PL238699B1 - Związek chemiczny mający zastosowanie jako marker diagnostyczny nowotworów, sposób otrzymywania, metoda diagnozowania nowotworów nabłonkowych - Google Patents
Związek chemiczny mający zastosowanie jako marker diagnostyczny nowotworów, sposób otrzymywania, metoda diagnozowania nowotworów nabłonkowych Download PDFInfo
- Publication number
- PL238699B1 PL238699B1 PL434553A PL43455318A PL238699B1 PL 238699 B1 PL238699 B1 PL 238699B1 PL 434553 A PL434553 A PL 434553A PL 43455318 A PL43455318 A PL 43455318A PL 238699 B1 PL238699 B1 PL 238699B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- pna
- abz
- val
- trp
- lys
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 8
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 title abstract description 8
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 26
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 26
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 21
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 14
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 7
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- -1 2-chlorochlorotrityl Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 5
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 2
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N tetrachloro-1,4-benzoquinone Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C(Cl)C1=O UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 8
- 208000034179 Neoplasms, Glandular and Epithelial Diseases 0.000 description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100074988 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) nmp-1 gene Proteins 0.000 description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tris[(dimethylamino)methyl]phenol Chemical compound CN(C)CC1=CC(CN(C)C)=C(O)C(CN(C)C)=C1 AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- ZPGDWQNBZYOZTI-UHFFFAOYSA-N 1-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCN1C(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ZPGDWQNBZYOZTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 3
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 3
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000007821 HATU Substances 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012317 TBTU Substances 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000006593 Urologic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 208000010932 epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000035778 pathophysiological process Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 1
- DYWUPCCKOVTCFZ-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-amino-3-[1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]indol-3-yl]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2N(C(=O)OC(C)(C)C)C=C(C[C@H](N)C(O)=O)C2=C1 DYWUPCCKOVTCFZ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- VVQIIIAZJXTLRE-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCCCC[C@H](N)C(O)=O VVQIIIAZJXTLRE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZZOKVYOCRSMTSS-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl carbamate Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N)C3=CC=CC=C3C2=C1 ZZOKVYOCRSMTSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N Bestatin Chemical compound CC(C)C[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N Bestatin Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000201986 Cassia tora Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 208000008636 Neoplastic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010046431 Urethral cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046458 Urethral neoplasms Diseases 0.000 description 1
- WXIONIWNXBAHRU-UHFFFAOYSA-N [dimethylamino(triazolo[4,5-b]pyridin-3-yloxy)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CN=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 WXIONIWNXBAHRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 108010021331 carfilzomib Proteins 0.000 description 1
- BLMPQMFVWMYDKT-NZTKNTHTSA-N carfilzomib Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)[C@]1(C)OC1)NC(=O)CN1CCOCC1)CC1=CC=CC=C1 BLMPQMFVWMYDKT-NZTKNTHTSA-N 0.000 description 1
- 229960002438 carfilzomib Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- QTBFPMKWQKYFLR-UHFFFAOYSA-N isobutyl chloride Chemical compound CC(C)CCl QTBFPMKWQKYFLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- VWBWQOUWDOULQN-UHFFFAOYSA-N nmp n-methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O.CN1CCCC1=O VWBWQOUWDOULQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NCAIGTHBQTXTLR-UHFFFAOYSA-N phentermine hydrochloride Chemical compound [Cl-].CC(C)([NH3+])CC1=CC=CC=C1 NCAIGTHBQTXTLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000003741 urothelium Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Związek o wzorze ogólnym: ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6 gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, pNA oznacza 4-nitroanilinę oraz sposób otrzymywania związku. Wynalazek obejmuje marker diagnostyczny o wzorze ogólnym ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5 -pNA6 do zastosowania w diagnostyce nowotworu oraz sposób diagnozowania nowotworu nabłonkowego w materiale biologicznym ssaka z użyciem markera.
