PL60445B1

PL60445B1 -

Info

Publication number: PL60445B1
Application number: PL121168A
Authority: PL
Original assignee: The Upjohn Company
Filing date: 1967-06-15
Publication date: 1970-04-25

Description

17.VI.1966 Stany Zjednoczone Ameryki 60445 KI. 30 h, 6 Opublikowano: 5.VIII.1970 MKP C 12 d, 9/14 UKD Wlasciciel patentu: The Upjohn Company, Kalamazoo (Stany Zjednoczo¬ ne Ameryki) Sposób otrzymywania linkomycyny S Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymy¬ wania N-idemeitylo-N-etyloliinkomycyny C, nazy¬ wanej równiez linkomycyna S.Linkomycyna S jest zwiazkiem organicznym, wytwarzanym wedlug wynalazku przez hodowle drobnoustrojów (actinomyceta) produkujacych linkomycyne, na wodnej pozywce w obecnosci do¬ datku etioniny, w warunkach tlenowych. Linko¬ mycynie S odpowiada wizór ogólny 1, w którym R i R' oznaczaja rodniki etylowe, a R" oznacza rodnik n-propylowy, scislej wzór 2.Linkomycyna S jest zwiazkiem zasadowym, ma¬ jacym wlasciwosci przeciwdzialania wzrostowi ba¬ kterii granno-ujemnych i gramondodatnich, na przyklad iStaphylococcus aureus, Bacilluis subftiris, Streptococcus faecalisi, Streptococcus hemolyticus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae i Salmo¬ nella schottmuelleri. Zgodnie z tym, linkomycyna S moze byc uzywana sama lub w polaczeniu z innymi srodkami antybiotycznyrciii dla zapobiega¬ nia wzTositowi, lulb dla zmniejszenia liczby bakite- rii, w TÓznych srodowiskach. Mozna ja stosowac na przyklad jako srodek dezynfekcyjny do róz¬ nych instrumentów dentystycznych i lekarskich, zanieczyszczonych przez Staphylococcus aureus.Jest ona uzyteczna takze w roztworach sluzacych do celów sanitarnych, jak mycie rak, czyszczenie insitrumenitcw, mycie podlóg lub mebli w zakazo¬ nych pomieszczeniach lub laboratoriach, jest tak¬ ze uzyteczna jako srodek ochronny w dziedzinie 10 15 20 przemyslowej, na przyklad jako kapiel bakterio- statyczna dla pranej odziezy, czy do nasycania papieru i tkanin; jest ona takze uzyteczna do powsitrzymywania wzrostu , wrazliwych organiz¬ mów w próbach plytkowych i innych srodowis¬ kach mikrobiologicznych.Jako actinomycetes do wytwarzania linkomycy¬ ny S w sposobie wedlug wynalazku stosuje sie Streptomyces lincolnensis var, LincolnensiJs. Szczep ten posiada nr NRRL 2936 i jest zdeponowany w Nothern Regional Research Laboratories, U. S., Departament of Agricultuire, Peoria, Illinois, UjS.A.Linkomycyna S jest strukturalnie pokrewna antybiotycznym linkomycynom, linkomycynie B (U-21.699) i linkomycynie C (U-11,021). Biorac za podstawe wzór 1, budowa tych linkomycyn jest nastepujaca: R' R" Linkomycyna Linkomycyna B Linkomycyna C Linkomycyna S CH3 CH3 CHs CtHi OH3 OH3 C2H5 C2H5 C3H7 CjH.5 CsHt C3H7 30 Linkomycyna S, chociaz strukturalnie pokrew¬ na linkomycynie, linkomycynie B ii linkomycynie C, jest wyraznie innym antybiotykiem, majacym nie¬ oczekiwane wlasciwosci prizeciwbakteryjhe. Lin- 60 44560 3 komycyna, linkomycyna B i linkomycyna C ma¬ ja dzialanie pi-zeciwbakteryjine w stosunku do drobnoustrojów gramo-dodatnich , podczas1 gdy linkomycyna S jest