PL241174B1 - Związek chemiczny-marker diagnostyczny nowotworu trzustki oraz sposób diagnozowania in vitro nowotworu trzustki - Google Patents

Związek chemiczny-marker diagnostyczny nowotworu trzustki oraz sposób diagnozowania in vitro nowotworu trzustki Download PDF

Info

Publication number
PL241174B1
PL241174B1 PL430348A PL43034819A PL241174B1 PL 241174 B1 PL241174 B1 PL 241174B1 PL 430348 A PL430348 A PL 430348A PL 43034819 A PL43034819 A PL 43034819A PL 241174 B1 PL241174 B1 PL 241174B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
anb
resin
minutes
thr
fmoc
Prior art date
Application number
PL430348A
Other languages
English (en)
Other versions
PL430348A1 (pl
Inventor
Adam LESNER
Adam Lesner
Natalia Gruba
Original Assignee
Urteste Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Urteste Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia filed Critical Urteste Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority to PL430348A priority Critical patent/PL241174B1/pl
Priority to KR1020227002283A priority patent/KR20220024867A/ko
Priority to BR112021026192A priority patent/BR112021026192A2/pt
Priority to PCT/EP2020/067542 priority patent/WO2020260309A1/en
Priority to AU2020306623A priority patent/AU2020306623A1/en
Priority to EP20733488.9A priority patent/EP3987050A1/en
Priority to MX2021016095A priority patent/MX2021016095A/es
Priority to US17/622,070 priority patent/US20220251625A1/en
Priority to CN202080045600.3A priority patent/CN114096555A/zh
Priority to CA3144839A priority patent/CA3144839A1/en
Priority to JP2021577260A priority patent/JP2022538862A/ja
Publication of PL430348A1 publication Critical patent/PL430348A1/pl
Priority to IL289348A priority patent/IL289348A/en
Publication of PL241174B1 publication Critical patent/PL241174B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C07K1/062—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for alpha- or omega-carboxy functions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C07K1/063—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups for alpha-amino functions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
    • G01N2800/067—Pancreatitis or colitis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest związek chemiczny - marker diagnostyczny o wzorze ogólnym, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, X to oznacza ANB-NH2 lub pNA, przy czym ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, ANB - kwas 5-amino-2-nitrobenzoesowy, a pNA oznacza para-nitroanilinę. Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania tego związku chemicznego - markera diagnostycznego, prowadzony na nośniku, którym jest żywica oraz w buforze. Sposób diagnozowania nowotworu trzustki polega na tym, że związek chemiczny - marker diagnostyczny w przedziale stężeń 0.1 - 10 mg/ml inkubuje się w buforze pomiarowym o pH obojętnym lub zasadowym z niewielką ilością ludzkiego moczu, w zakresie proporcji 1:2 do 1:10 do buforu pomiarowego, i mierzy się intensywność absorbancji w zakresie 300-500 nm.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest związek chemiczny, który znajduje zastosowanie jako marker diagnostyczny nowotworu trzustki, oraz sposób diagnozowania in vitro nowotworu trzustki z zastosowaniem takiego związku.
Nowotwór trzustki należy do grupy nowotworów, dla których współczesna medycyna wciąż poszukuje powszechnie dostępnych specyficznych metod diagnostycznych. Ze względu na dynamikę tego nowotworu pięcioletnie przypadki przeżycia chorego na tę chorobę należą do rzadkości. Na świecie nowotwór trzustki diagnozuje się u około 250 000 osób, zaś w Polsce u 3500 osób. Niestety zdecydowana większość przypadków kończy się śmiercią (powyżej 80%).
Związek chemiczny będący przedmiotem wynalazku należy do klasy peptydów chromogenicznych.
Znany jest sposób otrzymywania peptydów chromogenicznych polegający na prowadzeniu procesu na nośniku w postaci żywicy, posiadającej grupę Fmoc, którą usuwa się w trakcie prowadzenia reakcji. Używana żywica do prowadzenia tego procesu powinna zostać odpowiednio przygotowana. Przygotowanie tej żywicy polega na zwiększeniu jej objętości poprzez wielokrotne przemywanie rozpuszczalnikami hydrofobowymi. Z żywicy tej należy usunąć grupę ochronną Fmoc poprzez przemywanie 20% roztworem rozpuszczalnika.
Znane procesy otrzymywania peptydów chromogenicznych polegają na przyłączaniu poszczególnych elementów składowych w odpowiednich warunkach czasowych i stechiometrycznych. Ten proces przyłączania składa się z kolejnych etapów, w których poszczególne elementy (pochodne aminokwasowe) są przyłączane, pozostałości odmywane, i kolejno grypy ochronne usuwane i ponownie przemywane. Taki cykl powtarzany jest dla każdej reszty aminokwasowej. Otrzymany peptyd oddzielany jest od żywicy poprzez reakcję w warunkach kwasowych, po czym roztwór oddzielany jest od żywicy w procesie sączenia, a następnie z otrzymanego roztworu peptyd wytrącany jest rozpuszczalnikiem niepolarnym. Uzyskany w ten sposób osad peptydu jest wirowany.
Znany jest sposób otrzymywania peptydów chromogenicznych polegający na prowadzeniu procesu na nośniku stałym i częściowo w buforze. Jako nośnik stały stosuje się żywicę amidową, a jako roztwór mieszaninę rozpuszczalników hydrofobowych.
Ze stanu techniki znane jest, że cząsteczki peptydów chromogenicznych rozpadają się pod wpływem enzymów proteolitycznych, powodując zmianę lub wzrost zabarwienia badanego roztworu. Efekt ten jest następstwem uwalniania chromoforu (4-nitroanilidu lub kwasu 5,2 amino nitro benzoesowego).
Zastosowanie tego typu pochodnych peptydów znane jest z publikacji:
1. Erlanger BF, Kokowsky N, Cohen W., The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin., Arch Biochem Biophys.,listopad 1961 ; 95: 271-8.
2. Hojo K, Maeda M, Iguchi S, Smith T, Okamoto H, Kawasaki K., Amino acids and peptides., XXXV. Facile preparation of p-nitroanilide analogs by the solid-phase method., Chem Pharm Bull (Tokyo), listopad 2000; 48(11): 1740-4.
