PL51230B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano: 15.IV.1966 51230 KI. 30 h, ^ MKP A Ol-*" * UKD BIBLIOTEKA Urzedu Patentowego ¦inlrUli i 'IrpffT Wspóltwórcy wynalazku: Stefan Marcinkiewicz, Maria Budzynska Wlasciciel patentu: Instytut Farmaceutyczny, Warszawa (Polska) Sposób wydzielania enzymów proteolitycznych z pozostalosci trzustki po wyodrebnieniu insuliny Przedmiotem wynalazku jest sposób wydziela¬ nia enzymów proteolitycznych z pozostalosci gru¬ czolu trzustkowego po wyodrebnieniu insuliny.Otrzymane enzymy nadaja sie do stosowania w przemysle, np. w garbarstwie, a wydzielone w sta¬ nie wysokiej czystosci nadaja sie zwlaszcza do ce¬ lów terapeutycznych.Na temat wydzielania enzymów proteolitycznych trzustki, a zwlaszcza na temat wykorzystania do tego celu materialu odpadowego, którym jest pozostalosc trzustki po wyodrebnieniu insuliny, istnieje obszerna literatura patentowa. Insuline wyodrebnia sie przez traktowanie rozdrobnionej trzustki alkoholowymi roztworami kwasów. Insu¬ lina przechodzi do roztworu, a równoczesnie na¬ stepuje osadzanie i zdezaktywowanie enzymów proteolitycznych. W celu uzyskania tych enzymów o przywróconej aktywnosci, znany jest sposób traktowania pozostalosci bardzo duzymi ilosciami wody. Woda przede wszystkim usuwa kwas i al¬ kohol, a nastepnie rozpuszcza pewna ilosc tych enzymów. Z bardzo rozcienczonego roztworu wod¬ nego, enzymy wysala- sie chlorkiem sodowym, co pochlania wielkie ilosci soli. Znane jest równiez zageszczenie rozcienczonego roztworu wodnego pod obnizonym cisnieniem, a nastepnie wysalanie enzymów z mniejszej objetosci roztworu zageszczo¬ nego.Znane sa takze i inne sposoby polegajace na 25 2 ekstrakcji pozostalosci trzustki rozpuszczalnikami organicznymi mieszajacymi sie z woda i wydzie¬ lanie enzymów z tych ekstraktów. Wydajnosc zna¬ nych sposobów jest bardzo niewielka, a postepo- wanie klopotliwe. Nieco lepsza wydajnosc uzyskuje sie innym znanym sposobem polegajacym na wstepnym ogrzaniu pozostalosci po wydobyciu insuliny przed ekstrakcja do temperatury 100° pod warunkiem, ze czas ogrzewania jest bardzo krótki.Warunek ten jest trudny do realizacji w skali przemyslowej, co praktycznie sposób ten dyskwa¬ lifikuje.Próby stosowania róznych znanych sposobów wykazaly, ze mozna o#rzymac z 1 kg pozostalosci najwyzej 5 g preparatu o aktywnosci okolo 10,000 jednostek Fuld-Grossa, czyli mozna ogólem uzyskac okolo 50.000 tych jednostek.Pozostalosc po wyodrebnieniu insuliny jak rów¬ niez nieekstrahowany rozdrobniony gruczol trzus¬ tkowy dzieki zawartosci enzymów proteolitycznych maja sklonnosc do autolizy. Stwierdzono, ze auto- lizaty te mozna bez trudnosci ekstrahowac, za¬ pewne na skutek zniszczenia pierwotnej struktury zywej tkanki. Ponadto autoliza przywraca aktyw¬ nosc enzymom zdezaktywowanym podczas wyod¬ rebniania insuliny alkoholowym roztworem kwasu.Przeprowadzone próby ekstrakcji autolizatu otrzymanego z pozostalosci po wyodrebnieniu insuliny, w których zastosowano rózne rozpuszczal- 512303 niki, wykazaly ze nie jest sluszne dazenie do wyekstrahowania enzymów proteolitycznych z auto- lizatu, lecz raczej r^alezy ekstrakcje nastawic na usuniecie jak najwiekszej ilosci innych substancji z pozostawieniem mozliwie jak najwiekszej ilosci enzymów proteolitycznych. Jakkolwiek pewna" ilosc enzymów nieuchronnie przejdzie do ekstraktu, mozna uzyskac pozostalosc poekstrakcyjna, stano¬ wiaca koncentrat enzymów o wielkiej