PL49977B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: Opublikowano: 18.11.1963 (P 100 782) 27.111.1962 Niemiecka Republika Demokratyczna 10.IX.1965 49977 KI 30 h, 6 MKP C 12 d UKD 9|to Wspóltwórcy wynalazku: inz. Gunter Kammann, dr Hans — Jórg Schmidt, dr inz. Helmut Engelmann, Ludwig Schiedt Wlasciciel patentu: VEB Arzneimittelwerk Dresden, Radebeul (Niemiec¬ ka Republika Demokratyczna) Sposób otrzymywania czystej gryzeofulwiny i Wynalazek dotyczy uproszczonego sposobu otrzy¬ mywania czystej gryzeofulwiny z brzeczki pofer¬ mentacyjnej na drodze ekstrakcji specjalnymi roz¬ puszczalnikami i adsorbcje substancji towarzysza¬ cych. 5 Gryzeofulwina, produkt przemiany materii, któ¬ ry mozna otrzymac na drodze fermentacji róznych szczepów Penicillium (na przyklad P.gryseofulvum, P.patulum i inne) zdobyla duze znaczenie w medy¬ cynie jako srodek hamujacy wzrost grzybów oraz 10 przy zwalczaniu chorób roslin.Szczepy wytwarzajace gryzeofulwine mozna ho¬ dowac wedlug znanych sposobów podpowierzdhnIo¬ wo lub powierzchniowo. Po skonczonej fermentacji, sulbstancja czynna znajduje sie przede wszystkim 15 w miceli, z powodu malej jej rozpuszczalnosci w wodzie. Poza tym wiadomo, ze grzyb, po zaczy¬ najacym sie rozpadzie miceli moze jeszcze tworzyc znaczne ilosci gryzeofulwiny. W celu uzyskania gryzeofulwiny micele oddziela sie od roztworu fer- 20 mentacyjnego przez odsaczenie, micele ekstrahuje odpowiednimi rozpuszczalnikami takimi jak nizsze alkohole, ester etylowy kwasu octowego ,aceton, trójchloroetylen lub chloroform, a otrzymana przy tym surowa substancje oczyszcza przez wielokrot- 25 ne przekrystalizowanie. Poniewaz w procesie wy¬ zej opisanym otrzymuje sie micele czesciowo zau- tolizowana odsaczenie 'jej nastrecza trudnosci.Znane sa takze sposoby polegajace na suszeniu na walcach calego srodowiska kultury (opis pa- 30 tentowy NiRF Nr 1.040,187 i opis patentowy bry¬ tyjski Nr 795.039) i nie wydzielanie gryzeofulwiny z grzybni suszonej przez wielokrotna ekstrakcje za pomoca trójchloroetylenu lub chloroformu. W ten sposób mozna uzyskac do 80°/o pierwotnie zawartej w calej masie fermentacyjnej substancji czynnej.Po oddestylowaniu rozpuszczalnika otrzymuje ' sie gryzeofulwine o czystosci do 92%.Poza tym wiadomo, ze w przeciwienstwie do in¬ nych antybiotyków gryzeofulwina wykazuje wyso¬ ka trwalosc na biologiczny rozklad wywolywany obcymi zarodnikami tak, ze mozna zrezygnowac z utrzymywania srodowiska kultury w warunkach sterylnych. Dzieki temu mozliwe jest, prowadzenie procesu w sposób ciagly przy stosowaniu stalej pozywki. Otrzymany produkt ekstrahuje sie, bez suszenia przy pomocy metyloizobutyloketonu w ekstraktorze przeciwpradowym pracujacym w sposób ciagly. Otrzymana przez zageszczenie ekstraktu surowa gryzeofulwine trzeba dalej oczy¬ szczac przez przekrystalizowanie poniewaz wyka¬ zuje stcpien czystosci 80—90% i temperature top¬ nienia 220°C.Ponadto znany jest sposób, wedlug któregor brzeczke przy niskiej wartosci pH ogrzewa sie do temperatury 60—120X!, oddziela stala micele i po dodaniu Ca(OH)2 otrzymuje sie gryzeofulwine z wilgotnej miceli przez ekstrakcje acetonem.Równoczesnie wyekstrahowane substancje towa¬ rzyszace oddziela sie nastepnie na drodze prze- 4997749SI7? 