Na podstawie tych publikacji opracowano budowę związku w taki sposób, aby obserwowany wzrost barwy w przedziale 380-440 nm następował w wyniku zmieszania/kontaktu z moczem osoby z nowotworem trzustki, a jednocześnie w taki sposób, aby efekt ten nie występował w reakcji z moczem osoby zdrowej lub z diagnozą innego typu nowotworu.
Proces inicjacji, wzrostu i przerzutowania komórek nowotworowych przebiega przy udziale wielu czynników, w tym szeregu enzymów proteolitycznych. Ta grupa białek wykazuje zdolność do hydrolizy (katalizowania rozpadu) białek i peptydów na mniejsze fragmenty. Proces ten umożliwia komórkom nowotworowym rozrost przez kolonizację nowych tkanek, wzmożenie procesu tworzenia naczyń krwionośnych (angiogenenzy), co umożliwia efektywne dostarczanie substancji odżywczych do guza. Enzymy te powstają także w wyniku obumierania komórek zdrowych na skutek procesu rozrostu nowotworu. Wszystkie te procesu tworzą charakterystyczny profil proteolityczny komórek nowotworowych.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest związek chemiczny o wzorze ogólnym 1:
ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-X6, gdzie:
ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy,
X oznacza ANB-NH2 lub pNA, przy czym ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego,
PL 241 174 B1
ANB oznacza kwas 5-amino-2-nitrobenzoesowy, a pNA oznacza para-nitroanilinę.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także sposób diagnozowania in vitro nowotworu trzustki, polegający na tym, że związek chemiczny o wzorze ogólnym 1, jak zdefiniowano powyżej, inkubuje się, w przedziale stężeń 0,1-10 mg/ml, korzystnie w stężeniu 1 mg/ml, w buforze pomiarowym o pH obojętnym lub zasadowym, korzystnie fizjologicznym, z niewielką ilością ludzkiego moczu, w zakresie proporcji 1 : 2 do 1 : 10, korzystnie 1 : 5, próbki moczu do buforu pomiarowego, i mierzy się intensywność absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze z przedziału 25-40°C, korzystnie 36-38°C, przy czym wzrost intensywności absorbancji w badanej próbce wskazuje na obecność nowotworu trzustki.
Zgodnie z wynalazkiem opracowano również sposób otrzymywania związku chemicznego o wzorze 2:
ABZ1-Thr2-Th r3-Ala4-Arg5-ANB-NH26, gdzie:
ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, a
ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego.
Sposób ten polega na tym, że proces prowadzi się na nośniku w postaci żywicy, korzystnie posiadającej grupę Fmoc, przy czym nośnik przed rozpoczęciem procesu przygotowuje się poprzez zwiększenie jego objętości poprzez wielokrotne przemywanie rozpuszczalnikami hydrofobowymi, korzystnie dimetyloformamidem, chlorkiem metylenu lub N-metylopirolidonm, i usunięcie grupy ochronnej Fmoc, korzystnie poprzez przemywanie 10-30% roztworem piperydyny w rozpuszczalnikach, takich jak dimetyloformamid, chlorek metylenu lub N-metylopirolidon, po czym proces realizuje się w kolejnych etapach:
a) osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB) na żywicy poprzedza się przemyciem nośnika 3-6% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF, po czym przygotowuje się roztwór ANB w DMF, do którego dodaje się kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA), w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3 : 3 : 2 : 6, po czym tak przygotowaną mieszaninę dodaje się do żywicy i miesza się do uzyskania jednorodności, po czym żywicę odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, i przemywa rozpuszczalnikami, takimi jak DMF, DCM i izopropanol, a następnie kontynuuje się przyłączanie ANB do żywicy poprzez zastosowanie heksafluorofosforanu O -(7-azabenzotriazol-1ilo)-N,N,N’,N’-tetrametylouroniowego (HATU), a potem heksafluorofosforanu O -(benzotriazol-1-ilo)N,N,N’,N’-tetrametylouroniowego (HBTU) w ilościach nadmiarowych, a po zakończeniu przemywa się nośnik kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i łagodnie suszy się;
b) przyłączanie reszty aminokwasowej do ANB prowadzi się poprzez reakcję z pochodną aminokwasową Fmoc-Arg(Pbf)-OH, przy czym co najmniej pięciokrotny nadmiar molowy pochodnej aminokwasowej w stosunku do żywicy rozpuszcza się w bezwodnej pirydynie i kontaktuje się z żywicą z osadzonym ANB, po czym całość chłodzi się do temperatury nie niższej niż -20°C, a następnie dodaje się POCI3 w stosunku 1 : 1 do użytej ilości pochodnej aminokwasowej i całość miesza się, po czym proces mieszania prowadzi się w temperaturze pokojowej, a następnie w podwyższonej temperaturze, zaś po zakończeniu reakcji żywicę odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, przemywa się DMF oraz MeOH i łagodnie suszy się, po czym uzyskany związek przejściowy poddaje się procesowi acylowania;
c) acylowanie uzyskanego związku przejściowego prowadzi się przy zastosowaniu pochodnej aminokwasowej, korzystnie Fmoc-Ala-OH, i kolejno Fmoc-Thr(tBu)-OH, następnie Fmoc-Thr(tBu)-OH i w końcowym etapie syntezy Boc-Abz-OH, przy czym acylowanie prowadzi się etapowo od reszty 6 do 1 z wykorzystaniem jako środka sprzęgającego diizopropylokarbodiimidu, który stosuje się w nadmiarze, a po zakończeniu każdego etapu żywicę przemywa się DMF, i korzystnie podaje testowi chloroanilowemu, w którym monitoruje się przyłączenia pochodnej aminokwasowej;
d) usunięcie grupy ochronnej Fmoc prowadzi się poprzez przemywanie roztworem 10-30% piperydyny w DMF i kolejnymi przemywaniami każdym z rozpuszczalników: DMF, izopropanolem i chlorkiem metylenu;
e) odszczepianie peptydu od żywicy przeprowadza się, stosując mieszaninę TFA : fenol : woda : TIPS, przy zachowaniu stosunków odpowiednio 88 : 5 : 5 : 2 v/v/v/v, przy czym mieszaninę miesza się przez okres co najmniej jednej godziny, korzystnie trzy godziny, a uzyskany osad odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym przemywa się eterem dietylowym i uzyskany peptyd odwirowuje się;
PL 241 174 B1
f) przygotowanie gotowego produktu przeprowadza się poprzez rozpuszczenie peptydu w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddaje się liofilizacji.
