PL47117B1 - - Google Patents

Description

Wiadomo, ze w czasie fermentacji kobala- miny, która przeprowadza sie za pomoca bak¬ terii propionowycn powstaje nie tylko wita¬ mina B12 lecz równiez pokrewne zwiazki ko- balaminowe. Te, tak zwane czynniki moga wy¬ kazywac takie same lub inne wlasciwosci niz witamina B12; istnieja równiez zdecydowanie antagonistyczne czynniki w stosunku do wita¬ miny B12.Poza tym wiadomo, ze przez czesciowa hy¬ drolize witaminy B12 — zwiazku stanowiacego amid kwasu trójkarboksylowego mozna wytwo¬ rzyc kwas kobalaminomonokarboksylowy a wiec jeden z czynników. Produkt tego chemicz¬ nego sposobu zawiera trzy mozliwe izomery kwasu kobalaminokarboksylowego, które nie sa równocenne pod wzgledem biologicznym.*) Wlasciciel patentu oswiadczyl, ze wspól¬ twórcami wynalazku sa Agoston Simon, Agnes Mertha, Jiozsef Borsy i Endre Csanyi.Stwierdzono, ze jeden z aktywnych izomerów tego kwasu mozna otrzymac w sposób prosty i ekonomiczny, jezeli bakterie propionowe szczepu PBS77 podda sie fermentacji na hydro¬ lizacie bialkowym, zawierajacym kwas panto¬ tenowy i biotyne a izomer kwasu cyjanokobala- minomonokarboksylowego powstaly w wyniku fermentacji cieklej kultury, oddzieli i odizoluje od równiez powstalej witaminy B12.Stwierdzono równiez, ze tak otrzymany izo¬ mer kwasu cyjanokobalaminomonokariboksylo- wego bedacy pod wzgledem biologicznym anta¬ gonista witaminy B12, mozna skutecznie stoso¬ wac jako srodek leczniczy przeciw policythemii.Zwalczanie policythemii stanowilo do dzis nie¬ rozwiazany problem w medycynie. Za pomoca otrzymanego wedlug wynalazku aktywnego czynnika, osiagnieto, przy podaniu sródmiesnio- wym w dziennej dawce 1—3 mg po miesiecz¬ nym aplikowaniu, spadek liczby czerwonychciailek krwi o 30—40%, wzglednie osiagnieto z powrotem normalna ich liczbe.Bakterie propionowe szczepu PBS 77 zastoso¬ wane w tym sposobie posiadaja nastepujace wlasciwosci: dobry wzrost na cieklej pozywce, zawierajacej naimok kukurydziany lub ekstrakt drozdzowy i glikoze przy hodowli w warunkach mikroaerobowych, zwlaszcza jezeli do pozywki doda sie CaCo^. Na podstawie klasyfikacji bakterii wedlug Berge'ya Manuala i Krassil- nikowa szczep ten odpowiada mniej wiecej bakteriom P. shermanii.Pod wzgedem morfologicznym charakterysty¬ czne jest to, ze kultura, która w okresie mlo¬ dosci, w wiekszej czesci sklada sie z pojedyn¬ czych couusów i z nieregularnych oraz bardzo krótkich i cienkich paleczek, w okresie doj¬ rzalym ma prawie wylacznie couusy i mniejsza liczbe duzych, nabrzmialych form inwolucyj¬ nych. Charakterystyczne wlasciwosci bioche¬ miczne: szczep rozwija sie dobrze na pozywce zawierajacej kwas mlekowy; ciekla kultura po zalkalizowaniu NaOH daje klaczkowaty osad; w czasie fermentacji w obecnosci 5,6—dwume- tylo-benzimidazolu srodowisko fermentacyjne zawiera witamine B12 i aktywny iizomer kwasu cyjanokobalaminomonokarboksylowego, który jest antagonistyczny w stosunku do witaminy Szczep bakterii propionowych PBS 77 wy¬ tworzono nastepujaco: szczepionke wytworzono ze