czynna nie tylko w stosunku do drobnoustrojów graimo^dodatnich, ale takze w stosunku do gramo-ugemnych drobnoustrojów.Nizej podana tabela 1 przedstawia porównanie dzialania linkomycyny i linkomycyny S wobec gramo-dodatnich i gramo-ujemnych organizmów.Tablica 1 Badane organizmy 1 I A i M \ - 1 Y \ *" 1 S. aureus i StrAptococclm-S »hf-t» 1 heiiolyitlwttó**^ ¦'- *«™ \ Streptococcus faecalis E. coli K. pneumoniae S. Schottmuelleri Minimalne stezenie lnhiblcyjne w n-g/ml Linkomycyna 0,8 0,4 0,4 ponad 200 50 ponad 200 Linkomycyna 0,4 0,4 0,4 ¦ 50 12,5 50. ©twierdzono, ze jezeli prowadzi sja fermenjtacje za pomoca mikroorganizmów w Streptomyces lin- colnensis var, lincolnensis w obecnosci dodatku etioniny (o wzorfce CH/3HjS€|H^CH(NH2)COOH) wówczas oprócz linkomycyny C i niewielkich ilo¬ sci linkomycyny i linkomycyny \B tworzy sie Mn- komycyna S. Liinkomycyna S jest nowym anty¬ biotykiem. W znanych metodach otrzymywano lin¬ komycyna, linkomycyne B i linkomycyne C dl po wyodrebnieniu tych zwiazków z brzeczki pofer¬ mentacyjnej pozostalosc odrzucano* O ile wiec na¬ wet linkomycyna S tworzyla slie, to jednak w tych warunkach fermentacyjnych albo ulegala rozkla¬ dowi albo warunki te unilemozliwiialy jej wydzie¬ lenie, bo dotychczas nie byla ani rozpoznana, ani uzyskiwana w stopniu umozliwiajacym jej ziden¬ tyfikowanie. Dopiero prowadzenie fermentacji sposobem wedlug wynalazku w obecnosci etioniny powoduje tworzenie sie lmkomycyny S i umozli¬ wia jej wyosobnienie ii oddzielenie od powstaja¬ cych równoczesnie linkomycyny, linkomycyny B, linkomycyny C i podobnych zwiazków towarzy¬ szacych.Opis patentowy Stan. Zjedn. Ameryki nr a486.912 omawia sposób otrzymywania wylacznie linkomycyny, przez fermentacje prowadzona za .pomoca Sforeptomyces lincolnensis, var, Lincolnen¬ sis, NRIRIL 2936 w srodowisku wodnym, w warun¬ kach aerobowych.Chociaz linkomycyne S mozna wytwarzac pro¬ wadzac fermentacje w takim samym srodowisku jak opisane w wyzej cytowanym opisie patento- wyn^ St. Zjedn. Ameryki {przyklad- I) z tym jed¬ nak warunkiem, ze dodaje sie etionine, jednakze wydajnosc linkomycyny S w tych warunkach, nie jest zadowalajaca. Korzystnie linkomycyne S wy¬ twarza s:"e stosujac symltetyczne srodowisko fer¬ mentacyjne, z dodatkiem etioniny. Zródlem we- 445 4 gla w takim srodowisku jest jednowodzian gluko¬ zy, a zródlem azotu — azotan amonowy; Do sro¬ dowiska tego dodaje sie sladowe ilosci metali/ ta¬ kich jak cynk, zelazo i magnez. Chociaz to srodo- 5 wisfco bardzo korzystne dostarcza najwiekszej ilo¬ sci uzyskiwallnej linkomycyny S oczywistym jest dla fachowców w tej dziedzinie, ze mozna stoso¬ wac inne srodowiska* przez uzycie innych zródel wegla i azotu. Takimi innymi zródlami wegla mq- 10 ga byc: brunatny cukier, sacharoza, glicerol, skrobia, skrobia zbozowa, kukurydziana, galak- toza, dekstryna, melasa i podobne. Innymi zró¬ dlami azotu moga byc: naimok kukurydziany, drozdze, autolifzowane drozdze browarnicze wol- 15 ne od czesci stalych, maczka sojowa, maczka z nasion bawelny, maka kukurydziaina, sitale sub¬ stancje