Wiadomo, ze w czasie fermentacji kobala- miny, która przeprowadza sie za pomoca bak¬ terii propionowycn powstaje nie tylko wita¬ mina B12 lecz równiez pokrewne zwiazki ko- balaminowe. Te, tak zwane czynniki moga wy¬ kazywac takie same lub inne wlasciwosci niz witamina B12; istnieja równiez zdecydowanie antagonistyczne czynniki w stosunku do wita¬ miny B12.Poza tym wiadomo, ze przez czesciowa hy¬ drolize witaminy B12 — zwiazku stanowiacego amid kwasu trójkarboksylowego mozna wytwo¬ rzyc kwas kobalaminomonokarboksylowy a wiec jeden z czynników. Produkt tego chemicz¬ nego sposobu zawiera trzy mozliwe izomery kwasu kobalaminokarboksylowego, które nie sa równocenne pod wzgledem biologicznym.*) Wlasciciel patentu oswiadczyl, ze wspól¬ twórcami wynalazku sa Agoston Simon, Agnes Mertha, Jiozsef Borsy i Endre Csanyi.Stwierdzono, ze jeden z aktywnych izomerów tego kwasu mozna otrzymac w sposób prosty i ekonomiczny, jezeli bakterie propionowe szczepu PBS77 podda sie fermentacji na hydro¬ lizacie bialkowym, zawierajacym kwas panto¬ tenowy i biotyne a izomer kwasu cyjanokobala- minomonokarboksylowego powstaly w wyniku fermentacji cieklej kultury, oddzieli i odizoluje od równiez powstalej witaminy B12.Stwierdzono równiez, ze tak otrzymany izo¬ mer kwasu cyjanokobalaminomonokariboksylo- wego bedacy pod wzgledem biologicznym anta¬ gonista witaminy B12, mozna skutecznie stoso¬ wac jako srodek leczniczy przeciw policythemii.Zwalczanie policythemii stanowilo do dzis nie¬ rozwiazany problem w medycynie. Za pomoca otrzymanego wedlug wynalazku aktywnego czynnika, osiagnieto, przy podaniu sródmiesnio- wym w dziennej dawce 1—3 mg po miesiecz¬ nym aplikowaniu, spadek liczby czerwonychciailek krwi o 30—40%, wzglednie osiagnieto z powrotem normalna ich liczbe.Bakterie propionowe szczepu PBS 77 zastoso¬ wane w tym sposobie posiadaja nastepujace wlasciwosci: dobry wzrost na cieklej pozywce, zawierajacej naimok kukurydziany lub ekstrakt drozdzowy i glikoze przy hodowli w warunkach mikroaerobowych, zwlaszcza jezeli do pozywki doda sie CaCo^. Na podstawie klasyfikacji bakterii wedlug Berge'ya Manuala i Krassil- nikowa szczep ten odpowiada mniej wiecej bakteriom P. shermanii.Pod wzgedem morfologicznym charakterysty¬ czne jest to, ze kultura, która w okresie mlo¬ dosci, w wiekszej czesci sklada sie z pojedyn¬ czych couusów i z nieregularnych oraz bardzo krótkich i cienkich paleczek, w okresie doj¬ rzalym ma prawie wylacznie couusy i mniejsza liczbe duzych, nabrzmialych form inwolucyj¬ nych. Charakterystyczne wlasciwosci bioche¬ miczne: szczep rozwija sie dobrze na pozywce zawierajacej kwas mlekowy; ciekla kultura po zalkalizowaniu NaOH daje klaczkowaty osad; w czasie fermentacji w obecnosci 5,6—dwume- tylo-benzimidazolu srodowisko fermentacyjne zawiera witamine B12 i aktywny iizomer kwasu cyjanokobalaminomonokarboksylowego, który jest antagonistyczny w stosunku do witaminy Szczep bakterii propionowych PBS 77 wy¬ tworzono nastepujaco: szczepionke wytworzono ze spozywczej smietany na bulionie, skladaja¬ cym sie z 1,5% ekstraktu drozdzowego, 0,5% peptonu i 1% glukozy; przy czym szczep ho¬ dowano w termostacie w temperaturze 