PL242142B1

PL242142B1 - Promotor aktywowany przez białko NAI1 oraz zawierający go układ ekspresyjny

Info

Publication number: PL242142B1
Application number: PL436296A
Authority: PL
Inventors: Shayan Sarkar; Kenji Yamada; Natalia Stefanik; Ikuko Hara-Nishimura; Tadashi Kunieda
Original assignee: Uniwersytet Jagielloński
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2023-01-23
Also published as: PL436296A1

Abstract

W niniejszym zgłoszeniu opisano promotor aktywowany przez białko NAI1 oraz zawierający go układ ekspresyjny, który może znaleźć zastosowanie w biotechnologii roślin.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest promotor aktywowany przez białko NAI1 oraz zawierający go układ ekspresyjny, które mogą znaleźć zastosowanie w biotechnologii roślin.

Rośliny uprawne były selekcjonowane ze względu na wielkość otrzymywanych plonów oraz walory smakowe. Z tego powodu wykazują niższą odporność na choroby oraz na szkodniki niż dzikie rośliny. Kontrola szkodników roślin jest kluczowa w utrzymaniu wystarczającej produkcji żywności. Dlatego niezbędne jest ciągłe poszerzenie dostępnych metod ochrony roślin.

Rośliny z rodziny Kapustowatych (Brassicaceae), takie jak Arabidopsis thaliana, wytwarzają organelle zwane ciałkami ER, pochodzące z retikulum endoplazmatycznego (ER) [1-3]. Ciałka ER, wyspecjalizowane są w akumulacji β-glukozydazy (BGLU), które posiadają sygnał retencji ER [4]. W Arabidopsis korzenie i komórki skórki siewek konstytutywnie gromadzą dużą liczbę ciał ER [2]. Olbrzymie komórki skórki liści również gromadzą konstytutywnie ciałka ER [5, 6], ale zranienie lub obecność hormonu zranienia - kwasu jasmonowego, dodatkowo indukuje akumulację ciał ER w całych liściach [7, 8]. Niedawno wykazano, że ciałka ER w siewkach i liściach są odpowiedzialne za obronę chemiczną przed zwierzętami roślinożernymi we współpracy ze glukozydami specyficznymi dla Brassicaceae, zwanymi glukozynolanami [6, 9]. W ciałach ER, BGLU hydrolizują glukozynolany, tworząc silną substancję odstraszającą szkodniki, system obrony zwany „bomba oleju musztardowego” [10-12].

Komórki mirozynazowe i ciała ER są rozmieszczone tylko w niektórych gatunkach Brassicales, podobnie jak glukozynolany, co sugeruje, że ewoluowały jako system obronny oparty na bombie gorczycowej . W uprawach rolniczych wykorzystywanych jest wiele roślin z rodziny kapustowatych (Brassicaceae). Zrozumienie działania systemów obronnych na poziomie molekularnym przyczyni się do poszerzenia wiedzy na temat systemów obronnych u roślin.

Czynnik trankskrypcyjny NAI1 z Arabidopsis thaliana zaangażowany jest w formowanie ciałek ER dla zapewnienia ochrony przed zwierzętami roślinożernymi. Jednak motyw rozpoznający DNA dla NAI1 pozostawał nieznany.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowych narządzi, które mogą być wykorzystywane w biotechnologii roślin.

Określony problem został rozwiązany w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest promotor aktywowany przez białko NAI1 oraz zawierający go układ ekspresyjny zdefiniowane w załączonym wniosku.

Wynalazcy określili motyw rozpoznawania DNA dla NAI1, co otwiera możliwość wykorzystania tego białka do indukcji określonych genów o unikalnych sekwencjach DNA. Przedmiotowy wynalazek może być bardzo przydatny dla przemysłu rolniczego, zwiększając „zestaw narzędzi” do produkcji roślin odpornych na szkodniki.

Określono aktywność wiązania DNA NAI1 in vitro i in vivo. Jak ustalono w wynalazku, białko NAI1 może wiązać się z fragmentem DNA o określonej sekwencji. Ponadto opracowano sztuczny system do indukowania genów przez NAI1 w liściach tytoniu.

Zastosowanie NAI1 pozwala na aktywację zestawu genów, które mają sekwencję wiążącą NAI1 w swoim promotorze. W roślinach z rodziny kapustowatych indukowane są geny związane z ciałkami ER, więc możemy użyć NAI1 do indukowania ciałka ER w celu wyjątkowego wzmocnienia systemu obronnego rośliny.

Można również wprowadzić sztuczne geny z sekwencją wiążącą NAI1, aby indukować te geny. Ze względu na niewielką liczbę systemów indukcji genów, unikalny system z wykorzystaniem NAI1 istotnie urozmaica ten zbiór.

Niniejszy opis został dodatkowo objaśniony na załączonych figurach.

Figura 1. Aktywność wiązania DNA przez białko NAI1. (A) Obraz żelu wybarwionego za pomocą Coomassie Brilliant Blue oczyszczonej tioredoksyny (TRX) i rekombinowanego białka fuzyjnego TRX-NAI1 (grot strzałki). (B) Diagramy ułożenia sekwencji G-box i E-box w promotorach NAI2 i BGLU23. Liczby wskazują pary zasad nukleotydów od kodonu początkowego (ATG). (C) EMSA wykazująca wiązanie NAI1 z sondą pNAI2 w sposób zależny od G-box. (D) EMSA NAI1 i sonda pNAI2 z różnymi konkurencyjnymi fragmentami DNA, zgodnie z oznaczeniem.

Figura 2. Lokalizacja NAI1 w komórkach roślinnych. Obraz z konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (GFP) i obraz w jasnym polu siedmiodniowych siewek roślin transgenicznych Arabidopsis (A) i liści N. benthamiana, które są infiltrowane przez Agrobacterium zawierającymi odpowiednie konstrukty (B). Słupki skali - 50 μm.

Figura 3. Model funkcji białka NAI1. Promotor NAI1 kieruje ekspresją NAI1 w siewkach i korzeniach Arabidopsis. Białka NAI1 wiążą się z kanonicznymi (G1) i niekanonicznymi (G2) sekwencjami G-box w promotorze NAI2, aby aktywować gen NAI2.

Figura 4. Aktywność czynnika transkrypcyjnego NAI1. (A) Schematyczny model konstruktu DNA zastosowany w eksperymencie. (B) Obrazy barwienia GUS w liściach N. benthamiana. Agrobacterium zawierające konstrukt efektorowy jest współinfiltrowane z Agrobacterium zawierającym konstrukt reporterowy, po czym następuje barwienie GUS. Skala - 0,5 cm.