mleka, pankreatynowy . wyciag kazeiny, filtraty brzeczki gorzelniczej, maczka rybna, zwierzece plyny peptonowe, skwarki (pozostalosc 20 po wytopieniu tluszczu z miesa) i maczka kostna i tym podobne.Linkomycyne mozna wytwanzac w temperatu¬ rze, sprzyjajacej zadowalajacemu wzrostowi mi- x kroorgandzmów, na przyklad w temperaturze 18 25 — 40°C, korzystnie okolp 25 — 30°C. Zwykle op¬ timum produkcji zwiazku uzyskuje sie w ciagu okolo 2 — 10 dni. Srodowisko normalnie pozostaje prawie obojetne lub zasadowe podczas fermenta¬ cji. Koncowa wartosc pH zalezy czesciowo od 30 obecnosci substancji buforowych, jezeli jakies zostaly Uzyte, a czesciowo od poczatkowej warto¬ sci pH, która korzystnie jest przed sterylizacja doprowadzic do okolo 6 — 8.* Jezeli wzrost jest prowadzony w duzych naczy- 35 niach i zbiornikach, korzystniej jest uzyc wegeta¬ tywnych niz przetrwalnikowych form milkroorga- * nizmów do szczepienia, aby uniknac duzego opóz¬ nienia w otrzymywaniu nowego zwiazku i zwia¬ zanego z tym nieefektywnego wykorzystania wy- 40 posazenia. Zgodnie z tymj korzystnie jest przygo¬ towac wegetatywny material do szczepienia na bulionowej pozywce, droga szczepienia bulionu.Otrzymany w ten sposób mlody, czynny wega- tatywny material do szczepienia nastepnie przeno- 45 si sie z zachowaniem warunków aseptycznych, do duzych kadzi lub zbiorników. Medium uzywane do produkcji materialu do szczepienia moze byc to samo, lub inne niz medium uzywane do pro¬ dukcji nowego 50 daje dobry wzrost mikroorganizmów.Korzystny dla linkomycyny S sposób fermen¬ tacji polega na dodaniu do fermentacji w przy¬ blizeniu 500 mg/litr' etioniny po 72 godzinach.Mozna stosowac wieksza lufo mniejsza ilosc etio- 55 niny, efektywna dla produkcji linkomycyny S, od okolo 0,5 mg/ml do okolo 4 mg/ml. (Produkty fer¬ mentacji zbiera sie po 6 dniach. Mozna stosowac zarówno DL-etionine jak i L-etionine, ale doda¬ tek L-etioniny daje bardziej wydajna produkcje eo linkomycyny S. Jakakolwiek etionine zastosuje sie, moze ona podzialac nieco toksycznie na wzrost mikroorganizmów, co moze zmniejszyc ostateczny uzysk linkomycyny S w fermentacji. To toksycz¬ ne dzialanie mozna sprowadzic do minimum przez 65 dodanie etioniny miejdzy 48 a 72 godzina fermen- <5 60 445 6 ~tacji. nasilanie moze odbywac sie metoda ciagla, pólciagla lub innymi sposobami, byle tylko ste¬ zenie etioniny nie wplywalo ma wzrost mikroorga¬ nizmów w sllbpriiu szkodliwym dla produkcji lin¬ komycyny.Do wyodrebniania i oczyszczania liinkomycyny S mozna stosowac rózne metody, ma przyklad ek¬ strakcje rozpuszczalnikowa, ekstrakcje cieczy cie¬ cza w aparacie Craig'a, stosowanie adsorbentów i krystalizacje z rozpuszczalników. Najdogodniej¬ sza jest metoda, wedlug której cala brzeczke po fermentacja linkomycynowej S filtruje sie z za¬ stosowaniem pomocniczego materialu filtracyjnego :na przyklad ziemi okrzemkowej, jezeli jest to po¬ trzebne. Nastepnie przesacz alkaliizuje sie do war¬ tosci pH okolo 10 i ekstrahuje rozpuszczalnikiem, ;nie -mieszajacym sie z woda. Najdogodniejszym rozpuszczalnikiem jest chlorek metylenowy. Ek¬ strakt rozpuszczalnikowy zateza sie do sucha otrzymujac surowy suchy preparat; zawierajacy -linkomycyne S, linkomycyne, linkomycyne B i linkomycyne C. Liinlkomycyna S oddziela sie od pozostalych limkomycyn droga chromatografii ko¬ lumnowej przy zastosowaniu ukladu rozpuszczal¬ ników, w których linktomycyna S jest rozpuszczal¬ na, w celu wyeluowania jej z kolumny. Korzystnie surowy preparat, • zawierajacy linkomycyne S i :inme liinkomycyny przeprowadza sile przez kolum¬ ne chromatograficzna. z zelem krzemionkowym.Kolumne eluuje sie mieszanina rozpuszczalników, skladajaca sie z ketonu metylowoetylowego, ace- *tonu i wody w stosunku objetosciowym 100:30:5.Linkomycyna S jest eluowana pierwsza z kolum¬ ny. Tak wiec kolumne eluuje sie, i frakcje zbiera i analizuje metoda chromatograf:!! cienkowarstwor- . wej, w celu wykrycia obecnosci liinkomycyny S.Chromatografie prowadzi sie na plytkach z zelu krzemionkowego G (E, Merck A. C, Darmstadt) *-o grubosci od 0,12 do 0,5 mm stosujac mieszanine ketonu metylowoetylowego, acetonu i wody, w sto¬ sunku objetosciowym 140:40:22, jako srodek elu- ujacy. Frakcje, zawierajace tylko linkomycyne S, zbiiera sie do dalszej obróbki. Frakcje zar wierajace linkomycyne S i inne liinkomycyny, zbiera sie i ponownie przeprowadza przez kolum¬ ne. Frakcje zawierajace litnkomycyine S i inne lin¬ komycyny, korzystnie „wzbogaca sie" w linkomy¬ cyne S przez poddanie ich ekstrakcji przeciwpra- dowej w aparacie Craig'a, uzywajac mieszaniny rozpuszczalników, skladajace sie z równych obje¬ tosci 1-butanolu i wody. Te wzbogacone frakcje z ekstrakcji przeciwipradowej nastepnie przepro¬ wadza sie przez kolumne chromatograficzna w ..sposób wyzej opisany.Alternatywinie, -surowe preparaty liinkomycyny S, zawierajace inne linkjomycyny, poddaje sie przeciwpradowej ekstrakcji w aparacie Oraig^, jak opisano wyzej, przed pierwszym przejsciem przez kolumne chromatograficzna. Ten sposób sto¬ nuje sie korzystnie, gdy nieoczyszczony preparat liinkomycyny S zawiera stosunkowo duza ilosc in¬ nych linkomycyn.Jakkolwiek chromatografia z uzyciem zelu krze- rmionkowego jest korzystna metoda wydzielania linkomycyny S z materialów, zawierajacych lin¬ komycyne S i inne -Unktomycyny, w zakres wyna¬ lazku wchodzi stosowanie równiez innych chro¬ matografii, takich jak chromatografia podzialowa 5 i adsorbcyjna.Krystalizacje, tak jak i rekrystalizacje chloro¬ wodorku liinkomycyny S prowadizj sie przez roz¬ puszczenie produktu antybiotycznego zawieraja¬ cego chlorowodorek linkomycyny S w wodzie, do- 10 danie mieszajacego sie z woda rozpuszczalnika, na przyklad acetonu, metanolu, etanolu lub 2npro- pamolu, a nastepnie ochlodzenie dla zapoczatko¬ wania lub. zakonczenia krystalizacji. Krysztaly odsacza sie i przemywa wodnymi rozpuszczalni- 15 kilem, oraz, jezeli jest to pozadane, bezwodnym rozpuszczalnikiem, i sus^y w prózni.Nowy zwiazek otrzymany sposobem wedlug wy¬ nalazku mozna odzyskiwac z przefiltrowanej brzeczki przez adsorbcje na zywicach kationito- wych. -W tym celu mozna stosowac zywice typu karboksylowego 1 