PL65086B1 - - Google Patents

Description

Próby ilosciowe¬ go okreslenia czynnika gosccowego u chorych, pro¬ wadzone w probówce, za pomoca tych uczulonych czastek czesto jednak daja astronomicznie wysokie miana, które bardziej wiaza sie z danym prepa¬ ratem ludzkiej globuliny uzytej do uczulania, niz ze stanem chorobowym badanej osoby.Do oznaczania czynnika gosccowego stosuje sie równiez czastki biologiczne. Jezeli stosuje sie ludz¬ kie krwinki czerwone, wówczas do uczulania uzy¬ wa sie wybrana, ludzka gamma globuline, zawie- 10 15 25 30 rajaca specyficzny czynnik nie aglutynujacy anty — D (Rh0), lub tez krwinki czerwone traktuje sie najpierw srodkiem, takim jak kwas taninowy, który zmienia wlasciwosci powierzchni tak, ze bialko jest latwo ale nieswoiscie adsorbowame. Zaden z tych srodków nie znalazl szerokiego zastosowa¬ nia, w przeciwienstwie do próby czerwonych krwi¬ nek owiec-królików, opisanej po raz pierwszy przez Waaler'a [Acta Path. Microbiol. Scand., 17, 172 (1940)] i nastepnie przez Rose i in. [Proc. Soc.Exper. Biol. and Med., 68, 1 (1948)].Aczkolwiek specyficzny charakter próby z krwin¬ kami owczymi nie jest znany, to jednak specyfika ta zostala wykazana wielokrotnie w klinicznych badaniach pacjentów, których surowica przy tym badaniu dawala wyniki pozytywne. Miana uzyski¬ wane w probówce rzadko przekraczaly 1 :5000 i nie zgadzaly sie z wynikami uzyskiwanymi przy uzy¬ ciu taninowanych i uczulonych krwinek czerwo¬ nych lub uczulonego lateksu, siegajacymi poza 1 :100000.Pomimo pewnosci próby Waaler-Rose, badanie przy uzyciu krwinek owczych nie jest rozpowszech¬ nione ze wzgledu na nietrwalosc nosnika czerwo¬ nych krwinek, bowiem normalizowanie i uczulanie czerwonych krwinek zajmuje wiele czasu, a nalezy je przeprowadzac czesto.Srodek wedlug wynalazku umozliwia przeprowa¬ dzanie prób potwierdzajacych badanie w probówce i nadaje sie do stosowania w przypadkach, w któ- 65 08665 086 rych przy uzyciu szybkiego badania wstepnego uzyskuje sie wynik pozytywny. Srodek wedlug wy¬ nalazku moze byc stosowany do sprawdzania wy¬ ników uzyskanych przy badaniu metoda czerwo¬ nych krwinek owczych.Srodek wedlug wynalazku sklada sie z zawie¬ siny stalych silnie rozdrobnionych czastek polime¬ ru o przecietnej srednicy 0,15 — 14 mikronów w cieczy polarnej, przy czym czastki te sa w celu uczulenia pokryte królicza gamma globulina, pod^ dana dzialaniu proteolitycznego enzymu. Jako czastki polimeru szczególnie korzystnie stosuje sie czastki polistyrenu o przecietnej srednicy 0,81 mi- krcnaM lub czastki polimeru akrylowego.Eaganie fiE^poltojca^ srodka wedlug wynalazku prowadzi sie w ten sfrj^sób, ze w szeregu probówek przygotowuje sie podwójnie rozcienczone miesza¬ niny surowicy krwi w substancji buforujacej jako rozcienczalniku,i dodaje taka sama objetosc srodka lateksowego. Probówki z mieszanina surowicy i srodka lateksowego ogrzewa sie w temperaturze 56°C w ciagu 2 godzin, a nastepnie pozostawia przez noc w temperaturze 4QC. Jezeli surowica za¬ wiera czynniki gosccowe, wówczas reakcja uwi¬ dacznia sie w zlepianiu sie czastek odczynnika la¬ teksowego. Jezeli zas czynników gosccowych nie ma, to lateks pozostaje równomiernie zawieszony w cieklym srodowisku. Nasilenie reakcji okresla sie przez oznaczanie stopnia aglutynacji.Poniewaz badanie to nie przebiega nalezycie przy uzyciu zwyklej gamma globuliny króliczej, uprzednio nalezy zmienic jej wlasciwosci antyge- niczne. Najskuteczniej osiaga sie to, jezeli przed uzyciem do uczulania czastek lateksu, królicza gamma globuline podda sie dzialaniu enzymu. Na¬ stepnie po zmieszaniu z lateksem ogrzewa sie, ko¬ rzystnie do temperatury 50°C w ciagu 7—10 dni, przy czym przemiana króliczej gamma globuliny dobiega konca. Mozna tez stosowac ogrzewanie w wyzszej temperaturze w ciagu krótszego okresu czasu, ale ogrzewanie bez uprzedniego potraktowa¬ nia enzymem nie daje dobrego odczynnika.Stwierdzono, ze