25c C w ciagu 48 godzin. Nastepnie dalej hodowano na plytkach Petriego na pozywce, zawierajacej 2% namoku kukurydzianego (zawartosc suchej substancji 50%), 2% glikozy i 1,8% agaru.Plytki przechowywano przez 8 dni w tempe¬ raturze 25°C w eksykatorze prózniowym w at¬ mosferze azotu. Z calkowicie rozwinietych kultur zbadano te, które pod wzgledem morfo¬ logicznym uwazano za bakterie propionowe na ich przydatnosc do otrzymywania witaminy B12 na drodze fermentacji na cieklej pozywce w obecnosci Co + +i 5,6—dwumetylobenzimida- zolu. Jedna z aktywnych kultur rozmnozono w cieklym srodowisku fermentacyjnym, skladaja¬ cym sie z 2% namoku kukurydzianego (50% suchej substancji), 2% glikozy i 1% CaCO^ a nastepnie w celu otrzymania wyizolowanej kultury dalej hodowano na stalej pozywce, której sklad odpowiadal skladowi stalej po- • zywki wyzej opisanej. r" "~~ " Nowy szczep PBS 77 zostal zarejestrowany w wegierskim Instytucie Zdrowia pod nr 601013.W czasie fermentacji przy zastosowaniu tego szczepu, ktra mozna przeprowadzic na pozywce, umozliwiajacej wzrost bakterii pro¬ pionowych, otrzymuje sie obok 2—3 y/11^ wita¬ miny Bls, 0,4—0,6 y/ml kwasu kobalaminamicno- karboksylowego antagonistycznego do witaminy B12. Jako pozywke mozna stosowac dowolny hydrolizat bialkowy pochodzenia zwierzecego lub roslinnego, który uzupelnia se 'kwasem pantotenowym i biotyna (np. namokiem kuku¬ rydzianym, ekstratem drozdzowym itd).Fermentacje prowadzi sie w warunkach mi¬ kroaerobowych, korzystnie w obecnosci 5,6— dwumetylobenzimidazolu w temperaturze 25— 30°C.W czasie przeróbki sfermentowanej cieklej kultury otrzymany kwas kobalaminomonokar- boksylowy mozna oddzielic ilosciowo w sposób prosty od witaminy Blt i nastepnie wyizolowac.Oddzielanie mozna przeprowadzic rozmaicie.Wedlug jednej z odmian wykonania sposobu, sfermentowana pozywke lub otrzymany z niej koncentrat ekstrahuje sie przy wartosci pH 7,5—8,5 za pomoca rozpuszczalnika nierozpusz¬ czalnego "w wodzie, przy czym najpierw zostaje usunieta witamina Blt. Nastepnie wodny roz¬ twór zakwasza sie i w koncu ekstrahuje przy wartosci pH korzystnie 2—4,5 za pomoca toz- puszczalnika nierozpuszczalnego w wodzie.Z roztworu tego mozna otrzymac kwas kobal- aminomonokarboksylowy, np. przez rozpuszcze¬ nie i wykrystalizowanie z wodnego roztworu rozpuszczalnika rozpuszczalnego w wodzie.Jako rozpuszczalnik do ekstrakcji ze srodor wiska fermentacyjnego mozna korzystnie sto¬ sowac fenol, krezol, crdorowco/pochodne fenolu lub rozpuszczalniki niepolarne, np. weglowo¬ dory alifatyczne lub ich chlorowco/pochodne albo ich mieszaniny.Do ekstrakcji kwasu monokarboksylowego nadaja sie równiez wyzej wymienione rozpusz¬ czalniki, wzglednie -ich mieszaniny.W dalszej odimiianie postepowania, sposobemwe¬ dlug wynalazku, oddziela sie ze sfermentowanej pozywki kwas cyjanokobalammomonokarbo- ksylowy od witaminy Blt za pomoca wymie¬ niaczy anionowych. Do tego celu mozna sto¬ sowac srednio silne lub silnie zasadowe wy¬ mieniacze anionowe po obróbce alkalicznej, a wiec w cyklu — OH. Na wymieniacz anio- - 2 -nowy nanosi sie srodowisko fermentacyjne wzglednie roztwór koncentratu w stanie slabo kiwasnym