spozywczej smietany na bulionie, skladaja¬ cym sie z 1,5% ekstraktu drozdzowego, 0,5% peptonu i 1% glukozy; przy czym szczep ho¬ dowano w termostacie w temperaturze 25c C w ciagu 48 godzin. Nastepnie dalej hodowano na plytkach Petriego na pozywce, zawierajacej 2% namoku kukurydzianego (zawartosc suchej substancji 50%), 2% glikozy i 1,8% agaru.Plytki przechowywano przez 8 dni w tempe¬ raturze 25°C w eksykatorze prózniowym w at¬ mosferze azotu. Z calkowicie rozwinietych kultur zbadano te, które pod wzgledem morfo¬ logicznym uwazano za bakterie propionowe na ich przydatnosc do otrzymywania witaminy B12 na drodze fermentacji na cieklej pozywce w obecnosci Co + +i 5,6—dwumetylobenzimida- zolu. Jedna z aktywnych kultur rozmnozono w cieklym srodowisku fermentacyjnym, skladaja¬ cym sie z 2% namoku kukurydzianego (50% suchej substancji), 2% glikozy i 1% CaCO^ a nastepnie w celu otrzymania wyizolowanej kultury dalej hodowano na stalej pozywce, której sklad odpowiadal skladowi stalej po- • zywki wyzej opisanej. r" "~~ " Nowy szczep PBS 77 zostal zarejestrowany w wegierskim Instytucie Zdrowia pod nr 601013.W czasie fermentacji przy zastosowaniu tego szczepu, ktra mozna przeprowadzic na pozywce, umozliwiajacej wzrost bakterii pro¬ pionowych, otrzymuje sie obok 2—3 y/11^ wita¬ miny Bls, 0,4—0,6 y/ml kwasu kobalaminamicno- karboksylowego antagonistycznego do witaminy B12. Jako pozywke mozna stosowac dowolny hydrolizat bialkowy pochodzenia zwierzecego lub roslinnego, który uzupelnia se 'kwasem pantotenowym i biotyna (np. namokiem kuku¬ rydzianym, ekstratem drozdzowym itd).Fermentacje prowadzi sie w warunkach mi¬ kroaerobowych, korzystnie w obecnosci 5,6— dwumetylobenzimidazolu w temperaturze 25— 30°C.W czasie przeróbki sfermentowanej cieklej kultury otrzymany kwas kobalaminomonokar- boksylowy mozna oddzielic ilosciowo w sposób prosty od witaminy Blt i nastepnie wyizolowac.Oddzielanie mozna przeprowadzic rozmaicie.Wedlug jednej z odmian wykonania sposobu, sfermentowana pozywke lub otrzymany z niej koncentrat ekstrahuje sie przy wartosci pH 7,5—8,5 za pomoca rozpuszczalnika nierozpusz¬ czalnego "w wodzie, przy czym najpierw zostaje usunieta witamina Blt. Nastepnie wodny roz¬ twór zakwasza sie i w koncu ekstrahuje przy wartosci pH korzystnie 2—4,5 za pomoca toz- puszczalnika nierozpuszczalnego w wodzie.Z roztworu tego mozna otrzymac kwas kobal- aminomonokarboksylowy, np. przez rozpuszcze¬ nie i wykrystalizowanie z wodnego roztworu rozpuszczalnika rozpuszczalnego w wodzie.Jako rozpuszczalnik do ekstrakcji ze srodor wiska fermentacyjnego mozna korzystnie sto¬ sowac fenol, krezol, crdorowco/pochodne fenolu lub rozpuszczalniki niepolarne, np. weglowo¬ dory alifatyczne lub ich chlorowco/pochodne albo ich mieszaniny.Do ekstrakcji kwasu monokarboksylowego nadaja sie równiez wyzej wymienione rozpusz¬ czalniki, wzglednie -ich mieszaniny.W dalszej odimiianie postepowania, sposobemwe¬ dlug wynalazku, oddziela sie ze sfermentowanej pozywki kwas cyjanokobalammomonokarbo- ksylowy od witaminy Blt za pomoca