3 opisany (J. Ch|m. mywania benzyna i adsorpcji na weglu aktyw¬ nym lub tlenku glinu. Otrzymywana przez wytra¬ cenie woda gryzeofulwine oczyszcza sie przez prze¬ mycie woda, metanolem lub acetonem albo przez powtórne wytracenie z acetonu. Z powodu dlu- . giego procesu oczyszczania, sposób ten jest czaso¬ chlonny i uciazliwy.Sposób dalszego oczyszczania gryzeofulwiny wstepnie oczyszczonej przez przekrystalizowanie, jest" przez Grove i wspólpracowników.Soc. 1952; 3955). Wedlug metody ^'W^|wspólpracowników (Biochem J. 33, 240 (1&39) ^gryzeofulwine otrzymuje sie na drodze ek-^ strakcji miceli eterem,; ekstrakcji pozostalosci po oddestylowaniu eteru za pomoca benzenu i przez przekrystalizowanie z etanolu otrzymanej z gry¬ zeofulwiny. Czysta gryzeofulwine otrzymuje sie z przekrystalizowanego produktu na drodze chro- matografowania roztworu benzenowego na aktyw¬ nym tlenku glinowym. Sposób ten nie nadaje sie jednak do otrzymywania gryzeofulwiny w sjkali przemyslowej, poniewaz do procesu wprowadza sie gryzeofulwine wielokrotnie przekrystalizowana,. a poza tym stosowany tlenek glina;trzeba bylo preparowac na drodze specjalnej obróbki.. Srodki te sa czasochlonne, uciazliwe i zwiazane ze strata¬ mi substancji.Stwierdzono, ze proc^---w^^ac^ania^ c^tej-- gryzeofulwiny mozna znacznie skrócic ' i uptoscic przez stosowanie jako srodka, ekstrahujacego dwu- chlorometanu lulb 1,2-dwuchloroetanu. Niespodzie¬ wanie dwuichlorometan i 1,2-dwuchloroetan oka¬ zaly sie szczególnie odpowiednie do ekstrakcji gryzeofulwiny ze wzgledu na szczególnie dolbra i selektywna zdolnosc rozpuszczania gryzeofulwi¬ ny. Stwierdzono mianowicie, ze rozpuszczalnosc gryzeofulwiny w dwuchlorometanie wynosi okolo 11% a w 1,2-dwuchloroetanie okolo 6%, podczas gdy w acetonie gryzeofulwina rozpuszcza sie w 3,9%-ach. W zwiazku z selektywnym dzialaniem rozpuszczalnika mozna ominac dotychczas ko¬ nieczne kilkustopniowe oczyszczanie gryzeoful¬ winy.Jezeli bezposrednio otrzymany surowy nieod- tluszczony wyciag traktuje sie tlenkiem glinu, weglem aktywnym lub innym adsorbentem, wów¬ czas prawie nie nastepuje, wzglednie nastepuje tylko w niewielkim stopniu adsorpcja zabarwiaja¬ cych substancji towarzyszacych.Stwierdzono 'jednak, ze nastepuje niespodziewa¬ nie silna adsorpcja substancji zabarwiajacych to¬ warzyszacych gryzeofulwinie, i^z^li zawarte w mi- celi tluszcze, ewentualnie substancje o charakte¬ rze tluszczów usunie sie calkowicie przed oczysz¬ czaniem gryzeofulwiny.-Tluszcze mozna przy tym usunac z miceli albo przed ekstrakcja gryzeoful¬ winy sposobem wedlug wynalazku albo takze z po¬ zostalosci poekstrakcyjnej. Jako srodki do usuwa¬ nia tluszczów, stosuje sie nasycone weglowodory alifatyczne o liczbie atomów wegla Q—C12.Ilosc potrzebnych do oczyszczania tak odtlusz¬ czonej gryzeofulwiny srodków adsorpcyjnych, ewentualnie ich mieszanin wynosi tylko 10—40% ilosci oczyszczalnej gryzeofulwiny. Zuzyty tlenek glinu mozna regenerowac przez prazenie w tem¬ peraturach nie przekraczajacych 9Ó0*C.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze micele oddziela sie od cieklej klultury przez od- 5 saczenie albo odwirowanie, suszy i ewentualnie rozdrabnia w plynie. Z suchej miceli ekstrahuje sie gryzeofulwine za pomoca dwiichlorometanu lulb 1,2-dwuchloroetanu.Po oddestylowaniu rozpuszczalnika otrzymuje 10 sie pozostalosc, która po odtluszczeniu, przy po¬ mocy alifatycznych nasyconych weglowodorów o liczbie atomów wegla C5—C12 zawiera co naj¬ mniej 95°/o substancji czynnej. JJauwanie tlusz¬ czów lulb substancji o charakterze tluszczów moz- 15 na prowadzic przed ekstrakcja lub po ekstrakcji gryzeofulwiny