Description
Opis wynalazku
Przedmiot wynalazku mieści się w dziedzinie diagnostyki nowotworów, zwłaszcza nabłonkowych, jak i markerów diagnostycznych umożliwiających wykrywanie, rozwój nowotworów nabłonkowych. Wynalazek dotyczy związku do zastosowania medycznego - diagnostycznego - w diagnostyce nowotworów nabłonkowych, przy czym związki te używane są jako odczynnik diagnostyczny - marker diagnostyczny - do wykrywania procesu patofizjologicznego w materiale biologicznym ssaków, zwłaszcza krwi i moczu człowieka. Wynalazek dotyczy również sposobu otrzymywania związku na bazie łańcucha aminokwasów, które znajdują zastosowanie w diagnostyce nowotworów nabłonkowych.
Znane są związki i markery diagnostyczne do wykrywania stanu zapalnego i procesu nowotworzenia.
Wciąż poszukuje się nowych związków diagnostycznych mogących w sposób jak najbardziej czuły i specyficzny wykryć procesy chorobowe jak w najwcześniejszym etapie procesu patofizjologicznego.
Przedmiotem wynalazku było opracowanie czułego i specyficznego markera diagnostycznego, który umożliwi zdiagnozowanie nowotworu, zwłaszcza nabłonkowego, zwłaszcza raka pęcherza, raka przewodów moczowych, raka cewki moczowej, czy też innych nowotworów, którym towarzyszy podwyższeniem aktywności enzymów proteolitycznych, i których to proces chorobowy może być obserwowany w materiale biologicznym, zwłaszcza moczu pacjenta, na bardzo wczesnym etapie chorobotwórczym.
Nieoczekiwanie okazało się, że opracowany nowy związek zawierający aminokwasy stanowi marker diagnostyczny, które jedynie w obecności enzymów proteolitycznych, które są wynikiem nowotworu nabłonkowego, i które to enzymy uwalniane są i obecne w materiale biologicznym, wykazuje właściwości chromogeniczne i/lub fluorogeniczne mierzone w zakresie fal 300-500 nm, zwłaszcza 380-430. Właściwości barwne są obserwowane podczas hydrolizy enzymatycznej tego związku w materiale biologicznym, zwłaszcza moczu i krwi pacjenta, u którego rozwinął się nowotwór nabłonkowy. W przypadku nowotworów, proces ten wiąże się ze skutkami choroby nowotworowej czyli podwyższeniem aktywności enzymów proteolitycznych guza i okolicznych tkanek wynikających z wielu procesów, do których zalicza się podwyższoną angiogenezę, remodeling tkanek, nekrozę tkanek zdrowych wskutek nacieku nowotworu a także apoptozę komórek nowotworowych.
W trakcie badań prowadzonych w Pracowni Analityki i Nanodiagnostyki Biochemicznej Uniwersytetu Gdańskiego przeprowadzono identyfikację związków, które byłyby podatne na zwiększoną aktywność proteolityczną w materiale biologicznym, zwłaszcza ludzkim moczu mających zastosowanie jako markery diagnostyczne nowotworów nabłonkowych, w tym zwłaszcza nowotworu nabłonka układu moczowego. W trakcie badań przeprowadzono badanie eksperymentalne na materiale biologicznym człowieka, w tym moczu osób chorych, u których potwierdzono reakcję nowotwory nabłonkowe na różnym etapie rozwoju, jak i moczu osób z wykluczonym stanem zapalnym - grupie kontrolnej.
W wyniku tych badań został opracowany związek o sekwencji ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6, gdzie ABZ to kwas 2-aminobenzoesowy zaś pNA to para-nitroanilina, który znajduje zastosowanie jako marker do wykrywania nowotworu nabłonkowego.
W diagnostyce towarzyszy hydroliza enzymatyczna markeru - w wyniku uwalniania enzymów w trakcie procesów proteolitycznych uwalnianych w wyniku rozwoju nowotworu nabłonkowego. Proces ten obserwuje się poprzez odpowiednio monitoring uwalnianej cząsteczki pNA (p -nitroanilina) przy długości fali 300-400, korzystnie 380-430 nm, czyli hydroliza następuje w pozycji 5 związku - po 5-tym w kolejności aminokwasie.
Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze: ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, pNA oznacza 4-nitroanilinę.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania związku ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, a pNA oznacza 4-nitroanilinę, zaś związek otrzymuje się w syntezie na nośniku stałym i częściowo w buforze lub tylko na nośniku stałym i sposób prowadzi się w następujących etapach:
a) przygotowanie żywicy 2-chlorochlorotrytylowej,
b) deprotekcja grupy ochronnej,
c) osadzenie Val4 na żywicy,
d) powtarzanie etapów od b) do c) aż do momentu uzyskania ABZ1-Met2-Lys3-Val4;
e) odszczepienie otrzymanego peptydu od żywicy,
PL 238 699 B1
f) otrzymanie paranitroanilidu aminokwasu (Trp-pNA),
g) sprzęganie paranitroanilidu z chronionym peptydem (ABZ-Met-Lys-Val+Trp-pNA, h) usunięcie osłon grup bocznych aminokwasów.
Przedmiotem wynalazku jest marker diagnostyczny o wzorze ogólnym ABZ1-Met2-Lys3-Val4-T rp5-pNA6, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy a pNA oznacza 4-nitroanilinę, do zastosowania w diagnostyce nowotworu, zwłaszcza nabłonkowego.
Przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania nowotworu nabłonkowego w materiale biologicznym ssaka, który charakteryzuje się według wynalazku tym, że jako marker diagnostyczny stosuje się związek o wzorze ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6, który stanowi marker nowotworu; gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, pNA oznacza 4-nitroanilinę, przy czym związek dodaje się do materiału biologicznego, a następnie dokonuje się pomiaru absorbancji przy długości fali w zakresie od 300 do 500 nm. Wykazanie zabarwienia, wzrostu absorbancji, wskazuje na wynik pozytywny. Zabarwienie jest wynikiem hydrolizy enzymatycznej związku zwłaszcza w pozycji 5 - po piątym z kolei aminokwasie, pod wpływem enzymów proteolitycznych obecnych w materiale biologicznym in vitro w wyniku procesu związanego z obecnością nowotworu in vivo. Czas odczytu absorbancji ustala się w zależności od ilości dodanego związku. Odczyt może nastąpić po około 60 minutach.
Korzystnie, pomiaru absorbancji dokonuje się przy długości fali 380-430 nm.
Związek o wzorze ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6, gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy a pNA oznacza 4-nitroanilinę otrzymuje się w syntezie na nośniku stałym i sposób prowadzi się w następujących etapach:
a) przygotowanie żywicy 2-chIorochlorotrytylowej,
b) deprotekcja grupy ochronnej np. Fmoc,
c) osadzenie Val4 na żywicy,
d) powtarzanie etapów od b) do c) aż do momentu uzyskania ABZ1-Met2-Lys3-Val4;
e) odszczepienie otrzymanego peptydu od żywicy
f) otrzymanie paranitroanilidu aminokwasu (Trp-pNA)
g) sprzęganie paranitroanilidu z chronionym peptydem (ABZ-Met-Lys-Val+Trp-pNA,
h) usunięcie osłon grup bocznych aminokwasów (Lys(Boc), Trp(Boc)).
Część określeń stosowanych powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:
Nowotwór nabłonkowy - czyli taki, którego komórki wywodzą się z nabłonka gruczołów wydzielania zewnętrznego i wewnętrznego oraz z przewodów tych gruczołów, np. nowotwór nabłonka układu moczowego.
Właściwości chromogeniczne - oznaczają powstawanie produktu barwnego
Właściwości fluorogeniczne - oznaczają powstawanie produktu emitującego fluorescencję
NMP - N-metylopirolidon DMF - dimetyloformamid
DCM - chlorek metylenu pNA - 4-nitroanilina, para-nitroanilina
ABZ - kwas 2-aminobeznoesowy.
Wynalazek przedstawiono bliżej w przykładach wykonania na rysunku.
Fig. 1 -- przedstawia szybkość hydrolizy substrata ABZ-Met-Lys-Val-Trp-pNA w próbkach moczu ze zdiagnozowanym nowotworem. Cyfry arabskie oznaczają numer losowo wybranej próbki moczu.
Fig. 2 - przedstawia szybkości hydrolizy substratu ABZ-Met-Lys-Val-Trp-pNA w zależności od obecności inhibitorów różnych klas enzymów.
Fig. 3 - przedstawia zależność stopnia hydrolizy substratu ABZ-Met-Lys-Val-Trp-pNA od środowiska pH.