aktywnosci proteolitycznej. Koncentrat ten moze byc stoso¬ wany bezposrednio, albo moze sluzyc jako pólpro¬ dukt do uzyskania zespolu enzymów proteolitycz¬ nych w stanie wysokiej czystosci.Wedlug wynalazku material wyjsciowy t.j. po¬ zostalosc po wyodrebnieniu insuliny z rozdrob¬ nionej trzustki nalezy uwolnic od alkoholu i eo¬ najmniej wiekszej czesci kwasu przy mozliwie jak najmniejszym wyekstrahowaniu z tego ma¬ terialu enzymów proteolitycznych.' W tym celu przemywa sie ten material niewielka iloscia wody lub rozpuszczalnika organicznego mieszajacego sie z woda, jak octan etylu, octan metylu, aceton, a pozostale kwasy neutralizuje, zwlaszcza amonia¬ kiem. Tak wstepnie przygotowany material po¬ zostawia sie w temperaturze pokojowej, lub zbli¬ zonej do niej, na przeciag kilku dni w celu prze¬ prowadzenia autolizy. Poniewaz jak sie okazalo, autoliza tego materialu ma charakter procesu autokatalitycznego tj. szybkosc jej wzrasta w mia¬ re postepu procesu, korzystne jest, aczkolwiek niekonieczne, dodawanie do substancji przezna¬ czonej do autolizy autolizatu trzustki. Ta droga pobudza sie autolize i przyspiesza jej przebieg np. do 2 dni.Autolizat poddaje sie nastepnie ekstrakcji roz¬ puszczalnikami mieszajacymi sie z woda jak al¬ kohole rozpuszczalne w wodzie, estry kwasów organicznych lub ketony. Rozpuszczalniki te usu¬ waja z autolizatu tluszcze, wode i znaczna czesc rozmaitych produktów autolizy, a stosunkowo niewielka ilosc enzymów proteolitycznych.' Po ekstrakcji pozostaje preparat bialkowy, który po wysuszeniu wykazuje wysoka aktywnosc ^proteo¬ lityczna wynoszaca 15.000-30.000 jednostek Fuld- -Grossa wig preparatu wysuszonego. Wobec tego preparat ten stanowi koncentrat enzymów pro¬ teolitycznych. • , Wydajnosc procesu wydzielania enzymów prote¬ olitycznych z pozostalosci po wyodrebnieniu insu¬ liny wyrazona w jednostkach FuldrGrossa jest rzedu wielkosci 107 z 1 kg, a wiec rzedu znacznie wyzszego niz wydajnosc osiagana sposobami zna¬ nymi.Droga dalszej ekstrakcji tego produktu mozna z niego wydzielic zespól enzymów proteolitycznych o bardzo wielkiej czystosci i aktywnosci. Ekstrak¬ cje te prowadzi sie wedlug wynalazku, wodnymi roztworami organicznymi rozpuszczalników mie¬ szajacych sie z woda a zwlaszcza wodnym roztwo¬ rem octanu etylu. Z ekstraktu przez dodanie orga¬ nicznego rozpuszczalnika, np. octanu etylu lub przez wysolenie, wytraca sie substancja bialkowa sta¬ nowiaca zespól enzymów proteolitycznych o aktyw¬ nosci 90-120.000 jednostek Fuld-Grossa wig. Tak wyodrebniony i oczyszczony zespól enzymów pro- 4 teolitycznych nadaje sie zwlaszcza do celów tarapeutycznych.Przyklad I. 50 g wolnej od insuliny pozosta- 5 losci gruczolu trzustkowego, zawierajacej 35% su¬ chej substancji, przemyto trzykrotnie 100 ml wody.Po odwirowaniu ostatniej porcji wody zebrano wil¬ gotna pozostalosc i dodano do niej 25 procentowy roztwór wodny amoniaku az do otrzymania pH = 7.Nastepnie dodano 5 g trzustki wieprzowej, która byla autolizowana w ciagu 3 dni w temperaturze 5°C. Otrzymana w ten sposób mieszanine staran¬ nie zmieszano w homogenizatorze i pozostawiono w temperaturze 20°C przez 2 dni. Nastepnie doda¬ no 100 ml octanu etylu i po starannym wymiesza- 15 niu dodano 100 ml etanolu. Mieszanine starannie wymieszano i pozostawiono na 2 godziny a nastep¬ nie odsaczono. Pozostalosc przemyto 50 ml octanu etylu i odsaczono, a nastepnie pozostawiono do wyschniecia w temperaturze pokojowej. Otrzyma- 