Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania pre¬ paratów insuliny o przedluzonym dzialaniu.Przedluzone dzialanie preparatów insuliny za¬ lezy od obecnosci lub od tworzenia sie insuliny trudnorozpuszczalnej we krwi przy wartosci pH dla niej charakterystycznej. Nierozpuszczalnego insuliny osiaga sie przez dodanie substancji o od¬ czynie zasadowym, np. protaminy, globiny i sur- fenu, które tworza z insulina zwiazki trudno- rozpuszczalne w srodowisku obojetnym.Stwierdzono obecnie, iz mozna wytwarzac pre¬ paraty insuliny o dzialaniu przedluzonym pomi¬ jajac stosowanie substancji pomocniczych, które utrudniaja wytwarzanie oraz kliniczne zastoso¬ wanie preparatów.*) Wlasciciel patentu oswiadczyl, ze twórcami wynalazku sa Knut Hallas Molier w Holte, Karl Petersen w Kopenhadze oraz Jorgen Schlichtkrul w Holte Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie preparaty insuliny o przedluzonym dzialaniu przy uzyciu czystej, krystalicznej insuliny w po¬ staci zawiesiny o ogólnej zawartosci takich me¬ tali jak cynk, kobalt, nikiel, kadm, miedz, man¬ gan lub zelazo, potrzebnych do krystalizacji in¬ suliny w ilosci okolo 7,5 X A X 10-3 milirówno- wazników w 1 litrze, przy czym A oznacza ilosc miedzynarodowych jednostek insuliny w 1 ml zawiesiny. Wprawdzie Fisher i Scott w nauko¬ wych dociekaniach nad znaczeniem obecnosci cynku w preparatach insuliny protaminowej wy¬ tworzyli zawiesine krysztalków insuliny w wo¬ dzie destylowanej, [J. Pharmacol. 58, 93 — 104 (1936)] jednak stwierdzili, ze zastrzyki wypro¬ dukowanej zawiesiny krysztalków insuliny za¬ stosowane podskórnie u królików, daja ten sam wynik co zastrzyki insuliny rozpuszczonej.Z pow3'zszego wysunieto wniosek, ze znana in¬ sulina krystaliczna zawierajaca 0,4 % cynku roz-puszcza sie latwo we krwi i cieczy tkankowej przy wartosci pH 7,2 dla nich charakterystycz¬ nej. ^ Jezeli insuline krystaliczna w postaci zawie¬ siny w wodzie destylowanej doprowadzi sie, np. wodorotlenkiem sodu do wartosci pH = 7, cala ilosc lub wieksza czesc krysztalków insuliny ule¬ gnie calkowitemu rozpuszczeniu. Z tych wzgle¬ dów, zawiesina insuliny krystalicznej w wodzie destylowanej nie znalazla zastosowania klinicz¬ nego.Stwierdzono obecnie na podstawie doswiadczen biologicznych i klinicznych, ze przy uzyciu za¬ wiesiny insuliny krystalicznej, otrzymanej spo¬ sobem wedlug wynalazku, osiaga sie preparat insuliny o przedluzonym dzialaniu, odpowiada¬ jacy a nawet przewyzszajacy stopien przedluzo¬ nego dzialania znanych preparatów insulino¬ wych.Roztwór insuliny krystalicznej o stezeniu 40 jednostek miedzynarodowych (1 ml do którego na kazde 100 ml dodano 4 mg cynku w postaci chlorku) nie wykazuje godnego uwagi dzialania przedluzonego. Jezeli jednak roztwór doprowa¬ dzi sie do wartosci pH = 5 i zostawi w spokoju, co powoduje wykrystalizowanie wytraconej in¬ suliny i wytworzenie zawiesiny krysztalków, za¬ wiesina wykazuje przedluzone dzialanie utrzy¬ mujace sie dluzej niz 24 godziny.Przyczyna przedluzonego dzialania preparatów insuliny, otrzymanych sposobem wedlug wyna¬ lazku, nie zostala scisle ustalona, jednakze przy¬ puszcza sie, ze insulina zawarta jest w postaci krystalicznej i, ze krysztaly zawiesiny sa trudno rozpuszczalne we krwi przy wartosci pH dla niej charakterystycznej.Jezeli insulina krystaliczna znajduje sie w po¬ staci zawiesiny w ilosci, np. 40 jednostek mie¬ dzynarodowych (1 ml w roztworze chlorku cyn¬ ku zawierajacym, np. 0,008 % cynku o wartosci pH = 7), w osrodku rozpraszajacym rozpuszczo¬ nej insuliny nie bedzie.Jezeli osrodek rozpraszajacy preparatów, wy¬ tworzonych sposobem wedlug wynalazku, posia¬ da wartosc pH okolo 