Zgodnie z wynalazkiem opracowano również sposób otrzymywania związku chemicznego o wzorze 3:
ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-pNA6, gdzie:
ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, a pNA oznacza paranitroanilid.
Sposób ten polega na tym, że proces prowadzi się na nośniku w postaci żywicy, korzystnie posiadającej grupę Fmoc, przy czym nośnik przed rozpoczęciem procesu przygotowuje się poprzez zwiększenie jego objętości poprzez wielokrotne przemywanie rozpuszczalnikami hydrofobowymi, korzystnie dimetyloformamidem, chlorkiem metylenu lub N-metylopirolidonem, i usunięcie grupy ochronnej Fmoc, korzystnie poprzez przemywanie 10-30% roztworem piperydyny w rozpuszczalnikach, takich jak dimetyloformamid, chlorek metylenu lub N-metylopirolidon, po czym proces dalej realizuje się w kolejnych etapach:
a) przyłączenie trzeciej reszty aminokwasowej (Fmoc-Ala) do żywicy dokonuje się przy wykorzystaniu odpowiedniej pochodnej aminokwasowej przy 9-krotnym nadmiarze molowym w stosunku do osadzenia żywicy, którą rozpuszcza się w bezwodnym chlorku metylenu, po czym mieszaninę miesza się przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej, zaś po zakończeniu reakcji żywicę odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i przemywa się DMF oraz MeOH, po czym suszy się;
b) w kolejnych etapach wykonuje się przyłączania reszty aminokwasowej, nazywane dalej acylowaniem, przy czym stosuje się pochodną Fmoc-Thr(tBu)-OH i kolejno Fmoc-Thr(tBu)-OH oraz Boc-ABZ-OH, przy czym każdy z etapów poprzedza się przemywaniem żywicy za pomocą DMF, korzystnie przez 5 minut, w kolejnych przyłączeniach stosuje się środek sprzęgający, korzystnie w postaci diizopropylokarbodiimidu, który stosuje się w nadmiarze, przy czym procedurę tę powtarza się dwukrotnie, a po zakończeniu każdego etapu żywicę przemywa się DMF, i korzystnie podaje testowi chloroanilowemu, w którym monitoruje się przyłączenia pochodnej aminokwasowej;
c) usunięcie grupy ochronnej Fmoc prowadzi się poprzez przemywanie roztworem 10-30% piperydyny w DMF i kolejne przemywania każdym z rozpuszczalników: DMF, izopropanolem i chlorkiem metylenu.
d) powtarzanie etapów od b) do c), aż do momentu uzyskania związku (ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4OH), przy czym syntezę prowadzi się od reszty 6 do 3, a następnie odszczepia się otrzymany związek od nośnika, stosując mieszaninę TFA : fenol : woda : TIPS, w proporcjach odpowiednio 88 : 5 : 5 : 2, v/v/v/v, w trakcie mieszania, po czym po upływie co najmniej dwóch godzin zawartość kolby odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, a osad przemywa się eterem dietylowym, po czym osad odwirowuje się, korzystnie w czasie 20 minut, a następnie osad rozpuszcza się w wodzie przy pomocy ultradźwięków, po czym poddaje się liofilizacji;
e) syntezę Fmoc-Arg(Pbf)-pNA przeprowadza się etapowo, przy czym w pierwszym etapie 2 mmole Fmoc-Arg(Pbf) rozpuszcza się w bezwodnym tetrahydrofuranie (THF) w obecności 2 mmoli N-metylomorfoliny (NMM) i aktywuje się grupę karboksylową pochodnej aminokwasowej 2 mmolami chlorku izobutylu, po czym po 10 minutach aktywacji dodaje się 3 mmmole p-nitroaniliny, zaś reakcję korzystnie prowadzi się przez 2 godziny, korzystnie w temperaturze -15°C, a następnie dobę w temperaturze pokojowej, a po skończonej reakcji rozpuszczalnik odparowuje się, a suchą pozostałość rozpuszcza się w octanie etylu, po czym otrzymany roztwór przemywa się kolejno nasyconym wodnym roztworem NaCl, 10% kwasem cytrynowym, 5% wodorowęglanem sodu i suszy się nad bezwodnym siarczanem sodu, zaś octan etylu oddestylowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, a suchą pozostałość suszy się;
f) łączenie chronionego peptydu ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH z paranitroanilidem Arg(Pbf) polega na tym, że chroniony peptyd ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH rozpuszcza się w niewielkiej ilości DCM, a następnie kolejno aktywuje się za pomocą TFFH (tetrametylofluoroformamidu), korzystnie przez 30 minut, korzystnie w temperaturze 0°C, po czym dodaje się katalityczną ilość DMAP oraz Fmoc-Arg(Pbf)5-pNA6, przy czym korzystnie reakcję prowadzi się przez 24 godziny, korzystnie w temperaturze pokojowej, po czym odparowuje się rozpuszczalnik, zaś otrzymany roztwór zalewa się mieszaniną ściągającą osłony boczne: TFA : fenol : woda : TIPS (88 : 5 : 5 : 2, v/v/v/v), i miesza się, korzystnie przez 3 godziny.
g) przygotowanie gotowego produktu przeprowadza się poprzez rozpuszczenie peptydu w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddaje się liofilizacji.
PL 241 174 B1
Zastosowane w opisie i zastrzeżeniach patentowych określenia i skróty należy rozumieć następująco: Właściwości chromogeniczne - oznaczają powstawanie produktu barwnego
Właściwości fluorogeniczne - oznaczają powstawanie produktu emitującego fluorescencję
NMP - N-metylopirolidon
DMF - dimetyloformamid
DCM - chlorek metylenu pNA - 4-nitroanilina, para-nitroanilina
ABZ - kwas 2-aminobenzoesowy,
ANB-NH2 - amid kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego,
Boc - grupa tert-butyloksykarbonylowa
Fmoc - grupa 9-fluorenylometoksykarbonylowa
TFA - kwas trifluorooctowy.