20 ny w ten sposób preparat utarto w mozdziezu. Pre¬ parat wazyl 7,8 g. Jego aktywnosc proteolityczna wynosila okolo 25.000 jednostek Fuld-Grossa w jednym gramie preparatu.P r z y iTl a d II. 50 g wolnej od insuliny pozosta- 25 losci gruczolu trzustkowego, zawierajacej 37 g suchej substancji, przemyto dwukrotnie 100 ml acetonu* odsaczono i wysuszono w temperaturze pokojowej. Sucha substancje zmieszano z 50 ml wody, dodano 25 procentowy roztwór amoniaku 30 az do pH = 7 oraz 5 g trzustki wieprzowej, która byla autolizowana w ciagu trzech dni w tempera¬ turze 5°C i calosc wymieszano w homogenizatorze, a nastepnie pozostawiono na dwa dni w tempera¬ turze 20°C. Po oplywie tego czasu do autolizatu 35 .dodano 100 ml acetonu, odsaczono, dodano 50 ml acetonu i 50 ml eteru, odsaczono, dodano 50 ml eteru i odsaczono, a pozostalosc wysuszono w tem¬ peraturze pokojowej i utarto w mozdziezu. Otrzy¬ many w ten sposób preparat wazyl 11 g. Jego ak- 40 tywnosc proteolityczna wynosila okolo 20.000 jed¬ nostek Fuld-Grossa w jednym gramie preparatu.Przyklad III. 5 g preparatu enzymów prote¬ olitycznych, otrzymanego wedlug przykladu I, zmieszano z 25 ml 25 procentowego roztworu wodnego etanolu, w temperaturze 20°C w ciagu 1 godziny, a, nastepnie przesaczono. Do przesaczu dodano 75 ml etanolu i pozostawiono na dwie go¬ dziny, nastepnie odwirowano wytracone bialka, przemyto je eterem i wysuszono w temperaturze pokojowej. Otrzymany w ten sposób preparat wa¬ zyl 0,47 g. Jego aktywnosc preteolityczna wyno¬ sila okolo 120.000" jednostek Fuld-Grossa w jed¬ nym gramie preparatu. 55 Przyklad IV. 5 g preparatu enzymów pro¬ teolitycznych, otrzymanego wedlug przykladu II, ,y zmieszano z 25 ml wody w ciagu 1 godziny w tem- '¦ peraturze 20°C, a nastepnie przesaczono. Do prze¬ saczu dodano 50 ml acetopu i pozostawiono na 2 60 godziny, a nastepnie odsaczono wytracone bialka, przemyto je eterem i wysuszono w temperaturze pokojowej. Otrzymany w ten sposób preparat wazyl 0,53 g. Jego aktywnosc proteolityczna wyno¬ sila okolo 90.000 jednostek Fuld-Grossa w jednym 65 gramie preparatu.51230 5 PL

Claims (1)

Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wydzielania enzymów proteolitycznych z pozostalosci trzustki po wyodrebnieniu insu¬ liny, znamienny tym, ze pozostalosc przemywa sie mala iloscia wody lub rozpuszczalnika orga¬ nicznego jak octan etylu, octan metylu, aceton, w celu usuniecia- alkoholu i wiekszej czesci kwasu, nastepnie zobojetnia sie zwlaszcza amo¬ niakiem i poddaje autolizie przez pozostawienie w temperaturze pokojowej ? w przeciagu kilku dni, nastepnie autolizat ekstrahuje sie rozpusz¬ czalnikiem mieszajacym sie z woda lub miesza¬ nina takich rozpuszczalników jak alkohole roz¬ puszczalne w wodzie, estry kwasów organicz¬ nych lub ketony, a pozostalosc po ekstracji, sta- 6 nowiaca koncentrat enzymów proteolitycznych albo suszy sie, albo poddaje dalszej ekstrakcji. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w celu zapoczatkowania i przyspieszenia auto- lizy dodaje sie do substancji poddawanej auto¬ lizie autolizat trzustki. 3. Sposób wedlug zastrz.

1. znamienny tym, ze koncentrat poddaje sie dalszej ekstrakcji wod¬ nymi roztworami organicznych rozpuszczalni¬ ków, a zwlaszcza roztworem octanu etylu, a z otrzymanego ekstraktu wytraca sie sub¬ stancje bialkowa stanowiaca zespól enzymów proteolitycznych przez dodanie do roztworu rozpuszczalnika organicznego lub przez wyso- lenie. PL