wymie¬ niaczy anionowych. Do tego celu mozna sto¬ sowac srednio silne lub silnie zasadowe wy¬ mieniacze anionowe po obróbce alkalicznej, a wiec w cyklu — OH. Na wymieniacz anio- - 2 -nowy nanosi sie srodowisko fermentacyjne wzglednie roztwór koncentratu w stanie slabo kiwasnym lub obojetnym, w ten sposób, ze roz¬ twór przeprowadza sie przez kolumne napel¬ niona granulowanym wymieniaczem jonowym albo miesza sie go z granulkami wymieniacza janowego, przez 10—15 mliaiut, po czym od¬ dziela sde wymieniacz jonowy, nastepnie do eluacjd stosuje sde roztwór kwasny, alkaliczny lub obojetny. Korzystnie jest, jezeli do eluacji' stosuje sde roztwór, zawierajacy równiez roz¬ puszczalny w wodzie polarny rozpuszczalnik organiczny nip. aceton, etanol lub metanol.Eluaicje prowadzi sde korzystnie przy wartosci pH 2—9.W dalszej odmianie sposobu wedlug wyna¬ lazku witamine B12 oddziela sie od kwasu kobalamdnomonokarboksylowego na drodze elektrodializy. Sposób ten stosuje sie, jezeli rozdzielaniu poddaje sie joiz oczyszczone roz¬ twory. Rozdzielanie mozna prowadzic w sro¬ dowisku obojetnym albo slabo alkalicznym w obecnosci srodka buforujacego.Kwas kobalaminomonokarboksylowy mozna wedlug wynalazku wyizolowac z jego roztworu w rozpuszczalniku nierozpuszczalnym w wo¬ dzie np. w sposób nastepujacy: roztwór zadaje sie woda w ilosci 200—1000 mig kwasu koba- laminomonokaffbokisylowego oraz 3—6 litrami polarnego rozpuszczalnika, np. acetonu, mety- loetyloketonu, eteru dwuetylowego, dioksanu, octanu etylowego, butanolu na litr roztworu, przez (co kwas cyjanokabalammonvmokarbo- ksylowy zostaje wyparty do fazy wodnej.Z tak otrzymanego wodnego roztworu mozna wydobyc kwas monokarbokisylowy przez ad¬ sorpcje na weglu zwierzecym d nastepujace po tym eluowanie wodnym roztworem alko¬ holu. Faze wodna mozna równiez poddac ekstrakcji polarnym rozpuszczalnikiem np. butanolem,, benzyna, alkoholem.Oczyszczony kwas kobalaminomonokarboksy¬ lowy wytraca sie z wody w postaci grubych, czerwonych, iglastych krysztalów, latwo roz¬ puszczalnyeh w wodnie i etanolu i wykazu¬ jacych takie samo widmo w ultrafiolecie jak wditamdna Bi2. Na drodze lowej metoda wystepujaca Machery - Naigel, oznacza sie za pomoca dirugorzedowego buta¬ nolu na 214 próbce bibuly wzgledna wartosc Rf = 0,3—0,6. Produkt wedruje do anody w czasie elektroforezy na bibule w buforze fosforanowym o wartosci pH = 6,8. Kwas monokarboksylowy mozna przeprowadzic w wi¬ tamine Bi2 przez amidowanie. Produkt chro- matografowany na bibule za pomoca kombi¬ nacji rozpuszczalnika; drugorzedowego butanolu (nasyconego woda) z lodowatym kwasem octen wym w stosunku 100 :1, okazal sie jednolity.W tescie na plycie z agaru produkt przy E. coli 113—3 okazal sie antagonistyczny w sto¬ sunku do witaminy Bi2. Antagonistyczne dzia¬ lanie posiada charakter kompetetywny i jest tylko wtedy calkowite, jezeli stosunek kwasu cyjanokobalaminomonokairbdksylowego do wita¬ miny Bi2 wynosi 40 :1 lub jest jeszcze wyzszy.Pod wzgledem farmakologicznym nie zaobser¬ wowano toksycznego dzialania