Korzyści wynikające z wykorzystania niniejszego wynalazku polegają na stworzeniu szybkiego i bezinwazyjnego sposobu diagnostycznego, umożliwiającego wczesne wykrycie nowotworu trzustki. Ponadto niniejszy wynalazek z powodzeniem może służyć do wykonywania badań przesiewowych. Niniejszy wynalazek daje możliwość wykonania pełnej diagnostyki na wczesnym etapie rozwoju nowotworu i skuteczniejszego leczenia. Wczesne rozpoznanie daje możliwość leczenia operacyjnego, które znacząco wydłuża przeżycie pacjenta.
Wynalazek przedstawiono bliżej w przykładach wykonania na rysunku, na którym:
Fig. 1 przedstawia stopień hydrolizy substratu (1), tj. związku o wzorze 2: ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANBNH2 w próbkach moczu pochodzących od osób ze zdiagnozowanym nowotworem trzustki (próbki 1-10) i próbkach moczu pochodzących od osób zdrowych (11-25). Cyfry arabskie oznaczają numer wybranej próbki moczu.
Fig. 2 przedstawia stopień hydrolizy substratu (2), tj. związku o wzorze 3: ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-pNA w próbkach moczu pochodzących od osób ze zdiagnozowanym nowotworem trzustki (próbki 1-10) i próbkach moczu pochodzących od osób zdrowych (11-25). Cyfry arabskie oznaczają numer wybranej próbki moczu.
Fig. 3 przedstawia zależność stopnia hydrolizy substratu (1) ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB NH2 od środowiska pH. Wartości wskazane na osi X oznaczają pH środowiska.
Fig. 4 przedstawia wyniki analizy hydrolizy (rozpadu) substratu, tj. ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2 w próbce moczu od osobnika ze zdiagnozowanym nowotworem trzustki.
Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, które nie stanowią jego ograniczenia.
P r z y k ł a d 1
Synteza nowego związku o wzorze: ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-ANB-NH26(wzór 2)
1. Otrzymanie peptydu chromogenicznego
a) Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie peptydu chromogenicznego, który otrzymano metodą syntezy w fazie stałej - na nośniku stałym - z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu, czyli z użyciem osłon.
Związek o sekwencji: ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-ANB-NH26, gdzie ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, a ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, zaś ANB oznacza kwas 5-amino-2-benzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej z wykorzystaniem następujących pochodnych aminokwasowych:
Boc-ABZ, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ala, Fmoc-Arg(Pbf), ANB.
Syntezę związku, czyli markera diagnostycznego do wykrywania nowotworu trzustki, którego diagnostyka jest związana z hydrolizą tego związku pod wpływem enzymów proteolitycznych, prowadzono na nośniku stałym umożliwiającym przekształcenie kwasu 5-amino-2-benzoesowego w amid ANB-NH2, np. żywicy amidowej, np. TentaGel S RAM firmy RAPP Polymere (Niemcy), np. o osadzeniu 0,23 mmol/g. Możliwe jest zastosowanie innej dostępnej handlowo żywicy amidowej, w tym Rink Amide (Niemcy).
Syntezę związku prowadzono w sposób manualny z zastosowaniem wytrząsarki laboratoryjnej. Przez większość etapów reaktorami była strzykawka o pojemności 25 ml, zakończona spiekiem do syntezy w fazie stałej.
Wszystkie otrzymywane końcowe związki zawierały w swojej sekwencji w pozycji 1, czyli na N-końcu, kwas 2-aminobenzoesowy (ABZ), a w pozycji 6, czyli na C-końcu, cząsteczkę kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB). ABZ pełni rolę donora fluorescencji, natomiast ANB pełni rolę wygaszacza fluorescencji i jednocześnie chromoforu. Peptydy w swojej sekwencji zawierały co najmniej i korzystnie
PL 241 174 B1 jedno miejsce reaktywne zlokalizowane pomiędzy resztami aminokwasowymi Arg-ANB-NH2, tj. w pozycji 5 związku. Syntezę polegająca na przyłączaniu pochodnych aminokwasowych prowadzi się od reszty 6 do 1, czyli od końca C do N.
b) Osadzenie ANB na żywicy TentaGel S RAM:
Syntezę peptydów wykonano na żywicy TentaGel S RAM firmy Rapp Polymere o osadzeniu 0,23 mmol/g. W pierwszym etapie przygotowano żywicę, w tym dokonano spulchnienia żywicy poprzez cykl przemywań. Kolejno przystąpiono do usunięcia z nośnika osłony grupy aminowej Fmoc - za pomocą 20% roztworu piperydyny w NMP. Następnie przeprowadzono cykl przemywań rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 1 x 10 minut, IsOH 1 x 10 minut, DCM 1 x 10 minut.
Usunięcie osłony Fmoc:
DMF 1 x 5 minut, 20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty, 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty, IsOH 3 x 2 minuty, DCM 3 x 2 minuty.
c) Test chloranilowy:
Test chloranilowy polegał na przeniesieniu, za pomocą łopatki, kilku ziaren żywicy z reaktora - strzykawki - do szklanej ampułki, do której następnie dodano 100 μl nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 μl świeżego aldehydu octowego. Po upływie 10 minut przeprowadzono kontrolę zabarwienia ziaren.