Fig. 4 - przedstawia wydajności hydrolizy substratu ABZ-Met-Lys-Val-Trp-pNA w zależności od stopnia zagęszczenia ludzkiego moczu ze stwierdzonym nowotworem nabłonka układu moczowego.
Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia.
P r z y k ł a d 1
Otrzymywanie związku ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6 gdzie:
ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, pNA oznacza 4-nitroanilinę.
PL 238 699 B1
Proces prowadzi się w sposób manualny - z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu, czyli z użyciem osłon. Wykorzystuje się odpowiednie pochodne aminokwasowe i dodatkowe podstawniki, a proces przeprowadza się częściowo w roztworze częściowo na nośniku stałym.
Otrzymanie p-nitroanilidu Trp
a. Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie chronionego peptydu, który otrzymano metodą syntezy w fazie stałej z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu
Związek ABZ1-Met2-Lys(Boc)3-VaI4-OH, gdzie ABZ - oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej z wykorzystaniem następujących pochodnych aminokwasowych:
Boc-ABZ, Fmoc-Met, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Val.
Syntezę związku prowadzono na nośniku stałym:
- żywica 2-chloro-chlorotytylowa np. firmy Iris BIOTECH GMBH (Niemcy) o osadzeniu grup 1,6 mmol Cl/g
Syntezę związku prowadzono manualnie z zastosowaniem wytrząsarki laboratoryjnej. Przez wszystkie etapy reaktor stanowiła strzykawka zakończona spiekiem do syntezy w fazie stałej o pojemności 25 ml,
Syntezę peptydów wykonano na żywicy 2-chloro-chlorotytylowa firmy Iris BIOTECH GMBH (Niemcy) o osadzeniu grup 1,6 mmol Cl/g. W pierwszym etapie dokonano spulchnienia żywicy poprzez cykl przemywań. Kolejno przystąpiono do usunięcia z nośnika osłony grupy aminowej Fmoc - za pomocą 20% roztworu piperydyny w NMP.
Następnie przeprowadzono cykl przemywań rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 1 x 10 minut
IsOH 1 x 10 minut
DCM 1 x 10 minut
Usunięcie osłony Fmoc :
DMF 1 x 5 minut
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
b) Test chloranilowy:
Test chloranilowy polegał na przeniesieniu za pomocą łopatki, kilku ziaren żywicy z reaktora strzykawki do szklanej ampułki, do której następnie dodano 100 μl nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 μl świeżego aldehydu octowego. Po upływie 10 minut przeprowadzono kontrolę zabarwienia ziaren.
Na tym etapie po przeprowadzeniu testu otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które świadczyło o obecności wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usunięcia osłon 9-fluorenylometoksykarbonylowych z żywicy można było przystąpić do kolejnego etapu, przyłączania pochodnej Fmoc-Val.
b. Osadzenie Fmoc-Val na nośniku stałym
Pierwszym etapem syntezy biblioteki peptydowej było osadzenie Fmoc-Val na 1 g żywicy. Przed przyłączeniem pochodnej aminokwasowej przemyto żywicę używaną do reakcji następującymi rozpuszczalnikami: DMF (dimetyloformamid), DCM (chlorek metylenu) i ponownie DMF, po czym usunięto osłonę Fmoc - z grupy funkcyjnej nośnika. Jeden cykl usuwania osłony Fmoc - obejmował następujące etapy:
Usunięcie osłony Fmoc-:
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut
Przemywanie
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
PL 238 699 B1
Test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych.
Żywicę z wolną grupą aminową przemyto DMF. W osobnej kolbie rozpuszczono Fmoc-Pro w DMF i dodano kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: Fmoc-Pro/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6. Tak przygotowaną mieszaninę dodano do żywicy i mieszano przez 3 godziny. Żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF, DCM i izopropanolem, a całą procedurę acylowania powtórzono dwa razy. Do przeprowadzenia kolejnych reakcji przyłączania Fmoc-Pro do żywicy zastosowano heksafluorofosforan-O -(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetrametylouroniowy (HATU), a potem heksafluorofosforan- O -(benzotriazol-1-yl)- N,N,N’,N’-tetrametylouroniowy (HBTU). W ostatnim etapie żywicę przemyto kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i suszono na powietrzu.
c. Przyłączanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych:
Żywicę wraz z przyłączoną resztą Fmoc-Val znajdującą się w reaktorku przemyto za pomocą DMF, a następnie przystąpiono do deprotekcji osłony Fmoc z grupy aminowej w celu przyłączenia chronionej pochodnej aminokwasowej kwasu glutaminowego.
