PL63144B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: 18.11.1964 Wegry Opublikowano: 10.VII.1971 63144 KI. 30 h, 2/20 MKP C 12 d, 5/06 UKD 2*"**J Wspóltwórcy wynalazku: Hariklia Vakaliosz, Ferenc Vargha, Sandor Piukovich Wlasciciel patentu: Chinoin Gyógyszer-es Vegycszeti Termskek Gyara RT, Budapeszt (Wegry) Sposób wytwarzania zwiazków nalezacych do grupy witaminy B12 i Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia zwiazków nalezacych do grupy witaminy B12 na drodze biologicznej.Z opisów patentowych NRF nr nr 1 09175 i 1097 081 znane jest otrzymywanie zwiazków z grupy witaminy B12 za pomoca szczepu Propioni- bacterium shermanii-33, wytworzonego w obec¬ nosci okolo 0,005% jonów kobaltu w stosunku do srodowiska hodowli. Stosujac ten szczep po 12 dniach fermentacji plyn fermentacyjny zawiera 18,8 mg/litr witaminy B12.Opis patentowy nr 47 117 omawia sposób otrzy¬ mywania witaminy B12 za pomoca Pronibacterium PBS 77. Przy wytwarzaniu tego szczepu stosuje sie jony kobaltu w ilosci 0,00025% w stosunku do pozywki, po czym fermentacje prowadzi sie rów¬ niez w obecnosci jonów kobaltu.Sposób wytwarzania zwiazków grupy witaminy B12 z wegierskiego opisu patentowego nr 143 834 polega na prowadzeniu fermentacji szczepu Pro¬ pionibacterium shermanii w obecnosci jonów ko¬ baltu. Uzyskuje sie wyzsza wydajnosc w stosunku do wyzej opisanych sposobów, osiagajac stezenie witaminy B12 w ilosci 17 gamma/ml.Stwierdzono, ze mozna wytwarzac zwiazki na¬ lezace do grupy witaminy B12, zwlaszcza cyjano- kobalaminy i hydroksokobalaminy na drodze bio¬ logicznej stosujac nowy szczep Propionibacterium shermanii 104 b. 15 30 Szczep Propionibacterium shermanii 104 b zde¬ ponowany w Panstwowym Instytucie Higieny w Budapeszcie pod nr 630903/24, wytwarza sie z zna¬ nego szczepu Propionibacterium shermanii przez mutacje w obecnosci jonów kobaltu w stezeniu 5000—10 000 y/ml.Nowy szczep rózni sie od innych szczepów Pro¬ pionibacterium shermanii i innych bakterii kwasu propionowego zdolnoscia rozkladania cukrów. Zna¬ ne bakterie kwasu propionowego rozkladaja fruk¬ toze i dekstroze, podczas gdy Propionibacterium shermanii 104/b rozklada dekstroze szybko, a fruk¬ tozy w ogóle nie rozklada.Nowy szczep odznacza sie nastepujacymi wlas¬ ciwosciami: komórki bakterii sa okragle o wiel¬ kosci 0,5—0,6 /u. Wystepuja parami lub w postaci krótkich lancuchów. Morfologiczne wlasciwosci szczepów hodowanych w warunkach aerobowych lub anaerobowych róznia sie tylko w nieznacznym stopniu: Ekstrat drozdzowy — kwas mlekowy — agar: slaby wzrost. Na powierzchni pozywki pow¬ staje szara obwódka. Namok kukurydziany — glu¬ koza — agar: po 12-dniowej hodowli w warunkach anaerobowych wystepuja biale lub kremowo za¬ barwione okragle bakterie. Ekstrakt drozdzowy — zelatyna — kwas mlekowy: bakterie nie prze¬ prowadzaja zelatyny w stan ciekly.Bakterie sa gram-dodatnie i katalazo-dodatnie.Oprócz kwasu propionowego, octowego i dwutlen¬ ku wegla bakterie produkuja kwas mlekowy, gli- 631443 ceryne, mannoze, galaktoze i fruktoze, natomiast nie produkuja dekstryny, inuliny, maltozy, rafi- nozy, sorbitolu i glikogenu. Bakterie nie powo¬ duja zupelnie redukcji azotanów. Bakterie mozna wyosabniac z produktów mlekowych.Sposób prowadzenia mutacji, w wyniku której otrzymuje sie szczep Propionibacterium shermanii 104/b jest nowy. Fakt uzyskania nowego szczepu, przez mutacje znanego szczepu w obecnosci jonów kobaltowych, w swietle danych literaturowych jest zupelnie nieoczekiwany. Wiadomo bowiem (np.Bayland Pharm. Rev. 6, 1954, 345; Dsmerc i wspól¬ prac, Am. Naturalist 85, 1951, 119; Jarai Acta Microbiol. Hung. 9, 1962, 273), ze obecnosc kobaltu nie wplywa zupelnie na mutacje bakterii i strep- tomjcetpw?