kwasu mono- karboksylowego.Witamine B12 mozna izolowac z roztworu uwolnionego od kwasu kobalammomonokarbo- ksylowego wedlug znanych metod (np. przez adsorpcje na weglu) po uprzednim oczyszczeniu.Sposób przeróbki wedlug wynalazku, a wiec oddzielanie czystego kwasu monokarboksylo- wego od witaminy B]2 i nastepnie izolowanie mozna skutecznie stosowac wtedy, gdy aktywny kwas kobalaminomonokarboksylowy znajduje sie w wodnym roztworze obok witaminy Bi2.W przykladzie V podano przykladowo jak na¬ lezy przerabiac sposobem wedlug wynalazku sfermentowana ciekla kulture szczepu P. freu- denreichii, który pod wzgledem procentowym produkuje znacznie mniej aktywnego kwasu monokarboksylowego. Dalsze szczególy opisane sa w przykladach.Przyklad I. W kolbie o poj. 50 1 sterylizuje sde 40 1 nastepujacej pozywki: 2% namoku kukurydzianego, 2% glikozy, 1% CaCo^ 5 y (ml Co(N03)2, 1 ylml 5,6 — dwumetylobenzi- midazolu. Srodowisko naszczepia sie 10% szcze¬ pionki PBS 77 otrzymanej na takiej samej pozywce i fermentuje w ciagu 6 dni w tem¬ peraturze 28—29°C mieszajac 2 razy dziennie.Po 6 dniach srodowisko fermentacyjne zawie¬ ralo w sumie 150 mg witaminy Bi2. Po skon¬ czonej fermentacji bakterie usuwa sie przez, odwirowanie. Zawiesine bakterii gotuje sie przez godzine z 500 nil 70%-wego wodnego roztworu etanolu zawierajacego 0,1% NaOH i przesacza. Wygotowywanie z etanolem pow¬ tarza sie jeszcze dwukrotnie stosujac kazdo¬ razowo 200 mil etanolu. Polaczone ekstrakty 0 czerwonym zabarwieniu uwalnia od etanolu pod zmniejszonym cisnieniem. Stezony wodny roztwór zadaje sie 5 g wegla aktywnego, po 1 godzinnym staniu odsacza, przemywa woda, po czym eluuje 67%-wym wodnym roztworem - 3 -etanolu w temperaturze 60—70°C. Eluat uwal¬ nia sie od etanolu pod zmniejszanym cisnieniem.Wodny roztwór alkalizuje sie 10%-wym roz¬ tworem amoniaku do wartosci pH = 8, a na¬ stepnie ekstrahuje mieszanina fenolu i cztero¬ chlorku wegla w stosunku 1 :3, dopóki roztwór fenolu prawie przestanie byc rózowy. Nastep¬ nie roztwór wodny zakwasza sie kwasem sol¬ nym do wartosci pH = 3,5. Ekstrakcje za po¬ moca fenolu i czterochlorku wegla prowadzi sie dalej, az rozpuszczalnik wykaze slabo ró¬ zowe zabarwienie. Nastepnie kwasny roztwór fenolu i czterochlorku wegla zadaje sie taka sama iloscia 50%-wego wodnego roztworu ace¬ tonu, tak, ze kwas cyjanokobalaminomo«no- kariboksylowy zostaje wyparty do fazy wodnej.Ekstrakcje acetonem prowadzi sie dalej, do¬ póki faza rozpuszczalnika nie zabarwia sie juz na czerwono. Z wodnych roztworów usuwa sie slady rozpuszczalników organicznych przez de¬ stylacje prózniowa. Po dodaniu 0y3 g wegla aktywnego odsacza sie. Wegiel przemywa sie woda i eluuje w temperaturze 60*0 za pmioca 67%-wego wodnego roztworu etanolu. Eluat zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem do okolo 0,5—1,0 ml. Po 1 dniowym staniu w tem¬ peraturze 5°C otrzymuje sie grube igielkowate krysztaly, które odsacza sie, przemywa mala iloscia bardzo zimnej wody i suszy w stru¬ mieniu powietrza w temperaturze pokojowej.Otrzymuje