Usunięcie osłony Fmoc :
DMF 1 x 5 minut
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym świadczyło zielone zabarwienie ziaren żywicy. Pozwoliło to na rozpoczęcie kolejnego etapu - przyłączania reszty aminokwasowej Fmoc-Lys(Boc)-OH.
Przyłączanie pochodnej aminokwasowej.
Wykonywane sprzęgania poprzedzono przemywaniem żywicy w DMF Podczas przyłączania chronionej reszty kwasu glutaminowego skład mieszaniny sprzęgającej pozostawał bez zmian.
Po zakończeniu każdego z acylowań stosowano cykl przemywań rozpuszczalnikami według podanej procedury, a następnie przeprowadzono test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych w roztworze.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty
Test chloranilowy:
Ziarna żywicy podczas testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu były bezbarwne, co pozwoliło na przejście do kolejnego etapu syntezy, jakim było wprowadzenie kolejnej chronionej pochodnej aminokwasowej - metioniny i cząsteczki kwasu 2-aminobenzoesowego. Procesy sprzęgania odbyły się zgodnie z procedurą omówioną wcześniej.
Testy przeprowadzone po przyłączeniu wyżej wymienionych reszt wykazały wyniki pozytywne, ziarna żywicy byty bezbarwne.
d. Usuwanie peptydu z nośniku z zachowaniem osłon grup bocznych
Po zakończeniu syntezy chroniony peptyd ABZ-Met-Lys(Boc)-Val-OH usunięto z nośnika wraz z zachowaniem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: kwas octowy; TFE (trifluoroetanoI):DCM (2:2:6, v/v/v) w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym.
Po upływie 2 godzin zawartość kolby odsączyło się pod zmniejszonym ciśnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta przemywając mieszaniną ściągającą. Roztwór przemyto heksanem (1:10 v/v), odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a następnie poddano liofilizacji.
e. Chemiczna synteza pochodnych paranitroanilidu Trp
Do syntezy Fmoc-Trp-pNA wykorzystano metodę mieszanych bezwodników. W pierwszym etapie 2 mmole Fmoc-Trp rozpuszczono w bezwodnym tetrahydrofuranie (THF) w obecności 2 mmoli N-metylomorfoliny (NMM). Grupa karboksylowa pochodnej aminokwasowej była aktywowana 2 mmolami chlorku izobutylu. Po 10 minutach aktywacji dodano 3 mmmole p-nitroaniliny. Reakcje prowadzono
PL 238 699 B1 przez 2 godziny w temperaturze -15°C, a następnie dobę w temperaturze pokojowej. Po skończonej reakcji rozpuszczalnik odparowano, a suchą pozostałość rozpuszczono w octanie etylu. Otrzymany roztwór przemywano kolejno nasyconym wodnym roztworem NaCl, 10% kwasem cytrynowym, 5% wodorowęglanem sodu. Otrzymany roztwór wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, octan etylu oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a suchą pozostałość suszono w eksykatorze próżniowym nad P2O5 i KOH.
f. Sprzęganie chronionego peptydu z paranitroanilidem Trp
Chroniony peptyd ABZ1-Mer2-Lys(Boc)3-Val4-OH rozpuszczono w niewielkiej ilości DCM, kolejno aktywowano za pomocą TFFH (tetrametylofluoroformamid) przez 30 minut w temperaturze 0°C. Następnie dodano katalityczną ilość DMAP oraz Fmoc-Trp-pNA. Reakcję prowadzono przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, po czym odparowano rozpuszczalnik. Otrzymany roztwór zalano mieszaniną ściągającą osłony boczne: TFA : fenol : woda : TIPS (88 : 5 : 5 : 2, v/v/v/v) i mieszano w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym przez 3 godziny.