Na tym etapie, po przeprowadzeniu testu, otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które świadczyło o obecności wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usunięcia osłon 9-fluorenylometoksykarbonylowych z żywicy można było przystąpić do kolejnego etapu, przyłączania pochodnej ANB (kwasu 5-amino-2-nitrobenozesowego).
d) Osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego na nośniku stałym
Pierwszym etapem syntezy biblioteki peptydowej - mieszaniny peptydów, było osadzenie ANB na 1 g żywicy. Przed przyłączeniem chromoforu przemyto żywicę używaną do reakcji następującymi rozpuszczalnikami: DMF, DCM i ponownie DMF, po czym usunięto osłonę Fmoc- z grupy funkcyjnej nośnika. Jeden cykl usuwania osłony Fmoc- obejmował następujące etapy:
Usunięcie osłony Fmoc-:
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty, 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut.
e) Przemywanie:
DMF 3 x 2 minuty, IsOH 3 x 2 minuty, DCM 3 x 2 minuty.
f) Test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych:
Żywicę z wolną grupą aminową przemyto 5% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF. Procedurę usuwania osłony Fmoc- oraz cykl przemywań przeprowadzono w naczynku Merrifielda. W osobnej kolbie rozpuszczono ANB w DMF i dodano kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3 : 3 : 2 : 6. Tak przygotowaną mieszaninę dodano do żywicy i mieszano przez 3 godziny. Żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF, DCM i izopropanolem, a całą procedurę acylowania powtórzono dwa razy. Do przeprowadzenia kolejnych reakcji przyłączania ANB do żywicy zastosowano heksafluorofosforan O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-W,W,W’,W’-tetrametylouroniowy (HATU), a potem heksafluorofosforan O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N'N’-tetrametylouroniowy (HBTU). W ostatnim etapie żywicę przemyto kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i suszono na powietrzu. g) Przyłączenie C-końcowej reszty aminokwasowej do ANB:
Odpowiednią pochodną aminokwasową (9-krotny nadmiar molowy w stosunku do osadzenia żywicy) rozpuszczono w pirydynie i przeniesiono do kolby zawierającej żywicę z osadzonym ANB. Całość chłodzono do uzyskania temperatury -15°C (łaźnia lodowa: 1 cz. wagowa NH4CI, 1 cz. wagowa NaNOs, 1 cz. wagowa lodu). Po osiągnięciu żądanej temperatury dodano POCI3 (w stosunku 1 : 1 do użytej ilości
PL 241 174 B1 pochodnej aminokwasowej) i całość mieszano na mieszadle magnetycznym: 20 minut w -15°C, 30 minut w temperaturze pokojowej oraz 6 godzin w 40°C (łaźnia olejowa). Po zakończeniu reakcji żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF oraz MeOH i zostawiono do wysuszenia.
W kolejnym etapie przyłączono resztę w pozycji P2 (alaninę).
Wszystkie przyłączania reszt aminokwasowych poprzedzono przemywaniem żywicy za pomocą DMF przez 5 minut. W kolejnych przyłączaniach jako środek sprzęgający stosowano diizopropylokarbodiimid. Procedurę powtarzano dwukrotnie.
Po każdym z acylowań rozpoczynano cykl przemywań żywicy, a następnie wykonywano test chloranilowy, w celu monitorowania przyłączania pochodnej aminokwasowej do wolnych grup aminowych żywicy.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty, IsOH 3 x 2 minuty, DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzonych testów po dwóch pierwszych sprzęganiach zabarwienie ziaren najpierw było zielone, a następnie szare, więc konieczne było przeprowadzenie kolejnego acylowania, w wyniku którego ziarna żywicy badanej testem chloranilowym były bezbarwne. Świadczyło to o przyłączeniu ANB do żywicy TentaGel S RAM, co pozwoliło przejść do następnego etapu syntezy peptydu. h) Przyłączanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych:
Znajdującą się w reaktorku żywicę wraz z przyłączoną resztą ANB przemyto za pomocą DMF, a następnie przystąpiono do deprotekcji osłony Fmoc z grupy aminowej, w celu przyłączenia chronionej pochodnej aminokwasowej alaniny.
Usunięcie osłony Fmoc:
DMF 1 x 5 minut, 20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty, 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty, IsOH 3 x 2 minuty, DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym świadczyło zielone zabarwienie ziaren żywicy. Pozwoliło to na rozpoczęcie kolejnego etapu - przyłączania reszty aminokwasowej Fmoc-Thr(tBu)-OH.
Przyłączanie pochodnej aminokwasowej:
Wykonywane sprzęgania poprzedzono przemywaniem żywicy w DMF. Podczas przyłączania chronionej reszty kwasu glutaminowego skład mieszaniny sprzęgającej pozostawał bez zmian.
Po zakończeniu każdego z acylowań stosowano cykl przemywań rozpuszczalnikami według podanej procedury, a następnie przeprowadzono test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych w roztworze.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty, IsOH 3 x 2 minuty, DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
Podczas testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu ziarna żywicy były bezbarwne, co pozwoliło na przejście do kolejnego etapu syntezy, jakim było wprowadzenie kolejnej chronionej pochodnej aminokwasowej - treoniny i cząsteczki kwasu 2-aminobenzoesowego. Procesy sprzęgania odbyły się zgodnie z procedurą omówioną wcześniej.
Testy przeprowadzone po przyłączeniu wyżej wymienionych reszt wykazały wyniki pozytywne, ziarna żywicy były bezbarwne.
2. Usuwanie peptydu z nośnika
Po zakończeniu syntezy amid peptydu ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2 usunięto z nośnika wraz z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: TFA : fenol : woda : TIPS (88 : 5 : 5 : 2, v/v/v/v) w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym.
Po upływie 3 godzin zawartość kolby odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta z przemywaniem eterem dietylowym. Powstały osad odwirowano na wirówce
PL 241 174 B1
SIGMA 2K30 (Laboratory Centrifuges) w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszczono w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddano liofilizacji.
Tożsamość/charakterystyka nowego związku - analiza HPLC, MS
Warunki HPLC: kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8 250 mm 4 mm, układ faz A 0,1% TFA w wodzie, B: 80% acetonitrylu w A), przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy 226 nm.
Potwierdzono otrzymanie związku.
P r z y k ł a d 2
Otrzymywanie związku o wzorze: ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-pNA6 (wzór 3).
Proces prowadzono w podobny sposób jak opisano w przykładzie 1, z tym, że wykorzystano odpowiednie pochodne aminokwasowe i dodatkowe podstawniki, a proces przeprowadzano częściowo w roztworze, a częściowo na nośniku stałym.
Otrzymanie p-nitroanilidu Ala
a) Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie chronionego peptydu, który otrzymano metodą syn- tezy w fazie stałej z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu.
Związek ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH, gdzie ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej z wykorzystaniem następujących pochodnych aminokwasowych:
Boc-ABZ, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ala.
Syntezę związku prowadzono na nośniku stałym, żywicy 2-chloro-chlorotytylowej, np. firmy Iris BIOTECH GMBH (Niemcy), o osadzeniu grup 1,6 mmol Cl/g.