sie 9,6 mg kwasu cyjanckobal- aminornonokarboksylowego, który po zbadaniu na drodze elektroforezy i chromatografii bibu¬ lowej okazuje sie jednolity.W czasie ekstrakcji alkalicznej wodnej fazy otrzymuje sie frakcje fenolu — czterochlorku wegla zawierajaca witamine B]2. Z roztworu fenolu wypiera sie witamine Bi2 do fazy wodnej przez wstrzasanie z 50%-wym wodnym roz¬ tworem etanolu. Po jednorazowej adsorpcji na weglu zwierzecym produkt poddaje sie krysta¬ lizacji. Otrzymuje sie 70 mg krystalicznej wi¬ taminy Bi2.Przyklad II. 1000 litrów pozywki opisanej w przykladzie I sterylizuje sie w ciagu godziny w fermenterze o pojemnosci 1 m3 z metalu kwasoodpornego w temperaturze 120°O. Nastep¬ nie zaszczepia szczepionke, zawierajaca 10% — szczepu PiBS 77 Propionibacterium shermanii.Szczepionke wytworzono przez zaszczepienie najpierw 10 litrów, a nastepnie 100 litrów srodowiska fermentacyjnego za pomoca 400 ml hodowli szczepu kazdorazowo po 6 dniach. 1000 litrów srodowiska fermentacyjnego pod¬ daje sie sterylnej kultywacji przez 6 dni w temperaturze 28—30°C i miesza ostroznie co 2 godziny. Po ukonczeniu fermentacji roz¬ twór posiada przy E. coli zawartosc witaminy B12 — 2,8 g. Srodowisko fermentacyjne gotuje sie przez godzine, chlodzi i zakwasza do war¬ tosci pH = 2,5, po czym dodaje 2% ziemi bie¬ lacej. Po 1 godzinnym mieszaniu odwirowuje sie od absorbenta i w koncu eluuje za pomoca 70%-wego roztworu etanolu nastawionego do wartosci pH = 8,5—9,0 za pomoca amoniaku.Eluacje powtarza sie 3-kixtnie,podczas gdy zie¬ mie bielaca odsacza sie. Polaczone obojetne eta- nolowe roztwory zageszcza sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem do 1/20 objetosci. Dodaje sie 1% NaCN i 20% (NH4)2S04, po czym ekstrahuje sie w 3 porcjach za pomoca alkoholu benzylo¬ wego, w sumie 20% objetosci. Roztwór alkoholu benzylowego zadaje sie taka sama objetoscia mieszaniny benzyna — benzen (2 :1), jak tez polowa objetosci wody tak, ze witamine B12 i kwas cyjanokobalaminomonokarboksylowy przeprowadza sie do fazy wodnej. Wodna ek¬ strakcje powtarza sie jeszcze dwukrotnie. Na^ stepnie wodny roztwór zadaje 150 g wegla zwierzecego i odsacza sie. Wegiel zwierzecy przemywa sie na nuczy woda zawierajaca 0,5% NaCN a nastepnie eluuje 67%rwym wodnym roztworem etanolu. Etanol usuwa sie przez destylacje pod zmniejszonym cisnieniem. Tak otrzymany wodny koncentrat zawiera witamine Bi2 i kwas cyjanokotoalaminomonokarbolcsylowy.Przez dodanie 3% NaHC03 czerwony wodny roztwór zostaje zalkalizowany do wartosci pH = 8, po czym ekstrahuje sie go mieszanina fenolu i chloroformu w stosunku 1 :4 tak dlugo, az faza fenolowa prawie nie jest zabarwiona na rózowo. Polaczony ekstrakt fenolowy zawie¬ ra witamine B12, która izoluje sie jak to opi¬ sano w przykladzie I. Otrzymuje sie 1,3 g krystalicznej witaminy B12.Alkaliczny wodny roztwór, zawierajacy kwas cjnanokobalaminomonokarboksylowy zakwasza sie do wartosci pH = 2,5, po czym ekstrahuje mieszanina fenolu i chloroformu w stosunku 1 :4 tak dlugo, az faza fenolowa prawie nie