PL68197Y1 - Mikroukład do hodowli komórkowej - Google Patents

Description

Opis wzoru

Przedmiotem wzoru użytkowego jest mikroukład do hodowli komórkowej stosowany do prowadzenia testów z materiałem biologicznym.

Badania biologiczne związane z hodowlą komórek i ich analizą prowadzone są w klasycznych laboratoriach z wykorzystaniem płytek dołkowych lub szalek Petriego. Wykonywanie badań z materiałem biologicznym w takich warunkach związane jest z pokładaniem ogromnych kosztów związanych z wyposażeniem laboratoriów czy też wykształceniem personelu. Istotne jest też to, iż warunki prowadzenia badań na takich hodowlach nie odzwierciedlają dostatecznie dobrze warunków in vivo. Metody wykorzystywane w laboratoriach biologicznych wymagają ciągłego udoskonalania, a także opracowywania i wprowadzania na rynek nowych urządzeń ze względu na wymagania, jakie są obecnie stawiane prowadzonym pomiarom. Mikrosystemy opisywane w literaturze, przeznaczone do testów komórek, wykonane są najczęściej z jednego rodzaju materiału, mikrowzory wykonywane są w jednej warstwie mikroukładu. Mikroukłady nie są wyposażone w element grzejny. Wykorzystanie miniaturyzacji w tworzeniu nowych urządzeń dedykowanych inżynierii komórkowej, niesie ze sobą wiele korzyści nie tylko ekonomicznych, ale również związanych z przystosowaniem warunków prowadzenia badań do takich, które są najbardziej zbliżone do warunków in vivo.

Znany jest z publikacji K. Ziółkowska i In., Sensor and actuators B: Chemical, 2010, 145:533-542, mikroukład składający się z dwóch płytek - szklanej i polimerowej. W szklanej płytce znajduje się macierz mikrokomór hodowlanych w układzie liniowym, przeznaczonych do prowadzenia hodowli komórek. Mikrokanały, korzystnie meandryczne, utworzone w płytce polimerowej, tworzą generator gradientu stężeń, zawierający dwa kanały wlotowe służące do wprowadzenia dwóch stężeń badanych substancji i kanały wylotowe połączone z mikrokomorami hodowlanymi i łączące mikrokomory hodowlane ze sobą wzdłuż mikroukładu. Od strony dwóch kanałów wlotowych znajdują się trzy mikrokanały, każdy następny etap generatora gradientu stężeń utworzony przez mikrokanały zawiera o jeden mikrokanał więcej. W ostatnim etapie generatora stężeń utworzonym przez mikrokanały znajduje się taka liczba mikrokanałów, która odpowiada liczbie mikrokomór hodowlanych. W trakcie przepływu substancji przez generator gradientu stężeń następuje wymieszanie badanych substancji i tworzenie różnych stężeń. Pozwala to na otrzymanie macierzy mikrokomór z tyloma stężeniami badanej substancji w jednym kroku ile jest linii mikrokomór hodowlanych. Ponadto mikrosystem zawiera wywiercony w płytce polimerowej otwór do wprowadzenia komórek do mikroukładu oraz pożywek hodowlanych.

Mikroukład według powyższej publikacji nie pozwala na zapewnienie stabilnej i ściśle określonej temperatury, koniecznej w trakcie badań z materiałem biologicznym.

Mikroukład według wzoru użytkowego zawiera przezroczystą grzałkę z kontaktami elektrycznymi. Umieszczona jest ona na spodniej stronie płytki szklanej. Grzałka może być wykonana z tlenku indowo-cynowego lub przezroczystego polimeru przewodzącego. Kontakty elektryczne grzałki wykonano metodą sitodruku z wykorzystaniem pasty srebrowej.

