PL249138B1 - Sposób otrzymywania biomasy oraz związków o wartości dodanej - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania biomasy oraz związków o wartości dodanej z wykorzystaniem mikroorganizmów wykorzystujących mannitol jako źródło węgla, polegający na tym, że sterylne standardowe podłoże inokulacyjne zaszczepia się czystą kulturą zmodyfikowanych drożdży Yarrowia lipolityca o genotypie ΔEYD1, przy ciągłym wstrząsaniu bądź mieszaniu, następnie uzyskane inokulum wprowadza się do naczynia hodowlanego z podłożem zawierającym w składzie mannitol w stężeniu od 5 do 200 g/L.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania biomasy oraz związków o wartości dodanej . Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle chemicznym, petrochemicznym oraz spożywczym.

Obecnie znane są metody otrzymywania biomasy mikroorganizmów z glukozy, inuliny, glicerolu czy innych surowców odpadowych.

Jednym ze sposobów produkcji biomasy i kwasów organicznych (cytrynowego i bursztynowego) jest wykorzystanie drożdży Yarrowia lipolytica. Produkcję przy udziale tego szczepu prowadzi się w bioreaktorze o pojemności roboczej 2 L, wstrząsarce w 500 ml kolbach w podłożu zwierającym 100 g/l glicerolu, jako źródło węgla. Po 192 godzinach hodowli bioreaktorowej uzyskuje się 8.15 ± 0.23 g/L biomasy drożdży oraz 3.50 ± 0.04 g/L kwasu cytrynowego oraz 20.99 ± 0.16 g/L kwasu bursztynowego (Mitrea i in. Environmental Technology & Innovation, Volume 28, November 2022, 102943).

Znany jest też sposób na produkcję biomasy drożdży Komagataella phaffii (P. pastoris) z surowców odpadowych zawierających metanol. Hodowle prowadzi się w 500 ml kolbach zwierających 50 ml podłoża hodowlanego, z ciągłym wytrząsaniem przy 200 rpm w 28C. Po 72 godzinach hodowli uzyskuje się 6.2 g/l biomasy drożdży (Shirvani i in. Front. Bioeng. Biotechnol. 2023. 11:1179269).

Innym sposobem produkcji biomasy drożdży Yarrowia lipolytica jest wykorzystanie inuliny. W tym celu do drożdży wprowadzono gen z Kluyveromyces marxianus CBS6432 (INU1 gen; nr GenBank: X57202.1) umożliwiając utylizację tego źródła węgla. Podczas procesu przeprowadzonym w bioreaktorze ze 100 g/l inuliny wyprodukowano od 9 do 16,5 g/L biomasy drożdży oraz 48,7 do 75,5 g/L kwasu cytrynowego (Rakicka i in. 2019 BMC Biotechnology volume 19, Article number: 11).

Wykazano również, że biomasa makroalg może być substratem dla mikroorganizmów do produkcji cennych produktów. Wykazano, że możliwa jest modyfikacja gen etyczna bakterii E. coli, w celu produkcji etanolu z substratu odpadowego biomasy makroalg (Wargacki, A.J., et al., An Engineered Microbial Platform for Direct Biofuel Production from Brown Macroalgae. Science, 2012. 335(6066): p. 308-313).

Jest też znany sposób wykorzystania mannitolu jako substratu przez drożdże S. cerevisae. Drożdże poddane modyfikacji genetycznej przez nadekspresję genów kodujących transportery mannitolu, były zdolne do wzrostu na tym związku, jako jedynym źródle węgla. (Jordan P, Choe JY, Boles E, Oreb M Hxt13, Hxt15, Hxt16 and Hxt17 from Saccharomyces cerevisiae represent a novel type of polyol transporters. Sci Rep. 2016 Mar 21; 6:23502).