z miceli. Taka surowa ^gryzeoful¬ wine rozpuszcza* sie nastepnie w wymienionych rozpuszczalnikach, prawie do stanu nasycenia, a brunatno zabarwiony roztwór chromatografuje sie 20 na tlenku glino^m. , Zabarwiajace substancje towarzyszace zostaja przy tym znacznie zaadsorbowane. Jako eluat otrzymuje.sie bezbarwny roztwór,. z którego przez . ,--¦ zageszczenie lub wytracenie otrzymuje sie prawie 25 ilosciowo czysto biala, krystaliczna gryzeofulwine, która po oznaczeniu spektrofotometrycznym wy¬ kazuje 99—100% substancji czynnej. Z oczyszczo- . nego roztworu mozna, wytracic gryzeofulwine '' jfrzez -dodanie do niej 20—50% alifatycznego we- 30 glowodoru o liczbie atomów wegla C5—C12 i na¬ stepna destylacje. Gryzeofulwina wskutek tego, ze jest trudno rozpuszczalna w alifatycznych we¬ glowodorach przy oddestylowaniu dwuchlorome- tanu krystalizuje w postaci jedwabistych miekkich 35 tete*- Poza tym stwierdzono ,ze gryzeofulwine mozaa wytracic pomijajac oddestylowanie rozpuszczalni¬ ka. W tym celu odtluszczona pozostalosc poekstrak¬ cyjna rozpuszcza sie w dwuchlorometanie lub 40 dwuchloroetanie, traktuje weglem aktywnym w ilosci 10—30% w stosunku do oczyszczonej gry¬ zeofulwiny, po czym przez dodanie weglowodoru alifatycznego, o liczbie atomów wegla C5—C12, o objetosci 3—5 razy wiekszej od objetosci dwu- 45 chlorometanu lub dwuchloroetanu, wytraca gry¬ zeofulwine. Sposób ten ze wzgledu na swoja pro¬ stote nadaje sie do przemyslowego zastosowania i prowadzi do otrzymania czysto bialej, krystalicz¬ nej gryzeofulwiny.Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej sposób we¬ dlug wynalazku.Przyklad I. Z 50 litrów roztworu kultury o zawartosci 3000 mg/1 gryzeofulwiny otrzymano przez odciagniecie na materiale filtracyjnym, ta¬ kim jak ziemia okrzemkowa 12,0 kg wilgotnej mi¬ celi, z której po wysuszeniu otrzymano 6,1 kg su¬ chej miceli. Przesacz kultury oddzielony od miceli zawieral jeszcze 8% gryzeofulwiny. Sucha micele 6o zmielono a nastepnie calkowicie odtluszczono za pomoca benzyny w aparacie ekstrakcyjnym pracu¬ jacym w sposób ciagly. Nastepnie sucha micele uwolniona od benzyny ekstrahowano w sposób ciagly za pomoca dwuchlorometanu. W 19,4 litrach 65 ' wyciagu znajdowalo sie wedlug oznaczenia spek- 50 5549977 6 trofotometrycznego 136,5 g gryzeofulwiny. Wyciag zageszczony do 2 litrów chromatografowano w ko¬ lumnie zawierajacej 30 g tlenku glinu, o srednicy 2,5 cm. Z bezbarwnego eluatu oddestylowano cal¬ kowicie dwuchlorometan, po uprzednim dodaniu 1 litra ciezkiej benzyny o temperaturze wrzenia 150QC. Z lugu macierzystego zawierajacego ciezka benzyne wytracilo sie 121 g (= 80,5 % w odnie¬ sieniu do zawartosci roztworu kultury) czysto bia¬ lej gryzeofulwiny o temperaturze topnienia 220 - —221°. Zawartosc 99,9% gryzeofulwiny.Przyklad II. 1 kg zmielonej suchej mice]i o zawartosci 22,5 g gryzeofulwiny i zawartosci 12% tluszczu, mieszano w ciagu 5 minut z 3 litrami dwuchloroimetanu, wyciag oddzielono od miceli na drodze saczenia cisnieniowego, a micele prze¬ myto 1 litrem dwuchlorometanu. Wyciag dwu- chlorometanowy zageszczono do 500 ml, dodano 200 ml ciezkiej benzyny o temperaturze wrzenia okolo 150°, i calkowicie oddestylowano dwuchloro¬ metan. Surowa gryzeofulwine wydzielajaca sie przy tym z roztworu ciezkiej benzyny odsaczono i odtluszczono benzyne. Otrzymano 21,8 g gryzeo¬ fulwiny o temperaturze topnienia 218—221° i za¬ wartosci substancji czynnej 96%.Surowy (produkt rozpuszczono w 200 ml dwu- chlorometanu a roztwór przesaczono przez war¬ stwe filtracyjna, która skladala sie z 5 g miesza¬ niny tlenku glinu i wegla aktywowanego w sto¬ sunku 1:1 i której srednica wynosila 1 cm.Z bezbarwnego przesaczu po oddestylowaniu roz¬ puszczalnika otrzymano 20,5 g grzyeofulwiny (= 91% zawartosci oznaczonej w suchej miceli) o temperaturze topnienia 220—221° i zawartosci powyzej 99% substancji czynnej.Przyklad III. 20 kg suchej miceli o zawar¬ tosci 0,690 kg gryzeofulwiny i 13% substancji o charakterze tluszczowym, ekstrahowano w zam¬ knietym urzadzeniu w sposób ciagly za pomoca 73,0 kg dwuchlorometanu o temperaturze wrzenia 760 = 39—42°C d20 = 1,322), w ciagu 5 godzin.Wyciag odparowano do sucha a otrzymane krysz¬ taly ^odtluszczono za pomoca benzyny o temperatu¬ rze wrzenia (80—110°C d20 = 0,720) a nastepnie suszono. Otrzymano' 0,690 kg surowej gryzeoful¬ winy o zawartosci 92% substancji czynnej. Surowy produkt rozpuszczono w 11,0 kg dwuchlorometanu traktowano 0,160 kg wegla aktywnego i odsaczono.Z bezbarwnego roztworu bez oddestylowania dwu- chloroetanu wytracono gryzeofulwine za pomoca 24,0 kg benzyny. Produkt przemyto tym samym rozpuszczalnikiem i suszono.Otrzymano 0,620 kg czysto bialej, krystalicznej gryzeofulwiny (= 90% substancji czynnej zawartej 5 w suchej miceli) o zawartosci 99,4% substancji czynnej i temperaturze topnienia 220—221°C.% Przyklad IV. 1 kg suchej miceli o zawar¬ tosci 29 g gryzeofulwiny, ekstrahowano w sposób 10 ciagly za pomoca 3 litrów 1,2-dwuchloroetanu. Po usunieciu rozpuszczalnika i odtluszczeniu pozosta¬ losci poekstrakcyjnej otrzymano 28 g surowej gryzeofulwiny o zawartosci 95%. Te surowa gry¬ zeofulwine rozpuszczono w 400 ml 1,2-dwuchloro- 15 etanu, odsaczono i chromatografowano na kolum¬ nie z tlenkiem glinu, która zawierala 12 g tlenku glinu w warstwie o gruibosci 4 cm. Z bezbarwnego eluatu otrzymano .26 g czysto bialej, krystalicznej gryzeofulwiny o temperaturze topnienia 220—221° 20 i zawartosci powyzej * 99% gryzeofulwiny, co od¬ powiada wydajnosci 8£f% w odniesieniu do zawar¬ tosci substancji czynnej w suchej miceli. 25 35 40 PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania czystej gryzeofulwiny na drodze ekstrakcji miceli zawierajacej gryzeoful¬ wine i nastepne oczyszczanie wyciagu za pomoca 30 tlenku glinu lub wegla aktywnego, znamienny tym, ze jako srodek do ekstrakcji stosuje sie dwuchlorometan lub 1,2-dwuchloroetan a micele przed ekstrakcja lub pozostalosc otrzymana po odpedzeniu- rozpuszczalnika z wyciagu odtluszcza sie za pomoca weglowodorów alifatycznych o licz¬ bie atomów C5—C12 a wyciag z surowej gryzeoful¬ winy uzyskany z odtluszczonej miceli, wzglednie s.urowa gryzeofulwine uzyskana po odtluszczeniu pozostalosci poekstrakcyjnej, po uprzednim roz¬ puszczeniu w dwuchlorometanie lub dwuchloroeta- nie traktuje sie tlenkiem glinu lub weglem aktyw¬ nym, po czym z uzyskanego oczyszczonego roztworu wydziela sie gryzeofulwine jprzez zageszczenie roz¬ tworu albo wytraca ja za pomoca weglowodorów 45 alifatycznych o liczbie atomów w^gla C5—C12, przy czym jesli dodatek weglowodorów wynosi 20—50% ilosci oczyszczonego roztworu, wówczas dodatkowo oddestylowuje sie dwuchlorometan lub dwuchloro- etan, a gdy dodatek ten stosuje sie w objetosci 3—5 razy wiekszej od objetosci roztworu, wówczas gryzeofulwine wytraca sie bez potrzeby oddesty- lowywania dwuchlorometanu lub dwuchloroetanu. 50 PL