lub obojetnym, w ten sposób, ze roz¬ twór przeprowadza sie przez kolumne napel¬ niona granulowanym wymieniaczem jonowym albo miesza sie go z granulkami wymieniacza janowego, przez 10—15 mliaiut, po czym od¬ dziela sde wymieniacz jonowy, nastepnie do eluacjd stosuje sde roztwór kwasny, alkaliczny lub obojetny. Korzystnie jest, jezeli do eluacji' stosuje sde roztwór, zawierajacy równiez roz¬ puszczalny w wodzie polarny rozpuszczalnik organiczny nip. aceton, etanol lub metanol.Eluaicje prowadzi sde korzystnie przy wartosci pH 2—9.W dalszej odmianie sposobu wedlug wyna¬ lazku witamine B12 oddziela sie od kwasu kobalamdnomonokarboksylowego na drodze elektrodializy. Sposób ten stosuje sie, jezeli rozdzielaniu poddaje sie joiz oczyszczone roz¬ twory. Rozdzielanie mozna prowadzic w sro¬ dowisku obojetnym albo slabo alkalicznym w obecnosci srodka buforujacego.Kwas kobalaminomonokarboksylowy mozna wedlug wynalazku wyizolowac z jego roztworu w rozpuszczalniku nierozpuszczalnym w wo¬ dzie np. w sposób nastepujacy: roztwór zadaje sie woda w ilosci 200—1000 mig kwasu koba- laminomonokaffbokisylowego oraz 3—6 litrami polarnego rozpuszczalnika, np. acetonu, mety- loetyloketonu, eteru dwuetylowego, dioksanu, octanu etylowego, butanolu na litr roztworu, przez (co kwas cyjanokabalammonvmokarbo- ksylowy zostaje wyparty do fazy wodnej.Z tak otrzymanego wodnego roztworu mozna wydobyc kwas monokarbokisylowy przez ad¬ sorpcje na weglu zwierzecym d nastepujace po tym eluowanie wodnym roztworem alko¬ holu. Faze wodna mozna równiez poddac ekstrakcji polarnym rozpuszczalnikiem np. butanolem,, benzyna, alkoholem.Oczyszczony kwas kobalaminomonokarboksy¬ lowy wytraca sie z wody w postaci grubych, czerwonych, iglastych krysztalów, latwo roz¬ puszczalnyeh w wodnie i etanolu i wykazu¬ jacych takie samo widmo w ultrafiolecie jak wditamdna Bi2. Na drodze lowej metoda wystepujaca Machery - Naigel, oznacza sie za pomoca dirugorzedowego buta¬ nolu na 214 próbce bibuly wzgledna wartosc Rf = 0,3—0,6. Produkt wedruje do anody w czasie elektroforezy na bibule w buforze fosforanowym o wartosci pH = 6,8. Kwas monokarboksylowy mozna przeprowadzic w wi¬ tamine Bi2 przez amidowanie. Produkt chro- matografowany na bibule za pomoca kombi¬ nacji rozpuszczalnika; drugorzedowego butanolu (nasyconego woda) z lodowatym kwasem octen wym w stosunku 100 :1, okazal sie jednolity.W tescie na plycie z agaru produkt przy E. coli 113—3 okazal sie antagonistyczny w sto¬ sunku do witaminy Bi2. Antagonistyczne dzia¬ lanie posiada charakter kompetetywny i jest tylko wtedy calkowite, jezeli stosunek kwasu cyjanokobalaminomonokairbdksylowego do wita¬ miny Bi2 wynosi 40 :1 lub jest jeszcze wyzszy.Pod wzgledem farmakologicznym nie zaobser¬ wowano toksycznego dzialania kwasu mono- karboksylowego.Witamine B12 mozna izolowac z roztworu uwolnionego od kwasu kobalammomonokarbo- ksylowego wedlug znanych metod (np. przez adsorpcje na weglu) po uprzednim oczyszczeniu.Sposób przeróbki wedlug wynalazku, a wiec oddzielanie czystego kwasu monokarboksylo- wego od witaminy B]2 i nastepnie izolowanie mozna skutecznie stosowac wtedy, gdy aktywny kwas kobalaminomonokarboksylowy