Sposób wytwarzania pleuromutiliny Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia pleuromutiliny.Otrzymana sposobem wedlug wynalazku pleu- Tomutilina o wzorze 1 jest juz znana i zostala otrzymana w sposób opisany w publikacji w Proc.Nat. Acat. Sci., strona 570 (1951). Wedlug tego sposobu hoduje sie drobnoustrój Pleurotus mutilus w temperaturze 25°C, w 2800 ml roztworu pozyw¬ ki „corn steep", zawierajacej w 1 litrze kazdora¬ zowo 1,5 g KH2P04, 0,5 g KCl, 0,5 g MgS04 • 7H20, 3 g NaN03, 40 g dekstrozy i 5 g pozywki specjal¬ nej Staley'a, w butli Fernbactfa. Po uplywie oko¬ lo 4 tygodni po zaszczepieniu grzybnia pokrywa powierzchnie cieczy.Wedlug odmiany powyzszego sposobu hodowle Pleurotus mutilus zaszczepia sie na wstrzasarce kolowej w temperaturze 25°C w 200 ml wyzej po¬ danego roztworu pozywki w kolbie Erlenmeyer'a o pojemnosci 500 ml.Otrzymana w powyzszy sposób ciecz hodowlana ekstrahuje sie chloroformem przy wartosci pH = = 5,3, to znaczy przy naturalnej wartosci pH roz¬ tworu pozywki.Stosunek ilosci roztworu pozywki do ilosci chlo¬ roformu wynosi 10:1. Po zatezeniu warstwy chlo¬ roformowej w niskiej temperaturze otrzymuje sie brunatna mase o konsystencji gumy. Pozostalosc rozpuszcza sie w eterze i ekstrahuje roztwór ete¬ rowy jednokrotnie za pomoca okolo 0,05 objetosci In roztworu wodorotlenku sodu w celu usuniecia 10 15 25 30 substancji kwasnych, a nastepnie przemywa kilka¬ krotnie woda i wreszcie rozcienczonym kwasem.Eter odciaga sie w temperaturze pokojowej i bru¬ natna mase o konsystencji gumy pozostawia sie do wykrystalizowania.Krysztaly miesza sie z eterem, nastepnie saczy i przemywa niewielka iloscia eteru. Z przesaczu otrzymuje sie dalsza ilosc krystalizatu. Brunatne krysztaly rozpuszcza sie w niewielkiej ilosci eta¬ nolu, nastepnie roztwór traktuje sie eterem i we¬ glem aktywowanym, a w koncu saczy. Otrzymany roztwór zateza sie w temperaturze pokojowej, otrzymana przy tym szklista mase rozpuszcza sie w mozliwie malej ilosci wrzacego etanolu i zadaje eterem. Otrzymane przy tym krysztaly odsacza sie, przemywa eterem i wysusza w powietrzu. Z 1 li¬ tra cieczy hodowlanej otrzymuje sie w ten spo¬ sób 50 mg krystalicznej pleuroniutiliny (Proc. Nat.Acad. Sci., str. 572, w. 3/4, 1951).Zwiazek ten jest latwo rozpuszczalny w alkoho¬ lu, eterze, octanie butylu, acetonie, metyloizobu- tyloketonie, czteroglikolu i chloroformie, natomiast trudno rozpuszczalny w wodzie, eterze naftowym i cykloheksanie. Jego temperatura topnienia wy¬ nosi 167°C (po wykrystalizowaniu z mieszaniny H20 : C2H5OH = 1:4), skrecalnosc optyczna [a]MD = = +32° (10% roztwór w chloroformie), charaktery¬ styczne maksima w widmie ultrafioletowym przy dlugosci fal 205 i 293 m|ji (w eterze) lub 209 i 290 m \i (w 60%-wym etanolu) oraz charakterystyczne 69 774 4 pasma adsorpcji w widmie podczerwonym przy czestotliwosciach 3400, 3000, 1235 i 1095 cm"1 (w pastylkach z bromku potasowego) i przy 3570, 3610, 1730, 1740 i 1630 cm-1 (w roztworze w chlorku metylenu).Analogicznie, jak w sposobach wyzej opisanych poddaje sie hodowli mikroorganizmy Pleurotus passeckerianus Pilat,^jak równiez Drosophila sub- strata. Pierwszy z tych mikroorganizmów daje za¬ dana pleuromutiline z wydajnoscia znacznie poni¬ zej 50 mg na litr cieczy hodowlanej (Proc. Nat.Acad. Sci., str. 1, w. 5—7 od dolu, 1951). Stosujac drugi z wymienionych mikroorganizmów, otrzymu¬ je sie równiez tylko niewielkie ilosci pleuromutili- -ly^fDroi^WKtr^j wraz z domieszka skladnika BAicidhilm A,-fc^I).I Zaleta sposobu wedlug wynalazku polega na tym^e^gr^Ly ie^O tgomocy uzyskuje sie pleuromu- ltofij ^ itafl¥iJCVft spuSJUUtllli; Wyó*a'jricJscia, która pozwala na technicz¬ ne zastosowanie tego zwiazku.Sposobem wedlug wynalazku przy zastosowaniu drobnoustroju Clitopilus passeckerianus (Pil.) Sing.NRRL 3100 otrzymuje sie 2390 mg surowego pro¬ duktu na 1 litr cieczy hodowlanej i odpowiednio 1960 mg 100°/o-wej substancji czystej, a w przypad¬ ku zastosowania jego mutanta NRRL 3279 wydaj¬ nosc wynosi 3630 mg surowego produktu na 1 litr cieczy hodowlanej i odpowiednio 3160 mg 100°/o- -wej substancji czystej.Sposobem wedlug wynalazku mozna uzyskac pleuromutiline, hodujac drobnoustrój Clitopilus passeckerianus (Pil.) Sing. NRRL 3100, albo jego mutant NRRL 3279, w wodnym roztworze pozyw¬ ki, zawierajacej zródlo azotu i weglowodanów.Korzystna forma przeprowadzenia powyzszego sposobu hodowania polega na tym, ze wyzej wy¬ mieniony drobnoustrój NRRL 3 100 lub jego mu¬ tant NRRL 3279 hoduje sie najpierw w kulturze wstepnej, zawierajacej jako zródlo weglowodanów i azotu ekstrakt slodowy, a ponadto make fasolo¬ wa, ekstrakt drozdzowy, agar, pepton oraz sole mineralne, a otrzymana przy tym brzeczke fer¬ mentacyjna przenosi sie nastepnie w celu dalszego hodowania do roztworu fermentacyjnego, zawiera¬ jacego jako zródlo weglowodanu glukoze, a jako zródlo azotu autolizat drozdzy piwnych, jak rów¬ niez sole mineralne. Po zakonczeniu hodowli wy¬ tworzona przy tym pleuromutiline wyodrebnia sie w znany sposób.Stosowany sposobem wedlug wynalazku drobno¬ ustrój Clitopilus passeckerianus (Pil.) Sing. NRRL 3 100 nalezy do rodziny Tricholomataceae, rzedu Agaricales, klasy Basidiomycetes.Grzybek podstawczak Clitopilus passeckerianus, NRRL 3 100 rosnie bardzo bujnie na dekstrozo- agarowej pozywce Sabourad'a (produkcji Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA), jego kolonie osiagaja po 10 dniach hodowli w temperaturze 25°C przecietna srednice 49 mm. Barwa wierzch¬ niej strony kolonii jest blado-smietankowa z bia¬ lymi wycinkami. Barwa spodniej strony kolonii jest sniezno-biala z rozjasnionymi wycinkami.Podloze pod kolonia nie zmienia barwy wlasnej.Struktura powierzchni kolonii: w centrum umiar¬ kowanie podwyzszony, waciasto-puszysty, bialy wierzcholek o srednicy 4—5 mm. Z niego promie- niscie wybiegajace, ciasno przy sobie lezace pa¬ sma nitek grzybni, które w wycinkach bialych 5 ulozone sa bardzo scisle. Brzeg kolonii jest po¬ strzepiony. Obraz mikroskopowy: nitki grzybni o srednicy 2—3 mikronów, nie tworzace klamr, nie tworzace zarodników.Grzybek ten rosnie bardzo bujnie na pozywce z autolizatu drozdzy piwnych, dekstrozy i agaru o nastepujacym skladzie: 1,0 g N z przesaczonego autolizatu drozdzy piwnych, 50,0 g glikozy, 1,0 g KH2P04, 0,5 g MgS04 • 7H20, 0,5 g Ca/NOs/2, 0,1 g NaCl, 0,05 g FeS04 • 7H20, 20,0 g bacto-agaru (fir- 15 my Difco), dopelnionej do 1000 ml woda zródlana, pH = 6 nastawione za pomoca NaOH. Kolonie