Znany jest sposób wykorzystania biomasy alg morskich jako źródła węgla (mannitolu oraz glukozy) do hodowli biomasy oraz lipidów przez drożdże Yarrowia lipolytica na podłożu powstałym po hydrolizie alg brunatnych oraz z dodatkiem azotowej bazy drożdżowej i siarczanem amonu (Dobrowolski A, Nawijn W, Mirończuk AM, Front Bioeng Biotechnol. 2022 Aug 17; 10:944228). Szczepy A101 oraz AJD DGA1/DGA2, wyprodukowały odpowiednio, 7,7 g/l oraz 8,9 g/l biomasy. Poziom produkcji lipidów dla obu szczepów był poniżej 10% zawartości suchej biomasy drożdży.

Znany jest również sposób wykorzystania nadekspresji genu EYD1 (YALI0F01650g) w biotechnologii do biokonwersji erytrytolu do erytrulozy przez drożdże Yarrowia lipolytica w podłożu pełnym, z użyciem glicerolu zamiast glukozy (w stężeniu 10, 20 lub 30 g/L) oraz 30 g/L erytrytolu, lub podłożu minimalnym, suplementowanym glicerolem (10, 20, 30 g/L) i erytrytolem (30 g/L) (Identification and characterization of EYD1, encoding an erythritol dehydrogenase in Yarrowia lipolytica and its application to bioconvert erythritol into erythrulose. Carly i in. Bioresour Technol. 2018 Jan; 247:963-969.

Nieznany jest natomiast sposób produkcji biomasy oraz związków o wartości dodanej z mannitolu oraz surowców zawierających mannitol, przez drożdże Yarrowia lipolytica, w których usunięto (znokautowano) gen EYD1 (YALI0F01650g). Drożdże Y. lipolytica o genotypie AEYD1 mają usunięty gen YALI0F01650g odpowiedzialny za metabolizm erytrytolu w tych mikroorganizmach (Identification and characterization of EYD1, encoding an erythritol dehydrogenase in Yarrowia lipolytica and its application to bioconvert erythritol into erythrulose. Carly F, Steels S, Telek S, Vandermies M, Nicaud JM, Fickers P. Bioresour Technol. 2018 Jan; 247:963-969. doi: 10.1016/j.biortech.2017.09.168.). Drożdże AEYD1 mogą produkować wysokie miana biomasy oraz lipidów z mannitolu, jako jedynego źródła węgla. Jednym z surowców zawierających mannitol jest biomasa makroalg. Mannitol to alkohol cukrowy (poliol), sześciowęglowy związek służący jako materiał zapasowy mikro i makroorganizmów. Stężenie mannitolu w biomasie makroalg, oscyluje na poziomie 30% w zależności od gatunku oraz pory roku. Drożdże AEYD1 mają zdolność wzrostu na hydrolizatach oraz płukankach uzyskanych z biomasy alg morskich, takich jak Fucus vesiculosus czy Saccharina latissima, gdzie stężenie mannitolu w roztworze po płukaniu makroalg przekracza 5g/L.

Istotą wynalazku jest sposób otrzymywania biomasy drożdży Yarrowia lipolytica AEYD1 oraz związków o wartości dodanej z wykorzystaniem mikroorganizmów wykorzystujących mannitol jako źródło węgla, charakteryzujący się tym, że sterylne standardowe podłoże inokulacyjne zaszczepia się czystą kulturą zmodyfikowanych drożdży Yarrowia lipolytica o genotypie AEYD1, przy ciągłym wstrząsaniu bądź mieszaniu, następnie uzyskane inokulum wprowadza się do naczynia hodowlanego z podłożem zawierającym w składzie mannitol w stężeniu od 20 do 50 g/L i uzyskuje się biomasę zawierającą lipidy takie jak kwas palmitynowowy, kwas oleopalmitynowy, kwas stearynowy, kwas oleinowy, kwas linoleinowy.

Korzystnie jest, głównym źródłem węgla w standardowym podłożu inokulacyjnym jest glukoza i/lub glicerol.

Korzystnie także jest, gdy ustala się pH podłoża inokulacyjnego na poziomie od 5 do 6.

Korzystnie jest, gdy całość podłoża hodowlanego sterylizuje się.

Korzystne jest, gdy temperatura hodowli wynosi co najmniej 26°C.