- Dofychcza^ stosowano jony kobaltu, w dipsci wynoszacej 0,0203% w stosunku do po¬ zywki wylacznie do wytwarzania drozdzy o zmniej¬ szonej zdolnosci oddychania (Lidegren i wspólpr.Nature ~182, 1958, 446), W jurylwarzaniu nowego szczepu sposobem we¬ dlug wynalazku stosuje sie jony kobaltu w ilosci 15—20-krotnej w stosunku do ilosci jonów kobaltu uzywanych w wczesniejszych doswiadczeniach (0,2—0,3% jonów kobaltu). Otrzymany nowy szczep rozmnaza sie znacznie szybciej od szczepu wyj¬ sciowego.Wedlug wynalazku zwiazki nalezace do grupy witaminy B12, zwlaszcza cyjanokobalamine, hydro- ksokobalamine i inne biologicznie czynne zwiazki wytwarza sie w nieobecnosci jonów kobaltowych w sposób nastepujacy: Szczep Propionibacterium shermanii 104/b pod¬ daje sie fermentacji w warunkach anaerobowych, korzystnie przy wartosci pH = 6,5—7 w pozywce skladajacej sie zasadniczo z roztworu otrzymanego po kwasowej lub enzymatycznej hydrolizie sub¬ stancji zawierajacych skrobie (skrobia, mleczko skrobiowe, chleb itd.), odpowiadajacego zawartosci glikozy w ilosci 2—10% i 2—4% namoku kukury¬ dzianego.Fermentacje prowadzi sie w ciagu od okolo 40 do 96 godzin, przy czym okres ten zalezy od ste¬ zenia pozywki. Po zakonczeniu rozkladu weglo¬ wodanów korzystnie do brzeczki dodaje sie 5,6- -dwumetylobenzimidazol, korzystnie w ilosci 1 mg/litr, który wlacza sie w czasteczke produktu fermentacji, po czym fermentacje kontynuuje sie podczas mieszania 10—24 godzin. Otrzymany plyn fermentacyjny, zawierajacy mase bakteryjna wraz z zwiazkami nalezacymi do grupy witaminy B12 mozna w zaleznosci od zyczenia przerabiac do zastosowania w medycynie ludzkiej lub na pasze.Mase bakteryjna usuwa sie z plynu fermenta¬ cyjnego przez odfiltrowanie przy wartosci pH = = 6,7—7,5. Zgodnie z korzystna postacia wynalaz¬ ku, mase bakteryjna ekstrahuje sie nastepnie go¬ raca woda, po czym ekstrakt zateza do jednej setnej pierwotnej objetosci i ewentualnie dalej oczyszcza przez ekstrakcje, adsorpcje itd.Sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie wi¬ tamine B12 o bardzo wysokim stopniu czystosci z znacznie wyzsza wydajnoscia od uzyskiwanej w znanych sposobach. Nowy szczep wytwarza oprócz hydroksokobalaminy okolo 20% cyjanokoba- 63144 4 laminy bez dodawania jonów cyjanowych do roz¬ tworu fermentacyjnego, która ewentualnie mozna przeprowadzic w cyjanokobalamine. W tym przy¬ padku cyjanokobalamine otrzymuje sie z wydaj- 5 noscia 25—30 mg/litr (przy oznaczeniu chemicz¬ nym, a przy oznaczeniu za pomoca bakterii E.Coli wartosc ta jest naturalnie znacznie wyzsza).Powazna zalete stosowania nowego szczepu do fermentacji stanowi fakt, ze po przeprowadzonej 10 fermentacji, przy wartosci pH roztworu pofermen¬ tacyjnego 6,7—7,5 latwo odsacza sie mase bakte¬ ryjna wraz z zwiazkami z grupy witaminy B12, co znacznie upraszcza proces. 