osiagaja po 10 dniach hodowli w temperaturze 25°C przecietna srednice 60 mm. Barwa wierzch¬ niej strony kolonii jest biala. Spodnia strona kolo- 20 nii ma barwe jasnego zóltka jaja. Podloze pod ko¬ lonia nie zmienia barwy wlasnej.Struktura powierzchni kolonii: wierzcholek cen¬ tralny o srednicy 3—5 mm, wysokosci 1—2 mm, z bardzo zbitej waciastej grzybni. Z niego 12—14, przewaznie 15—20 mm dlugich, wybiegajacych pro¬ mienistych bruzd. Kolonie wykazuja poza obsza¬ rem wierzcholka puszysta grzybnie z promieniscie skierowanymi pasmami nitek grzybni. Czesc brze¬ gowa kolonii o szerokosci 3 mm sklada sie z luzno ulozonych nitek grzybni i pozwala przeswiecac podlozu. Brzeg jest slabo postrzepiony. Obraz mi¬ kroskopowy: nitki grzybni o srednicy 2,0—3,5 mi¬ kronów, bez klamr, nie tworzace zarodników. 35 Grzybek rosnie nadzwyczaj slabo na roztworze agarowym Czapek'a (produkcji Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA). Bardzo rzadka grzybnia z wyjatkiem czesci centralnej kolonii daje sie dobrze rozpoznac pod mikroskopem tylko w swietle prze- 40 chodzacym. Kolonie osiagaja po 10 dniach hodowli w temperaturze 25°C przecietna srednice 78 mm.Barwa wierzchniej i spodniej strony kolonii jest w czesci centralnej biala, poza tym prawie szklista.Podloze pod kolonia nie zmienia barwy wlasnej. 45 Struktura powierzchni kolonii: czesc centralna O' srednicy 7 mm skladajaca sie z gestszych pasm ni¬ tek grzybni, poza tym bardzo luzno obok siebie le¬ zace, promieniscie wybiegajace i bardzo slabo roz¬ galezione nitki grzybni. Brzeg kolonii jest silnie 50 postrzepiony. Obraz mikroskopowy: nitki grzybni o srednicy 1,5 — 3,0 mikronów, nie tworzace klamr, nie tworzace zarodników.Grzybek rosnie slabo na agarze slodowym (pro¬ dukcji Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA 55 i osiaga po 10 dniach hodowli w temperaturze 25°C przecietna srednice 74 mm. Barwa wierz¬ chniej i spodniej strony kolonii jest prawie szkli¬ sta. Podloze pod kolonia nie zmienia barwy wlas¬ nej. Struktura powierzchni kolonii: czesc centralna 60 o srednicy 5 — 7 mm, lekko wzniesiona i sklada¬ jaca sie z grubszych pasm nitek grzybni. Pozostala powierzchnia plaska, o bardzo delikatnych, lecz ge¬ sto obok siebie lezacych, promieniscie wybiegaja¬ cych pasmach nitek grzybni. Brzeg kolonii jest 65 postrzepiony. Obraz mikroskopowy: nitki grzybni69 774 o srednicy 1,5 — 4,5 mikrona, nie tworzace klamr, nie tworzace zarodników.Mutant grzybka podstawczaka Clitopilus pas- seckerianus, NRRL 3279 rosnie bardzo bujnie na dekstrozo-agarowej pozywce Sabouraud'a (produkcji Difco Laboratories, Detroit, Mich. USA), jego ko¬ lonie osiagaja po 10 dniach hodowli w temperatu¬ rze 25°C przecietna srednice 35 mm. Barwa wierz¬ chniej strony kolonii jest mleczno-biala.Barwa spodniej strony kolonii jest jasnosmietan- kowa, w centrum ochrowo-zólta. Podloze pod ko¬ lonia nie zmienia barwy wlasnej. Struktura po¬ wierzchni kolonii: w centrum umiarkowanie pod¬ wyzszony, stozkowaty, aksamitny, bialy wierzcho¬ lek o srednicy 2 — 3 mm. Od niego promieniscie wybiegajace, scisle ulozone pasma nitek grzybni.Brzeg kolonii jest slabo postrzepiony. Obraz mi¬ kroskopowy: nitki grzybni o srednicy 1,5 — 3,5 mikrona, nie tworzace klamr, nie tworzace