Korzystne jest gdy podłoże procesowe zawiera drożdżową bazę azotową (YNB) bez aminokwasów i siarczanu amonu 1,7 g/l, wyciąg drożdżowy min. 0,25 g/l oraz siarczan amonu 0,1-3,0 g/L i ustalone pH w zakresie pH 3-10.

Korzystnie również jest, gdy mannitol pochodzi z procesu wypłukiwania z makroalg morskich.

Korzystnie jest także, gdy startowa gęstość optyczna hodowli wynosi co najmniej 0,5.

Korzystne również jest, gdy stosunek C/N wynosi od 40 do 100.

Korzystnie jest również, gdy po zakończeniu procesu, oddziela się biomasę drożdży od cieczy poprzez filtrację, płyn pofermentacyjny poddaje się dekoloryzacji na węglu aktywnym, a jony usuwa na wymieniaczach jonowych. Biomasę suszy się i mrozi, a następnie w procesie liofilizacji przygotowuje do procesu ekstrakcji lipidów.

Zaletą sposobu produkcji według wynalazku jest możliwość otrzymywania dużych ilości biomasy oraz lipidów mikrobiologicznych (SCO) z odnawialnych, tanich surowców roślinnych jakim jest biomasa makroalg morskich, które nie konkurują o tereny użytkowe z roślinami rolnymi. Zaletą jest szybkość procesu, umożliwiająca otrzymanie wysokich mian produktywności tworzenia biomasy drożdży, zgromadzonych w niej lipidów oraz uwalnianych do podłoża hodowlanego związków o wartości dodanej.

Zaletą jest to, że wydajność produkcji biomasy osiąga wartość od 0,45 do 0,55 g/g a końcowe stężenie lipidów w suchej biomasie wynosi od 7 do 32%. W skład oznaczonych kwasów tłuszczowych wchodzą: kwas palmitynowy, kwas oleopalmitynowy, kwas stearynowy, kwas oleinowy, kwas linoleinowy.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest na przykładach:

Przykład 1. Podłoże inokulacyjne o objętości 10 ml zawierające: glukoza - 20 g/l; ekstrakt drożdżowy - 10 g/l; bakto-pepton - 10 g/l; woda destylowana do 1 litra, zaszczepia się szczepem Yarrowia lipolytic a AEYD1 następnie hoduje się drożdże przez 48 godzin w kolbie stożkowej o objętości 100 ml, w temperaturze 27-30°C na wstrząsarce rotacyjnej przy 200 obr/min. Hodowla ta stanowi inokulum właściwej hodowli produkcyjnej, którą przeprowadza się w płytce głębokodołkowej w objętości 3,5 ml, w podłożu o składzie: czysty mannitol 20 g/l, wyciąg drożdżowy 5 g/l i siarczan amonu 0,5 g/l, woda destylowana do 1L, OD początkowe 1.0, początkowe pH 5,3. W trakcie procesu utrzymuje się stałą temperaturę 28°C, z szybkością wytrząsania 200 obr/min. Po 72 godzinach procesu uzyskuje się od 3,6 do 4,7 g/l suchej biomasy drożdży. Określa się także skład kwasów tłuszczowych w suchej biomasie. Analiza profilu kwasów tłuszczowych odbywała się z wykorzystaniem metody Soxhleta, metylowane estry kwasów tłuszczowych rozdzielane były z użyciem metody chromatografii gazowej, przy zastosowaniu wewnętrznego standardu kwasu heptadekanowego. Otrzymane wartości dla kwasów tłuszczowych, zawartych w biomasie drożdży po hodowli: kwas palmitynowy (0,11 g/l), kwas oleopalmitynowy (0,1 g/l), kwas stearynowy (0,06 g/l), kwas oleinowy (0,52 g/l), kwas linoleinowy (0,12 g/l).