7, lub jest doprowadzony do tej wartosci pH, stwierdzono, ze krysztalki insuliny wyosobnione wykazuja zwiekszona za¬ wartosc metalu w porównaniu do stalej jej za¬ wartosci co w odniesieniu do cynku wynosi okolo 0,4 %.Stwierdzone przedluzone dzialanie preparatów, otrzymanych sposobem wedlug wynalazku, moze byc wobec tego wynikiem obecnosci lub wytwa¬ rzania sie krysztalków insuliny o zwiekszonej za¬ wartosci metalu.Z tego wzgledu wywnioskowano, ze mozna równiez osiagnac przedluzone dzialanie prepa¬ ratu przez zawieszenie krysztalków insuliny o zwiekszonej zawartosci metalu w osrodku roz¬ praszajacym nie zawierajacym metalu.W celu wytworzenia preparatu o przedluzo¬ nym dzialaniu wystarcza aby w osrodku rozpra¬ szajacym panowaly takie warunki, w których krysztalki wykazujace zwiekszona zawartosc me¬ talu bylyby trudno rozpuszczalne we krwi i w cieczy tkankowej.przy wartosci pH dla nich cha¬ rakterystycznej.Sposób wedlug wynalazku jest równiez zna¬ mienny tym, ze stosuje sie osrodek rozpraszaja¬ cy o takim skladzie, w którym zawieszone krysz¬ talki insuliny wykazuja zwiekszona zawartosc pozadanego metalu, przy pH osrodka zawiesiny wynoszacym lub doprowadzonym do wartosci 7.Jezeli wytwarza sie preparat z insuliny kry¬ stalicznej zawierajacej okolo 0,4 % cynku lub odpowiednia ilosc innego z poprzednio wymie¬ nionych metali, osrodek zawiesiny winien wyka¬ zywac taka zawartosc wymienionych metali, aby bedace w stanie zawiesiny krysztalki insuliny przy wartosci pH osrodka równej 7 posiadaly zawartosc metalu ponad 0,10 milirównowazni- ków (1 g krysztalków).Jednakze stwierdzono, ze aby otrzymac prze¬ dluzone dzialanie preparatów wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku, korzystnie jest przygotowac krzysztalki insuliny o zawartosci metalu okolo 0,20 milirównowazników (1 g krysz¬ talków, to znaczy, np. okolo 0,65 % cynku), przy zalozeniu, ze insulina zostala wykrystalizowana przy uzyciu cynku. Jezeli zawartosc cynku w krysztalach wynosi, np. w przyblizeniu 1 %, wytwarzany preparat wykazuje przedluzone dzialanie równe przedluzonemu dzialaniu prepa¬ ratów insuliny cynkowo-protaminowej. Przy wiekszej zawartosci cynku mozna otrzymac dzia¬ lanie bardziej przedluzone.Co sie tyczy zawartosci metalu w osrodku wod¬ nym zawiesiny, nalezy zaznaczyc, ze ze wzro¬ stem zawartosci metalu w osrodku zawiesiny trzeba zwiekszyc zawartosc insuliny aby utwo¬ rzyly sie krysztalki o zamierzonej zwiekszonej zawartosci metalu. Jezeli zawiesine doprowadzi sie do zawartosci 40 jednostek miedzynarodo¬ wych insuliny (1 ml, otrzymuje sie krysztalki insuliny o zawartosci cynku okolo 2,3 % przy wartosci pH osrodka równej 7) osrodek doprowa¬ dza sie do wspomnianego A pH przy uzyciu wo¬ dorotlenków alkalicznych (i przy zawartosci cyn~ ku w osrodku wynoszacej 0.008 %). Jezeli osro- — 2 —dek zawiera 10 jednostek miedzynarodowych in¬ suliny (1 ml, otrzymuje sie insuline krystaliczna 6 zawartosci cynku okolo 2,6 %, a przy zawar¬ tosci insuliny 80 jednostek miedzynarodowych) 1 ml, otrzymuje sie krysztalki Insuliny o zawar¬ tosci okolo 1,8-& cynku, przy czym we wszyst¬ kich tych przypadkach zawartosc cynku w krysz¬ talkach przed ich zawieszeniem wynosi okolo 0,4%. Przy z góry okreslonej ilosci krysztalków insuliny na jednostke objetosci osrodka zawiesi¬ ny, wzrastajaca zawartosc metalu w osrodku wy¬ woluje wzrost zawartosci metalu w krysztal¬ kach. Jezeli osrodek zawiesiny posiada wartosc pH wynoszaca okolo 7 lub jest do tej wartosci pH doprowadzony, mozna w zwyklych warun¬ kach zwiazac, np. do 2,7 % cynku, co odpowiada liczbie grup kwasowych czasteczki insuliny. Po¬ dobne stosunki odnosza sie do innych