sulfonowego. Korzystnie jako zywice karboksylowe 'stosuje sie zywice poliakry- lowe, otrzymywane przez kopolimeryzacje kwa¬ su akrylowego i dwuwinytobenzenu sposobem, 25 opisanym przez K-unin'a „Jon Exchange Resins", str: 87, wyd. 2, 1958, John Wiley and Sons, Inc.Karboksylowe zywice kationitowe tego typu zna¬ ne sa pod nazwa Amberlite IRC-50 i Zeckarb 226.Jako zywice sulfonowe stosuje sie korzystnie sul¬ fonowane pierscieniowe zywice polistyrenowe, po¬ laczone wiazaniem poprzecznym z dwuwlhyloben- zenem, otrzymywane sposobem podanym na str. 84 u Kunina, op, cit. Sulfonowe zywice kattaonlto- we tego typu dostepne sa pod nazwami handlo¬ wymi Dowex 50, Amlbeiiite IR-»120, Nalcite HCR, Chempro G-20, Permutiit Q i Zeokarb 225.Antybiotyk* eluuje sie z zywicy kwasem, ko¬ rzystnie przy pH nizszym, niz pKa uzytej zywicy 40 kationitowej. Zadowalajace wyniki osiaga sie pKa wartosci pH okolo 1 — 6. Muat alkalizuje sie do wartosci pH = 7,5 *- 8y5 na przyklad wodoro¬ tlenkiem sodu lub silnie zasadowa, zywica aniionl* towa. Eluat nastepnie oczyszcza sie na kolumnie 45 chromatograficznej i przez ekstrakcje przeciwpra- dowa, w sposób wyzej opisany. Odpowiednimi do tego celu zywicami amonitowymi sa zywice otrzy¬ mane przez chlorometylowanie (sposobem opisa¬ nym na str. 88 i 97 cytowanej ksiazki KunSna) 50 polistyrenu, jezeli jest to pozadane, to polaczone¬ go poprzecznym wiazaniem z dwuwinylobenze- nem, otrzymanym sposobem podanym na str. 84 cytowanej ksiazki Kunina, i czwairtorzedotwanie trójmetyloamina lub dwumetyloamina sposobem 55 podanym na str. 07 cytowanej ksiazki Kunina.Zywice andonitowe tego 'typu znane sa pod nazwa Dowex-2, Dowex 20, Amberlite IRA-400, Duolite A-102 i Permutiit S-l.Rózne sole addycyjne linkomycyny S mozna 60 otrzymywac przez zobojetnienie wolnej zasady odpowiednim kwasem do wartosci pH ponizej okolo 7,0, a korzystnie do pH okolo 2 — 6. Odpo¬ wiednimi do tego celu kwasami sa: solny, siarko¬ wy, fosforowy, octowy, bursztynowy, cytrynowy, 65 mlekowy, maleinowy, fumarowy, cholowy, pailmi-60 445 tynowy, sluzowy, kamforowy, glutarowy, glflkolo- wy, ftalowy, winowy, laurynowy, stearynowy, sa¬ licylowy, 3nfenylosalteylowy, 5-fenylosalicylowy, 3-tnetykgluitarowy, ortosulfobenzoesowy, cyklo- heksano-aminosulfonowy, cyMopenitanopfopionowy 1,2-cykloheksanodwukarboksylowy, 4-cykloheksa- nokarboksyliowy, okltadecenylobursztynowy, ofcte- nylobursztynowy, metanosulfonowy, benzenosulfo- nowy, heliantynowy, kwas Reinecke'a, dwumetylo- dwutiókarbamidowy, sorbinowy, jednochloroocto- wy, uhdecylenowy, ^-hydroksyazobenzeno^-sulfo- ndwy, oktadecylosiarkowy, pikrynowy, benzoesowy, cynamonowy i tym podobne.Sole liintoomycyny S mozna stosowac do takich samych biologicznych celów^ jak wolna zasade, lub tez moga byc stosowane do wzbogacania an¬ tybiotyku przez kolejne przejscia od protonowej do nieprotomowej postaci i odwrotnie, szczególnie przy równoczesnym zastosowaniu innych sposo¬ bów obróbki, na przyklad e&sitrakcji rozpuszczal¬ nikowej i "przemywania, chromatografii i frakcyj¬ nej eksitrakcji cieczy ciecza. Na przyklad, anty¬ biotyk mozna przeprowadzac w nierozpuszczalna sól taka jak pifcrymian, która mozna poddac oczyszczaniu, a nastepnie uzyc do regeneracji an¬ tybiotyku w czystej postaci przez potraktowanie zasada. Mozna tez przeprowadzac antybiotyk w rozpuszczalna w wodzie sól, taka jak chlorowodo¬ rek lub siarczan, a nastepnie dksitranowac sól róz- ' nymi rozpuszczalnikami mieszajacymi sie z wio¬ da, po czym regenerowac antybiotyk w czystej po¬ staci przez potraktowanie zasada wyekstrahowa¬ nego roztworu soli.Linkomycyne S mozna stosowac do zwalczania bakterii S. aureus na mytych utensyliach zwiaza¬ nych z zywieniem. Mozna ja równiez stosowac ja¬ ko srodek dezynfekcyjny do róznych instrumen¬ tów lekarskich £ dentystycznych zakazonych S. aureus. Lnnkomycyna S jeslt aktywna wobec Ba- cillus subtilis i mo±e byc stosowana w hodowli jedwabników w celu zapobiegania lub sprowa¬ dzenia do minimum zakazenia, spowodowanego przez te organizmy. Mozna ja takze stosowac do likwidowania lub sprowadzenia do minimum za¬ pachu ryb i skrzynek na ryby, powodowanego przez ten organizm.Nastepujace przyklady wyjasniaja blizej wyna¬ lazek nie stanowiac przy tym ograniczenia wyna¬ lazku. Wszystkie wielkosci procentowe podane sa wagowo, a mieszaniny rozpuszczalników w jed¬ nostkach objetosci, o ile nie podano inaczej.Przyklad I. Lankomycyna S. Fermentacja.Streptomyces lincolnensds var. Lincolnensis, NRRL 2936 stosuje sie do szczepienia szeregu 500 ml kolb Erlenmeyera, z których kazda zawiera 100 ml. szczepionego medium, skladajacego sie z na¬ stepujacych skladników: N-Z-Amina B**) letnia woda q.s. 5 g 1 litr 10 Szczepione medium po sterylizacja ma wairtos6 pH okolo 7,3. Posiew wzrasta przez 2 dni w tem¬ peraturze 28°C na obrotowej wstrzasarce GHunp'a. poruszajacej sie z predkoscia 250 obr./min. i &• skoku 63,30 mm. 5% materialu szczepionego z opisanego wyzej posiewu (5 ml) dodaje sie do kazdej z 500 ml koll- Erlenmeyera, z których kazda izawiera po 100 mi nastepujacego medium fermentacyjnego: 15 20 25 35 40 50 Jedinowodzian glikowy Cyltrynian sodu ZnS04 • 7H*0 Fe$04 # 7H*0 MgS04 K^HP04 NaCl NH4NOs Zdejoniizowanai woda do (q.s.) 30 g/liltr 3 g/lltr 0,001 g/liltr 0,001 g/litr 1 g/litr 2,5 g/litr 0,5 g/litr 2,0 g/litr 1 lita: Yeastolac*) JednowocMan glifcozy 10 g 10 g Jednowodzian gilikozy i cytrynian sodu steryli¬ zuje sie odddzietaie od soli. Po sterylizacji wartosc pH medium fermenltacyjlnego waha sie 'w grani- 30 cach 7,3 — 7,8. Zaszczepione kolby fermentacyjne umieszcza sie w obrotowej wstrzasarce -Gumro^, o 250 obrJmin. i skoku 63,30 mm. Wstrzasarka znajduje sie w pomiiesizczeniu termostatowym, gcMe utrzymuje sie temperature 28°C. Po 72 go¬ dzinach trwania fermentacji dodaje sie do kolb w warunkach asepltycznych 500 mg/1 DL-ettioniny.Rezultaty fermentacji zbiera sie po 6 dniach.Fermentacje prowadzi sie w taki sam sposób, jezeli DL-etionine zastapi siie L-etionina.Odzyskiwanie. Po fermentacji linkomycynowej S, przy wartosci pH takfrm, jak w momencie za¬ konczenia fermentacji, fiUtruje sie brzeczke z uzy¬ ciem pomocniczych srodków filtracyjnych, na