Syntezę związku prowadzono manualnie z zastosowaniem wytrząsarki laboratoryjnej. Przez wszystkie etapy reaktor stanowiła strzykawka o pojemności 25 ml, zakończona spiekiem do syntezy w fazie stałej.
Syntezę peptydów wykonano na nośniku, żywicy 2-chloro-chlorotytylowej, np. firmy Iris BIOTECH GMBH (Niemcy), o osadzeniu grup 1,6 mmol Cl/g. W pierwszym etapie dokonano spulchnienia żywicy poprzez cykl przemywań. Kolejno przystąpiono do usunięcia z nośnika osłony grupy aminowej Fmoc, za pomocą 20% roztworu piperydyny w NMP. Następnie przeprowadzono cykl przemywań rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 1 x 10 minut, IsOH 1 x 10 minut, DCM 1 x 10 minut.
Usunięcie osłony Fmoc:
DMF 1 x 5 minut, 20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty, 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty, IsOH 3 x 2 minuty, DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
Test chloranilowy polegał na przeniesieniu, za pomocą łopatki, kilku ziaren żywicy z reaktora, tj. strzykawki, do szklanej ampułki, do której następnie dodano 100 μl nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 μl świeżego aldehydu octowego. Po upływie 10 minut przeprowadzono kontrolę zabarwienia ziaren.
Na tym etapie, po przeprowadzeniu testu, otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które świadczyło o obecności wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usunięcia osłon 9-fluorenylometoksykarbonylowych z żywicy można było przystąpić do kolejnego etapu, przyłączania pochodnej Fmoc-Ala. b) Osadzenie Fmoc-Ala na nośniku stałym
Pierwszym etapem syntezy biblioteki peptydowej było osadzenie Fmoc-Ala na 1 g żywicy. Przed przyłączeniem pochodnej aminokwasowej przemyto żywicę używaną do reakcji następującymi rozpuszczalnikami: DMF (dimetyloformamid), DCM (chlorek metylenu) i ponownie DMF, po czym usunięto osłonę Fmoc- z grupy funkcyjnej nośnika. Jeden cykl usuwania osłony Fmoc- obejmował następujące etapy:
Usunięcie osłony Fmoc-:
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty, 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut.
PL 241 174 B1
Przemywanie:
DMF 3 x 2 minuty, IsOH 3 x 2 minuty, DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych:
Żywicę z wolną grupą aminową przemyto DMF. W osobnej kolbie rozpuszczono Fmoc-Ala w DMF i dodano kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: Fmoc-Pro/TBTU/DMAP/DEPEA, 3 : 3 : 2 : 6. Tak przygotowaną mieszaninę dodano do żywicy i mieszano przez 3 godziny. Żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF, DCM i izopropanolem, a całą procedurę acylowania powtórzono dwa razy. Do przeprowadzenia kolejnych reakcji przyłączania Fmoc-Pro do żywicy zastosowano heksafluorofosforan O -(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetrametylouroniowy (HATU), a potem heksafluorofosforan O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetrametylouroniowy (HBTU). W ostatnim etapie żywicę przemyto kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i suszono na powietrzu.
c) Przyłączanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych:
Żywicę wraz z przyłączoną resztą Fmoc-Ala znajdującą się w reaktorku przemyto za pomocą DMF, a następnie przystąpiono do deprotekcji osłony Fmoc z grupy aminowej w celu przyłączenia chronionej pochodnej aminokwasowej treoniny.
Usunięcie osłony Fmoc:
DMF 1 x 5 minut, 20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty, 20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty, IsOH 3 x 2 minuty, DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym świadczyło zielone zabarwienie ziaren żywicy. Pozwoliło to na rozpoczęcie kolejnego etapu - przyłączania reszty aminokwasowej Fmoc-Thr(tBu)-OH.
Przyłączanie pochodnej aminokwasowej:
Wykonywane sprzęgania poprzedzono przemywaniem żywicy w DMF. Podczas przyłączania chronionej reszty kwasu glutaminowego skład mieszaniny sprzęgającej pozostawał bez zmian.
Po zakończeniu każdego z acylowań stosowano cykl przemywań rozpuszczalnikami według podanej procedury, a następnie przeprowadzono test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych w roztworze.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty, IsOH 3 x 2 minuty, DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
Ziarna żywicy podczas testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu były bezbarwne, co pozwoliło na przejście do kolejnego etapu syntezy, jakim było wprowadzenie kolejnej chronionej pochodnej aminokwasowej - treoniny i cząsteczki kwasu 2-aminobenzoesowego. Procesy sprzęgania odbyły się zgodnie z procedurą omówioną wcześniej.
Testy przeprowadzone po przyłączeniu wyżej wymienionych reszt wykazały wyniki pozytywne, ziarna żywicy były bezbarwne.
d) Usuwanie peptydu z nośniku z zachowaniem osłon grup bocznych
Po zakończeniu syntezy chroniony peptyd ABZ-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Ala-OH usunięto z nośnika wraz z zachowaniem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: kwas octowy : TFE (trifluoroetanol) : DCM (2 : 2 : 6, v/v/v) w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym.
Po upływie 2 godzin zawartość kolby odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta z przemywaniem mieszaniną ściągającą. Roztwór przemyto heksanem (1 : 10 v/v), odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie poddano liofilizacji.
e) Chemiczna synteza pochodnych paranitroanilidu Arg
Do syntezy Fmoc-Arg(Pbf)-pNA wykorzystano metodę mieszanych bezwodników. W pierwszym etapie 2 mmole Fmoc-Arg(Pbf) rozpuszczono w bezwodnym tetrahydrofuranie (THF) w obecności 2 mmoli N-metylomorfoliny (NMM). Grupa karboksylowa pochodnej aminokwasowej była aktywowana 2 mmolami chlorku izobutylu. Po 10 minutach aktywacji dodano 3 mmmole p-nitroaniliny. Reakcje
PL 241 174 B1 prowadzono przez 2 godziny w temperaturze -15°C, a następnie dobę w temperaturze pokojowej. Po skończonej reakcji rozpuszczalnik odparowano, a suchą pozostałość rozpuszczono w octanie etylu. Otrzymany roztwór przemywano kolejno nasyconym wodnym roztworem NaCl, 10% kwasem cytrynowym, 5% wodorowęglanem sodu. Otrzymany roztwór wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, octan etylu oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a suchą pozostałość suszono w eksykatorze próżniowym nad P2O5 i KOH.