Wykonanie mikroukładu do hodowli komórkowej rozpoczyna się od zaprojektowania przebiegu mikrokanałów przepływowych i miejsca wzrostu komórek stanowiących mikrokomory. W szkle wykonano mikrokomory z wykorzystaniem fotolitografii i mokrego trawienia. Materiał światłoczuły umieszcza się na płytce szklanej i naświetla go światłem UV przez 2,5 min, w ten sposób otrzymując tzw. pieczątkę. Uzyskaną pieczątkę wywołuje się w roztworze HF:NH4F (6:1) przez 30 minut. Po przeciwnej stronie płytki szklanej wykonano grzałkę nanosząc polimer przewodzący oraz pastę srebrową za pomocą sitodruku. Mikrowzory w płytce polimerowej wytwarzane są za pomocą fotolitografii i metody odlewu. Na wykonaną pieczątkę, z wypukłą strukturą, wylewa się płynny prepolimer, sieciuje w temperaturze 70°C. Po 60 minutach otrzymuje się wzór w płytce polimerowej. Usieciowaną strukturę w płytce polimerowej zamraża się w ciekłym azocie, a następnie wywierca otwory pełniące rolę wlotu badanych substancji i wlotu służącego do wprowadzania komórek. Wykonane płytki: szklaną i polimerową połączono ze sobą z wykorzystaniem plazmy tlenowej, a w wykonanych otworach umieszczono wężyki doprowadzające roztwory do mikroukładu. Tak przygotowany mikrosystem jest gotowy do użycia. Przed rozpoczęciem prowadzenia badań z materiałem biologicznym mikroukład wysterylizowano.

Mikrosystem umożliwia prowadzenie hodowli zarówno nowotworowych jak i prawidłowych komórek w stabilnej i ściśle określonej temperaturze, koniecznej w trakcie badań z materiałem biologicznym.

Mikroukład do hodowli komórek według wzoru został przedstawiony na rysunku Fig. 1 w rzucie ukośnym.

Claims (2)