metali.Przyjawszy, ze osrodek zawiesiny nie zawiera substancji o wiekszym powinowactwie chemicz¬ nym do wymienionych metali niz krysztalki in¬ suliny i, ze te posiadaja zwykla zawartosc me¬ talu, osrodek powinien zawierac najmniej jeden z wymienionych metali w ilosci najmniej 7,5 X A X 10—3 milirównowazników (1 litr, przy czym A oznacza ilosc miedzynarodowych jedno¬ stek insuliny) 1 ml dodanych do osrodka.Przy najczesciej w praktyce uzywanym steze¬ niu insuliny, wynoszacym okolo 40 jednostek miedzynarodowych (1 ml i przy osrodku zawie¬ siny zawierajacym cynk w ilosci 0,002%, oraz przy wprowadzeniu krysztalków insuliny o za¬ wartosci cynku okolo 0,4 %), znajdujace sie w za¬ wiesinie krysztalki insuliny beda zawieraly okolo 1,1 % cynku przy wartosci pH osrodka zawiesiny TÓwnej 7. Przy zawartosci cynku w osrodku za¬ wiesiny wynoszacej 0,004 %, krysztalki zawiera¬ ja okolo 1,7 % cynku, przy zawartosci cynku w osrodku zawiesiny wynoszacej 0,008 %, zawar¬ tosc cynku w krysztalkach insuliny wynosi okolo Jezeli pozadane jest, aby bedace w zawiesinie krysztalki insuliny byly nasycone cynkiem, np. zawieraly okolo 2,7 % cynku, osrodek zawiesiny powinien, w wyzej wymienionych warunkach, zawierac znacznie wiecej cynku, mianowicie oko¬ lo 0,03 %.Wartosc pH osrodka zawiesiny jest jednym z czynników posiadajacych decydujacy wplyw na rozpuszczalnosc krysztalków insuliny w osrodku i na zwiekszenie zawartosci metalu w krysztal¬ kach. Przy zalozeniu, ze osrodek nie zawiera substancji posiadajacych szczególne wlasciwosci zmniejszajace rozpuszczalnosc krysztalów, w pre¬ paratach do praktycznego uzycia nie mozna przeszkodzic rozpuszczaniu sie wszystkich krysz~ talków insuliny znajdujacych sie w stanie za¬ wiesiny w osrodku o wartosci pH wyzszej niz 9.Poza tym, powyzej tej wartosci pM, trudno jest wytwarzac preparaty o wystarczajacej trwalosci.Takze w normalnych warunkach, nie mozna przeszkodzic rozpuszczaniu sie krysztalów przy wartosci pH osrodka zawiesiny nizszej niz 3 —4.Wskutek tego, o ile osrodek zawiesiny nie za¬ wiera substancji, posiadajacych szczególne wlas¬ ciwosci zmniejszania rozpuszczalnosci insuliny, nalezy utrzymywac wartosc pH osrodka we wspomnianych granicach.Jak wynika z rozwazan przytoczonych powy¬ zej, zawiesina zawiera krysztalki insuliny o zwie¬ kszonej zawartosci metalu jezeli osrodek zawie¬ siny posiada wartosc pH okolo 7, pod warun¬ kiem, ze osrodek nie zawiera substancji o wiek¬ szym powinowactwie chemicznym do wymienio¬ nych metali niz krysztalki insuliny.W celu uzyskania przedluzonego dzialania, nie jest konieczne aby swiezo wytworzona zawie¬ sina zawierala in ' vitro krysztalki insuliny o zwiekszonej zawartosci metalu.Zwiekszona zawartosc metalu mozna osiagnac przez zmiane wartosci pH osrodka zawiesiny do 7. Przypuszczalnie przyczyna tego jest zmia¬ na wysokosci wartosci pH do okolo 7, zacho¬ dzaca przy wstrzyknieciu takiej zawiesiny, w której krysztalki insuliny o zwiekszonej zawar¬ tosci metalu tworza sie in vivo. Stwierdzono ni podstawie doswiadczen klinicznych, ze dwie za- -wiesiny o identycznym skladzie, z których jedna jest doprowadzona do wartosci pH —4,5, druga do pH = 7 wykazuja takie samo przedluzone dzialanie. Analiza ilosci metalu zawartego w znaj¬ dujacych sie w stanie zawiesiny krysztalkach insuliny wykazala, ze krysztalki insuliny o war¬ tosci pH —4,5 zawieraja normalna ilosc metalu, natomiast krysztalki o wartosci pH = 7 zawie¬ raja zwiekszona ilosc metalu. Wobec tego dal¬ sza cecha znamienna wynalazku jest to, ze osro¬ dek wodny zawiesiny posiada odczyn kwasny lub jest,do niego doprowadzany.Sposobem wedlug wynalazku mozna osrodek zawiesiny doprowadzic do