Przykład 1. Identyfikacja kluczowej sekwencji promotora NAI2.

W celu badania aktywności wiązania DNA NAI1 dokonano ekspresji białka NAI1 jako białka fuzyjnego tioredoksyna (TRX) -His-tag w Escherichia coli i oczyszczono je za pomocą chromatografii do Ni. Masa cząsteczkowa oczyszczonego białka była nieco wyższa niż oczekiwano w porównaniu z teoretyczną wartością przewidywaną dla rekombinowanego białka, która wynosiła około 65 kda (Fig. 1). Co więcej, odkryto, że NAI1 ma potencjał rozpoznawania kanonicznych i niekanonicznych sekwencji G-box w promotorze NAI2. Dlatego zbadano jego zdolność do wiązania się z kanonicznymi i niekanonicznymi G-boxami (G1 i G2) w promotorze NAI2 (Fig. 1). Wygenerowano biotynylowaną sondę DNA zawierającą G1 i G2 (sonda pNAI2, Fig. 1) i poddano ją elektroforetycznemu testowi przesunięcia ruchliwości (EMSA). Sekwencję pNAI2 przedstawiono jako Sekw. Nr. 1.

Kompleksy białko-DNA wykryto, gdy białka fuzyjne TRX-NAI1 inkubowano z sondą pNAI2 (Fig. 2). Nadmiar nieznakowanego pNAI2-G1/G2 był w stanie konkurować o aktywność wiązania DNA NAI1 (Ryc. 2). Możliwość niespecyficznego wiązania białka TRX została wyeliminowana, ponieważ nie zaobserwowano przesuniętych prążków, gdy białko TRX inkubowano z sondą (Fig. 2). Wyniki te wskazują na specyficzną interakcję między NAI1 z sondą pNAI2. Aby opracować wiązanie DNA NAI1 w sposób specyficzny dla sekwencji, oceniano aktywność wiązania białek fuzyjnych TRX-NAI1 z sondą pNAI2 w konkurencji z trzema zmutowanymi wersjami w sekwencji DNA sondy pNAI2: (i) mutacja kanoniczny G-box (pNAI2-mG1 / G2); (ii) mutacja niekanonicznego G-box (pNAI2-G1 / mG2) i (iii) mutacja obu G-box (pNAI2-mG1 / mG2). Co ciekawe, aktywność wiązania NAI1 z sondą pNAI2 była hamowana przez nadmiar nieznakowanego pNAI2-mG1 / G2 lub pNAI2-G1 / mG2 (Fig. 2A). Jednak pNAI2-mG1 / mG2 nie miał zdolności konkurencyjnej (Fig. 2A), co wskazuje, że obecność w obu sekwencjach G-box jest kluczowa dla wiązania NAI1 z sondą pNAI2.

Ponadto zweryfikowano zdolność wiązania NAI1 z motywami G1 i G2 w promotorze NAI2. NAI1 zlokalizowany w jądrze może aktywować promotor NAI2 jako czynnik transkrypcyjny poprzez swoje dwie sekwencje G-box (Fig. 3). Zbadano również za pomocą testu EMSA jego zdolność wiązania DNA w motywu podobnego do G-box (CACGTTT) w promotorze TSA1 i motywów E-box (CANNTG) w promotorach NAI2 i BGLU23. EMSA ujawniła, że białko NAI1 rozpoznaje sekwencje G-box (CACGTG) i G-box podobne (CACGTT) w promotorze NAI2, co sugeruje, że NAI1 jest bezpośrednim regulatorem genu NAI2. Jest to zgodne z faktem, że NAI1 reguluje ekspresję genu NAI2 u Arabidopsis . W przeciwieństwie do powyższej obserwacji, białko NAI1 nie związało się z sekwencją DNA promotora TSA1, który zawiera również motyw G-box podobny (CACGTTT).

Wynik potwierdza, że obecność motywu podobnego do G-box nie jest wystarczająca do wiązania NAI1, ale sekwencje flankujące obejmujące motywy podobne do G-box mogą wpływać na rozpoznawanie przez NAI1. Zatem element użyty jako promotor rozpoznawany przez białko NAI1 będzie zawierał sekwencję pNAI2.

Przykład 2. System ekspresji oparty na interakcji promotora NAI1/NAI2.

Aby potwierdzić, że NAI1 aktywuje promotor NAI2 u roślin, przeprowadzono test efektor-reporter (Fig. 4). Kiedy wprowadzono konstrukty: GFP-NAI1 sterowany promotorem CaMV35S (p35S: GFPNAI1, patrz Id. Sekw. Nr 2) i reporter β-glukuronidazy sterowany przez promotor NAI2 (pNAI2: GUS, patrz Id. Sekw. Nr 3) w N. benthamiana przez agroinfiltrację, wykryto ciemnoniebieski sygnał barwienia GUS (Fig. 4B).

Sygnał GUS nie został wykryty, kiedy wprowadzano p35S: GFP zamiast p35S: GFP-NAI1. Wyniki wykazały, że białko GFP-NAI1 może aktywować promotor NAI2 w celu indukowania ekspresji GUS. W przeciwieństwie do tego, sygnał GUS jest słabo wykrywany konstruktem mającym mutację w dwóch elementach G-box w promotorze NAI2 (mut-pNAI2: GUS), co wskazuje, że GFP-NAI1 nie może aktywować zmutowanego promotoraNAI2 (Fig. 4B). Wynik dowodzi, że NAI1 aktywuje promotor NAI2 poprzez interakcję z elementami G-box w komórkach roślinnych. Gdy użyto konstruktu GFP-NAI1 z promotorem

NAI1 (pNAI1: GFP-NAI1), nie zaobserwowano ekspresji genu GUS (Fig. 4B). Wyniki potwierdzają również, że promotor NAI1 nie jest wystarczający do indukowania NAI1-GFP w liściach N. benthamiana. W opisywanych przykładach zostały wykorzystane następujące elementy:

Sekwencja kodująca cDNA białka NAI1 przedstawiona jako Sekw. Nr. 4.

Kodowane przez nią białko NAI1, którego sekwencja aminokwasowa została przedstawiona jako Sekw. Nr. 5.

Sekwencja kodująca cDNA białka fuzyjnego GFP-NAI1 przedstawiona jako Sekw. Nr. 6.

Kodowane przez nią fuzyjne GFP-NAI1, którego sekwencja aminokwasowa została przedstawiona jako Sekw. Nr. 7.

Sekwencja promotora NAI2 przedstawiona jako Sekw. Nr. 8.