przyklad ziemi okrzemkowej, jezeM jest to potrze- 45 bne. Placek grzybniowy przemywa sie woda, a na¬ stepnie usuwa. Mieszanine wody i filtrowanej brzecziki doprowadza slie do wartosci moca 50% roztworu wodorotlenku sodu, a nastep¬ nie trzykrotnie etotrahuje, za kaizdym razem jed¬ na czwarta objetosci chlorku metylenu. Wyciagi uzyskane chlorkiem metylenu miesza sie i zateza do konsystencji oleistej.Oczyszczanie chromatograficzne. Oleisty produkt zawierajacy linkomycyne S, rozpuszcza sie w me- 55 tanolowym roztworze chlorowodoru o wartosci pH~ okolo 2, traca sie osad. Osad ten, zawierai}acy linkomycy¬ ne, linkomycyne iB, Mnkomycyne C i Ikikomycyne- S, oddziela sie przez odfiltrowanie i wprowadza do kolumny chromatograficznej, zawierajaca zel krzemionkowy, przygotowanej w nastepujacy spo¬ sób: 60 *) Yeastolac stanowi hydrolizat proteinowy komórek ¦drozdzowych 65 **) N-Z-Amina B jest enzymatycznym wyciagiem^ kazeinowym Sheffield'a.60 445 9 Zel krzemióokowy (Merck-DaTmstadt Nir 7734, 0,05 — 0^20 «nm) wsypuje sie do sizklaneji kolum¬ ny (6,5 cm ID) i pozostawia, by osiadl pod cisnie¬ niem atmosferycznym. Surowy produkt zawiera^ jacy linkomycyne S rozpuszcza sie w absolutnym metanolu. Otrzymany iroztwór miesza sie z zelem krzemionkowym, przy czym tworzy sie zawiesina i mieazaftkie ni Material ten wprowadza sie na szczyt kolum¬ ny z zelu krzemionkowego. Na te warsitwe nakla¬ da «le nastepnie warstwe zelu krzemionkowego i fcottumne eluuje sie rozpuszczalnikiem, zlozonym z ketonu metylowoetylowego, acetonu i wody w stosunku 100:30:5.Frakcje zawierajace tylko linkomycyne.v S elu- uja sile tz kolumny przed innymi! lankom^cynaml Obecnosc linkomycyny S stwierdza sie metoda chromatografii cienkowarstwowej, w sposób opi¬ sany wyzej. Frakcje, zawierajace tylko JLiinkomy- cyne S zbiera sie i zateza do sucha. [Pozostalosc rozpuszcza sie w IN metanolowym roztworze.chlo¬ rowodoru o wartosci pH okolo 2. Roztwór-A ten znów zateza sie do sucha. Pozostallosc rozpuszcza sie w absolutnym metanolu i mieszanine te,miesza z eterem. Podczas powolnego zatezenia ittieszani- ny na wyparce obrotowej krystalizuje bezbarwna substancja, która droga chromatografii) cienko¬ warstwowej identyfikuje sie jako linkomycyne S.Dalsze Ilosci krysztalów linkomycyny iS uzyskuje sie przez zaltezenie przesaczu do sucha,.Pozostac, losc rozpuszcza sie w absolutnym metanolu i roz^; twór ten miesza z eterem etylowym. Mieszanine te miesza sie w ciagu okolo 4 godzin. Powstale podczas mieszania krysztaly linkomycyny iS od¬ dziela sie przez odfiltrowanie i suszy.Krystaliczny chlorowodorek linkomycyny S ma nastepujace chemiczne i fizyczne wlasciwosci: obliczono dla C2oH3^N2O^S,H!Cl.H^O : C, 49;12t H, 8,47; O, 22, 95; N, 5, 74; S, 6, 57; a, 7, 27. ciezar czasiteczkowy: 488,5 (obliczony) 25 skrecenie plaszczyzny polaryzacji: [a] D = -H 144,5° (c, 0,38, woda).Widmo podczerwone: cnlorowbdotrek linkomycy¬ ny S wykazuje wartosci maksymalne przy naste¬ pujacych dlugosciach fal, wyrazanych w odwrotu nosciach centymetrów (reciprocal cenitymeters), badanie prowadzone z zastosowaniem