pozadanej wartosci pH za pomoca substancji buforowych lub ich mieszaniny.Przy wyborze substancji buforowych i innych domieszek osrodka wodnego zawiesiny nalezy wziac pod uwage rozmaite czynniki. Stwierdzo¬ no, ze obecnosc w osrodku zawiesiny pewnych anionów wplywa na przedluzone dzialanie pre¬ paratów insuliny, prawdopodobnie ze wzgledu — 3 —na wplyw anionów na ir"3HiKiw»7ttlmróc krysz¬ talków insuliny w osrodku, jak równiez na zdol¬ nosc krysztalków do adsorbowania metali z o- srodka zawiesiny lub do utrzymania zwiekszonej zawartosci metalu. Jezeli np. insulina krysta¬ liczna znajduje sie w stanie zawiesiny w wod¬ nym roztworze zawierajacym 0,008 % cynku (w postaci chlorku) i 1/120 molowego roztworu fosforanu sodu, doprowadzonym do wartosci pH — 5, a nastepnie do pH — 7, krysztalki roz¬ puszcza sie calkowicie lub czesciowo bez wiaza¬ nia cynku.To samo bedzie mialo miejsce jezeli zamiast soli fosforanowej uzyje sie jako buforu cytry¬ nianu. Jednakze, jezeli zamiast cynku uzyje sie niklu, przy zmianie wartosci pH do 7 w obec¬ nosci fosforanu, krysztalki insuliny nie rozpusz¬ cza sie lecz zaabsorbuja nikiel z osrodka zawie¬ siny.Przypuszcza, sie, ze jony fosforanowe posiada¬ ja wieksze powinowactwo chemiczne do jonów cynku niz krysztalki insuliny i wskutek tego w srodowisku obojetnym Wiaza jony cynkowe.W przypadku obecnosci jonów niklu, jony fos¬ foranowe nie wiaza ich w takim.stopniu, aby uniemozliwic reakcje z krysztalkami insuliny.Z tego wzgledu, przy wytwarzaniu preparatów o przedluzonym dzialaniu silnie dzialajacych, przy uzyciu substancji buforowej w celu dopro¬ wadzenia osrodka zawiesiny do odpowiedniej wartosci pH, nalezy uzywac takiej substancji buforowej, której anion w srodowisku obojet¬ nym, nie wiaze metalu wchodzacego w gre.Ustalona rozpuszczalnosc krysztalków insuliny daje korzysci, poniewaz umozliwia wytwarzanie preparatów insuliny wykazujacych czesciowo szybkie dzialanie, czesciowo dzialanie przedlu¬ zone. Osrodek zawiesiny moze posiadac taki sklad i kwasowosc, ze moze zawierac insuline rozpuszczona lub w postaci bezpostaciowego o- sadu.Mozna z góry zapewnic obecnosc insuliny roz¬ puszczonej lub wytraconej jako bezpostaciowy osad, dopuszczajac do rozpuszczenia sie czesci krysztalków insuliny i nastepnie wytracajac ja jako osad bezpostaciowy. W zwiazku z tym, dal¬ sza cecha znamienna wynalazku jest to, ze uzy¬ wa sie osrodka zawiesiny zawierajacego w nad¬ miarze insuline rozpuszczona lub w postaci bez¬ ksztaltnego osadu lub ze uzyskuje sie taki osro¬ dek zawiesiny przez dodanie krysztalków insuliny.Insuline o szybkim dzialaniu mozna równiez otrzymac przez dodanie do osrodka zawiesiny anionów powodujacych rozpuszczalnosc krysztal¬ ków insuliny w srodowisku obojetnym.Zmieniajac w osrodku zawiesiny zawartosc cynku lub podobnych metali, pH, zawartosc anio¬ nów oraz zawartosc rozpuszczonej insuliny lub insuliny wytraconej jako bezpostaciowy osad, umozliwia sie, zgodnie z wynalazkiem otrzyma^ nie preparatów insuliny, wykazujacych zarówno przedluzone dzialanie o zamierzonej dlugosci trwania jak i w zamierzonym stopniu szybkie dzialanie insuliny rozpuszczonej. Wynalazek jest równiez oparty na spostrzezeniu, ze przedluzone dzialanie wytwarzanej zawiesiny krysztalków in¬ suliny zalezy od ich wielkosci Stwierdzono na podstawie biologicznych doswiadczen, przepro¬ wadzonych zgodnie z wynalazkiem na pozba¬ wionych trzustki psach, ze krysztalki insuliny o wielkosci okolo 10 /u w zawiesinie zawierajacej cynk w omówionych ilosciach wykazuja prze¬ dluzone dzialanie w tym samym stopniu co in¬ sulina cynkowo-protaminowa, zas krysztalki o wielkosci 25 —100^ wykazuja jeszcze bardziej