Ponadto wykorzystano następujące metody:

Uzyskanie białka NAI1

Otrzymano plazmidowy DNA niosący cDNA NAI1 w wektorze wejściowym Gateway pDONR201 (klon nr REGIo476B122D) z Source BioScience (Nottingham, UK). Region kodujący NAI1 w pDONR201 przeniesiono do pET32a-GW. PET32a-GW pochodzi z pET32a (Novagen, Madison, Wisconsin, USA), który został zmodyfikowany przy użyciu Gateway Vector Conversion System (Invitrogen) [30]. W celu ekspresji rekombinowanego białka (TRX-NAI1-His-Tag) w bakteriach plazmid wprowadzono do kompetentnych komórek BL21 (DE3) pLysS Rosetta (Novagen). Ekspresję rekombinowanego białka indukowano przez hodowanie komórek w 150 ml pożywki LB zawierającej 0,4 mM izopropylo-e-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) przez 18 godzin w 18°C. W celu oczyszczenia białka komórki zebrano z hodowli indukcyjnej i ponownie zawieszono w buforze do lizy CelLytic B (Sigma). Komórki bakteryjne poddano lizie przez sonikację, następnie odwirowano, a supernatant zmieszano w równych proporcjach z buforem równoważącym (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol) przed nałożeniem do kolumny Ni-NTA (Qiagen). Po trzykrotnym przemyciu roztworem imidazolu o stężeniu w zakresie od 20-100 mM, białko TRX-NAI1-His-tag eluowano przy użyciu 500 mM imidazolu. Rozpuszczalnik białkowy zastąpiono PBS (10 mM fosforan sodu, pH 7,2 i 130 mM NaCl) przez dializę, a następnie zatężono za pomocą urządzenia Amicon Ultra Centrifugal (Thermo Fisher).

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej

Biotynylowaną dwuniciową sondę DNA pNAI2-G1 / G2 uzyskano poprzez zmieszanie 50-μm mieszaniny komplementarnych oligonukleotydów w 10 mm Tris-Cl, 50 mm NaCl i 1 mm EDTA (pH 8,0) przez ogrzewanie do 95°C przez 5 minut, a następnie powolne chłodzenie do temperatury pokojowej. Reakcje wiązania indukowano przez chłodzenie na lodzie przez 30 minut, a następnie rozdzielano przez 6% PAGE. Po elektroforezie produkty przeniesiono na dodatnio naładowaną nylonową membranę (Thermo Fisher). Oddziaływania DNA-białko wizualizowano tą samą metodą co Western Blot, z wyjątkiem tego, że błonę blokowano 3% odtłuszczonym mlekiem i sondowano awidyną sprzężoną z peroksydazą chrzanową (Pierce Avidin, Thermo Fisher). Testy EMSA przeprowadzono przy użyciu 25x, 50x i 100x nadmiaru nieznakowanych sond w reakcjach wiązania.

Analiza lokalizacji subkomórkowej NAI1

Do produkcji roślin transgenicznych wykorzystano szczep Columbia (Col-0) mutantów insercyjnych A. thaliana, które wytwarzają GFP-NAI1. Promotor, region kodujący i regiony z kodonem terminacyjnym genu NAI1 amplifikowano metodą PCR z DNA genomu Arabidopsis jako matrycę. Amplifikowane fragmenty DNA wprowadzono do wektora wejściowego Gateway. Następnie cały region przeniesiono do wektora pGWB501 w celu wytworzenia pGWB501 / ProNAI1: sGFP-NAI1: TerNAI1. Wektor wprowadzono następnie do szczepu Agrobacterium tumefaciens, a następnie transformowano do Arabidopsis.

Do wytworzenia konstruktu nadekspresji pGWB406-NAI1, który składał się z cDNA ORF NAI1 niosącego N-końcową fuzję z GFP, pod kontrolą promotora wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) 35S, zastosowano binarny wektor Gateway pGWB406 [31]. Powstały plazmid, pGWB406-NAI1, transformowano do szczepu A. tumefaciens GV3101 (pMP90RK) przez elektroporację. Za kontrolę służył pGWB406, który eksprymuje GFP pod kontrolą promotora CaMV 35S [31]. Bakterie hodowano w pożywce lizogennej (LB) zawierającej ryfampicynę, kanamycynę i spektynomycynę w 28°C przez 2 dni, zebrano i ponownie zawieszono w pożywce do infiltracji (10 mM MES, 10 mM MgCl2 i 150 μM acetosyringonu). Zawiesiny bakteryjne doprowadzono do OD600 = 1,0, inkubowano przez 4 godziny w 28°C, a następnie infiltrowano 1 ml strzykawką bez igły do odosiowych przestrzeni powietrznych 4-tygodniowych liści N. benthamiana. Aby stłumić wyciszanie genów, dokonaliśmy koinfiltracji Agrobacterium (OD600 = 0,5) zawierającej supresor wyciszający p19 wirusa krzaczastej karłowatości pomidora (TBSV) [32]. Po 36 do 40 godzinach fluorescencję GFP obserwowano w laserowym mikroskopie konfokalnym (LSM 880, Zeiss).

Analiza ekspresji GUS

Region promotorowy genu NAI2 o długości 635 bp amplifikowano metodą PCR z genomowego DNA Arabidopsis thaliana Col-0. Sekwencję promotora NAI2 zweryfikowano, a następnie sklonowano ją do pBI121 (Clontech) w miejscach Hindlll i BamHI, zastępując promotor CaMV35S w celu wytworzenia pNAI2: GUS. Aby wygenerować mut-pNAI2: GUS, przeprowadzono PCR typu overlap extension PCR [33] w celu zastąpienia sekwencji rdzeniowej kanonicznych i niekanonicznych elementów G-box (G1 / G2-box) w promotorze NAI2. W skrócie, dwie serie reakcji PCR przeprowadzono z użyciem genomowego DNA Arabidopsis jako matrycy i starterów (pNAI2HindIIIF i nić dopełniacza dla pNAI2-mG1 / mG2p; NAI2BamHIR i nić przednia dla pNAI2-mG1 / mG2p). Produkty otrzymane z powyższych reakcji PCR zmieszano w stosunku 1 : 1, a następnie przeprowadzono trzecią reakcję PCR z użyciem starterów (pNAI2HindIIIF i pNAI2BamHIR) w celu amplifikacji zmutowanych kaset G1 / G2 zawierających fragment promotora NAI2. Zmutowaną sekwencję w promotorze NAI2 zweryfikowano, a następnie wklonowano ją do pBI121 w miejscach Hindlll i BamHI. Powstałe plazmidy wprowadzono do szcz epu EHA105 A. tumefaciens przez elektroporację. Szczepy Agrobacterium zawierające efektor (p35S: GFP, p35S: GFP-NAI1, pNAI1: GFP-NAI1) lub konstrukty reporterowe zmieszano odpowiednio 1 : 1, a następnie koinfiltrowano do liści N. benthamiana na etapie 5 liści przy użyciu strzykawki o pojemności 1 ml. Ektopowy supresor wyciszający P19 był współinfiltrowany przy OD600 = 0,3. Po infiltracji rośliny utrzymywano przez 2 dni w komorze wzrostowej w 28°C w warunkach fotoperiodu 16 godzin światła.