15 Nowy szczep odznacza sie niezwykla odpornos¬ cia wobec zelaza. Przy wprowadzeniu do roztwo¬ ru fermentacyjnego 2000 Wml siarczanu zelaza nie obserwuje sie istotnych róznic ani we wzroscie szczepu ani w wydajnosci produktu koncowego 20 w porównaniu z prowadzona w analogicznych wa¬ runkach próba kontrolna.Ponadto duza zaleta sposobu wedlug wynalazku jest fakt, ze fermentacje z nowym szczepem moz¬ na prowadzic w stosunkowo szerokim zakresie 25 temperatur, a mianowicie 30—36°C, przy czym zmienia sie wylacznie szybkosc fermentacji, na¬ tomiast zdolnosc produkcyjna szczepu praktycznie nie ulega zmianie.Nastepujace przyklady wyjasniaja blizej wyna- 30 lazek.Przyklad I. Otrzymanie szczepu Propioni¬ bacterium shermanii 104/b. 9 ml pozywki, otrzy¬ manej z 20,0 g dekstrozy, 10,0 g namoku kuku- 35 rydzianego, 40 y/ml siarczanu zelaza i 7.500 y/ml azotanu kobaltu w 1000 ml wody wprowadza sie 1 ml inoculum zawierajacego 4 X 109 bakterii zna¬ nego szczepu Propionibacterium shermanii. Hodow¬ le inkubuje sie przez 120 godzin w temperaturze 40 28°C w termostacie, po czym przenosi sie na po¬ zywke agarowa w plytkach Petri'ego i inkubuje w anaerobowych warunkach w atmosferze. Otrzy¬ many szczep. Propionibacterium shermanii 104/b stosuje sie do fermentacji. 45 Przyklad II. Fermentacje za pomoca mutan- tu bakterii Propioni shermanii 104/b prowadzono w roztworze o objetosci 4 litrów o nastepujacym skladzie: 50 Hydrolizat*) — 800 ml/litr namok kukurydziany, w prze¬ liczeniu na sucha substancje — 20 g/litr pantotenian wapniowy — 20 mg/litr wartosc pH = 6,5 55 Hydrolizat przed zmieszaniem z pozostalymi skladnikami pozywki wysterylizowano w tempera¬ turze 120°C w ciagu 40 minut po czym w stanie sterylnym zmieszano z reszta skladników. Pozyw¬ ke fermentacyjna zaszczepiono 25% 4—5-dnio- wym, odpowiednio rozwinietym szczepem.*) Hydrolizat otrzymany po hydrolizie substancji za¬ wierajacych skrobie stosowano w ilosci odpowiadajacej 65 zawartosci 10% glikozy.5 Inoculum hodowano na pozywce o nastepu¬ jacym skladzie: glikoza — 80 glitr namok kukurydziany w przeli¬ czeniu na sucha substancje — 20 g/litr CaCo3 — 4 g/litr wartosc pH = 7,3 Przy szczepieniu wartosc pH pozywki ustalono w warunkach sterylnych na 6,8—7,0. Fermentacje prowadzono w temperaturze 28°C, przy czym ste¬ zenie jonów wodorowych wzrastalo w fazie in¬ tensywnej fermentacji o wartosc 0,6—0,8 w ciagu czterech godzin. Korygowanie pH do wartosci 6,8— 7,0 przeprowadzano wiec co cztery godziny za po¬ moca wodorotlenku amonowego.Rozmnazanie mutantu Propionibacterium sher- manii 104/b zakonczylo sie po 64—72 godzinach i uzyskano ilosc bakterii 6,0—8,0 • 1010/ml. Fermen¬ tacje prowadzono dalej do 80 godzin, po czym dodano 1 mg/litr 5,6-dwumetylobenzimidazolu.Plyn fermentacyjny zawieral 8 mg/litr cyjanoko- balaminy i 20 mg/litr innych zwiazków z grupy witaminy B12, takich jak kwas kobirynowy, ko- binowy, kobamowy, koenzym a-dwumetylobenzi- midazolilokobamidu, które oznaczono metoda chro¬ matografii bibulowej.Przyklad III Podczas fermentacji prowadzo¬ nej jak w przykladzie I, po 80 godzinach dodano 1 mg/litr 6,5-dwumetylobenzimidazolu, a nastepnie przez 24 godziny próbke plynu fermentacyjnego ogrzewano do wrzenia z KCN i oznaczono za po¬ moca bakterii E. Coli metoda dyfuzyjna na agarze zawartosc witaminy B12. Aktywnosc witaminy B12 w plynie fermentacyjnym wynosila po 80 godzi¬ nach 86 mg/litr. Zawartosc witaminy B12 oznaczono metoda chemiczna przez ogrzewanie do wrzenia z cyjankiem potasowym, a nastepnie za