przedluzone dzialanie.Fakt ten nalezy brac pod uwage stosujac ziarn¬ ka krystalicznej insuliny o odpowiedniej wiel¬ kosci. Do wytwarzania preparatów insuliny mozna uzywac krysztalków insuliny otrzymywa¬ nych przy uzyciu jakiegokolwiek sposobu kry¬ stalizacji dajacego pozadane wyniki. Sposród dotad znanych sposobów najkorzystniejsza jest tak zwana metoda cytrynianowa -opisana, np. w patencie dunskim nr 70270. Z innych korzy¬ stnych sposobów wymienic nalezy, np. sposób opracowany przez Scotta [Biochemical J. 28, 1952 (1934)] i pózniejsze sposoby z niego wypro¬ wadzone. Do wytwarzania osrodka zawiesiny wykazujacego zawartosc wymienionych metali, mozna uzywac wody destylowanej z dodatkiem jednego z wymienionych metali, np. w postaci soli. Do uzytku klinicznego jest jednak korzyst¬ niej stosowac izotoniczne osrodki zawiesiny.Wlasciwosci izotoniczne osrodka wodnego mo¬ zna osiagnac przez dodatek substancji takich jak np. glukoza, chlorek sodu lub gliceryna. W celu zachowania trwalosci preparatów insulinowych nalezy dodawac do nich jednego lub wiecej osrodków konserwujacych stosowanych zwykle do cieczy do wstrzykiwania, np. fenolu i jego po¬ chodnych, estru metylowego kwasu p-hydroksy- benzoesowego (nipagina), estru propylowego kwasu p-hydroksybenzoesowego i octanu feny- lorteciowego* Rózne przyklady osrodków wodnej zawiesiny stosowanych do wytwarzania preparatów insuli¬ nowych sposobem wedlug wynalazku i wykazu- - 4 —jacych zawartosc wymienionych metali podano ponizej Przyklad I. Osrodek zawiesiny skladajacy sie z roztworu izotonicznego do którego dodano srodka konserwujacego oraz jednego z poprze¬ dnio wymienionych metali posiada sklad naste¬ pujacy: 0,9% chlorku sodu 0,1 % nipaginy 0,004 % cynku (jako chlorku) Jezeli ten osrodek zawiesiny doprowadzi sie do wartosci pH=r6— 7 zwykle krysztalki insuliny beda w nim jeszcze trudniej rozpuszczalne niz w czystej wodzie, natomiast krysztalki o zwiek¬ szonej zawartosci cynku tworza sie przez ich zawieszenie. Jesli krysztalki zawierajace pier¬ wotnie okolo 0,4% cynku doda sie w takiej ilosci, ze osrodek zawiesiny zawiera 40 miedzynarodo¬ wych jednostek (1 ml), krysztalki bedace w sta¬ nie zawiesiny zawieraja okolo 1,7% cynku. .Przy uzyciu krysztalków insuliny znacznie wie¬ kszych niz 10 u, korzystnie jest dodac do osrod¬ ka stabilizatora, który podnosi lepkosc osrodka zawiesiny do takiego stopnia, ze krysztalki utrzymywane sa w stanie zawiesiny w ciagu od¬ powiedniego okresu czasu po wstrzasnieciu am¬ pulki Jako stabilizatora zawiesiny mozna uzyc, np. wysokoczasteczkowych polisacharydów. Mozna takze uzywac innych utrwalaczy, które w da¬ nych warunkach sa nieczynne w stosunku do krysztalków insuliny i innych skladników osrod¬ ka zawiesiny.Przyklad II. Do wodnego roztworu substancji izotonicznej dodano srodka konserwujacego, jed¬ nego z wymienionych metali i stabilizatora za¬ wiesiny. Sklad byl nastepujacy: 0,9 % chlorku sodu 0,2 % trójkrezolu 0,005 % niklu (jako chlorku) 5 % dekstranu zdepolimeryzowanego.Wartosc pH doprowadzono za pomoca lugu so¬ dowego do 6 — 7. Krysztalki insuliny nie zawie¬ rajace niklu bedac zawieszone w tym roztworze w takiej ilosci, aby osrodek zawiesiny zawieral 40 jednostek miedzynarodowych/1 ml, zawie¬ raja nikiel.Wspomniano poprzednio, ze osrodek wodnej zawiesiny moze zawierac substancje buforowa lub mieszanine takich substancji, czesciowo w celu uregulowania i utrzymania pH osrodka, czesciowo w celu spowodowania szybkiego dzia¬ lania preparatu in vivo. Jako przyklady sub¬ stancji buforowych mozna wymienic octany, bo¬ rany, cytryniany:, dwuetylobarbiturany, fosfora¬ ny, jablezaay lub ich mieszaniny. Z wymienio¬ nych substancji buforowych fosforany i cytrynia¬ ny mozna korzystnie uzywac do spowodowania szybkiego dzialania preparatów.. Przyklad III. Osrodek zawiesiny skladajacy sie z wodnego roztworu substancji izotonicznej do którego dodano srodka konserwujacego, jed¬ nego z wymienionych metali oraz substancji bu¬ forowej posiada nastepujacy sklad: 0,8 % chlorku sodu 0,1 % nipaginy 0,008 % cynku (jako chlorku) 1/120 molowego roztworu octanu sodu Wartosc pH doprowadzono przy uzyciu CHI do okolo 5.Zwykle krysztalki insuliny wykazuja w tym osrodku zawiesiny mala rozpuszczalnosc podobnie jak w osrodku zawiesiny wedlug przykladu T.Jezeli krysztalki insuliny zawierajace okolo 0,4 % cynku znajduja sie w osrodku w postaci zawie¬ siny w takiej ilosci aby zawiesina zawierala 10 miedzynarodowych jednostek/l ml i jezeli pH osrodka zawiesiny doprowadzi sie do wartosci 7, np. przy uzyciu NaOH, zawieszone krysztalki za¬ wieraja okolo 2,2 % cynku.Przyklad IV. Osrodek wodnej zawiesiny posia¬ dajacy taka sama kwasowosc jak ciecz tkanko¬ wa ciala ludzkiego oraz izotpniczny z krwia po¬ siada nastepujacy sklad: 1,3 % czesci objetosciowych gliceryny 0,1 % nipaginy 0,002 % cynku 1/120 molowego roztworu kwasu dwuetylo- barbiturowego Wartosc pH doprowadzono, przy uzyciu NaOH do okolo 7,2. Mniej niz 2 jednostki miedzynaro¬ dowe insuliny/l ml przechodza w tym osrodku zawiesiny do roztworu. Jezeli w osrodku znaj¬ duja sie krysztalki insuliny zawierajace okolo 0,4 % cynku w stanie zawiesiny w takiej ilosci aby osrodek zawieral 40 jednostek miedzynaro¬ dowych/l ml, krysztalki zawieraja okolo 1,1 % cynku.Przyklad V. Osrodek wodnej zawiesiny o sla¬ bo zasadowym odczynie posiada nastepujacy sklad: 1,3 % czesci objetosciowych gliceryny . 0,1 % nipaginy 0,016 % cynku (jako chlorku) 1/120 molowego roztworu kwasu borowego — 5 —Wartosc pH doprowadzono przy uzyciu NaOH do Okolo 8.Takze w tym osrodku zawiesiny do roztworu przechodzi mniej niz 2 jednostki miedzynarodo¬ wa insuliny/l mL Jezeli w osrodku znajduja sie w stanie zawiesiny krysztalki insuliny zawie¬ rajace okolo 0,4 % cynku w takiej ilosci aby o- srodek ten zawieral 40 miedzynarodowych jed¬ nostek/1 ml i jezeli doprowadzi sie go do war¬ tosci pH =.-: 7, np. przy uzyciu-ffCI, krysztalki in¬ suliny zawieraja okolo 2,5 % cynku.Przyklad VI. Przygotowuje sie wodny osrodek zawiesiny zawierajacy 0,8 % chlorku sodu 0,1 % nipaginy 0,001 % cynku (jako chlorku) 1/120 molowego roztworu octanu sodu i doprowadza sie pH do wartosci 5 przy uzyciu HCI.Jezeli w osrodku znajduja sie w postaci za¬ wiesiny krysztalki insuliny o zawartosci cynku okolo 0,4 % w takiej ilosci aby osrodek ten za¬ wieral 40 jednostek miedzynarodowych/l ml, za¬ wieszone krysztalki zawieraja okolo 0,8 % cyn¬ ku, przy zalozeniu, ze wartosc pH osrodka za¬ wiesiny doprowadzono przy uzyciu NaOH do 7.Przyklad VII. Przygotowano roztwór wodny zawierajacy 0,8 % chlorku sodu 0,1 % nipaginy 0,008 % niklu (jako chlorku) 1/120 molowego roztworu fosforanu sodu i doprowadzono go przy uzyciu HCI do wartosci pH = 7.Jezeli w roztworze znajduja sie w postaci za¬ wiesiny krysztalki insuliny o zawartosci niklu okolo 0,3 % w takiej ilosci aby zawiesina zawie¬ rala 40 miedzynarodowych jednostek/l ml, krysz¬ talki te wykazuja zwiekszona zawartosc niklu.Przyklad VIII. Przygotowano roztwór wodny zawierajacy 1,3 % czesci objetosciowych gliceryny 0,2 % trójkrezolu 0,014 % kadmu (jako chlorku) 1/120 molowego roztworu octanu sodu i doprowadzono roztwór do wartosci pH — 5 przy uzyciu tiCl.Jezeli znajdujace sie w postaci zawiesiny kry¬ sztalki insuliny o zawartosci cynku okolo 0,4% znajduja; sie w osrodku wn takiej ilosci aby za¬ wiesina zawierala 40 jednostek miedzynarodo¬ wych/l ml, krysztalki te wykazuja zawartosc okolo 3 % Cd, przyjawszyr ze wartosc pH zawie¬ siny doprowadzono przy uzyciu NaOIf do 7.