Barwienie GUS przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem [34] z niewielkimi modyfikacjami. Infiltrowane liście pocięto na kawałki i namoczono w buforze barwiącym GUS (100 mM fosforan sodu, 1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-e-D-glukuronid, 0,5 mM żelazocyjanek potasu, 0,5 mM żelazocyjanek potasu, 10 mM Na2EDTA, pH 7,0), a następnie infiltrowano pod próżnią przez 5 minut i inkubowano w 37°C przez noc. Po wybarwieniu próbek liści na obecność GUS, potraktowano je 70% etanolem do całkowitego usunięcia pigmentów, takich jak chlorofile, i przemyto je wodą destylowaną w celu odbarwienia.

Bibliografia

1. Iversen TH. The morphology, occurrence, and distribution of dilated cisternae of the endoplasmic reticulum in tissues of plants of the Cruciferae. Protoplasma 1970; 71:467-77.

2. Matsushima R, Hayashi Y, Yamada K, Shimada T, Nishimura M, Hara-Nishimura I. The ER body, a novel endoplasmic reticulum-derived structure in Arabidopsis. Plant Cell Physiol 2003; 44:661-6.

3. Gunning BES. The identity of mystery organelles in Arabidopsis plants expressing GFP. Trends Plant Sci 1998; 3:417.

4. Matsushima R, Kondo M, Nishimura M, Hara-Nishimura I. A novel ER-derived compartment, the ER body, selectively accumulates a β-glucosidase with an ER-retention signal in Arabidopsis. Plant J 2003; 33:493-502.

5. Nakazaki A, Yamada K, Kunieda T, Tamura K, Hara-Nishimura I, Shimada T. Biogenesis of leaf endiolasmic reticulum body is regulated by both jasmonate-dependent and independent pathways. Plant Signal Behav 2019; 14:e1622982.

6. Nakazaki A, Yamada K, Kunieda T, Sugiyama R, Hirai YM, Tamura K, et al. Leaf endoplasmic reticulum bodies identified in Arabidopsis rosette leaves are involved in defense against herbivory. Plant Physiol 2019; 179:1515-24.

7. Stefanik N, Bizan J, Wilkens A, Tarnawska-Glatt K, Goto-Yamada S, Strzałka K, et al. NAI2 and TSA1 drive differentiation of constitutive and inducible ER body formation in Brassicaceae. Plant Cell Physiol 2020; 61:722-34.

8. Matsushima R, Hayashi Y, Kondo M, Shimada T, Nishimura M, Hara-Nishimura I. An endoplasmic reticulum-derived structure that is induced under stress conditions in Arabidopsis. Plant Physiol 2002; 130:1807-14.

9. Yamada K, Goto-Yamada S, Nakazaki A, Kunieda T, Kuwata K, Nagano AJ, et al. Endoplasmic reticulum-derived bodies enable a single-cell chemical defense in Brassicaceae plants. Commun Biol 2020; 3:21.

10. Nakano RT, Piślewska-Bednarek M, Yamada K, Edger PP, Miyahara M, Kondo M, et al. PYK10 myrosinase reveals a functional coordination between ER bodies and glucosinolates in Arabidopsis thaliana. Plant J 2017; 89:204-20.

11. Nakano RT, Yamada K, Bednarek P, Nishimura M, Hara-Nishimura I. ER bodies in plants of the Brassicales order: Biogenesis and association with innate immunity. Front Plant Sci 2014; 5:73.

12. Luthy B, Matile P. The mustard oil bomb: rectified analysis of the subcellular organisation of the myrosinase system. Biochem Physiol Pflanzen 1984; 179:5-12.

13. Matsushima R, Fukao Y, Nishimura M, Hara-Nishimura I. NAI1 gene encodes a basic-helix-loophelix-type putative transcription factor that regulates the formation of an endoplasmic reticulumderived structure, the ER body. Plant Cell 2004; 16:1536-49.

14. Yamada K, Nagano AJ, Nishina M, Hara-Nishimura I, Nishimura M. NAI2 is an endoplasmic reticulum body component that enables ER body formation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell 2008; 20:2529-40.

15. Geem KR, Kim DH, Lee DW, Kwon Y, Lee J, Kim JH, et al. Jasmonic acid-inducible TSA1 facilitates ER body formation. Plant J 2019; 97:267-80.

16. Voronova A, Baltimore D. Mutations that disrupt DNA binding and dimer formation in the E47 helixloop-helix protein map to distinct domains. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87:4722-6.

17. Swanson HI, Chan WK, Bradfield CA. DNA binding specificities and pairing rules of the Ah receptor, ARNT, and SIM proteins. J Biol Chem 1995; 270:26292-302.

18. Bai M-Y, Fan M, Oh E, Wang Z-Y. A triple helix-loop-helix/basic helix-loop-helix cascade controls cell elongation downstream of multiple hormonal and environmental signaling pathways in Arabidopsis. Plant Cell 2012; 24:4917-29.

19. MacAlister CA, Bergmann DC. Sequence and function of basic helix-loop-helix proteins required for stomatal development in Arabidopsis are deeply conserved in land plants. Evol Dev 2011; 13:182-92.

20. Pires N, Dolan L. Origin and diversification of basic-helix-loop-helix proteins in plants. Mol Biol Evol 2010; 27:862-74.

21. Yi K, Menand BB, Bell E, Dolan L. A basic helix-loop-helix transcription factor controls cell growth and size in root hairs. Nat Genet 2010; 42:264-7.

22. Toledo-Ortiz G, Huq E, Quail PH. The Arabidopsis basic/helix-loop-helix transcription factor family. Plant Cell 2003; 15:1749-70.

23. Meshi T, Iwabuchi M. Plant transcription factors. Plant Cell Physiol 1995; 36:1405-20.

24. Heim MA, Jakoby M, Werber M, Martin C, Weisshaar B, Bailey PC. The basic helix-loop-helix transcription factor family in plants: a genome-wide study of protein structure and functional diversity. Mol Biol Evol 2003; 20:735-47.

25. Van Moerkercke A, Steensma P, Gariboldi I, Espoz J, Purnama PC, Schweizer F, et al. The basic helix-loop-helix transcription factor BIS2 is essential for monoterpenoid indole alkaloid production in the medicinal plant Catharanthus roseus. Plant J 2016; 88:3-12.