zarod¬ ników.Grzybek rosnie bardzo bujnie na pozywce z auto- lizatu drozdzy piwnych, dekstrozy i agaru o na¬ stepujacym skladzie: 1,0 g N przesaczonego auto- lizatu drozdzy piwnych, 50,0 g glikozy, 1,0 g KH2P04, 0,5 g MgS04-7H20, 0,5 g Ca/N03/2, 0,1 g Na Cl, 0,05 g FeS04-7H20, 20,0 g bacto-agaru (fir¬ my Difco) dopelnionej do 1000 ml woda zródlana, pH = 6,0 nastawione za pomoca NaOH. Kolonie osiagaja po 10 dniach hodowli w temperaturze 25°C przecietna srednice 23 mm. Barwa wierzch¬ niej strony kolonii jest sniezno-biala. Barwa spod¬ niej strony kolonii jest jasno-smietankowa. Pod¬ loze pod kolonia nie zmienia barwy wlasnej. Struk¬ tura powierzchni kolonii: cala powierzchnia sklada sie ze zbitej, aksamitnej grzybni. Centralny, slabo podwyzszony, stozkowaty wierzcholek o srednicy 2 — 3 mm. Z niego wybiegajacych 7 — 8, prze¬ waznie 5 — 7 mm dlugich, dobrze uwydatnionych promienistych bruzd. Brzeg kolonii jest slabo po¬ strzepiony. Obraz mikroskopowy: nitki grzybni o srednicy 1,5 — 3,0 mikronów, bez klamr, nie two¬ rzace zarodników.Grzybek rosnie bardzo slabo na roztworze aga¬ rowym Czapek'a (firmy Difco Laboratories, Detroit Mich., USA). Bardzo rzadka grzybnia z wyjatkiem centralnej czesci kolonii daje sie dobrze rozpoznac makroskopowo tylko w swietle przechodzacym. Ko¬ lonie osiagaja po 10 dniach hodowli w temperaturze 25°C przecietna srednice 33 mm. Barwa wierzchniej i spodniej strony kolonii w czesci srodkowej bla- do-biala, poza tym szklista. Podloze pod kolonia nie zmienia barwy wlasnej. Struktura powierzchni kolonii; czesc centralna o srednicy 2 — 4 mm skladajaca sie z nieco gestszych pasm nitek grzyb¬ ni, poza tym bardzo luzno obok siebie lezace, wy¬ biegajace promieniscie pasma nitek grzybni. Brzeg kolonii jest silnie postrzepiony. Obraz mikroskopo¬ wy: nitki grzybni o srednicy 2 — 4 mikronów, bez klamr, nie tworzace zarodników.Grzybek rosnie slabo na agarze slodowym (fir¬ my Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA) i osia¬ ga po 10 dniach hodowli w temperaturze 25°C przecietna srednice kolonii 37 mm. Barwa wierzch¬ niej i spodniej strony kolonii jest prawie szklista.Podloze pod kolonia nie zmienia barwy wlasnej.Struktura powierzchni kolonii: czesc centralna o srednicy 2 — 3 mm, lekko wzniesiona i skladajaca sie z grubszych pasm nitek grzybni. Pozostala po¬ wierzchnia plaska, z delikatnymi, lecz scisle uloio- 5 nymi, promieniscie wybiegajacymi pasmami nitek grzybni, które blyszcza jedwabiscie w swietle prze¬ chodzacym. Brzeg kolonii jest slabo postrzepiony.Obraz mikroskopowy: nitki grzybni o srednicy 1,5 — 4,0 mikronów, nie tworzace zarodników. 10 Pleuromutilina, otrzymana sposobem wedlug wy¬ nalazku, stanowi znakomity dodatek do gotowych mieszanek paszowych. Poniewaz w stosowanych zwykle ilosciach, wskutek niewielkiego wchlania¬ nia w organizmie ludzkim, jest ona nieskuteczna 15 przeciwko zarazkom chorobotwórczym u czlowieka, wytworzone przy uzyciu tego zwiazku gotowe mie¬ szanki paszowe nie moga prowadzic do rozwoju odpornych kultur bakterii, jak to ma zazwyczaj miejsce w przypadku antybiotyków, stosowanych 20 u ludzi, które stanowia równiez znane dodatki pa¬ szowe.Dalsza zaleta pleuromutiliny polega na tym, ze nie jest ona atakowana przez