-.Przyklad IX. Przygotowano roztwór wodny zawierajacy 0,8 % chlorku sodu 0,1 % nipaginy 0,006% miedzi (jako chlorku) 1/120 molowego roztworu octanu sodu i doprowadzono wartosc pH dó 6 przy' uzyciu HCI. Jezeli krysztalki insuliny o zawartosci cyn¬ ku okolo 0,4% znajduja sie w stanie zawiesiny w osrodku w takiej ilosci aby zawartycli bylo 40 jednostek miedzynarodowych/l ml osrodka zawiesiny, znajdujace sie w stanie zawiesiny krysztalki zawieraja miedz.Osrodek zawiesiny krysztalków insuliny w. wy¬ zej wymienionych przykladach posiada talu sklad, ze krysztalki sa praktycznie nierozpusz¬ czalne w osrodku. Preparaty insulinowe otrzy¬ mane tym sposobem odznaczaja sie przede wszystkim przedluzonym dzialaniem. Mozna jed¬ nak jak uprzednio wspomniano wytwarzac pre¬ paraty o czesciowo przedluzonym i czesciowo szybkim dzialaniu.Przyklad X. Przygotowano roztwór zawiera¬ jacy 1,3 % czesci objetosciowych gliceryny 0,1 % nipaginy 0,008 % cynku (jako chlorku) 1/120 molowego roztworu octanu sodu i doprowadzono wartosc pH do 4 przy uzyciu HCI.Jezeli krysztalki insuliny o zawartosci cynku okolo 0,4 % znajduja sie w tym roztworze w sta¬ nie zawiesiny w ilosci 40 miedzynarodowych jed¬ nostek/l ml, Vs ilosci krysztalków insuliny prze¬ chodzi do roztworu, w wyniku czego osrodek za¬ wiesiny zawiera 12 — 14 miedzynarodowych jed¬ nostek rozpuszczalnej insuliny/l ml.Przy podskórnym lub domiesniowym wstrzy¬ kiwaniu otrzymanej zawiesiny, uzyskuje sie dzialanie czesciowo szybkie dzieki obecnosci roz¬ puszczonej insuliny, czesciowo przedluzone dzie¬ ki zawartosci krysztalków insuliny bedacych w stanie zawiesiny.Przyklad XI. Przygotowuje sie wodny roztwór" chlorowodoru zawierajacy1,3 % czesci objetosciowych gliceryny 0,1 % nipaginy 0,008 % cynku (jako chlorku) 1/120 molowego roztworu kwasu dwuetylo- barbiturowego 0,087 % insuliny (23 jednostki miedzynaro¬ dowe (1 mg) rozpuszczonej w HCl i przy uzyciu NaOH doprowadza sie wartosc pH roztworu do okolo 7, przy której rozpuszczalna insulina wytraca sie ilosciowo jako bezpostacio¬ wy osad (20 jednostek mie^zynarodowych/1 ml).Jezeli w powstalym osrodku znajduja sie kryr sztalki insuliny w stanie zawiesiny, osiaga sie przy wstrzykiwanu podskórnym lub domiesnio¬ wym jej dzialanie szybkie oraz przedluzone.W wyzej wymienionych przykladach dodawa¬ no metale w postaci chlorków. Nie ma jednak zadnych przeszkód w dodawaniu metali w po¬ staci innych nieorganicznych lub organicznych zwiazków jak siarczany, azotany, octany, cytry¬ niany, wodorotlenki, tlenki lub zwiazki zlozone, lub tez w postaci czystego metalu pod warunkiem, ze uzyty metal lub jego zwiazek bedzie znajdo¬ wal sie w takim stanie w warunkach panuja¬ cych w osrodku aby tworzace sie krysztalki in¬ suliny mogly go wiazac.Nalezy dalej zwrócic uwage, ze zmiany pH osrodka po wprowadzeniu krysztalków insuliny w stan zawiesiny, wspomniane w niektórych przykladach, nalezy traktowac jedynie jako czynnosc dodatkowa.Osrodek zawiesiny jest gotowy do uzycia przy takiej wartosci pH do jakiej zostal doprowadzo¬ ny w czasie wytwarzania.W wymienionych przykladach krysztalki insu¬ liny wytwarza sie oddzielnie z zastosowaniem an- tyseptycznej krystalizacji, nastepnie z zachowa¬ niem antyseptycznych warunków dodaje sie. krysztalki do gotowego jalowego osrodka wod¬ nej zawiesiny.Sposobem wedlug wynalazku mozna krystali¬ zowac insuline takze w gotowym osrodku zawie¬ siny w sposób opisany w nizej podanych przy¬ kladach.Przyklad XII. 174 mg insuliny rozpuszcza