26. Van Moerkercke A, Steensma P, Schweizer F, Pollier J, Gariboldi I, Payne R, et al. The bHLH transcription factor BIS1 controls the iridoid branch of the monoterpenoid indole alkaloid pathway in Catharanthus roseus. Proc Natl Acad Sci USA 2015; 112:8130-5.

27. Mertens J, Pollier J, Vanden Bossche R, Lopez-Vidriero I, Franco-Zorrilla JM, Goossens A. The bHLH transcription factors TSAR1 and TSAR2 regulate triterpene saponin biosynthesis in Medicago truncatula. Plant Physiol 2016; 170:194-210.

28. Tamura K, Yoshida K, Hiraoka Y, Sakaguchi D, Chikugo A, Mochida K, et al. The basic helix-loophelix transcription factor GubHLH3 positively regulates soyasaponin biosynthetic genes in Glycyrrhiza uralensis. Plant Cell Physiol 2018; 59:783-96.

29. O’Malley RC, Huang SC, Song L, Lewsey MG, Bartlett A, Nery JR, et al. Cistrome and epicistrome features shape the regulatory DNA landscape. Cell 2016; 165:1280-92.

30. Yamada K, Fukao Y, Hayashi M, Fukazawa M, Suzuki I, Nishimura M. Cytosolic HSP90 regulates the heat shock response that is responsible for heat acclimation in Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 2007; 282:37794-804.

31. Nakagawa T, Suzuki T, Murata S, Nakamura S, Hino T, Maeo K, et al. Improved Gateway binary vectors: high-performance vectors for creation of fusion constructs in transgenic analysis of plants. Biosci Biotechnol Biochem 2007; 71:2095-100.

32. Lindbo JA. High-efficiency protein expression in plants from agroinfection-compatible Tobacco mosaic virus expression vectors. BMC Biotechnol 2007; 7:52.

33. Ho SN, Hunt HD, Horton RM, Pullen JK, Pease LR. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain-reaction. Gene 1989; 77:51-9.

34. Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW. GUS fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 1987; 6:3901-7.

PL 242142 Β1

Wykaz sekwencji <110> Uniwersytet Jagielloński <120> Promotor aktywowany przez białko NAI1 oraz zawierający go układ ekspresyj ny <130> PK/7891/RW <160> 8 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 aaaaataaaa gccacgtgaa ttctattatt aaattaaaaa gccacgttga gttattttac 60 <210> 2 <211> 2073 <212> DNA <213> sztuczna <220>

<223> p35S:GFP-NAI1 <400> 2

tgagactttt	caacaaaggg	taatatccgg	aaacctcctc	ggattccatt	gcccagctat	60
ctgtcacttt	attgtgaaga	tagtggaaaa	ggaaggtcgc	tcctacaaat	gccatcattg	120
cgataaagga	aaggccatcg	ttgaagatgc	ctctgccgac	agtggtccca	aagatggacc	180
cccacccacg	aggagcatcg	tggaaaaaga	agacgttcca	accacgtctt	caaagcaagt	240
ggattgatgt	gatatctcca	ctgacgtaag	ggatgaogca	caatcccact	atccttcgca	300
agacccttcc	tctatataag	gaagttcatt	tcatttggag	agaacacggg	ggactctaga	360
ggatccatgg	cgagcaaggg	cgaggagctg	ttcaccgggg	tggtgcccat	cctggtcgag	420
ctggacggcg	acgtgaacgg	ccacaagttc	agcgtgtccg	gcgagggcga	gggcgatgcc	480
acctacggca	agctgaccct	gaagttcatc	tgcaccaccg	gcaagctgcc	cgtgccctgg	540
cccaccctcg	cgaccacctt	cacctacggc	gtgcagtgct	tcagccgcta	ccccgaccac	600
atgaagcagc	acgacttctt	caagtccgcc	atgcccgaag	gctacgtcca	ggagcgcacc	660
atcttcttca	aggacgacgg	caactacaag	acccgcgccg	aggtgaagtt	cgagggcgac	720
accctggtga	accgcatcga	gctgaagggc	atcgacttca	aggaggacgg	caacatcctg	780
gggcacaagc	rggagtacaa	ctacaacagc	cacaacgtct	atatcatggc	cgacaagcag	840

PL 242142 Β1

aagaacggca	tcaaggtgaa	cttcaagatc	cgccacaaca	tcgaggacgg	cagcgtgcag	900
ctcgccgacc	actaccagca	gaacaccccc	atcggcgacg	gccccgtgct	gctgcccgac	960
aaccactacc	tgagcaccca	gtccgccctg	agcaaagacc	ccaacgagaa	gcgcgatcac	102 0
atggtcctgc	tggagttcgt	gaccgccgcc	gggatcactc	acggcatgga	cgagctgtac	1080
atcacaagtt	tgtacaaaaa	agcaggctcc	atggatgatt	caagctttat	ggatttgatg	1140
atcgacactg	acgagtatct	gatcgatgac	tgggaatccg	atttcccgat	atgcggggaa	1200
actaacacca	accccggttc	cgagtctgga	tctggaaccg	ggtttgagtt	gctagcagaa	1260
agaccaacga	agcaaatgaa	aaccaacaac	aacatgaatt	caacatcttc	ttctccgtcg	1320
tcttcttctt	cttctggttc	tcgcacgtca	caagtgatct	catttgggtc	tccagacacg	1380
aaaaccaacc	cggtcgagac	atctttgaac	ttctccaacc	aagtaagcat	ggatcagaaa	1440
gtggggtcga	aaagaaaaga	ttgtgttaac	aatggaggaa	gaagagaacc	acatctattg	1500
aaagaacatg	ttttggctga	acgaaaacgt	cgacaaaagc	tcaacgagcg	tttgattgct	1560
ctctctgctc	ttcttcctgg	cctcaaaaag	acggacaagg	caacagttct	tgaagatgcc	1620
atcaaacatt	tgaaacaact	tcaagagcgg	gtaaagaagc	tggaggagga	gcgagtggtg	1680
accaagaaaa	tggatcaatc	aattatattg	gtgaagagat	ctcaagtgta	tttagatgat	1340
gattcttcat	cttattcttc	tacttgctct	gctgcgtctc	ctctgtcttc	ttcttcggac	1800
gaagtttcga	tcttcaaaca	aacaatgcct	atgatcgaag	cccgagtttc	agacagagat	1860
ttgttgatta	gagtccattg	tgagaagaac	aaagggtgta	tgattaagat	cttaagttcc	1920
ttggagaagt	ttcgtcttga	agtagtcaat	agcttcactt	taccatttgg	aaattcaact	1980
ctcgttataa	ccattctcac	taagatggac	aacaaatttt	ctcgaccagt	tgaagaagtg	2040
gtgaagaaca	taagagttgc	gttagctgaa	taa			2073