pomoca chromatografii bibulowej. Wynosila ona 27 mg/litr.Przykla \ IV. Fermentor o pojemnosci 40.000 litrów, który zawieral wysterylizowana po¬ zywke o nastepujacym skladzie: Hydrolizat (analogiczny jak w przykladzie I) — 450 ml/litr namok kurkurydziany w prze¬ liczeniu na sucha substancje — 20 mg/litr pantotenian wapniowy — 20 mg/litr wartosc pH = 6,5 zaszczepiono czterodniowa hodowla Propionibac¬ terium shermanii 104/b.Hydrolizat przed zmieszaniem z pozostalymi skladnikami wysterylizowano w ciagu 40 minut w temperaturze 120°C.Uzyta ilosc inoculum wynosila 25%. Po zaszcze¬ pieniu pH srodowiska fermentacyjnego doprowa¬ dzono za pomoca wodorotlenku amonowego do do wartosci 6,8—7,0 a temperature do 28°C. W trakcie fermentacji korygowano pH za pomoca wodorotlenku amonowego do wartosci 6,8—7,0. 6 Po 44 godzinach fermentacji dodano 1 mg/litr 5,6-dwumetylobenzimidazolu. Zawartosc witaminy B12 w plynie fermentacyjnym, oznaczona metoda chromatografii bibulowej, wynosila 16 mg/litr. 5 Otrzymany plyn fermentacyjny w ilosci 40 ms po doprowadzeniu do wartosci pH = 7—7,5 prze¬ saczono na prasie filtracyjnej, a osad zawierajacy mase bakteryjna wraz z zwiazkami z grupy wita¬ miny B12 przemyto woda, po czym zawieszono 10 go w wodzie w ilosci takiej, zeby uzyskac obje¬ tosc 6 m8. Po dodaniu formaliny i Fe Cl8 wytracil sie osad, po czym mieszanine ogrzano do wrzenia, ponownie przesaczono i osad przemyto. Przesacz, który zawieral witamine B12, zatezono pod zmniej- 15 szonym cisnieniem do okolo 400 litrów.Wytracony osad odsaczono z pomocniczym srod¬ kiem filtracyjnym i ekstrahowano alkoholem ben¬ zylowym. Po oddzieleniu faz przemyto alkohol benzylowy wóda, zawierajaca siarczan amonowy, 20 a nastepnie przez dodanie czterochlorku wegla przeprowadzono witamina B12 z alkoholu benzy¬ lowego do wody. Z wodnego roztworu witamine ekstrahowano fenolem i chromatografowano na Al^a, a nastepnie krystalizowano. Otrzymano 315 25 g krystalizowanej witaminy B12. PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 30 1. Sposób wytwarzania zwiazków nalezacych do grupy witaminy B12, zwlaszcza cyjanokobalaminy i hydroksokobalaminy na drodze biologicznej, zna¬ mienny tym, ze nowy szczep Propionibacterium shermanii 104/b, zdeponowany w Panstwowym In- 35 stytucie Higieny w Budapeszcie pod nr 630903/24, otrzymany przez mutacje znanego szczepu Pro¬ pionibacterium shermanii za pomoca jonów ko¬ baltu, korzystnie w stezeniu 5000—10 000 y/ml, poddaje sie fermentacji i po oddzieleniu masy 40 bakteryjnej znajdujace sie w niej zwiazki nalezace do grupy witaminy B12 ewentualnie wyodrebnia sie w znany sposób.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, 45 ze fermentacje prowadzi sie w srodowisku skla¬ dajacym sie z hydrolizatu otrzymanego przez kwa¬ sowa lub enzymatyczna hydrolize substancji za¬ wierajacych skrobie w ilosci odpowiadajacej 2—10% glikozy i z namoku kukurydzianego w rQ ilosci wynoszacej 2—4% w stosunku do pozywki.

3. Sposób wedlug zastrz. 1—2, znamienny tym, ze mase bakteryjna wraz z produktem koncowym oddziela sie z plynu pofermentacyjnego przez od- 55 filtrowanie przy wartosci pH = 6,7—7,5.

4. Sposób wedlug zastrz. 1—4, znamienny tym, ze mase bakteryjna ekstrahuje sie goraca woda i otrzymany ekstrakt zateza do jednej setnej po- 60 przedniej objetosci, po czym ewentualnie oczysz¬ cza w znany sposób. PL