f) Sprzęganie chronionego peptydu z para-nitroanilidem Arg(Pbf)
Chroniony peptyd ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH rozpuszczono w niewielkiej ilości DCM, po czym aktywowano za pomocą TFFH (tetrametylofluoroformamid) przez 30 minut w temperaturze 0°C. Następnie dodano katalityczną ilość DMAP oraz Arg(Pbf)-pNA. Reakcję prowadzono przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, po czym odparowano rozpuszczalnik. Otrzymany roztwór zalano mieszaniną ściągającą osłony boczne: TFA : fenol : woda : TIPS (88 : 5 : 5 : 2, v/v/v/v) i mieszano w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym przez 3 godziny.
Po tym czasie do kolby dodano zimny eter dietylowy, a powstały osad odwirowano na wirówce wysokoobrotowej przy 5 tys. obrotów na minutę w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszczono w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddano liofilizacji.
Tożsamość/charakterystyka nowego związku - analiza HPLC, MS
Warunki HPLC: kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8 250 mm 4 mm, układ faz A 0,1% TFA w wodzie, B: 80% acetonitrylu w A), przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy 226 nm. Potwierdzono otrzymanie związku.
P r z y k ł a d 3
Badanie zastosowania nowych związków wykonano na grupie 10 chorych z diagnozą nowotworu trzustki. W tym celu związek o wzorze 2: ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2 lub o wzorze 3: ABZ-Thr-ThrAla-Arg-pNA rozpuszczono w dimetylosuflotlenku (w stężeniu 0,5 mg/ml), a następnie 50 μl takiego roztworu zmieszano z 120 μl buforu (200 mM Tris-HCl, pH 8,0) i 80 μl moczu osoby chorej na nowotwór (raka) trzustki. Pomiar wykonano w płytce 96 dołkowej przeznaczonej do pomiaru absorbancji, a każdą próbkę analizowano w temperaturze 37°C w trzech powtórzeniach. Czas trwania pomiaru wynosił 60 minut. W czasie pomiaru monitorowano długość fali charakterystyczną dla uwalniającego się chromoforu (ANB-NH2 lub pNA) - przy długości fali 405 nm (zakres 380-430 nm).
W wyniku pomiaru zaobserwowano wzrost zabarwienia roztworu w czasie we wszystkich próbkach moczu pochodzących od osób z diagnozą nowotworu trzustki. Obserwowana wielkość wzrostu absorbancji w czasie jest różna dla każdej z badanych próbek. Odmienny efekt uzyskano dla 15 próbek osób zdrowych, gdyż w żadnej z tych 15 badanych próbek moczu nie zaobserwowano wzrostu absorbancji w zakresie diagnostycznym.
Jak pokazano na Figurze 4 analiza RP HPLC losowo wybranego systemu zawierającego mocz pochodzącego od osoby z diagnozą nowotworu trzustki wskazuje na to, że zarówno związek o wzorze 2, jak i o wzorze 3, rozpada się na fragment peptydowy ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg i grupy chromoforowe, w przypadku związku o wzorze 2 - ANB-NH2, a w przypadku związku o wzorze 3 - pNA. Analiza HPLC: Substrat ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2 w buforze o składzie 200 mM Tris-HCl, pH 8,0. Wyniki tej analizy badanego związku przedstawiono na Figurze 4.
Figura 1 wskazuje, że wszystkie próbki 1-10 uległy rozpadowi, lecz w przypadku próbek 3 i 10 rozpad substratu, tj. związku ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2, zachodzi wydajniej niż w przypadku materiałów 2 czy 9. Taki rezultat może być spowodowany różnicą w aktywności, jak i ilości enzymów odpowiedzialnych za proteolizę. Ponadto Figura 1 wskazuje, że inkubacja roztworu związku o wzorze 2 z próbkami moczu pochodzącymi od osób zdrowych (bez zdiagnozowanego nowotworu) nie prowadzi do wzrostu absorbancji, a zatem nie zachodzi hydroliza badanego związku. Rezultat wskazuje na brak obecności enzymów proteolitycznych charakterystycznych dla nowotworu trzustki.
Podobny obraz otrzymano przy zastosowaniu związku o wzorze 3: ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-pNA - zobacz Figura 2.
Przeprowadzono pomiary zależności aktywności proteolitycznej od odczynu środowiska reakcji. W wyniku tego eksperymentu stwierdzono, że w badanym materiale występuje co najmniej jeden enzym wykazujący maksimum aktywności w pH zasadowym (Fig. 3).
PL 241 174 B1
Podsumowanie
Analiza potwierdziła przydatność zastosowania związków według przykładów w diagnostyce nowotworu trzustki. Mechanizm działania nowego związku polega na jego hydrolizie enzymatycznej w takim miejscu, które prowadzi do uwolnienia wolnych cząsteczek chromoforów, odpowiednio ANB-NH2 (amid kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego) lub pNA (para-nitroaniliny), które wykazują absorbancję przy długości fali 320-480 nm, zwłaszcza 380-430 nm.

Claims (2)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Związek chemiczny - marker diagnostyczny - o wzorze ogólnym 1: ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-X6, gdzie:
    ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy,
    X oznacza ANB-NH2 lub pNA.
    przy czym ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego,
    ANB oznacza kwas 5-amino-2-nitrobenzoesowy, a pNA oznacza para-nitroanilinę.
  2. 2. Sposób diagnozowania in vitro nowotworu trzustki, znamienny tym, że związek chemiczny o wzorze ogólnym 1 jak zdefiniowano w zastrz. 1 inkubuje się, w przedziale stężeń 0,1-10 mg/ml, korzystnie w stężeniu 1 mg/ml, w buforze pomiarowym o pH obojętnym lub zasadowym, korzystnie fizjologicznym, z niewielką ilością ludzkiego moczu, w zakresie proporcji 1 : 2 do 1 : 10, korzystnie 1 : 5, próbki moczu do buforu pomiarowego, i mierzy się intensywność absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze z przedziału 25-40°C, korzystnie 36-38°C, przy czym wzrost intensywności absorbancji w badanej próbce wskazuje na obecność nowotworu trzustki.