<210> 3 <211> 2481 <212> DNA <213> sztuczna <220>

<223> pNAI2:GUS <400> 3

aagcttgccg aacgaaaatt	taattatagc	cgatcattga	gttttagggt	cgtgacacat	60
gtggttgtca gttctgtaca	agtacaatca	tatatatgta	tttaattttc	tcatgtagca	120
cgctaatatt atcttatagt	ataaataaat	accaagtcta	acagatacga	tttggtagta	180
gtgtagtgaa catcgcatta	tttatttata	tcagcaaagt	agttcacaat	acgtggacta	240

PL 242142 Β1

tggcctatga	ggataattaa	ttatactcta	atgattatac	ttctatttca	taatattgta	300
gtaagttaaa	ctgattaata	gttggattta	ccagcattag	tggattccat	tatagatata	360
tttcaataat	aaacttttcg	ttttttcact	tttttaaaaa	tatcattttt	cttagtcttt	420
cttttggcaa	gattaagagt	gggataatca	taatttatag	gcgtttcaca	tacacagaaa	480
ctaatgaaga	caagaataaa	attaaaaata	gcgttgaatt	ctttgtaatt	aggaacgtgg	54 0
aatatatata	aaaataaaag	ccacgtgaat	tctattatta	aattaaaaag	ccacgttgag	600
ttattttact	ttggttttat	ttaaagtctt	gtttttcctc	aagctggatc	cccgggtggt	660
cagtccctta	tgttacgtcc	tgtagaaacc	ccaacccgtg	aaatcaaaaa	actcgacggc	720
ctgtgggcat	tcagtctgga	tcgcgaaaac	tgtggaattg	atcagcgttg	gtgggaaagc	780
gcgttacaag	aaagccgggc	aattgctgtg	ccaggcagtt	ttaacgatca	gttcgccgat	640
gcagatattc	gtaattatgc	gggcaacgtc	tggtatcagc	gcgaagtctt	tataccgaaa	900
ggttgggcag	gccagcgtat	cgtgctgcgt	ttcgatgcgg	tcactcatta	cggcaaagtg	960
tgggtcaata	atcaggaagt	gatggagcat	cagggcggct	atacgccatt	tgaagccgat	102 0
gtcacgccgt	atgttattgc	cgggaaaagt	gtacgtatca	ccgtttgtgt	gaacaacgaa	1080
ctgaactggc	agactatccc	gccgggaatg	gtgattaccg	acgaaaacgg	caagaaaaag	1140
cagtcttact	tccatgattt	ctttaactat	gccggaatcc	atcgcagcgt	aatgctctac	12 00
accacgccga	acacctgggt	ggacgatatc	accgtggtga	cgcatgtcgc	gcaagactgt	1260
aaccacgcgt	ctgttgactg	gcaggtggtg	gccaatggtg	atgtcagcgt	tgaactgcgt	132 0
gatgcggatc	aacaggtggt	tgcaactgga	caaggcacta	gcgggacttt	gcaagtggtg	1380
aatccgcacc	tctggcaacc	gggtgaaggt	tatctctatg	aactgtgcgt	cacagccaaa	1440
agccagacag	agtgtgatat	ctacccgctt	cgcgtcggca	tccggtcagt	ggcagtgaag	1500
ggcgaacagt	tcctgattaa	ccacaaaccg	ttctacttta	ctggctttgg	tcgtcatgaa	1560
gatgcggact	tgcgtggcaa	aggattcgat	aacgtgctga	tggtgcacga	ccacgcatta	1620
atggactgga	ttggggccaa	ctcctaccgt	acctcgcatt	acccttacgc	tgaagagatg	1680
ctcgactggg	cagatgaaca	tggcatcgtg	gtgattgatg	aaactgctgc	tgtcggcttt	1740
aacctctctt	taggcattgg	tttcgaagcg	ggcaacaagc	cgaaagaact	gtacagcgaa	1800
gaggcagtca	acggggaaac	tcagcaagcg	cacttacagg	cgattaaaga	gctgatagcg	1860
cgtgacaaaa	accacccaag	cgtggtgatg	tggagtattg	ccaacgaacc	ggatacccgt	1920
ccgcaaggtg	cacgggaata	tttcgcgcca	ctggcggaag	caacgcgtaa	actcgacccg	1980

PL 242142 Β1

acgcgtccga	tcacctgcgt	caatgtaatg	ttctgcgacg	ctcacaccga	taccatcagc	2040
gatctctttg	atgtgctgtg	cctgaaccgt	tattacggat	ggtatgtcca	aagcggcgat	2100
ttggaaacgg	cagagaaggt	actggaaaaa	gaacttctgg	cctggcagga	gaaactgcat	2160
cagccgatta	tcatcaccga	atacggcgtg	gatacgttag	ccgggctgca	ctcaatgtac	2220
accgacatgt	ggagtgaaga	gtatcagtgt	gcatggctgg	atatgtatca	ccgcgtcttt	2280
gatcgcgtca	gcgccgtcgt	cggtgaacag	gtatggaatt	tcgccgattt	tgcgacctcg	2340
caaggcatat	tgcgcgttgg	cggtaacaag	aaagggatct	tcactcgcga	ccgcaaaccg	2400
aagtcggcgg	cttttctgct	gcaaaaacgc	tggactggca	tgaacttcgg	tgaaaaaccg	2460
cagcagggag	gcaaacaatg	a				2481