jest zabarwiona na rózowo. Faza wodna po¬ zostaje zólto-farazowa. Polaczone ekstrakty fe¬ nolowe wytrzasa sie z 50%-wym wodnym roz¬ tworem acetonu, po czym kwas cyjanokobal- aminomonokarboksylowy przechodzi do fazjr wodnej. Dodaje sie 2 g wegla zwierzecego, który odsacza sie po 0,5 godzinnym -staniu, - 4 '-dokladnie przemywa woda destylowana, a na¬ stepnie eluuje 67B/0Hwym roztworem etanolu.Roztwór etanolowy kwasu cyjanokobalamino- monokarboksyiowego uwalnia sie od etanolu pod zmniejszonym cisnieniem i zageszcza. Tak otrzymany wodny roztwór po ochlodzeniu za¬ wiera krysztaly. Po 24 godzinnym przechowy¬ waniu w temperaturze 5°C otrzymuje sie gruba warstwe krysztalów. Krysztaly odsacza sie na zimno na szklanej nuczy 6—4, przemywa mala iloscia lodowatej wody i suszy. Otrzymije sie 92 mg krystalicznego kwasu cyjanokobalamimo- monokanboksylowego. Produkt po zbadaniu na drodze elektroforezy i chromatografii bibulo¬ wej okazal sie jednolity.Przyklad III. W fermenterze o pojemnosci 20 m3 poddaje sie fermentacji pozywka za pomoca szczepu FBS 77 P. Shermanii jak opi¬ sano w przykladzie II. Po skonczonej fermen¬ tacji srodowisko zawiera 31,2 g witaminy Bt2.Bakterie usuwa sie przez odwirowanie, po czym z bakterii otrzymuje wspólnie wita¬ mine Bi2 i kwas cyjanokobalaminomonokarbo- ksylowy jak opisano w przykladzie I. Po ad¬ sorpcji na weglu zwierzecym otrzymuje sie oczyszczony ekstrakt, zawierajacy witamine Bi2 i kwas cyjanokobalaminomonokarboksylowy.Rozdzielenie witaminy Bi2 od kwasu cyjano- kobalaminornonokarooksylowego prowadza sie rastepujaco: 2 litry koncentratu, zawierajacego 19,6 g witaminy B.2 i 2,15 g kwasu cyjanokobalamino- monokariboksylowego wprowadza sfie do ko¬ lumny wypelnionej (800 g) silnie zasadowym Amberlieia IRC — 410 (wymieniacz jonowy znajduje sie w cyklu CH, przemyty zostal wo¬ da i jest wolny od alkaliów). Po przejsciu koncentratu przez kolumne z wymieniaczem przemywa sie tak dlugo destylowana woda, az woda z przemycia nie wykaze rózowego zabarwienia. Przeciek i eluaty zawieraja cala zawartosc witaminy B^ podczas gdy kwas monokariboksylowy pozostaje w kolumnie. Na¬ stepnie eluuje sie go za pomoca 0,01 n HCL zawierajacego 50% acetonu (800 ml).Otrzymany roztwór kwasu kobalaminomono- karboksylowego w stanie obojetnym zostaje uwolniony od rozpuszczalnika pod zmniejszo¬ nym cisnieniem. Otrzymany koncentrat zawiera 1,8 g kwasu cyjanokobalaminomonokarboksy- lowego, co oznacza sie na drodze fotometrycz- nej. Wodny roztwór oczyszcza sie przez adsorp¬ cje, jak opisano w przykladzie II. Po odpedze¬ niu etanolu dodaje sie tak dlugo acetonu, az roztwór zmetnieje, po czym przechowuje sie go przez noc w temperaturze 5°C. Wydzielone igielkowate krysztaly odsacza sie, przemywa 80%-wym wodnym roztworem acetonu i suszy w temperatjrze pokojowej. Otrzymuje sie 1,5 g kwasu cyjanokobalaminomonokarboksylowego.Przyklad IV. 100 litrów materialu fermen¬ tacyjnego poddaje sie fermentacji jak w przy¬ kladzie I. Sfermentowana ciecz wykazywala aktywnosc 257 mg witaminy Bi2. Przeróbke prowadzi