Po tym czasie do kolby dodano zimny eter dietylowy, a powstały osad odwirowano na wirówce SIGMA 2K30 (Laboratory Centrifuges) w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszcza się w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddano liofilizacji.
Tożsamość/charakterystyka nowego związku - analiza HPLC, MS
HPLC warunki: kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8 250 mm 4 mm, układ faz A 0,1% TFA w wodzie, B: 80% acetonitrylu w A), przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy 226 nm.
Potwierdzono otrzymanie związku.
P r z y k ł a d 2
Zastosowanie związku otrzymanego według przykładu 1 do diagnostyki nowotworu nabłonkowego in vitro w próbkach biologicznych.
Związek ABZ-Met-Lys-Val-Trp-pNA analizowano pod kątem zastosowania w diagnostyce nowotworów nabłonkowych. Analizę przeprowadzono poprzez ocenę aktywności protolitycznej ludzkiego moczu w próbkach osób chorych: z potwierdzonym nowotworem nabłonkowym i w grupie kontrolnej: bez stanu zapalnego i nowotworu.
Procedura do 80 μl moczu pacjentów z diagnozą nowotworu nabłonka układu moczowego lub mocz od pacjenta zdrowego
- 100 μl buforu (50 mM Tris-HCl, pH 8,3)
- 20 μl substratu ABZ-Met-Lys-Val-Trp-pNA (0,5 mg/ml DMSO - dimetylosulfotlenek)
- Temperatura 37°C
- Pomiar wzrostu absorbacji monitorowano w zakresie 380-430 nm przez 60 minut.
Aktywność proteolityczna enzymów obecnych w badanym materiale biologicznym (próbki moczu ze zdiagnozowanym nowotworem) jest proporcjonalna do intensywności obserwowanego sygnału absorbancji, uwalnianego w wyniku hydrolizy wiązania peptydowego ANB. Hydroliza substratu ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6 następuje w pozycji 5, gdzie otrzymujemy ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5 oraz pNA6.
Peptyd (substrat) o sekwencji ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6 wykazuje niską absorbcję przy długości fali 405/410 nm. Podczas hydrolizy uwalnia się wolna cząsteczka pNA6 która wykazuje maximum absorbancji przy 405/410. Hydroliza peptydu powoduje wzrost stężenia pNA6 i tym samym wzrost absorbancji przy 405/410 nm.
Z wykresu (Fig. 1) odczytać możemy, że w przypadku próbek 5, 6, 4 i 60 rozpad substratu ABZ-Met-Lys-Val-Trp-ANB-NH2 zachodzi wydajniej niż w przypadku materiałów 40; 3, 9 czy 7. Taki rezultat może być spowodowany różnicą w aktywności, jak i ilości enzymów odpowiedzialnych za proteolizę.
Aktywność proteolityczna jest zależna od obecności określonych związków nazywanych inhibitorami w tym celu do połączonych próbek moczu osób chorych (nowotwór nabłonka układu moczowego) dodaliśmy efektywny stężenia hamujące określone klasy enzymów proteolitycznych. Wynik tego eksperymentu przedstawia fig. 2.
Użycie inhibitorów różnych klas enzymów nie spowodowało spadku aktywności proteolitycznej. Jedynie inkubacja moczu z leupeptyną skutkowała zmniejszeniem wydajności hydrolizy. Taki wynik mógłby sugerować obecność proteinaz serynowych bądź cysteinowych. Pozostałe zastosowane inhibi
PL 238 699 Β1 tory także hamują te klasy enzymów, stąd nasuwa się wniosek, że za aktywność enzymatyczną w moczu osób ze zdiagnozowaną chorobą nowotworową pęcherza moczowego odpowiadają) enzym(y) należący(e) do innego rodzaju niż wymienione w powyższej tabeli.