<210> 4 <211> 963 <212> DNA <213> sztuczna <220>

<22 3> NAIl_cDNA <400> 4

atggatgatt	caagctttat	ggatttgatg	atcgacactg	acgagtatct	gatcgatgac	60
tgggaatccg	atttcccgat	atgcggggaa	actaacacca	accccggttc	cgagtctgga	120
tctggaaccg	ggtttgagtt	gctagcagaa	agaccaacga	agcaaatgaa	aaccaacaac	180
aacatgaatt	caacatcttc	ttctccgtcg	tcttcttctt	cttctggttc	tcgcacgtca	240
caagtgatct	catttgggtc	tccagacacg	aaaaccaacc	cggtcgagac	atctttgaac	300
ttctccaacc	aagtaagcat	ggatcagaaa	gtggggtcga	aaagaaaaga	ttgtgttaac	360
aatggaggaa	gaagagaacc	acatctattg	aaagaacatg	ttttggctga	acgaaaacgt	420
cgacaaaagc	tcaacgagcg	tttgattgct	ctctctgctc	ttcttcctgg	cctcaaaaag	4 80
acggacaagg	caacagttct	tgaagatgcc	atcaaacatt	tgaaacaact	tcaagagcgg	540
gtaaagaagc	tggaggagga	gcgagtggtg	accaagaaaa	tggatcaatc	aattatattg	600
gtgaagagat	ctcaagtgta	tttagatgat	gattcttcat	cttattcttc	tacttgctct	660
gctgcgtctc	ctctgtcttc	ttcttcggac	gaagtttcga	tcttcaaaca	aacaatgcct	320
atgatcgaag	cccgagtttc	agacagagat	ttgttgatta	gagtccattg	tgagaagaac	780
aaagggtgta	tgattaagat	cttaagttcc	ttggagaagt	ttcgtcttga	agtagtcaat	840
agcttcactt	taccatttgg	aaattcaact	ctcgttataa	ccattctcac	taagatggac	900
aacaaatttt	ctcgaccagt	tgaagaagtg	gtgaagaaca	taagagttgc	gttagctgaa	960

PL 242142 Β1 taa <210> 5 <211> 320 < 212> PP.T < 213> Arabidopsis thaliana < 400> 5

Met Asp Asp Ser Ser Phe Met Asp 1 5

963

Met Ile Asp Thr Asp Glu Tyr

15

Leu Ile Asp Asp Trp Glu Ser Asp 20

Pro Ile Cys Gly Glu Thr Asn 30

Thr Asn Pro Gly Ser Glu Ser Gly

40

Gly Thr Gly Phe Glu Leu Leu 45

Ala Glu Arg Pro Thr Lys Gin Met

55

Thr Asn Asn Asn Met Asn Ser

Thr Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ser

70

Ser Ser Gly Ser Arg Thr Ser

80

Gin Val Ile Ser Phe Gly Ser Pro 85

Thr Lys Thr Asn Pro Val Glu

95

Thr Ser Leu Asn Phe Ser Asn Gin

100

Ser Met Asp Gin Lys Val Gly

110

Ser Lys Arg Lys Asp Cys Val Asn

115 120

Gly Gly Arg Arg Glu Pro His 125

Leu Leu Lys Glu His Val Leu Ala

130 135

Arg Lys Arg Arg Gin Lys Leu 140

Asn Glu Arg Leu Ile Ala Leu Ser

145 150

Leu Leu Pro Gly Leu Lys Lys

155 160

Thr Asp Lys Ala Thr Val Leu Glu 165

Ala Ile Lys His Leu Lys Gin

170 175

Leu Gin Glu Arg Val Lys Lys Leu 180

Glu Glu Arg Val Val Thr Lys 190

PL 242142 Β1

Lys

Met

Asp 195

Gin

Ser

Ile

Leu 200

Val

Lys

Arg

Ser

Gin 205

Val

Tyr

Leu

Asp

Asp 210

Asp

Ser

Tyr 215

Ser

Thr

Cys

Ser 220

Ala

Ser

Pro

Leu 225

Ser

Asp 230

Glu

Val

Ser

Ile

Phe 235

Lys

Gin

Thr

Met

Pro 240

Met

Ile

Glu

Ala

Arg 245

Val

Ser

Asp

Arg

Asp 250

Leu

Ile

Arg

Val 255

His

Cys

Glu

Lys

Asn 260

Lys

Gly

Cys

Met

Ile 265

Lys

Ile

Leu

Ser

Ser 270

Leu

Glu

Lys

Phe

Arg 275

Leu

Glu

Val

Asn 280

Ser

Phe

Thr

Leu

Pro 285

Phe

Gly

Asn

Ser

Thr 290

Leu

Val

Ile

Thr

Ile 295

Leu

Thr

Lys

Met

Asp 300

Asn

Lys

Phe

Ser

Arg Pro 305 <210> <211> <212> <213> <220> <223>

Val Glu 6 1707 DMA sztuczna GFP-NAI1

Glu Val 310 cDNA

Val

Lys

Asn

Ile

Arg 315

Val

Ala

Leu

Ala

Glu 320

<400> 6 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac60 ggcgacgtga acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc180 ctcgtgacoa ccttcaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc300 ttcaaggaog acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc540

PL 242142 Β1 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actcacggca tggacgagct gtacatcaca720 agtttgtaca aaaaagcagg ctccatggat gattcaagct ttatggattt gatgatcgac780 actgacgagt atctgatcga tgactgggaa tccgatttcc cgatatgcgg ggaaactaac640 accaaccccg gttccgagtc tggatctgga accgggtttg agttgctagc agaaagacca900 acgaagcaaa rgaaaaccaa caacaacatg aattcaacar cttcttctcc gtcgtcttct960 tcttcttctg gttctcgcac gtcacaagtg atctcatttg ggtctccaga cacgaaaacc1020 aacccggtcg agacatcttt gaacttctcc aaccaagtaa gcatggatca gaaagtgggg1080 tcgaaaagaa aagattgtgt taacaatgga ggaagaagag aaccacatct attgaaagaa1140 catgttttgg ctgaacgaaa acgtcgacaa aagctcaacg agcgtttgat tgctctctct1200 gctcttcttc ctggcctcaa aaagacggac aaggcaacag ttcttgaaga tgccatcaaa1260 catttgaaac aacttcaaga gcgggtaaag aagctggagg aggagcgagt ggtgaccaag1320 aaaatggatc aatcaattat attggtgaag agatctcaag tgtatttaga tgatgattct1380 tcatcttatt cttctacttg ctctgctgcg tctcctctgc cttcttcttc ggacgaagtt1440 tcgatcttca aacaaacaat gcctatgatc gaagcccgag tttcagacag agatttgttg1500 attagagtcc attgtgagaa gaacaaaggg tgtatgatta agatcttaag ttccttggag1560 aagtttcgtc ttgaagtagt caatagcttc actttaccar ttggaaattc aactctcgtt1620 ataaccattc rcactaagat ggacaacaaa ttttctcgac cagttgaaga agtggtgaag1680 aacataagag ctgcgttagc tgaataa1707 <210> 7 <211> 568 <212> PRT <213> sztuczna <220>

