proste badz lekko zgiete, dosc dlugie. Spory cylindryczne o za¬ okraglonych kon¬ cach, o wymiarach 0,3—0,5 ^jl/0,8—1,2 \i Test hydrolizy skrobi — dodatni69 885 7 8 dok. tabl. 1 Podloze Agar syn¬ tetyczny.Czapka z gliceryna Ref. J" Hodowla na ziem¬ niaku W-27 Zelatyna 12 % Ref. K Bulion- skrobia azotowa W-19 Bulion.Czapka z celuloza Ref. L Podloze Tresnera i Danga Ref. M Mleko odtluszczo¬ ne Ref, M | Wzrost hodowli dobry b. dobry dobry dobry Umiar¬ kowany lecz wyraz¬ ny dobry dobry Grzybnia wegetatywna.Zabarwienie hodowli Zabarwienie czarne.Grzybnia gesta, pofal¬ dowana, dobrze roz¬ winieta.Grzybnia czarna, B. gesta i pofaldo¬ wana Zabarwienie zólto- -brazowe.Dobry rozwój powierzchniowy Grzybnia dobrze roz¬ winieta. Intensywnie zabarwiona pomaran- czowo-brazowo Zabarwienie czarne Zabarwienie inten¬ sywno brazowe.Strzepki dobrze roz¬ winiete.Grzybnia powie¬ trzna (barwa, sporulacja) Bialo-szara.Umiarkowanie rozwinieta Rózowo-szara w ilosciach sladowych Rózowo-szara.Umiarkowanie rozwinieta Biala Umiarkowanie rozwinieta Bialorózowa na bibule zanurzo¬ nej w bulionie Brak Brak Rozpuszczalny barwnik Intensywnie pomaranczowo- brazowy, pra¬ wie czarny Czarny Pomaranczowo- brazowy Pomaranczowo- brazowy w nie¬ wielkich ilos¬ ciach, pojawia¬ jacy sie na po¬ wierzchni.Intensywnie czarny, obfity Intensywnie brazowy, prawie czarny 1 Cechy zewnetrzne.Wlasciwosci bioche¬ miczne Rozpuszczanie ze¬ latyny — dosc szybkie Test redukcji azo¬ tanów do azoty¬ nów — pozytywny.Test zuzycia celu¬ lozy — pozytywny Wytwarzanie H2S po 24 godzinach hodowli Poczatek peptoni- zacji pod koniec 2-go tygodnia ho¬ dowli. Calkowita — po 1 miesiacu.Koagulacji nie stwierdzono.Zmiana pH od 6,3 do 7,0 w ciagu 1 mies. hodowli. | Streptomyces venezuelae, var. ful. szczep DS 11.355 odznacza sie podobnymi cechami co szczep DS 7.103 na wyzej wymienionych podlozach, poda¬ nych w tablicy I. Jak dotad jedyna stwierdzona róznica jest zdolnosc wykorzystywania róznych zródel wegla lub azotu. Szczep DS 11.355 nie wy¬ korzystuje adonitolu, potrzebnego szczepowi DS 7.103, wykorzystuje natomiast sarkozyne bezuzy¬ teczna dla szczepu DS 7.103.Zdolnosc wykorzystywania róznych zródel wegla i azotu przez wymienione tu szczepy, okreslono we¬ dlug metodyki Pridhama i Gottlieba (J. Bact. 56, 107—114, 1948), rozwój obserwowano na podlozu podstawowym badz zastepujac glukoze innymi zwiazkami, mogacymi sluzyc jako zródlo wegla badz tez zastepujac (NH^SC^ innymi zwiazkami mogacymi sluzyc jako zródlo azotu. Wyniki podano w tablicy 2.Tablica 2 Badane zródla wegla d-ryboza d-ksyloza 1-arabinoza l-remnoza d-glukoza | d-galakto'za Wykorzy¬ stanie przez szczepy co o l-H IO co 1-4 . i-» ; W Q Badania zródla azotu NaN03 NaNOz (NH4)2H P04 (NH4)2H P04 adenina adenozyna 1 Wykorzy¬ stanie przez szczepy co o W Q m io co i-H i-H CO Q69 9 cd. tabl. 2 Badane zródla wegla d-fruktoza d-mannoza 1-sorboza laktoza maltoza sacharoza trehaloza ceellobioza rafinoza dekstryna inulina skrobia glikogen glicerol erytrytol adonit adonit dulcytol d-mannitol d-sorbitol inozytol Wykorzy¬ stanie przez