| Inhibitor | Rodzaj inhibitora | Klasa hamowanych enzymów | Stężenie [M] |
| Carfilzomib | Nieodwracalny | proteinazy treoninowe (aktywność chymotrypsynowa ludzkiego proteasomu 20S) | 1,000 X 10‘8 |
| Bestatyna | nieodwracalny | aminop eptydazy | 4,625 χ 10'4 |
| E-64 | nieodwracalny | proteinazy cysteinowe | 3,495 χ 10‘4 |
| Leupeptyna | odwracalny | Proteinazy cysteinowe i serynowe | 2,630 χ 10'4 |
Na aktywność enzymatyczną wpływa wiele czynników, spośród których jednym jest pH środowiska reakcji. Przeprowadzony eksperyment może wskazywać, że w badanym moczu znajdują się enzymy preferujące odmienne warunki. Obserwujemy dwa maksima aktywności proteolitycznej, co sugeruje na obecność co najmniej dwóch proteinaz - z których co najmniej jedna przeprowadzającą hydrolizę w warunkach kwasowych druga zasadowych (fig. 3).
Aby zwiększyć czułość metody detekcji otrzymany materiał biologiczny (ludzki mocz ze stwierdzonym nowotworem nabłonka układu moczowego) został zagęszczony. W tym celu użyto kolumn filtracyjnych Amicon. W wyniku tego procesu otrzymaliśmy czterokrotnie krotnie zagęszczony materiał o aktywności około 4 kromie wyższej niż materiał wyjściowy (fig. 4). Fakt liniowej odpowiedzi na wzrastające stężenie enzymu potwierdza selektywność otrzymanego związku.
Claims (5)
1. Związek o wzorze ogólnym:
ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6 gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, pNA oznacza 4-nitroanilinę.
2. Sposób otrzymywania związku
ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6 gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy a pNA oznacza 4-nitroanilinę, znamienny tym, że związek otrzymuje się w syntezie na nośniku stałym i sposób prowadzi się w następujących etapach:
a) przygotowanie żywicy 2-chlorochlorotrytylowej,
b) deprotekcja grupy ochronnej,
c) osadzenie Val4 na żywicy,
d) powtarzanie etapów od b) do c) aż do momentu uzyskania ABZ1-Met2-Lys3-Val4,
e) odszczepienie otrzymanego peptydu od żywicy,
f) otrzymanie paranitroanilidu aminokwasu (Trp-pNA),
g) sprzęganie paranitroanilidu z chronionym peptydem (ABZ-Met-Lys-Val+Trp-pNA, h) usunięcie osłon grup bocznych aminokwasów.
PL 238 699 B1
3. Marker diagnostyczny o wzorze ogólnym ABZ1-Met2-Lys3-Val4-Trp5-pNA6 gdzie: ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy a pNA oznacza 4-nitroanilinę, do zastosowania w diagnostyce nowotworu.
4. Sposób diagnozowania nowotworu nabłonkowego w materiale biologicznym ssaka, znamienny tym, że jako marker diagnostyczny stosuje się związek według zastrzeżenia 1, przy czym związek dodaje się do materiału biologicznego, a następnie dokonuje się pomiaru absorbancji przy długości fali w zakresie od 300 do 500 nm.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że pomiaru absorbancji dokonuje się przy długości fali 380-430 nm.
PL 238 699 Β1
Rysunki
Fig.l - przedstawia szybkość hydrolizy substratu ABZ-Met-Lys-Val-Trp-pNA w próbkach moczu ze zdiagnozowanym nowotworem. Cyfry arabskie oznaczają numer losowo wybranej próbki moczu.
Fig.2 - przedstawia szybkości hydrolizy substratu ABZ-Met-Lys-Val-Trp-pNA w zależności od obecności inhibitorów różnych klas enzymów.