znajduje sie w wodnym roztworze obok witaminy Bi2.W przykladzie V podano przykladowo jak na¬ lezy przerabiac sposobem wedlug wynalazku sfermentowana ciekla kulture szczepu P. freu- denreichii, który pod wzgledem procentowym produkuje znacznie mniej aktywnego kwasu monokarboksylowego. Dalsze szczególy opisane sa w przykladach.Przyklad I. W kolbie o poj. 50 1 sterylizuje sde 40 1 nastepujacej pozywki: 2% namoku kukurydzianego, 2% glikozy, 1% CaCo^ 5 y (ml Co(N03)2, 1 ylml 5,6 — dwumetylobenzi- midazolu. Srodowisko naszczepia sie 10% szcze¬ pionki PBS 77 otrzymanej na takiej samej pozywce i fermentuje w ciagu 6 dni w tem¬ peraturze 28—29°C mieszajac 2 razy dziennie.Po 6 dniach srodowisko fermentacyjne zawie¬ ralo w sumie 150 mg witaminy Bi2. Po skon¬ czonej fermentacji bakterie usuwa sie przez, odwirowanie. Zawiesine bakterii gotuje sie przez godzine z 500 nil 70%-wego wodnego roztworu etanolu zawierajacego 0,1% NaOH i przesacza. Wygotowywanie z etanolem pow¬ tarza sie jeszcze dwukrotnie stosujac kazdo¬ razowo 200 mil etanolu. Polaczone ekstrakty 0 czerwonym zabarwieniu uwalnia od etanolu pod zmniejszonym cisnieniem. Stezony wodny roztwór zadaje sie 5 g wegla aktywnego, po 1 godzinnym staniu odsacza, przemywa woda, po czym eluuje 67%-wym wodnym roztworem - 3 -etanolu w temperaturze 60—70°C. Eluat uwal¬ nia sie od etanolu pod zmniejszanym cisnieniem.Wodny roztwór alkalizuje sie 10%-wym roz¬ tworem amoniaku do wartosci pH = 8, a na¬ stepnie ekstrahuje mieszanina fenolu i cztero¬ chlorku wegla w stosunku 1 :3, dopóki roztwór fenolu prawie przestanie byc rózowy. Nastep¬ nie roztwór wodny zakwasza sie kwasem sol¬ nym do wartosci pH = 3,5. Ekstrakcje za po¬ moca fenolu i czterochlorku wegla prowadzi sie dalej, az rozpuszczalnik wykaze slabo ró¬ zowe zabarwienie. Nastepnie kwasny roztwór fenolu i czterochlorku wegla zadaje sie taka sama iloscia 50%-wego wodnego roztworu ace¬ tonu, tak, ze kwas cyjanokobalaminomo«no- kariboksylowy zostaje wyparty do fazy wodnej.Ekstrakcje acetonem prowadzi sie dalej, do¬ póki faza rozpuszczalnika nie zabarwia sie juz na czerwono. Z wodnych roztworów usuwa sie slady rozpuszczalników organicznych przez de¬ stylacje prózniowa. Po dodaniu 0y3 g wegla aktywnego odsacza sie. Wegiel przemywa sie woda i eluuje w temperaturze 60*0 za pmioca 67%-wego wodnego roztworu etanolu. Eluat zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem do okolo 0,5—1,0 ml. Po 1 dniowym staniu w tem¬ peraturze 5°C otrzymuje sie grube igielkowate krysztaly, które odsacza sie, przemywa mala iloscia bardzo zimnej wody i suszy w stru¬ mieniu powietrza w temperaturze pokojowej.Otrzymuje sie 9,6 mg kwasu cyjanckobal- aminornonokarboksylowego, który po zbadaniu na drodze elektroforezy i chromatografii bibu¬ lowej okazuje sie jednolity.W czasie ekstrakcji alkalicznej wodnej fazy otrzymuje sie frakcje fenolu — czterochlorku wegla zawierajaca witamine B]2. Z roztworu fenolu wypiera sie witamine Bi2 do fazy wodnej przez wstrzasanie z 50%-wym wodnym roz¬ tworem etanolu. Po jednorazowej adsorpcji na weglu zwierzecym produkt poddaje sie krysta¬ lizacji. Otrzymuje sie 70 mg krystalicznej wi¬ taminy Bi2.Przyklad II. 1000 litrów pozywki opisanej w przykladzie I sterylizuje sie w ciagu godziny w fermenterze o pojemnosci 1 m3 z metalu kwasoodpornego w temperaturze 120°O. Nastep¬ nie zaszczepia szczepionke, zawierajaca 10% — szczepu PiBS 77 Propionibacterium shermanii.Szczepionke wytworzono przez zaszczepienie najpierw 10 litrów, a nastepnie 100 litrów srodowiska fermentacyjnego za pomoca 400 ml hodowli szczepu kazdorazowo po 6 dniach. 