szczepy co o I W Q -5- °°. i-H i-H W Badania zródla azotu uracyl mocznik l-asparagina glikokol sarkozyna dl-alanina dl-walina kwas dl-as- paraginowy kwas dl-glu- taminowy 1-arginina 1-lizyna dl-treonina dl-metionina tauryna dl-fenyloala- nina 1-tyrozyna 1-tyrozyna dl-prolina 1-hydroksy- prolina 1-histydyna 1-tryptofan 1 Wykorzy¬ stanie przez szczepy co o i-H CO Q co CO Q Nowe szczepy, z których wytwarza sie antybiotyk 11.837 RP róznia sie zasadniczo od szczepu znane- 40 go, opisanego w opisie patentowym nr 58 131.Szczep S. viridians DS 9 466 tworzy grzybnie po¬ wietrzna, która zabarwia sie na kolor szary gdy pojawia sie sporulacja. Sposób sporulacji szczepu charakteryzujacy sie tworzeniem lancuchów spo- 45 rów zwijajacych sie w spirale, zalicza go do Sek¬ cji Spira klasyfikacji Pridhama. Ponadto S. viri- dans DS 9 466 ma wlasciwosci wytwarzania w róz¬ nych srodowiskach rozpuszczalnego pigmentu zie¬ lonego, bardzo charakterystycznego, który zabar- 50 wia podloze agarowe w tym samym czasie gdy grzybnia wegetatywna zabarwia sie równiez na zielono. Jest to wlasciwosc, której nigdy nie wy¬ kazuja szczepy S. venezuelae, var. fulrofurvescens.Szczep S. viridans DS 9 466 nie tworzy pigmentu 55 melaninowego i nie wytwarza H2S.Nowe szczepy S. venezuelae var. fulvofurvescens DS 7.103 i DS 11.355 tworza grzybnie powietrzna o sporach barwy rózowej. Sposób sporulacji, cha¬ rakteryzujacy sie tworzeniem lancuchów sporów 60 bardzo wydluzonych, prostych lub lekko wygietych, zalicza te szczepy do sekcji Rectus — Flexibilis klasyfikacji Pridhama. Szczepy te nie produkuja nigdy rozpuszczalnego pigmentu zielonego, wytwa¬ rzaja natomiast pigmenty melaninowe i H2S. 65 10 W ponizszej tablicy zestawiono cechy rózniace zasadniczo szczepy Streptomyces viridans DS 9.466 i szczepy Streptomyces venezuelae, var. fulvofur- vescens DS 7.103 i DS 11.355.Barwa grzybni po¬ wietrznej sporulu- jacej Sekcja klasyfikacji Pridhama (pod wzgledem postaci sporoforów) Wytwarzanie mela- niny Wytwarzanie roz¬ puszczalnego pig¬ mentu zielonego Wytwarzanie H2S S. viridaus DS 9.466 szara Spira negatywne dodatnie negatywne S. venezuelae, var. fulvofur- vescens DS 7.103 i DS 11.355 rózowe Rectus-Flexi- bilis dodatnie negatywne dodatnie | Antybiotyk 11.837 RP produkowany przez szcze¬ py DS 7.103 i DS 11.355 jest mieszanina skladni¬ ków, których wlasciwosci sa identyczne z kompo¬ nentami antybiotyku 11.837 RP wytwarzanego przez szczep DS 9.366. Obserwowano natomiast zmiany we wzglednych zawartosciach poszczególnych skladników antybiotyku w zaleznosci od uzytego szczepu; takze w przypadku stosowania tego sa¬ mego szczepu wystepowaly róznice w skladzie w poszczególnych partiach produkcyjnych.Nowe szczepy wykazuja wlasciwosci korzystniej¬ sze niz znany szczep, gdyz pozwalaja otrzymac mieszanine mniej zlozona niz produkowane przez szczep streptomyces viridans DS 9.466 i której skladnik dominujacy jest wytwarzany przez S. vi- ridaus w niewielkiej ilosci. Sklad antybiotyków badano klasycznymi metodami chromatografii bi¬ bulowej, cienkowarstwowej i elektroforezy