<223> GFP-NAIl_protein <400> 7

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

PL 242142 Β1

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr

40

Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val 50 55

Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 60

Phe Thr Tyr Gly Val Gin Cys Phe 65 70

Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

80

Gin His Asp Phe Phe Lys Ser Ala 85

Pro Glu Gly Tyr Val Gin Glu

95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp

100

Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu

115 120

Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn

130 135

Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr

145 150

Met Ala Asp Lys Gin Lys Asn

155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile 165

His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

170 175

Val Gin Leu Ala Asp His Tyr Gin

180

Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His

195 200

Leu Ser Thr Gin Ser Ala Leu

205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg

210 215

His Met Val Leu Leu Glu Phe

220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His 225 230

Met Asp Glu Leu Tyr Ile Thr

235 240

Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Ser 245

Asp Asp Ser Ser Phe Met Asp

250 255

Leu Met Ile Asp Thr Asp Glu Tyr

260

Ile Asp Asp Trp Glu Ser Asp

270

PL 242142 Β1

Phe

Ser

Lys 305

Ser

Asp

Val

Asn

Glu

385

Ala

Asp

Glu

Val

Ser 4 65

Ser

Arg

Pro Ile Cys

275

Gly Glu Thr

Asn Thr Asn

8 0

Pro Gly Ser

285

Glu Ser Gly

Gly Thr Gly 290

Thr Asn Asn

Ser Ser Gly

Thr Lys Thr

340

Ser Met Asp

355

Gly Gly Arg 370

Arg Lys Arg

Lcu Lcu Pro

Ala Ile Lys

420

Glu Glu Arg 435

Lys Arg Ser 450

Thr Cys Ser

Ile Phe Lys

Asp Leu Leu

500

Phe Glu Leu

295

Leu Ala Glu

Arg Pro Thr 300

Lys Gin Met

Asn Met Asn

310

Ser Arg Thr 325

Asn Pro Val

Gin Lys Val

Arg Glu Pro

375

Arg Gin Lys

390

Gly Lcu Lys 405

His Leu Lys

Val Val Thr

Gin Val Tyr

455

Ala Ala Ser

470

Gin Thr Met 485

Ile Arg Val

Ser Thr Ser

Ser Gin Val

330

Glu Thr Ser

345

Gly Ser Lys 360

His Leu Leu jeu Asn Glu _jys Thr Asp 410

Gin Leu Gin

425

Lys Lys Met 440

Leu Asp Asp

Pro Leu Ser

Pro Met Ile

490

His Cys Glu 505

Ser Ser Pro 315

Ile Ser Phe

Leu Asn Phe

Arg Lys Asp

365

Lys Glu His

380

Arg Leu Ile 395

Lys Ala Thr

Glu Arg Val

Asp Gin Ser

445

Asp Ser Ser

460

Ser Ser Ser

475

Glu Ala Arg

Lys Asn Lys

Ser Ser Ser

320

Gly Ser Pro

335

Ser Asn Gin

350

Cys Val Asn

Val Leu Ala

Ala Leu Ser

400

Val Lcu Glu

415

Lys Lys Leu 430

Ile Ile Leu

Ser Tyr Ser

Asp Glu Val

480

Val Ser Asp

495

Gly Cys Met 510

PL 242142 Β1

Ile Lys Ile Leu Ser 515

Ser Leu Glu Lys Phe Arg 52 0

Leu Glu Val Val Asn

525

Ser Phe Thr Leu Pro

530

Phe Gly Asn Ser Thr Leu 535

Val Ile Thr Ile Leu 540

Thr Lys Met Asp Asn 545

Lys Phe Ser Arg Pro Val

550 555

Glu Glu Val Val Lys

560

Asn Ile Arg Val Ala

565

Leu Ala Glu <210> 8 <211> 639 <212> DNA <21 3> Arabidopsis thaliana <400> 8

gccgaacgaa	aatttaatta	tagccgatca	ttgagtttta	gggtcgtgac	acatgtggtt	60
gtcagttctg	tacaagtaca	atcatatata	tgtatttaat	tttctcatgt	agcacgctaa	120
tattatctta	tagtataaat	aaataccaag	tctaacagat	acgatttggt	agtagtgtag	180
tgaacatcgc	attatttatt	tatatcagca	aagtagttca	caatacgtgg	actatggcct	240
atgaggataa	ttaattatac	tctaatgatt	atacttctat	ttcataatat	tgtagtaagt	300
taaactgatt	aatagttgga	tttaccagca	ttagtggatt	ccattataga	tatatttcaa	360
taataaactt	ttcgtttttt	cactttttta	aaaatatcat	ttttcttagt	ctttcttttg	420
gcaagattaa	gagtgggata	atcataattt	ataggcgttt	cacatacaca	gaaaataatg	480
aagacaagaa	taaaattaaa	aatagcgttg	aattctttgt	aattaggaac	gtggaatata	540
tataaaaata	aaagccacgt	gaattctatt	attaaattaa	aaagccacgt	tgagttattt	600
tactttggtt	ttatttaaag	tcttgttttt	cctcaagct			639

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Promotor aktywowany przez białko NAI1 zawierający sekwencję przedstawioną jako Sekw. Nr. 1.
2. Promotor według zastrz. 1 posiadający sekwencję przedstawioną jako Sekw. Nr. 8.
3. Układ ekspresyjny zawierający kasetę efektora i kasetę reportera, znamienny tym, że kaseta efektora zawiera gen kodujący białko NAI1 lub gen kodujący białko fuzyjne zawierające białko NAI1 pod kontrolą dowolnego znanego, korzystnie indukowalnego, promotora, natomiast kaseta reportera zawiera gen kodujący białko reporterowe pod kontrolą promotora aktywowanego przez białko NAI1, przy czym promotor aktywowany przez białko NAI1 zawiera sekwencję przedstawioną jako Sekw. Nr. 1.
4. Układ ekspresyjny według zastrz. 3, znamienny tym, że promotor aktywowany przez białko NAI1 posiada sekwencję przedstawioną jako Sekw. Nr. 8.
5. Układ ekspresyjny według zastrz. 3, znamienny tym, że gen kodujący białko NAI1 koduje białko o sekwencji przedstawionej jako Sekw. Nr. 5.

PL 242142 Β1
6. Układ ekspresyjny według zastrz. 3, znamienny tym, że gen kodujący białko NAI1 posiada sekwencję przedstawioną jako Sekw. Nr. 4.
7. Układ ekspresyjny według zastrz. 3, znamienny tym, że gen kodujący białko fuzyjne zawierające białko NAI1 koduje białko o sekwencji przedstawionej jako Sekw. Nr. 7.
8. Układ ekspresyjny według zastrz. 3, znamienny tym, że gen kodujący białko fuzyjne zawierające białko NAI1 posiada sekwencję przedstawioną jako Sekw. Nr. 6.
9. Układ ekspresyjny według zastrz. 3, znamienny tym, że kaseta efektora posiada sekwencję przedstawioną jako Sekw. Nr. 2.
10. Układ ekspresyjny według zastrz. 3, znamienny tym, że kaseta reportera posiada sekwencję przedstawioną jako Sekw. Nr. 3.