pozostale skladniki gotowej mieszanki paszowej, jak np. suche grzyb- 25 nie, w szczególnosci z produkcji penicyliny, macz¬ ki z krwi i/lub substancje mineralne i/lub witamin ny, w szczególnosci jednak przez koncentraty bial¬ kowe, np. maczki rybne. Poniewaz pleuromutilina jest w wodzie trudno rozpuszczalna, bardzo duze ^ jej ilosci po hodowaniu znajduja sie w grzybniach, tak ze jest mozliwe juz przez wysuszenie i nastep¬ ne zmielenie grzybni uzyskanie bardzo skutecznego dodatku do pasz suchych.Zawartosc pleuromutiliny w 1 kg gotowej mie- 85 szanki paszowej powinna wynosic 2,5 — 50 mg dla drobiu i 10 — 50 mg dla swin. W przypadku cielat i bydla tucznego gotowa mieszanka paszowa powinna byc skarmiana w takiej ilosci, aby dzien¬ nie przyjmowana dawka wynosila 25 — 70 mg 40 pleuromutiliny. Pleuromutilina wykazuje w wiek¬ szych dawkach korzystne dzialanie przeciwko za¬ razkom chorobotwórczym zwierzat, tak ze mozli¬ we jest stosowanie pleuromutiliny w weterynarii.Ponizsze przyklady stanowia ilustracje sposobu wedlug wynalazku, nie ograniczajac jednak jego zakresu.Przyklad I. Otrzymywanie pleuromutiliny.Kulture Clitopilus passeckerianus NRRL 3100 na pozywce agarowej splukuje sie wyjalowionym fiz¬ jologicznym roztworem soli kuchennej i 3 ml otrzy¬ manej zawiesiny przeszczepia do szerokoszyjnej kol¬ by stozkowej o pojemnosci 500 ml napelnionej 60 ml wyjalowionego roztworu pozywki.Pozywka do skosów agarowych: maka fasolowa 55 10,0 g, KH2P04 0,5 g, FeCl (1% roztwór) 1,0 ml, ekstrakt drozdzowy 0,1 g, ekstrakt slodowy 50,0 g, pepton 1,0 g i agar 15,0 g, woda destylowana do 1000 ml, przy naturalnym pH.Roztwór pozywki do fermentacji: glukoza 50,0 60 g/l, N-autolizat drozdzy piwnych 1,0 g/l, KH2P04 1,0 g/l, MgS04-7H20 0,5 g/l, Ca/N03/2 0,5 g/1, NaCl 0,1 g/l i FeS04-7H20 0,05 g/l, woda destylowana do 1000 ml; pH przed wyjalowieniem 6,0.Po 120 godzinach fermentacji w temperaturze _ 24°C na wytrzasarce obrotowej o skoku 40 mm 45 5069774 8 1 250 obrotach na minute, zawartosc szerokoszyjnej kolby stozkowej o pojemnosci 500 ml nabiera kon¬ systencji gestej brei. Z niej 10 ml stosuje sie do przeszczepienia do szerokoszyjnej kolby stozkowej o pojemnosci 2 litrów, napelnionej 200 ml wyzej podanego wyjalowionego roztworu pozywki do fer¬ mentacji. Hodowle przeprowadza sie w tych sa¬ mych warunkach, jak przy przeprowadzaniu pierw¬ szego etapu wstepnego. Po uplywie 48 godzin uzy¬ skana brzeczke fermentacyjna przeszczepia sie do wypelnionego 10 1 wyzej podanego roztworu po¬ zywki do fermentacji naczynia typu New-Bruns- wick do fermentacji submersyjhej, wyposazonego w uklad przeszkód. Fermentacje prowadzi sie w ciagu 120 godzin przy przeplywie powietrza 0,5 1 na 1 1 roztworu pozywki na minute i przy szyb¬ kosci obrotowej mieszadla krazkowego 350 obrotów na minute.Wytwarzanie placka zawierajacego pleuromutili- ne do zastosowania jako dodatek do paszy. Cala zawartosc naczynia fermentacyjnego odparowuje sie do suchosci w wyparce prózniowej w tempe¬ raturze pokojowej, a uzyskany placek miele sie na drobny proszek. Otrzymuje sie przy tym 200 g suchego proszku o zawartosci 5 g pleuromutiliny.Wyodrebnienie pleuromutiliny. Po zakonczeniu fermentacji breje fermentacyjna rozdziela sie przez saczenie na nuczy cisnieniowej na 8,1 1 przesaczu kultury i grzybnie.Ekstrakcja pleuromutiliny z przesaczu kultury. 