PL430348A 2019-06-24 2019-06-24 Związek chemiczny-marker diagnostyczny nowotworu trzustki oraz sposób diagnozowania in vitro nowotworu trzustki PL241174B1 (pl)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL430348A PL241174B1 (pl) 2019-06-24 2019-06-24 Związek chemiczny-marker diagnostyczny nowotworu trzustki oraz sposób diagnozowania in vitro nowotworu trzustki
EP20733488.9A EP3987050A1 (en) 2019-06-24 2020-06-23 Novel diagnostic marker for pancreatic cancer
BR112021026192A BR112021026192A2 (pt) 2019-06-24 2020-06-23 Marcador de diagnóstico para câncer pancreático
PCT/EP2020/067542 WO2020260309A1 (en) 2019-06-24 2020-06-23 Novel diagnostic marker for pancreatic cancer
AU2020306623A AU2020306623A1 (en) 2019-06-24 2020-06-23 Novel diagnostic marker for pancreatic cancer
KR1020227002283A KR20220024867A (ko) 2019-06-24 2020-06-23 새로운 췌장암 진단 마커
MX2021016095A MX2021016095A (es) 2019-06-24 2020-06-23 Nuevo marcador de diagnostico para cancer pancreatico.
US17/622,070 US20220251625A1 (en) 2019-06-24 2020-06-23 Novel diagnostic marker for pancreatic cancer
CN202080045600.3A CN114096555A (zh) 2019-06-24 2020-06-23 新型胰腺癌诊断标志物
CA3144839A CA3144839A1 (en) 2019-06-24 2020-06-23 Diagnostic marker for pancreatic cancer
JP2021577260A JP2022538862A (ja) 2019-06-24 2020-06-23 膵臓がんの新規診断マーカー
IL289348A IL289348A (en) 2019-06-24 2021-12-23 A new diagnostic marker for pancreatic cancer

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL430348A PL241174B1 (pl) 2019-06-24 2019-06-24 Związek chemiczny-marker diagnostyczny nowotworu trzustki oraz sposób diagnozowania in vitro nowotworu trzustki

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL430348A1 PL430348A1 (pl) 2020-12-28
PL241174B1 true PL241174B1 (pl) 2022-08-16

Family

ID=83560142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL430348A PL241174B1 (pl) 2019-06-24 2019-06-24 Związek chemiczny-marker diagnostyczny nowotworu trzustki oraz sposób diagnozowania in vitro nowotworu trzustki

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL241174B1 (pl)

Also Published As

Publication number Publication date
PL430348A1 (pl) 2020-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hudson et al. Methionine enkephalin and isosteric analogues I. Synthesis on a phenolic resin support
PL99020B1 (pl) Sposob wytwarzania nowych enzymatycznych substratow chromogenicznych oraz ich soli do oznaczania proteaz seryny a zwlaszcza czynnika xa
CN115989413A (zh) 前列腺癌的新型诊断标志物
PL241174B1 (pl) Związek chemiczny-marker diagnostyczny nowotworu trzustki oraz sposób diagnozowania in vitro nowotworu trzustki
PL225341B1 (pl) Nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów
EP0123951A2 (en) Intermediates for thymosin alpha 1
GB1584669A (en) Process for synthesising peptides containing a sulphated tyrosine residue
CN115368437A (zh) 一种固相合成环状多肽的方法
US20240353410A1 (en) Fret enzymatic substrate and uses thereof in liver cancer
KR20000057503A (ko) 펩티드, 사람 펩시노오겐 ｉ 또는 사람 펩신 ｉ의 측정 방법,및 측정용 키트
KR20240099390A (ko) Fret 효소 기질 및 간암에서의 그 용도
EP3431490B1 (en) Chemical compounds for use as diagnostic markers of inflammation and neoplams, the method for synthesis of the chemical compounds, diagnostic kit for use in diagnosis of inflammatory processes and epithelial neoplasms and in vitro diagnostic method of inflammatory processes and epithelial neoplasms
KR20240120719A (ko) Fret 효소 기질 및 폐암에서의 그 용도
US10556925B2 (en) Compound, process for its preparation, a pharmaceutical solution containing the compound, a method of determining the presence of cancer, a kit for cancer detection, and the use of hydrolysis of the compound for the detection of cancer
PL236125B1 (pl) Związki chemiczne mające zastosowanie jako markery diagnostyczne stanu zapalnego i nowotworów, sposób ich otrzymywania, marker diagnostyczny i metoda diagnozowania procesów zapalnych i nowotworów nabłonkowych
CN118871453A (zh) 化合物——肠癌诊断标志物、酶活性检测方法、肠癌诊断方法、包含该化合物的试剂盒、化合物的用途和治疗肠癌的方法
PL245425B1 (pl) Związek-marker diagnostyczny raka trzonu macicy, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka trzonu macicy, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego
AU2023256464A1 (en) Compound - diagnostic marker for kidney cancer, method lor detecting enzymaticactivity, method for diagnosis of kidney cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of kidney cancer
PL238575B1 (pl) Związek oraz jego zastosowanie do wykrywania nowotworów nabłonkowych
PL238699B1 (pl) Związek chemiczny mający zastosowanie jako marker diagnostyczny nowotworów, sposób otrzymywania, metoda diagnozowania nowotworów nabłonkowych
AU2023241522A1 (en) Compound - diagnostic marker for intestinal cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of intestinal cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of intestinal cancer
CN111777668B (zh) 一种基于海洋环肽Samoamide A的改造多肽、合成方法及应用
WO2024072241A1 (en) Compound - diagnostic marker for ovarian cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of ovarian cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of ovarian cancer
PL238700B1 (pl) Związki chemiczne mające zastosowanie jako markery diagnostyczne stanu zapalnego i nowotworów do zastosowania jako zestaw diagnostyczny i metoda diagnozowania i różnicowania procesów zapalnych i nowotworów nabłonkowych
WO2024172675A1 (en) Peptides and their labelled derivatives suitable for use in the diagnosis of diabetes or its complications