oraz nastepne wywolywanie metoda biologiczna, na przyklad na zaszczepionych plytkach agarowych.Widmo w podczerwieni produktów uzyskanych z hodowli nowych szczepów nie jest scisle iden¬ tyczne z widmem opisanym w opisie patentowym nr 58 131. Zawiera ono wprawdzie te same pasma absorpcji, lecz o nieco innej intensywnosci. Róznice tlumaczy sie zmiennym stosunkiem poszczególnych skladników.System A B Nosnik tel krzemion¬ kowy (firmy Merck) bibula Ar- ches 302 nie buforowana Rozpuszczalnik dioksan — woda w sto¬ sunku objetosciowym 8:2 n-butanol — kwas octo¬ wy w stosunku objetos¬ ciowym 6:469 885 11 Antybiotyki, wytwarzane przez rózne szczepy, porównywano w nastepujacym systemie chroma¬ tograficznym (patrz tabelka w lamie 10).Po rozwinieciu, wysuszeniu i wywolaniu na plyt¬ kach agarowych zaszczepionych Staphylococcus aureus 209 P, notuje sie plamy zahamowania przy wartosciach Rf, podanych w ponizszej tablicy.System A B Rf x 100 dla antybiotyków produkowanych przez szczepy: DS 9 466 20(25) 30 70 62 67 70(74) 79 DS 7 103 25 30 70 62 70 (79) DS 11 355 25 30 (70) 62 70 Wartosci w nawiasach oznaczaja skladniki obec¬ ne w postaci sladów, podkreslone dwa razy odpo¬ wiadaja skladnikowi dominujacemu.Nowy sposób wytwarzania antybiotyku 11.837 polega na hodowli Streptomyces venezuelae var. fulvofurvescens DS 7.103 badz Streptomyces vene- zuelae var. fulvofurvescens DS 11.355 na odpo¬ wiednich podlozach i w odpowiednich warunkach oraz na wyodrebnieniu antybiotyku w postaci soli, na przyklad soli potasowej.Warunki, w których Streptomyces venezuelae var. fulvofurvescens DS 7.103 i DS 11.355 wytwa¬ rzaja antybiotyki 11.837 RP, jak równiez metody wyodrebniania tego antybiotyku z brzeczki fer¬ mentacyjnej sa identyczne z opisanymi w opisie patentowym 58131 metodami wytwarzania antybio¬ tyku 11.837 RP. przez szczep Streptomyces viridans DS 9.466 (NRRL 3.087).Podane nizej przyklady ilustruja mozliwosc prak¬ tycznego zastosowania niniejszego wynalazku, nie wyczerpuja one jednakze wszystkich mozliwosci jego wykorzystania. Aktywnosc biologiczna okres¬ lono metoda zahamowania wzrostu Baeillus sub- tilis, bakterii wrazliwej na dzialanie antybiotyku 11.837 RP przyjetego za standart. Aktywnosc wy¬ razona jest w jednostkach na mg w odniesieniu do cial stalych i na cm3 w odniesieniu do roztwo¬ rów. Jednostka nazwano najmniejsza ilosc pro¬ duktu, który rozpuszczony w 1 cm3 odpowiednie¬ go podloza hamuje wzrost Staphylococcus aureus 209 P w okreslonych warunkach.Przyklad I. Kadz fermentacyjna o pojem¬ nosci 170 1 napelnia sie nastepujacymi skladni¬ kami: moczona miazga kukurydziana 4,800 kg glikoza uwodniona 2,400 kg chlorek sodowy 0,600 kg siarczan magnezowy 0,120 kg woda do 110 1 Po ustawieniu pH srodowiska na poziomie do 7,3 za pomoca 535 cm3 lugu sodowego (d = 1,33) dodaje sie 0,600 kg weglanu wapniowego i wyjala¬ wia, przepuszczajac zywa pare o temperaturze 122°C w ciagu 40 minut.Po odwodnieniu objetosc pozywki wynosi 120 1, a jej pH = 6,9. Podloze to szczepi sie 200 ml ho¬ dowli Streptomyces venezuelse var. fulvofurvescens