1000 litrów srodowiska fermentacyjnego pod¬ daje sie sterylnej kultywacji przez 6 dni w temperaturze 28—30°C i miesza ostroznie co 2 godziny. Po ukonczeniu fermentacji roz¬ twór posiada przy E. coli zawartosc witaminy B12 — 2,8 g. Srodowisko fermentacyjne gotuje sie przez godzine, chlodzi i zakwasza do war¬ tosci pH = 2,5, po czym dodaje 2% ziemi bie¬ lacej. Po 1 godzinnym mieszaniu odwirowuje sie od absorbenta i w koncu eluuje za pomoca 70%-wego roztworu etanolu nastawionego do wartosci pH = 8,5—9,0 za pomoca amoniaku.Eluacje powtarza sie 3-kixtnie,podczas gdy zie¬ mie bielaca odsacza sie. Polaczone obojetne eta- nolowe roztwory zageszcza sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem do 1/20 objetosci. Dodaje sie 1% NaCN i 20% (NH4)2S04, po czym ekstrahuje sie w 3 porcjach za pomoca alkoholu benzylo¬ wego, w sumie 20% objetosci. Roztwór alkoholu benzylowego zadaje sie taka sama objetoscia mieszaniny benzyna — benzen (2 :1), jak tez polowa objetosci wody tak, ze witamine B12 i kwas cyjanokobalaminomonokarboksylowy przeprowadza sie do fazy wodnej. Wodna ek¬ strakcje powtarza sie jeszcze dwukrotnie. Na^ stepnie wodny roztwór zadaje 150 g wegla zwierzecego i odsacza sie. Wegiel zwierzecy przemywa sie na nuczy woda zawierajaca 0,5% NaCN a nastepnie eluuje 67%rwym wodnym roztworem etanolu. Etanol usuwa sie przez destylacje pod zmniejszonym cisnieniem. Tak otrzymany wodny koncentrat zawiera witamine Bi2 i kwas cyjanokotoalaminomonokarbolcsylowy.Przez dodanie 3% NaHC03 czerwony wodny roztwór zostaje zalkalizowany do wartosci pH = 8, po czym ekstrahuje sie go mieszanina fenolu i chloroformu w stosunku 1 :4 tak dlugo, az faza fenolowa prawie nie jest zabarwiona na rózowo. Polaczony ekstrakt fenolowy zawie¬ ra witamine B12, która izoluje sie jak to opi¬ sano w przykladzie I. Otrzymuje sie 1,3 g krystalicznej witaminy B12.Alkaliczny wodny roztwór, zawierajacy kwas cjnanokobalaminomonokarboksylowy zakwasza sie do wartosci pH = 2,5, po czym ekstrahuje mieszanina fenolu i chloroformu w stosunku 1 :4 tak dlugo, az faza fenolowa prawie nie jest zabarwiona na rózowo. Faza wodna po¬ zostaje zólto-farazowa. Polaczone ekstrakty fe¬ nolowe wytrzasa sie z 50%-wym wodnym roz¬ tworem acetonu, po czym kwas cyjanokobal- aminomonokarboksylowy przechodzi do fazjr wodnej. Dodaje sie 2 g wegla zwierzecego, który odsacza sie po 0,5 godzinnym -staniu, - 4 '-dokladnie przemywa woda destylowana, a na¬ stepnie eluuje 67B/0Hwym roztworem etanolu.Roztwór etanolowy kwasu cyjanokobalamino- monokarboksyiowego uwalnia sie od etanolu pod zmniejszonym cisnieniem i zageszcza. Tak otrzymany wodny roztwór po ochlodzeniu za¬ wiera krysztaly. Po 24 godzinnym przechowy¬ waniu w