sde, jak opisano w przykladzie I, przez odwirowanie, ekstrakcje etanolem i ad¬ sorpcje. Po adsorpcji na weglu zwierzecym otrzymuje sie wodny roztwór, zawierajacy 151 mg witaminy BJ2 i 26,1 mg kwasu cyjano- kobalammomonokarboksylowego.Koncentrat wprowadza sie do komory apa¬ ratu do elekjtaolizy, skladajacego sie z dzie¬ sieciu okolo 50 ml komór. Aparat napelnia sie 0,1 molowym buforem fosforanowym o warto¬ sci pH = 6,8, po czym poddaje sie elektro- dializie w ciagu 3 godzin przy napieciu 220 Volt. Kwas cyjanokobalarninonianoikarboksylo- wy wedruje do anody. Oddzielone w ten spo¬ sób zwiazki oczyszcza sie oddzielnie przez ad¬ sorpcje, po czym witamine Bi2 wykryatalizo- wuje sie z wodnego roztworu acetonu a kwas cyjanokobalaminomonokarboksylowy — z gora¬ cej wody. Otrzymuje sie 150 mg witaminy Bi2 i 23,1 mg kwasu cyjanokobalaminomonokaTibo- ksylowego.Przyklad V. W fermenterze ze stali kwaso- odpornej o pojemnosci 1 m3 zaopatrzonym w mieszadlo sterylizuje sie 1000 litrów pozywki, zawierajacej drozdze prasowane (2% suchej substancji), które poddaje sie w ciagu 10 godzin autolizie w temperaturze 45°C. Nierozpuszczone czesci odwirowuje sie z autolizatu a plywajacy na powierzchni czysty roztwór przerabia sie dalej. Pozywka zawiera oprócz tego 2% gli- kozy, l%CaC03, 5 y/imi Ca(NOs)2 i 1 y/ml 5,6 — dwumetyiobenzimidazolu. Pozywke zaszczepia sie 10% srodowiska, zawierajacego Propioni- bacterium freudenreichii, fcitóre wyhodowano na tej samej pozywce. Po 6 dniowej sterylnej fermentacji w temperaturze 28—30°C i po dwu¬ dniowym mieszaniu srodowisko fermentacyjne wykazuje aktywnosc 2,57 g witaminy B12 (E. Coli). Bakterie usuwa sie przez odwirowa¬ nie. Ciecz wyplywajaca góra wylewa sie. Za¬ wiesine bakterii gotuje sie przez godzine z 30 litrami 56%-wego wodnego roztworu acetonu - 5 -o zawartosci 0,05% NaCN i odsacza. Wygoto¬ wywanie z wodnymi roztworem acetonu pow¬ tarza sie jeszcze dwukrotnie, po 15 litrów za kazdym razem. Polaczone czerwone roztwory uwalnia sie w prózni od acetonu, po czym wodny roztwór zadaje sie 140 g wegla zwie¬ rzecego i odsacza po 1/2 godzinie. Wegiel prze¬ mywa sie mala iloscia wody i eluuje wodnym roztworem etanolu o temperaturze 60—70°C.Eluat uwalnia sie w prózni od etanolu, po czym wodny roztwór alikalizuje sie za pomoca 10%-wego amoniaku do wartosci pH = 8 i ekstrahuje mieszanina fenol-chloroform w sto¬ sunku 1 :5, az faza fenolowa prawie nie wy¬ kaze rózowego zabarwienia. Nastepnie czesc wodna zakwasza sie kwasem solnymi do war¬ tosci pH = 3 i ekstrakcje prowadzi dalej za pomoca fenolu i chloroformu, az rozpuszczailinik prawie nie wykazuje rózowego zabarwienia.Kwasny roztwór fenolowo- chloroformowy za¬ daje sie 4^krotna objetoscia eteru i polowa objetosci wody tak, ze kwas cyjanokobalaimino- monokarboksylowy przechodzi do fazy wodnej.Nastepnie ekstrakcje za pomoca wody prowa¬ dzi sie dalej, az faza rozpuszczalnika nie wy¬ kaze wiecej czerwonego zabarwienia. Siady rozpuszczalnika organicznego usuwa sie z wod¬ nego roztworu na drodze destylacji prózniowej.Dodaje