DS 7.103. Hodowle rozwija sie w temperaturze 30°C w ciagu 28 godzin przy ciaglym wstrzasaniu 30 35 40 50 60 65 12 i napowietrzaniu wyjalowionym powietrzem. Po tym czasie mozna ja uzyc jako inokulum hodowli produkcyjnej.Hodowle produkcyjna prowadzi sie w kadzi o pojemnosci 800 1 przy uzyciu nastepujacego pod¬ loza: moczona miazga kukurydziana skrobia olej sojowy fosforan jednopotasowy siarczan magnezowy uwodniony chlorek kobaltowy woda 20 kg 7,5 kg 7,5 kg 1 kg 1 kg 0,01 kg do 460 1 Po ustawieniu pH na poziomie 7,15 za pomoca 2800 ml stezonego lugu sodowego (d = 1,33) dodaje sie 5 kg weglanu wapniowego. Podloze to o pH = = 7,35 wyjalawia sie przez przepuszczenie zywej pary o temperaturze 122°C, w ciagu 40 minut. Po schlodzeniu objetosc calosci wynosi 490 1, a pH srodowiska 7,05. Jako inokulum stosuje sie hodowle opisana wyzej. Hodowle przeprowadza sie w tem¬ peraturze 30°C w ciagu 96 godzin mieszajac stale srodowisko przy pomocy mieszadla (285 obrotów/ min.) i napowietrzajac je wyjalowionym powie¬ trzem (25 m3/godz.); pH srodowiska wynosi 8,55, a objetosc brzeczki 420 1. Ilosc wytworzonego anty¬ biotyku wynosi 1820 jednostek/cm3.Przyklad II. Do^ 420 1 brzeczki uzyskanej z hodowli Streptomyces venezuelae var. fulvofur- vescens DS 7.103, sporzadzone jak podano w przy¬ kladzie I, wprowadza sie przy mieszaniu kwas fosforowy, az do uzyskania pH srodowiska, wyno¬ szacego 4. Po 1/2-godzinnym mieszaniu dodaje sie 20 kg Clarcelu DIC i poddaje sie filtracji na pra¬ sie filtracyjnej. Pozostala na filtrze grzybnie prze¬ mywa sie 200 1 wody. Przesacz i popluczyny, o ogólnej objetosci 550 1, odrzuca sie, a mokry placek filtracyjny o wadze 113 kg zawiesza w mie¬ szaninie 250 1 metanolu i 50 1 wody i umieszcza w mieszalniku. pH zawiesiny doprowadza sie do wartosci 7,0 za pomoca weglanu sodowego (d = 1,33). Po uplywie jednej godziny zawiesine fil¬ truje sie na prasie i placek filtracyjny przemywa sie 50 1 70-procentowego metanolu. Grzybnie o ma¬ sie 96 kg odrzuca sie, a przesacz o lacznej pojem¬ nosci 360 1 zateza pod obnizonym cisnieniem (40 mm Hg) w aparacie obiegowym, do objetosci 6 1. Kon¬ centrat wytraca sie mieszanina 301 etanolu i 40 1 acetonu.Osad odwirowywuje sie, przemywa i suszy pod cisnieniem obnizonym. Uzyskuje sie 780 g produktu o mianie 515 jednostek/mg.Przyklad III. 780 g antybiotyku, sporzadzo¬ nego, jak podano w przykladzie II, o mianie 515 jednostek/mg rozpuszcza sie w 10 1 wody destylo¬ wanej.Roztwór ten filtruje sie przez zloze krzemionki, a nastepnie przepuszcza przez kolumne (o srednicy wewnetrznej 9 cm), zawierajaca 6 1 zywicy Dowex 1X2 w fazie chlorowej. Kolumne przemywa sie kolejno: woda destylowana az do odbarwienia eluatu 6 1 mieszanina kwasu mrówkowego i wody (10:90 objetosciowo) 20 169 885 13 14 mieszanina kwasu mrówkowego, wody i meta¬ nolu (10 : 10 : 80 objetosciowo) 20 1 mieszanina metanolu i wody (80 : 20 objetos¬ ciowo) 20 1 Antybiotyk eluuje sie mieszanina metanolu i wo¬ dy (80 : 20 objetosciowo) z dodatkiem chlorku po¬ tasowego (10 g/l). Odbiera sie 10 1 frakcje. Frakcje najbardziej