do przemiany króliczej gamma globuliny mozna stosowac z dobrym wynikiem rózne enzymy, mianowicie surowa lub krystaliczna trypsyne, chymotrypsyne lub papaine. Szczególnie skuteczne sa proteazy grzybowe i pepsyna. Charak¬ ter przemiany, której podlega przy tym królicza gamma globulina, nie zostal calkowicie poznany, ale prawdopodobnie zdolnosc do reagowania czyn¬ nika gosccowego z królicza gamma globulina za¬ lezy od miejsc, które staja sie niedostepne po zaad- sorbowaniu globuliny przez lateks. Rozdzial cza¬ steczek globuliny pod wplywem róznych proteoli¬ tycznych enzymów powoduje natomiast odslanianie istotnych ich czesci. Ogrzewanie rozdrobnionego materialu powoduje dalszy rozpad pierwotnej bu¬ dowy, z obnazeniem zadanych, czynnych miejsc na powierzchni.. W przeciwienstwie do tego, czasteczki ludzkiej gamma .globuliny, traktowane w ten sposób, ulegaja zwiekszeniu i nie nadaja sie jako odczynnik. Wstep¬ ne traktowanie ludzkiej gamma globuliny przed uczulaniem lateksu, jak stwierdzono, nie zwieksza jej zdolnosci do reakcji. Poza tym ludzika gamma globulina i królicza gamma globulina wymagaja sto¬ sowania innego srodowiska buforowego. Podczas gdy chlorek sodowy w boranowym srodowisku bu¬ forujacym przyspiesza szybkosc reakcji lateksu 5 uczulonego ludzka globulina, to 0,1 m roztwór chlorku sodowego w boranowym srodowisku bufo¬ rujacym hamuje calkowicie reakcje króliczej gam¬ ma globuliny. Reakcja przebiega najlepiej przy ste¬ zeniu 0,025 m soli w boranowym srodowisku bu- 10 forujacym.Wynalazek jest blizej wyjasniony w nizej po¬ danych przykladach.Przyklad I. 100 mg króliczej gamma globu¬ liny rozpuszcza sie w 5 ml 0,1 m boranowego roz- 15 tworu buforowego o wartosci pH "= 8,6 po czym dodaje sie 10 mg surowej trypsyny, ogrzewa do temperatury 37°C i utrzymuje w tej temperaturze w ciagu 1 godziny. Tak spreparowana gamma glo¬ buline rozciencza sie nastepnie 0,1 m boranowym 20 roztworem buforowym o wartosci pH = 8,6 do objetosci 50 ml i mieszajac wlewa powoli do 50 ml zawiesiny polistyrenu o sredniej wielkosci czastek 0,81 mikrona i o stezeniu 2% w stosunku wagowym.Nastepnie dodaje sie timerosalu do uzyskania ste- 25 zenia 1 : 5000, ogrzewa powoli do temperatury 50^C i utrzymuje w tej temperaturze w ciagu 10 dni, po czym w celu utrwalenia dodaje sie bydlecej albuminy surowiczej nie zawierajacej soli, az do uzyskania stezenia 0,1% i tak przygotowany ma- 30 terial przechowuje sie w temperaturze ^C.Przyklad II. 100 mg króliczej gamma glo¬ buliny rozpuszcza sie w 5 ml 0,1 m buforowego roztworu boranowego o wartosci pH = 8,6, dodaje 10 mg surowej trypsyny, ogrzewa do temperatury 35 37^ i utrzymuje w tej temperaturze w ciagu 1 go¬ dziny. Calosc rozciencza sie do 50 ml 0,1 m roztwo¬ rem buforowym boranu o pH = 8fi i mieszajac dodaje powoli do 50 ml 2% zawiesiny polistyrenu 0 przecietnej srednicy czastek 0,81 mikrona. Na- 40 stepnie dodaje sie timerosalu do uzyskania stezenia 1 :5000, ogrzewa do temperatury 93°C i utrzymuje w tej temperaturze w ciagu 10 minut. Otrzymany produkt przechowuje sie w temperaturze 4°C.Przyklad III. 100 mg króliczej gamma globu- 45 liny rozpuszcza sie w 5 ml 0,1 m roztworu bufo¬ rowego fosforanowego o wartosci pH = 7,1, dodaje 2 mg pafcainy, ogrzewa do temperatury 37QC i utrzymuje w tej temperaturze w ciagu 1 godziny, Produkt dializuje sie nastepnie boranowym roz- 50 tworem buforowym o wartosci pH = 8,6 rozcien¬ cza tym roztworem do 50 ml i mieszajac dodaje powoli do 50 ml 2% zawiesiny polistyrenu o prze¬ cietnej srednicy czastek 0,81 mikrona. Nastepnie dodaje sie timerosalu az do uzyskania stezenia 55 l : 5000, ogrzewa powoli do temperatury 50°C i utrzymuje w tej temperaturze w ciagu 10 dni.Otrzymany produkt przechowuje sie w tempera¬ turze 4^.Wprawdzie korzystnie jest stosowac czastki la- 60 teksu pokryte królicza gamma globulina w srodo¬ wisku o wartosci pH = 8,6, ale mozna tez stoso¬ wac wartosc pH = 8—9.Przy prowadzeniu prób potwierdzajacych obec¬ nosc czynnika gosccowego przy uzyciu srodka we- 65 diug wynalazku stosuje sie surowice krwi pacjen-65 086 %ów, u których wstepne badanie wykazalo obecnosc tego czynnika. Odczynnik przygotowany w sposób opisany w przykladach I — III rozciencza sie 1 :20 buforujacym roztworem boranowym 0,025 m. 10 probówek szklanych 12 X 75 mm umieszcza sie w stojaku, a roztwory dublujace przygotowuje sie w ten sposób, ze 0,1 ml surowicy pacjenta odmie¬ rza sie pipeta do probówki nr 1 i dodaje 1,9 ml 0,025 m roztworu buforowego boranu, zas do po¬ zostalych 9 probówek dodaje sie 1,0 ml tego roz¬ tworu. Miesza sie zawartosc probówki nr 1 i 1,0 ml tej zawartosci przenosi do probówki nr 2. Zawar¬ tosc probówki nr 2 miesza sie i 1,0 ml tej zawar¬ tosci przenosi do probówki nr 3 i tak dalej az do probówki nr 9, z której ostateczna 1,0 ml odrzuca sie. Probówka nr 10 sluzy do porównania.Nastepnie do kazdej z 10 probówek dodaje sie 1,0 ml rozcienczonego odczynnika, miesza i utrzy¬ muje w temperaturze 56°C w ciagu 2 godzin, a po tym przez noc w temperaturze 4°C. Wyniki reakcji odczytuje sie ze stopnia aglutynacji czastek i kla¬ rownosci cieczy nad osadem. Wyniki oznacza sie nastepujaco: ujemny (jak w próbie porównawczej), ±, 1+, 2+, 3+ lub 4+.Nizej podana tablica 1 zawiera wyniki prób kontrolnych w odniesieniu do przypadków, dla których otrzymano pozytywne wynika za pomoca znanej próby lateksowej, na szkielku. Podwójne rozcienczanie, przy którym wystepuje aglutynacja pod wplywem srodka wedlug wynalazku, moze byc porównana z podwójnym rozcienczaniem w metodzie Waaler-Rose przy uzyciu krwinek ow¬ czych.Tablica 1 Pacjenci pod obserwacja kliniczna, z ustalonym rozpoznaniem goscca pierwotnie przewleklego Numer surowicy 101 102 103 104 1 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 Próba Waaler- -Rose 2560 nd 1280 640 1280 2560 nd 5120 5120 320 40 320 5120 5120 1280 nd 320 40 320 1280 160 nd 640 Próba lateksowa na szkielku ++++ — +++ +++ ++ ++++ — ++++ +++ + — +++ ++++ ++++ +++ — +++ + ++ +++ ++ — ++4- Próba lateksowa w probówce 640 nd 320 320 640 2560 nd 1280 2560 160 <20 1280 2560 5120 640 nd 160 160 160 320 160 nd 163 W tablicy 1 „nd" oznacza, ze próby nie przepro¬ wadzano. Jezeli próba na szkielku dala wynik ne¬ gatywny, to prób innych nie wykonywano.Tablica 2 Pacjenci, których surowice wyslano do serologii goscca pierwotnie przewleklego Dane kliniczne niepewne 10 15 20 30 35 Numer surowicy 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 1 139 140 141 142 143 Próba Waaler- -Rose 160 320 160 1280 320 2560 1280 320 1280 1280 320 160 20 5120 320 320 640 160 5120 80 Próba lateksowa na szkielku +++ +++ +++ +++ ++++ +++ +++ ++ ++++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++ ++ + ++++ + Próba lateksowa w probówce 320 80 320 320 160 160 320 160 2560 2560 160 20 80 160 320 160 80 80 160 160 Tablica 3 Pacjenci, których surowice byly skierowane do serologii na syfilis Dane kliniczne niepewne 45 50 55 60 65 Numer surowicy 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 Próba Waaler- -Rose nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 320 nd nd nd nd nd nd nd nd nd Próba lateksowa na szkielku — — — — — — — — — — ++ — — — — — — — — ¦ — Próba lateksowa w probówce nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 320 nd nd nd nd nd nd nd nd nd |65 086 8 PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe nd nd nd nd nd nd 160 nd nd 10 1. Srodek do oznaczania czynnika gosccowego w plynach ustroju, znamienny tym, ze stanowi zawiesine w polarnej cieczy stalych, rozdrobnionych czastek polimeru o srednicy 0,15 — 14 mikronów, pokrytych królicza gamma globulina, poddana dzialaniu proteolitycznego enzymu.

2. Srodek wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zawiera czastki polistyrenu o srednicy 0,81 mi¬ krona. Typo Lódz, zatm. 91/72 — 215 egz. Cena zl 10,— PL PL