sie 0,5 wegla zwierzecego, po 1/2 go¬ dzinie odsacza sie, przemywa woda i eluuje 70%-wyim wodnym roztworem etanolu w tem¬ peraturze 60—70°C. Eluat zageszcza sie w pró¬ zni do stanu suchego, po czyim dodaje sie goracej wody tyle, azeby pozostalosc przeszla do roztworu. Po 2 godzinnym staniu w tem¬ peraturze 5°C odsacza sie wydzielone krysztaly, przemywa woda lodowata j suszy sie powiet¬ rzem. Otrzymuje sie 2,2 img kwasu cyjanokobal- aminornonokariboksylowego.* Ekstrakty fenolowo-chlorofonmowe, otrzyma¬ ne w czasie ekstrakcji alkalicznych wodnych roztworów, zawieraja witamdme Bi2. Z ekstrak¬ tów tych przeprowadza sie witamine Bi2 do roztworu wodnego przez dodanie 4 krotnej objetosci eteru i polowy objetosci wody. Po jednorazowej adsorpcji na weglu zwierzecym prowadzi sie krystalizacje. Otrzymuje sie 810 mg krystalicznej witaminjr Bi2. PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania izomeru kwasu cyjano- kobalaminomonokarboiksylowego, znamienny tym, ze pozywke z hydrolizatu bialkowego pochodzenia zwierzecego lub roslinnego, zar wierajaca (kwas pantotenowy i biotyne, ko^ rzystnie namok kukurydziany wzglednie ekstrakt drozdzowy, poddaje sie fermentacji za pomoca PropionibacteriUim shermanii szczepu PBS 77 w warunkach mikroaero- bowych w temperatuirze 26—30°C i w obec¬ nosci 5,6 — dwumetylobenzimidazolu, przy czym breje fermentacyjna lub wytworzony z niej i ewentualnie oczyszczony koncentrat ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem nierozpusz¬ czalnym w wodzie przy wartosci pH 7,5—8,5 w celu usuniecia witaimmy B±z a nastepnie faze wodna ekstrahuje rozpuszczalnikiem nierozpuszczalnym w wodzie przy wartosci pH = 2—4,5, albo breje fermentacyjna lub jej koncentrat traktuje sie zasadowym wy¬ mieniaczem anionowym w cyklu CH, lub breje fermentacyjna lub jej koncentrat pod¬ daje sie elektrolizie, a kwas cyjanokobai- aminomonokarboksylowy izoluje z roztworu otrzymanego przy kazdym rodzaju rozdzie¬ lania.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze do ekstrakcji jako rozpuszczalniki polarne stosuje sie: fenol, krezol, chlorowcopochodne fenolu lub niepolairne takie jak: weglowo¬ dory alifatyczne lub ich chlorowcopochodne, wzglednie mieszaniny wymienionych roz¬ puszczalników, korzystnie mieszanine fenolu i chloroformu lub fenolu i czterochlorku wegla.

3. Sposób wedlug zastrz. 1—2, znamienny tym, ze kwas cyjanokobalaminomonokarboksylo- wy przeprowadza sie z jego roztworu do rozpuszczalnika nierozpuszczalnego w wo¬ dzie przez wypieranie go najpierw do fazy wodnej, przez dodanie mieszaniny wody i polarnego rozpuszczalnika, przy czym otrzy¬ many wodny roztwór oczyszcza sie przez adsorpcje na weglu zwierzecym, a nastep¬ nie eluuje wodnym roztworem etanolu lub ekstrahuje rozpuszczalnikiem polarnym jak benzyna lub alkohol, a w koncu wykrystar lizowuje z wodnego roztworu alkoholu lub wody. Chinoin Gyógyszer es Vegyszeti Termekek Gyara r.t. Zastepca: mgr Józef Kaminski rzecznik patentowy 567. RSW „Prasa", Kielce. ^ --11... I U rzedu Pe te n t .owego. PL