aktywne (2—6) laczy sie i zateza pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 40°C do objetosci 3 1.W celu usuniecia soli i innych zanieczyszczen, koncentrat dializuje sie trzykrotnie przez blone celofanowa, przy uzyciu kazdorazowo wody desty¬ lowanej, w ciagu 48 godzin, a nastepnie liofilizuje sie go.Uzyskuje sie 27 g oczyszczonego antybiotyku w postaci soli potasowej o mianie 12 300 jednostek/ mg, o nastepujacych fizyko-chemicznych wlasci¬ wosciach: wyglad zewnetrzny — bezpostaciowy, bialy proszek latwo rozpuszczalny w wodzie: maksimum absorp¬ cji w nadfiolecie, okreslane przy uzyciu wodnego roztworu o stezeniu 50 mg/l — 255 urn 1* _ 106,5 15 20 \ lem "*""/• 25 Sklad elementarny antybiotyku przedstawia sie w przyblizeniu nastepujaco: C = 46,9% H = 6,55% O = 36,9% * N = 4,5% P = 2,1% K = 2,95% *) Wynik uzyskany przez odjecie od 100%. 30 Przyklad IV. Podloze przygotowuje sie, jak podano w przykladzie I. Podloze to, którego pH po sterylizacji wynosi 7,0 zaszczepia sie 200 ml ho¬ dowli Streptomyces venezuelae, var. fulvofurves- cens DS 11.355. Hodowla rozwija sie w ciagu 30 go¬ dzin przy mieszaniu i napowietrzaniu, w tempera¬ turze, jak podano w przykladzie I.Hodowle produkcyjna przygotowuje sie w kadzi 800 1 napelnionej 500 1 podloza, którego sklad po- 35 dano w przykladzie I, o pH =6,9 (po sterylizacji).Podloze to zaszczepia sie 50 1 hodowli — inokulum, przygotowanej w 170 1 kadzi. Po 99 godzinach ho¬ dowli w warunkach takich jak podano w przy¬ kladzie I, pH srodowiska wynosi 8,45, a objetosc brzeczki 495 1. Miano uzyskanego antybiotyku wy¬ nosi 1520 jednostek/mg.Przyklad V. 495 1 brzeczki uzyskanej z ho¬ dowli Streptomyces venezuelae var. fulvofurvescens DS 11.355 przerabia sie, jak w przykladzie II.Uzyskuje sie 480 kg nieoczyszczonego antybiotyku o mianie 1000 jednostek/mg.Przyklad VI. 470 g nieoczyszczonego anty¬ biotyku o mianie 1000 jednostek/mg, uzyskanego metoda opisana w przykladzie V, oczyszcza sie metoda opisana w przykladzie III.Uzyskuje sie 14,6 g czystego antybiotyku, w po¬ staci soli potasowej o mianie 19 400 jednostek/mg.Jest to bezpostaciowy, bialy proszek latwo rozpusz¬ czalny w wodzie, maksimum absorpcji w nadfiole¬ cie, okreslone przy uzyciu wodnego roztworu o ste¬ zeniu 50 mg/l, wynosi 256 urn. lE ^ = 120j.Wyniki analizy elementarnej: C = 46,4% H = 6,35% N = 4,1% P = 2,3% K= 6,9% O*) =33,95% *) Zawartosc tlenu okreslono przez odjecie od 100% sumy pozostalych skladników. PL PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania antybiotyku 11.837 RP po¬ legajacy na fermentacji przy uzyciu kultur Strep¬ tomyces, znamienny tym, ze szczep Streptomyces venezuelae var. fulvofurvescens DS 7.103 (NRRL 3354) lub Streptomyces venezuelae var. fulvofurves- cens DS 11.355 (NRRL 3355) poddaje sie hodowli w srodowisku odzywczym i w warunkach aerobo- wych, a nastepnie wyodrebnia sie antybiotyk w postaci soli. ERRATA Lam 7, 8, rubryka 1 jest: Bulion, skrobia azotowa powinno byc: Bulion. Skrobia azotanowa Lam 13, wiersz 28 jest: H = 6,55% powinno byc: H = 6,65% PL PL PL PL PL PL PL