1. Mikroukład według wzoru stanowi hybrydowy system składający się z płytki szklanej 1 ze szkła sodowego oraz płytki polimerowej 2 z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS). Płytka szklana 1 i płytka polimerowa 2 są ze sobą trwale połączone przy użyciu plazmy tlenowej, zapewniając uszczelnienie mi-krowzorów. Materiały wykorzystane do wykonania mikroukładu zostały wyselekcjonowane ze względu na ich właściwości chemiczne, które umożliwiają prowadzenie badań z materiałem biologicznym. Ponadto ze względu na przezroczystość użytych materiałów możliwa jest obserwacja zmian morfologii komórek w czasie rzeczywistym, jak również możliwość wykonania mikrosystemu z wykorzystaniem względnie tanich technologii. W mikroukładzie, w płytce szklanej 1 znajduje się macierz 5x5 mikro-komór hodowlanych 3 o średnicy 1000 μίτι i głębokości 30 μΐη, przeznaczonych do prowadzenia hodowli komórek. Mikrokanały 4, utworzone w płytce polimerowej 2, o szerokości 100 μίτι i głębokości 50 μΐη, tworzą generator gradientu stężeń, zawierający dwa kanały wlotowe 5a i 5b służące do wprowadzenia dwóch stężeń badanych substancji i pięć kanałów wylotowych 6 połączonych z mikrokomorami hodowlanymi 3. W trakcie przepływu substancji przez generator gradientu stężeń następuje wymieszanie badanych substancji i tworzenie różnych stężeń. Pozwala to na otrzymanie macierzy mikro-komór z pięcioma stężeniami badanej substancji w jednym kroku. Ponadto mikrosystem zawiera wywiercony w płytce polimerowej otwór 7 służący do wprowadzenia komórek do mikroukładu oraz pożywek hodowlanych. W celu zapewnienia stabilnej i ściśle określonej temperatury, koniecznej w trakcie prowadzenia badań z materiałem biologicznym, w mikrosystemie znajduje się przezroczysta grzałka 8. Umieszczona jest ona na spodniej stronie płytki szklanej 1. Grzałkę 8 wykonano z tlenku indowo--cynowego. Kontakty elektryczne 9 grzałki 8 wykonano metodą sitodruku z wykorzystaniem pasty srebrowej. Wykonanie mikroukładu do hodowli komórkowej rozpoczyna się od zaprojektowania przebiegu mikrokanałów przepływowych 4 i miejsca wzrostu komórek stanowiących mikrokomory 3. W szkle wykonano mikrokomory 3 z wykorzystaniem fotolitografii i mokrego trawienia. Materiał światłoczuły umieszcza się na płytce szklanej i naświetla go światłem UV przez 2,5 min, w ten sposób otrzymując tzw. pieczątkę. Uzyskaną pieczątkę wywołuje się w roztworze HF:NH4F (6:1) przez 30 minut. Po przeciwnej stronie płytki szklanej 2 wykonano grzałkę 8 nanosząc polimer przewodzący oraz pastę srebrową stanowiącą kontakty elektryczne 9 za pomocą sitodruku. Mikrowzory w płytce polimerowej 2 wytwarzane są za pomocą fotolitografii i metody odlewu. Na wykonaną pieczątkę, z wypukłą strukturą, wylewa się płynny prepolimer, sieciuje w temperaturze 70°C. Po 60 minutach otrzymuje się wzór w płytce polimerowej
2. 2. Usieciowaną strukturę w płytce polimerowej 2 zamraża się w ciekłym azocie, a następnie wywierca otwory 5a i 5b pełniące rolę wlotu badanych substancji i wlotu 7 służącego do wprowadzania komórek. Wykonane płytki: szklaną 1 i polimerową 2 połączono ze sobą z wykorzystaniem plazmy tlenowej, a w wykonanych otworach umieszczono wężyki doprowadzające roztwory do mikroukładu. Tak przygotowany mikrosystem jest gotowy do użycia. Przed rozpoczęciem prowadzenia badań z materiałem biologicznym mikroukład wysterylizowano (70% etanolem i światłem UV) i wprowadzono pożywkę hodowlaną. Następnie przez wlot 7 wprowadzono zawiesinę komórek adherent-nych A549 komórki nowotworowe płuc lub HT-29 - komórki nowotworowe jelita grubego o gęstości ok. 1*106 komórek/cm3, inkubowano je przez 24h w inkubatorze w t=37°C, C02=5%. Komórki wzrastały w mikrokomorach hodowlanych 3 przez 24 godziny. Następnie wlotami 5a i 5b wprowadzono substancję (5-fluorouracyl) o stężeniu 300 μΜ 5a i ΟμΜ 5b. Na końcach generatora gradientu stężeń 6 i w mikrokomorach 3 otrzymano pięć różnych stężeń badanej substancji. Po 24h działania związku określono żywotność komórek z wykorzystaniem barwienia różnicowego roztworem jodku propidyny (PI) i calceiny AM, który wprowadzono wlotem 7. Grzałka 8 zapewniała kontrolę temperatury w trakcie prowadzenia testów. Zastrzeżenia ochronne 1. Mikroukład do hodowli komórkowej, składający się z dwóch połączonych płytek - szklanej (1) i polimerowej (2), w szklanej płytce (1) znajduje się macierz mikrokomór hodowlanych (3) w układzie liniowym a w płytce polimerowej (2) znajdują się mikrokanały (4) tworzące generator gradientu stężeń, zawierający dwa kanały wlotowe (5a) i (5b) do wprowadzenia dwóch stężeń badanych substancji i kanały wylotowe (6) połączone z mikrokomorami hodowlanymi (3) i łączące mikrokomory hodowlane (3) ze sobą wzdłuż mikroukładu, przy czym od strony dwóch kanałów wlotowych (5a) i (5b) znajdują się trzy mikrokanały (4), każdy następny etap generatora gradientu stężeń utworzony przez