IKBr): 10 3350 (S) 3060 (M) 2960 (S) 2920 \S) 2865 (M) 2720 (W) 1680 (S) 1562 (S) 1545 (M) 1456 CM) 1392 (M) 1320 0VE) 1264 (M) 1210 (W) 1143 (M) 1095 1077 (S) 1048 (S) 993 (M) _ 977 (MX ,900 (W)' %7 (W)r , 801 (M) 750 (W) 707 (W) 675 (M) 45 50 Chlorowodorek linkomycyny S wykazuje war¬ tosci maksymalne przy nastepujacych dlugosciach fal, wyrazonych w odwroitnosciach centymeitrów, 60 badanie prowadzono w zawiesinie w ralnym: 3310 (S) 3060 (H) 2950 (S) (olej) 2920 (S) (olej) 2860 (S) (olej) 2850 (S) (oleji) 2720 (M) 1683 (S) 1567 (fM) 1545 (M) 1460 (S) (olej) 1376 (S) (olej) 1365 (M) 1338 (M) 1300 (M) 1262 (M) 1210 (M) 1142 (M) oleju mdine- 1095 (S) 1077 (S) 1049 (6) 991 (M) 977 (M) 900 (W) 867 (M) 801 (M) .713 (M) ,675 M) 10 Natezenia pasm w widmach podczerwonych sa 15 odpowiednib oznaczone symbolami S, M i W, i sa w przyblizeniu okreslane w stosunku do sasied1- nich;pasmV Pasmo S jest tego samego rzedu na¬ tezenia, co najsilniejsze pasmo w widmie; pasma M sa w 1/3 do 2/3 tak intensywne, jak najsilniej- 20 $ze pasmo, a pasma W sa mniej niz w 1/3 tak in¬ tensywne, jak najsiilniejlsze pasmo.Chlorowodorek linkomycyny S. jest rozpuszczal- ny w wodzie i metanolu. Jest umiarkowanie roz¬ puszczalny w 95% etanolu lufo w etanolu albsolut- 25 nym i stosunkowo nierozpuszczalny w acetonie, octanie etylu oraz w chlorowanych i nasyconych rozpuszczalnikach weglowodorowych.Spektrum aktywnosci przeciwbakteryjnej poda¬ ne w tablicy 1 zostalo okreslone metoda kolej¬ ko, nych rozcienczen w probówkach, przy "uzyciu po¬ zywki pochodzacej z BHI (Brailn Hearth Infu- sion Brotfy Difeo, Detroit, Michigan). Ptrobówkfl (18X150 mm) byly przygotowywane powszechnie stosowanym sposobem, jak podano u iSneirs, E. E., 35 yitamiin Methods, tom 1, Academic Press, Inc., Nowy Jork, 1950, str. 327. Do szczepienia pozywki uzyto organizmów kontrolnych, wyhodowanych przez 18 godzin w 37^C. Próby odczytano po 20 godzinacfc 40 PL

Claims

Zastrzezenia patentowe 1. 'Sjposób otrzymywania linkomycyny S o wzo¬ rze 2, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle Streptomyces limcolnensjjs var. lincolnensis nr NREL 2936 w wodnej pozywce, w obecnosci do¬ datku etioniny w warunkach aerobowych i utwo¬ rzona linkomycyne S wyosabhia sie w postaci' wol¬ nej od innych linkomycyn meltoda cnromatografii.
2. Spoisób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze eiecz pofermentacyjna zawierajaca linkomycyne S i inne linkomycyny przepuszcza sie przez kolum¬ ne, chromatograficzna; eluuje kolumne cnromato- graficzna rozpuszczalnikiem dla linkomycyny S oraz wydziela linkomycyne S zasadniczo w czystej postaci, wolnej od innych linkoimycyn, z eluatu.
3. Slposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze stosuje sie kolumne chromatograficzna z zelem krzemionkowym.
4. Sposób wedlug zagtrz. 3, znamienny tym, ze j-ako roztwór eluujacy stosuje sie keton metylo- woetylowy, aceton i wode w stosunku objetoscio¬ wym 100:30:
5.KI. 30 h, 6 60 445 MKP C 12 d, 9/14 CH3 le HO-CH CONH wzor A C2H5 U" HO-CH ÓONH ^ SCi He wzór 2 Bltk 1338/70 r. 220 egz. A4 PL