8,1 1 przesaczu opH = 6,8 ekstrahuje sie dwukrot¬ nie kazdorazowo za pomoca 1,6 1 octanu etylu. Ca¬ la substancja czynna przechodzi przy tym do fazy organicznej. Odwadnia sie ja za pomoca bezwod¬ nego Na2S04, zateza maksymalnie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem i wreszcie zadaje 50 ml eteru dwu- etylowego. Po 24-godzinnym odstaniu w temperatu¬ rze +3°C wytraca sie pleuromutilina w postaci krystalicznej. Nastepnie odsacza sie, przemywa dwukrotnie za pomoca 50 ml eteru naftowego o temperaturze wrzenia 60 — 80°C, po czym suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze pokojowej. Uzyskana pleuromutilina ma stopien czystosci 86,2%.Ekstrakcja pleuromutiliny z grzybni.Wilgotna grzybnie ekstrhuje sie trzykrotnie za pomoca 3,4 1 technicznego acetonu (o zawartosci 9 % wody), wytrzasajac silnie za kazdym razem w ciagu 30 minut. Po polaczeniu ekstraktów i od¬ parowaniu acetonu pod zmniejszonym cisnieniem pozostaje 2,0 1 fazy wodnej, z której wytraca sie pleuromutilina. Zawiesine ekstrahuje sie teraz dwu¬ krotnie kazdorazowo za pomoca 0,5 1 octanu etylu, ekstrat przemywa sie raz za pomoca 1 litra 5%-go roztworu wodnego weglanu sodowego, a nastepnie woda do odczynu obojetnego, Po nastepnym od¬ wodnieniu bezwodnym NasS04 i zatezeniu pod 5 zmniejszonym cisnieniem wytraca sie pleuromuti¬ lina w postaci krystalicznej. Zadaje sie ja 100 ml eteru i pozostawia na 24 godziny w temperaturze +3°C. Po odsaczeniu i przemyciu wykrystalizowa¬ nej substancji za pomoca 200 ml eteru naftowego 10 (temperatura wrzenia 60 — 80°C) otrzymuje sie pleuromutiline o stopniu czystosci 81,0%.Przyklad II. Otrzymywanie pleuromutiliny przez hodowanie mutanta NRRL 3279. Przy zasto¬ sowaniu opisanego w przykladzie I sposobu fer- ]5 mentacji, jednak z zastapieniem uzytego w nim szczepu grzyba Clitopilus passeckerianus NRRL 3 100 jego mutantem NRRL 3279, uzyskuje sie za¬ wierajaca pleuromutiline brzeczke fermentacyjna, która przerabia sie w sposób nizej opisany: 20 Ekstrakcja pleuromutiliny z przesaczu kultury: 8,5 1 przesaczu o pH = 6,5 ekstrahuje sie dwu¬ krotnie kazdorazowo za pomoca 1,7 1 octanu etylu.Dalsza przeróbke przeprowadza sie, jak w przy¬ kladzie I. Otrzymana pleuromutilina ma stopien czystosci 85,5%.Ekstrakcja pleuromutiliny z grzybni. Wilgotna grzybnie ekstrahuje sie trzykrotnie za pomoca 2,6 1 technicznego acetonu (o zawartosci 9% wody), silnie wytrzasajac za kazdym razem w ciagu 30 minut. Po polaczeniu ekstraktów i odparowaniu acetonu pod zmniejszonym cisnieniem otrzymuje sie 1,5 1 fazy wodnej, z której wytraca sie antybio¬ tyk. Dalsza przeróbke przeprowadza sie, jak w przykladzie I. Otrzymuje sie przy tym pleuromu¬ tiline o stopniu czystosci 87,3%.Otrzymywanie zawierajacego pleuromutiline plac¬ ka przez odparowanie brei kultury po fermentacji lub oddzielonej od cieczy przez saczenie grzybni jest przy zastosowaniu szczepu NRRL 3279 szcze¬ gólnie proste i racjonalne. Na skutek wysokiej za¬ wartosci pleuromutiliny w grzybni mozna w ten sposób uzyskac przedmieszke do przyrzadzania gotowej paszy, która zawiera 5% suchej substancji srodka czynnego. 25 85 45 50 PL PL