Przykład 2. Przygotowuje się inokulum i prowadzi proces jak w przykładzie 1, warunki hodowli są takie same jak w przykładzie 1, z tym, że skład podłoża produkcyjnego to: płyn po płukaniu makroalg zawierający 20 g/L mannitolu, wyciąg drożdżowy 5 g/l i siarczan amonu 0,5 g/l, woda destylowana do 1 I, OD początkowe 1.0, początkowe pH 5,6. W trakcie procesu utrzymuje się stałą temperaturę 28°C z szybkością wytrząsania 200 obr/min. Po 72 godzinach procesu uzyskuje się od 8 do 10 g/l suchej biomasy drożdży. Analiza profilu kwasów tłuszczowych odbywała się jak w przykładzie 1. Zawartość wyekstrahowanych lipidów wynosi 10,18% suchej biomasy drożdży, co stanowi: kwas palmitynowy (0,11 g/l), kwas oleopalmitynowy (0,1 g/l), kwas stearynowy (0,066 g/l), kwas oleinowy (0,51 g/l), kwas linoleinowy (0,12 g/l).

Przykład 3. Przygotowuje się inokulum i prowadzi proces jak w przykładzie 1, z tym że, warunki do prowadzenia hodowli: kolba stożkowa o pojemności 300 ml, 50 ml podłoża hodowlanego, początkowe pH 5,45. Początkowe od 1.0. Proces prowadzi się w podłożu o składzie: drożdżowa baza azotowa (YNB) bez aminokwasów i siarczanu amonu 1,7 g/l, czysty mannitol 50 g/l, wyciąg drożdżowy 0,5 g/L, siarczan amonu 1,55 g/l, stosunek C/N wynosi 60. Po 72 godzinach hodowli otrzymuje się na 1 litr pożywki od 11,6 do 12,3 g/l suchej biomasy drożdży.

Analiza profilu kwasów tłuszczowych odbywała się jak w przykładzie 1. Zawartość wyekstrahowanych lipidów wynosi 11,93% suchej biomasy drożdży. W skład oznaczonych lipidów wewnątrzkomórkowych wchodziły: kwas palmitynowy (0,1 g/l), kwas oleopalmitynowy (0,1 g/l), kwas stearynowy (0,055 g/l), kwas oleinowy (0,94 g/l), kwas linoleinowy (0,21 g/l).

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania biomasy drożdży Yarrowia lipolityca AEYD1 oraz związków o wartości dodanej z wykorzystaniem mikroorganizmów wykorzystujących mannitol jako źródło węgla, znamienny tym, że sterylne standardowe podłoże inokulacyjne zaszczepia się czystą kulturą zmodyfikowanych drożdży Yarrowia lipolytica o genotypie AEYD1, przy ciągłym wstrząsaniu bądź mieszaniu, następnie uzyskane inokulum wprowadza się do naczynia hodowlanego z podłożem zawierającym w składzie mannitol w stężeniu od 20 do 50 g/L i uzyskuje się biomasę o zawierającą lipidy takie jak kwas palmitynowowy, kwas oleopalmitynowy, kwas stearynowy, kwas oleinowy, kwas linoleinowy.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że głównym źródłem węgla w standardowym podłożu inokulacyjnym jest glukoza i/lub glicerol.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ustala się pH podłoża inokulacyjnego na poziomie od 5 do 6.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że całość podłoża hodowlanego sterylizuje się.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wszystkie hodowle prowadzi się w temperaturze co najmniej 26°C.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podłoże procesowe zawiera drożdżową bazę azotową (YNB) bez aminokwasów i siarczanu amonu 1,7 g/l, wyciąg drożdżowy min. 0,25 g/l oraz siarczan amonu 0,1-3,0 g/L i ustalone pH w zakresie pH 3-10.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do produkcji biomasy wykorzystuje się płukanki zawierające mannitol, uzyskane w wyniku wypłukiwania makroalg morskich.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że startowa gęstość optyczna hodowli wynosi co najmniej 0,5.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek C/N wynosi od 40 do 100.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po zakończeniu procesu, oddziela się biomasę drożdży od cieczy poprzez filtrację, płyn pofermentacyjny poddaje się dekoloryzacji na węglu aktywnym, a jony usuwa na wymieniaczach jonowych. Biomasę suszy się i mrozi, a następnie w procesie liofilizacji przygotowuje do procesu ekstrakcji lipidów.