temperaturze 5°C otrzymuje sie gruba warstwe krysztalów. Krysztaly odsacza sie na zimno na szklanej nuczy 6—4, przemywa mala iloscia lodowatej wody i suszy. Otrzymije sie 92 mg krystalicznego kwasu cyjanokobalamimo- monokanboksylowego. Produkt po zbadaniu na drodze elektroforezy i chromatografii bibulo¬ wej okazal sie jednolity.Przyklad III. W fermenterze o pojemnosci 20 m3 poddaje sie fermentacji pozywka za pomoca szczepu FBS 77 P. Shermanii jak opi¬ sano w przykladzie II. Po skonczonej fermen¬ tacji srodowisko zawiera 31,2 g witaminy Bt2.Bakterie usuwa sie przez odwirowanie, po czym z bakterii otrzymuje wspólnie wita¬ mine Bi2 i kwas cyjanokobalaminomonokarbo- ksylowy jak opisano w przykladzie I. Po ad¬ sorpcji na weglu zwierzecym otrzymuje sie oczyszczony ekstrakt, zawierajacy witamine Bi2 i kwas cyjanokobalaminomonokarboksylowy.Rozdzielenie witaminy Bi2 od kwasu cyjano- kobalaminornonokarooksylowego prowadza sie rastepujaco: 2 litry koncentratu, zawierajacego 19,6 g witaminy B.2 i 2,15 g kwasu cyjanokobalamino- monokariboksylowego wprowadza sfie do ko¬ lumny wypelnionej (800 g) silnie zasadowym Amberlieia IRC — 410 (wymieniacz jonowy znajduje sie w cyklu CH, przemyty zostal wo¬ da i jest wolny od alkaliów). Po przejsciu koncentratu przez kolumne z wymieniaczem przemywa sie tak dlugo destylowana woda, az woda z przemycia nie wykaze rózowego zabarwienia. Przeciek i eluaty zawieraja cala zawartosc witaminy B^ podczas gdy kwas monokariboksylowy pozostaje w kolumnie. Na¬ stepnie eluuje sie go za pomoca 0,01 n HCL zawierajacego 50% acetonu (800 ml).Otrzymany roztwór kwasu kobalaminomono- karboksylowego w stanie obojetnym zostaje uwolniony od rozpuszczalnika pod zmniejszo¬ nym cisnieniem. Otrzymany koncentrat zawiera 1,8 g kwasu cyjanokobalaminomonokarboksy- lowego, co oznacza sie na drodze fotometrycz- nej. Wodny roztwór oczyszcza sie przez adsorp¬ cje, jak opisano w przykladzie II. Po odpedze¬ niu etanolu dodaje sie tak dlugo acetonu, az roztwór zmetnieje, po czym przechowuje sie go przez noc w temperaturze 5°C. Wydzielone igielkowate krysztaly odsacza sie, przemywa 80%-wym wodnym roztworem acetonu i suszy w temperatjrze pokojowej. Otrzymuje sie 1,5 g kwasu cyjanokobalaminomonokarboksylowego.Przyklad IV. 100 litrów materialu fermen¬ tacyjnego poddaje sie fermentacji jak w przy¬ kladzie I. Sfermentowana ciecz wykazywala aktywnosc 257 mg witaminy Bi2. Przeróbke prowadzi sde, jak opisano w przykladzie I, przez odwirowanie, ekstrakcje etanolem i ad¬ sorpcje. Po adsorpcji na weglu zwierzecym otrzymuje sie wodny roztwór, zawierajacy 151 mg witaminy BJ2 i 26,1 mg kwasu cyjano- kobalammomonokarboksylowego.Koncentrat wprowadza sie do komory apa¬ ratu do elekjtaolizy, skladajacego sie z dzie¬ sieciu okolo 50 ml komór. Aparat napelnia sie 0,1 molowym buforem fosforanowym o warto¬ sci pH = 6,8, po czym poddaje sie elektro- dializie w ciagu 3 godzin przy napieciu 220 Volt. Kwas cyjanokobalarninonianoikarboksylo- wy wedruje do anody. Oddzielone w ten spo¬ sób zwiazki oczyszcza sie oddzielnie przez ad¬ sorpcje, po czym witamine Bi2 wykryatalizo- wuje sie z wodnego roztworu acetonu a kwas cyjanokobalaminomonokarboksylowy — z gora¬ cej wody. Otrzymuje sie 150 mg witaminy Bi2 i 23,1 mg kwasu cyjanokobalaminomonokaTibo- ksylowego.Przyklad V. W fermenterze ze stali kwaso- odpornej o pojemnosci 1 m3 zaopatrzonym w mieszadlo sterylizuje sie 1000 litrów pozywki, zawierajacej drozdze prasowane (2% suchej substancji), które poddaje sie w ciagu 10 godzin autolizie w temperaturze 45°C. Nierozpuszczone czesci odwirowuje sie z autolizatu a plywajacy na powierzchni czysty roztwór przerabia sie dalej. Pozywka zawiera oprócz tego 2% gli- kozy, l%CaC03, 5 y/imi Ca(NOs)2 i 1 y/ml 5,6 — dwumetyiobenzimidazolu. Pozywke zaszczepia sie 10% srodowiska, zawierajacego Propioni- bacterium freudenreichii, fcitóre wyhodowano na tej samej pozywce. Po 6 dniowej sterylnej fermentacji w temperaturze 28—30°C i po dwu¬ dniowym mieszaniu srodowisko fermentacyjne wykazuje aktywnosc 2,57 g witaminy B12 (E. Coli). Bakterie usuwa sie przez odwirowa¬ nie. Ciecz wyplywajaca góra wylewa sie. Za¬ wiesine bakterii gotuje sie przez godzine z 30 litrami 56%-wego wodnego roztworu acetonu - 5 -o zawartosci 0,05% NaCN i odsacza. Wygoto¬ wywanie z wodnymi roztworem acetonu pow¬ tarza sie jeszcze dwukrotnie, po 15 litrów za kazdym razem. Polaczone czerwone roztwory uwalnia sie w prózni od acetonu, po czym wodny roztwór zadaje sie 140 g wegla zwie¬ rzecego i odsacza po 1/2 godzinie. Wegiel prze¬ mywa sie mala iloscia wody i eluuje wodnym roztworem etanolu o temperaturze 60—70°C.Eluat uwalnia sie w prózni od etanolu, po czym wodny roztwór alikalizuje sie za pomoca 10%-wego amoniaku do wartosci pH = 8 i ekstrahuje mieszanina fenol-chloroform w sto¬ sunku 1 :5, az faza fenolowa prawie nie wy¬ kaze rózowego zabarwienia. Nastepnie czesc wodna zakwasza sie kwasem solnymi do war¬ tosci pH = 3 i ekstrakcje prowadzi dalej za pomoca fenolu i chloroformu, az rozpuszczailinik prawie nie wykazuje rózowego zabarwienia.Kwasny roztwór fenolowo- chloroformowy za¬ daje sie 4^krotna objetoscia eteru i polowa objetosci wody tak, ze kwas cyjanokobalaimino- monokarboksylowy przechodzi do fazy wodnej.Nastepnie ekstrakcje za pomoca wody prowa¬ dzi sie dalej, az faza rozpuszczalnika nie wy¬ kaze wiecej czerwonego zabarwienia. Siady rozpuszczalnika organicznego usuwa sie z wod¬ nego roztworu na drodze destylacji prózniowej.Dodaje sie 0,5 wegla zwierzecego, po 1/2 go¬ dzinie odsacza sie, przemywa woda i eluuje 70%-wyim wodnym roztworem etanolu w tem¬ peraturze 60—70°C. Eluat zageszcza sie w pró¬ zni do stanu suchego, po czyim dodaje sie goracej wody tyle, azeby pozostalosc przeszla do roztworu. Po 2 godzinnym staniu w tem¬ peraturze 5°C odsacza sie wydzielone krysztaly, przemywa woda lodowata j suszy sie powiet¬ rzem. Otrzymuje sie 2,2 img kwasu cyjanokobal- aminornonokariboksylowego.* Ekstrakty fenolowo-chlorofonmowe, otrzyma¬ ne w czasie ekstrakcji alkalicznych wodnych roztworów, zawieraja witamdme Bi2. Z ekstrak¬ tów tych przeprowadza sie witamine Bi2 do roztworu wodnego przez dodanie 4 krotnej objetosci eteru i polowy objetosci wody. Po jednorazowej adsorpcji na weglu zwierzecym prowadzi sie krystalizacje. Otrzymuje sie 810 mg krystalicznej witaminjr Bi2. PL PL