sie w 20 ml 0,01 n kwasu solnego i dodaje sie w ni¬ zej podanej kolejnosci 20 ml 4 % roztworu chlorku sodu 10 ml 1/12 molowego roztworu octanu sodu 50 ml roztworu zawierajacego 0,004% cynku 0,2 % nipaginy Nastepnie obniza sie wartosc pH do okolo 5 kwasem solnym i wytworzona zawiesine umiesz¬ cza sie w ampulce. Jezeli pozos.tawi sie zawie¬ sine w spokoju, wytracona insulina przechodzi w krystaliczna.Sposobem wedlug wynalazku jako osrodka za¬ wiesiny mozna uzywac cieczy macierzystej z krystalizacji insuliny, przy czym do cieczy ma¬ cierzystej dodaje sie wszelkich brakujacych sub¬ stancji jak substancji izotonicznych, cynku lub podobnych metali, substancji stabilizujacych oraz substancji regulujacych wartosc pH.Przyklad XIII. 174 mg krystalicznej insuliny rozpuszcza sie w 20 ml 0,01 n HCl i do roztworu dodaje sie 20 ml 4% roztworu chlorku sodu oraz 10 ml 1/12 molowego roztworu octanu sodu.Nastepnie doprowadza sie wartosc pH roztworu do okolo 5,5. Po ukonczeniu krystalizacji dodaje sie 50 ml roztworu zwiazku cynku zawierajacego 0,016 % cynku i 0,2 % nipaginy. W razie potrze¬ by reguluje sie wartosc pH otrzymanej zawie¬ siny. Zgodnie z wynalazkiem mozna dodac me¬ talu przed lub po przeprowadzeniu krysztalków insuliny w stan zawiesiny.Mozna wiec wyjsc z aseptycznie wytwarzanych krysztalków insuliny, zawieszonych w wodnym osrodku, do których dodaje sie pózniej odpo¬ wiedniego metalu* Przyklad XIV. 174 mg krysztalków insuliny zawiesza sie w 50 ml osrodka wodnej zawiesiny zawierajacego 1,6 % chlorku sodu 0,2 % nipaginy 1/60 molowego roztworu octanu sodu i doprowadza sie wartosc pH do 5,5 przez do¬ danie HCl. Do tej zawiesiny dodaje sie 50 ml zwiazku cynku w roztworze o takiej samej kwa¬ sowosci, zawierajacego 0,fll6 % cynku. Mozna u- zyc roztworu cynku o innej kwasowosci niz osro¬ dek zawiesiny, w tym przypadku uregulowanie wartosci pH utworzonej zawiesiny mozna prze¬ prowadzic pózniej.Przy zmianie pH osrodka zawiesiny do 7, kry¬ sztalki insuliny bedace w stanie zawiesiny za¬ wieraja okolo 2,2 % cynku, przy zalozeniu, ze krysztalki zawieraly uprzednio okolo 0,4 % cynku.Podobnie mozna calkowicie lub czesciowo za¬ pewnic zawartosc metalu w zawiesinie przez; uzywanie krysztalków insuliny wykazujacych, zwiekszona zawartosc metalu.Przyklad XV. Przygotowuje sie roztwór za¬ wierajacy — 7 —1,3 % czesci objetosciowych gliceryny 0,1 % nipaginy 1/120 molowego roztworu octanu sodu i doprowadza sie wartosc pH do 5 przy uzyciu HCl.Jezeli 1,7 g krysztalków insuliny o zawartosci cynku okolo 2 % znajduje sie w stanie zawiesiny w 1 litrze tego wodnego osrodka, krysztalki po¬ zostaja nierozpuszczone, lecz czesc cynku prze¬ chodzi do roztworu w osrodku, w wyniku czego zawiera cynk.Podane powyzej przyklady nalezy traktowac jedynie jako wyjasniajace istote wynalazku, któ¬ rego zasadnicza cecha jest wytworzenie zawie¬ siny krysztalków insuliny, wykazujacych zawar¬ tosc omawianych metali wieksza niz zawartosc w dotychczas znanych preparatach.Z tego wzgledu zakres wynalazku obejmuje wprowadzanie w stan zawiesiny krysztalków in¬ suliny o zwiekszonej zawartosci jednego z oma¬ wianych metali w osrodku odpowiednim do wstrzykiwan i nie wykazujacym zawartosci omawianych metali po zawieszeniu w nim kry¬ sztalków. Jako przyklad takich osrodków mozna wymienic wode destylowana i oleje takie jak olej oliwkowy, sezamowy i arachidowy. Nalezy zauwazyc, ze preparaty insulinowe wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, jesli to jest wy¬ magane, mozna dostarczac na rynek w dwóch ampulkach, z których jedna zawiera osrodek za¬ wiesiny a druga krysztalki insuliny o zwiekszo¬ nej zawartosci wspomnianych metali. PL