PL 238 699 Β1
Fig.3 - przedstawia zależność stopnia hydrolizy substratu ABZ-Met-Lys-Val-Trp-pNA od środowiska pH
7.5,
7.06.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Fig.4 - przedstawia wydajności hydrolizy substratu ABZ-Met-Lys-Val-Trp-pNA w zależności od stopnia zagęszczenia ludzkiego moczu ze stwierdzonym nowotworem nabłonka układu moczowego.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL434553A PL238699B1 (pl) | 2018-07-14 | 2018-07-14 | Związek chemiczny mający zastosowanie jako marker diagnostyczny nowotworów, sposób otrzymywania, metoda diagnozowania nowotworów nabłonkowych |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL434553A PL238699B1 (pl) | 2018-07-14 | 2018-07-14 | Związek chemiczny mający zastosowanie jako marker diagnostyczny nowotworów, sposób otrzymywania, metoda diagnozowania nowotworów nabłonkowych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL434553A1 PL434553A1 (pl) | 2020-12-28 |
| PL238699B1 true PL238699B1 (pl) | 2021-09-27 |
Family
ID=78055856
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL434553A PL238699B1 (pl) | 2018-07-14 | 2018-07-14 | Związek chemiczny mający zastosowanie jako marker diagnostyczny nowotworów, sposób otrzymywania, metoda diagnozowania nowotworów nabłonkowych |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL238699B1 (pl) |
-
2018
- 2018-07-14 PL PL434553A patent/PL238699B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL434553A1 (pl) | 2020-12-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI56828C (fi) | Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser | |
| US9506102B2 (en) | Fluorescent probe for high-sensitivity pancreatic fluid detection, and method for detecting pancreatic fluid | |
| PL99020B1 (pl) | Sposob wytwarzania nowych enzymatycznych substratow chromogenicznych oraz ich soli do oznaczania proteaz seryny a zwlaszcza czynnika xa | |
| WO2001094332A1 (en) | Profiling of protease specificity using combinatorial fluorogenic substrate libraries | |
| Na et al. | Microarray-guided discovery of two-photon (2P) small molecule probes for live-cell imaging of cysteinyl cathepsin activities | |
| JP5337960B2 (ja) | ヒストン脱アセチル化酵素活性の測定方法 | |
| PL238699B1 (pl) | Związek chemiczny mający zastosowanie jako marker diagnostyczny nowotworów, sposób otrzymywania, metoda diagnozowania nowotworów nabłonkowych | |
| PL225341B1 (pl) | Nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów | |
| EP3431490B1 (en) | Chemical compounds for use as diagnostic markers of inflammation and neoplams, the method for synthesis of the chemical compounds, diagnostic kit for use in diagnosis of inflammatory processes and epithelial neoplasms and in vitro diagnostic method of inflammatory processes and epithelial neoplasms | |
| WO2022260135A1 (ja) | 固相抽出を利用した蛍光プローブライブラリの調製方法、及びこれを用いた酵素活性計測方法 | |
| CS196314B2 (en) | Process for preparing new chromogenous substrates specific especially for thrombine | |
| PL236125B1 (pl) | Związki chemiczne mające zastosowanie jako markery diagnostyczne stanu zapalnego i nowotworów, sposób ich otrzymywania, marker diagnostyczny i metoda diagnozowania procesów zapalnych i nowotworów nabłonkowych | |
| PL238700B1 (pl) | Związki chemiczne mające zastosowanie jako markery diagnostyczne stanu zapalnego i nowotworów do zastosowania jako zestaw diagnostyczny i metoda diagnozowania i różnicowania procesów zapalnych i nowotworów nabłonkowych | |
| PL238575B1 (pl) | Związek oraz jego zastosowanie do wykrywania nowotworów nabłonkowych | |
| US20240353410A1 (en) | Fret enzymatic substrate and uses thereof in liver cancer | |
| CN118202246A (zh) | Fret酶底物及其在肝癌中的应用 | |
| Christensen et al. | Solid Phase Combinatorial Library of 1, 3‐Azole Containing Peptides for the Discovery of Matrix Metallo Proteinase Inhibitors | |
| EP3974438A1 (en) | Fluorescent probe for use in detection of brain tumor | |
| CN118451325A (zh) | Fret酶底物及其在肺癌中的应用 | |
| JPS62126197A (ja) | 新規な血漿キニノゲナーゼ測定用化合物 | |
| PL245425B1 (pl) | Związek-marker diagnostyczny raka trzonu macicy, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka trzonu macicy, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego | |
| CN106814055A (zh) | 二肽肽酶i体外微量快速检测方法 | |
| AU2023241522A1 (en) | Compound - diagnostic marker for intestinal cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of intestinal cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of intestinal cancer | |
| KR20000057503A (ko) | 펩티드, 사람 펩시노오겐 ｉ 또는 사람 펩신 ｉ의 측정 방법,및 측정용 키트 | |
| WO2016133913A1 (en) | Fluorescently labeled molecules containing modified tryptophan |