KR20220024867A - 새로운 췌장암 진단 마커 - Google Patents

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KR20220024867A
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나탈리아 그루바
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우르테스테 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 X1을 포함하는 단편 1과 X2를 포함하는 단편 2로 화합물의 절단되면 검출가능한 신호가 발생되는 식 (1): X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2를 특징으로 하는 화합물을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 화합물을, 췌장암 세포로부터 유래한 가수분해 효소를 포함할 수 있는 체액과 접촉시켜 신호를 검출하는 것을 포함하는, 개체의 체액에서 프로테아제 활성을 검출하는 시험관내 방법을 제공한다. 아울러, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 측정 완충제를 포함하는 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 췌장암의 검출, 또는 췌장암이 의심되거나 췌장암 발병 위험성이 증가되거나 또는 췌장암에 걸린 적 있는 개체에 대한 모니터링에 있어, 본 발명의 화합물, 시험관내 방법 또는 키트의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 개체의 체액에서 프로테아제 활성을 검출하는 시험관내 방법을 수행하는 단계 및 프로테아제 활성이 검출된 개체에서 췌장암을 치료하는 단계를 포함하는, 췌장암 치료 방법에서의 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.

Description

새로운 췌장암 진단 마커
본 발명은 췌장암을 진단하는데 이용하기 위한 화학적 화합물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 샘플에서 단백질 분해 효소를 검출하는데 적합한 발색성 펩타이드에 관한 것이다.
췌장암은 통상적으로 후기에 진단되므로, 흔히 예후가 매우 나쁘다. 췌장암은 역학으로 인해, 5년 생존율이 매우 낮다. 전세계적으로 연간 약 250,000건이 췌장암으로 진단되고, 폴라드에서는 3,500건에 달한다. 공교롭게도, 거의 대부분의 사례가 사망으로 끝난다 (80% 이상). 췌장암을 검출하기 위한 신뢰할 수 있으며, 신속하고, 복잡하지 않은 진단 방법에 대한 요구가 충족되지 남아 있다. 조기 진단은 외과적 치료 기회를 높여, 환자의 생존을 현저하게 연장할 수 있다.
암 세포의 개시, 증식 및 전파 과정은 여러가지의 단백질 분해 효소를 비롯한 다수의 인자들을 수반한다. 이러한 단백질 그룹은 단백질과 펩타이드를 더 작은 단편으로 가수분해할 수 있다. 단백질 분해 효소는 세포외 매트릭스의 분해를 매개함으로써, 암 세포가 새로운 조직에 정착하고, 종양으로 영양분의 효과적인 전달을 촉진하는 새로운 혈관 생성 (혈관신생)을 가능하도록 허용한다. 아울러, 단백질 분해 효소는 종양 증식 과정으로 인한 건강한 세포의 사멸 결과로서 존재한다. 이러한 모든 과정들이 종양을 특징짓는 단백질 분해 효소 프로파일을 구성한다.
단백질 분해 효소의 영향으로 분해되어 검사 용액의 색 변화 또는 색 강화를 유발하는 발색성 펩타이드 분자들이 기존에 개시된 바 있다. 이러한 발색 효과는 발색단 (예, 4-니트로아닐리드 또는 5-아미노-2-니트로벤조산)이 해리된 결과이다.
이러한 유형의 펩타이드 유도체는 다음과 같은 간행물들에 공지되어있다.
Erlanger BF, Kokowsky N, Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 1961 Nov;95:271-8. Hojo K, Maeda M, Iguchi S, Smith T, Okamoto H, Kawasaki K. Amino acids and peptides. XXXV. Facile preparation of p-nitroanilide analogs by the solid-phase method. Chem Pharm Bull (Tokyo). 2000 Nov;48(11):1740-4.
프로테아제의 발현을 검출 및 측정하는 방법들이 종래에 개시된 바 있다. 이러한 개시된 방법들은 특정 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체와 특정 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 PCR을 기반으로 한다. 프로테아제 활성의 입증은 발색성 분자가 접합된 적절한 합성 펩타이드 기질의 가수분해를 통해 측정되며, 프로테아제가 이러한 합성 기질을 자르고 기질의 가수분해 중에 해리되는 발색체의 흡광도를 측정한다 (CA 2 425 829).
본 발명에 따른 바람직한 화합물은, 이 화합물이 췌장암에 걸린 사람의 뇨 샘플과 접촉하였을 때, 신호, 예를 들어 380-440 nm 범위에서 색 강화를 검출할 수 있는 방식으로 개발되었다. 이러한 효과는, 만일 이 화합물이 다른 유형의 암으로 진단된 환자나 건강한 사람의 뇨 샘플과 접촉할 경우에는, 발생하지 않는다.
본 발명자들은, 이러한 신호, 예를 들어 해리된 발색성 화합물로부터 기인한 신호 또는 형광성 도너/어셉터 쌍이 분리된 이후의 형광 신호를 이용해, 췌장암에 걸린 적 있는 개체의 뇨에서 단백질 분해 효소의 존재를 검출할 수 있다는 것을, 알게 되었다. 화합물의 효소적 가수분해로 검출가능한 차이, 예를 들어 320-480 nm에서 흡광성을 나타내는 유리 발색단 분자 (ANB-NH2 - 5-아미노-2-니트로벤조산의 아미드 또는 pNA - 파라-니트로아닐린 각각)의 해리가 발생한다.
본 발명의 화합물은 특히 (i) 췌장암을 검출하기 위한 신속하고 비-침습적인 진단 방법, (ii) 췌장암을 조기 검출하는데 적합한 방법, (iii) 췌장암을 스크리닝하는데 성공적으로 이용할 수 있는 방법, (iv) 보다 효과적인 치료를 도입하기 위한 암 발생 초기 단계에서의 완전한 진단 공정을 제공한다.
제1 측면에서, 본 발명은 식 1을 특징으로 하는 화합물에 관한 것으로:
X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2 (식 1),
이 화합물이 X1을 포함하는 단편 1과 X2를 포함하는 단편 2로 절단되면, 검출가능한 신호가 발생한다. 이 화합물은 서열번호 1에 따른 테트라펩타이드 Thr-Thr-Ala-Arg를 포함한다.
제2 측면에서, 본 발명은 췌장암 세포로부터 유래한 가수분해 효소, 특히 프로테아제를 포함할 수 있는 개체의 체액을 본 발명의 제1 측면에 따른 화합물과 접촉시키고; 신호를 검출하는 것을 포함하는, 개체의 체액에서 프로테아제 활성을 검출하는 시험관내 방법에 관한 것이다.
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 화합물과 측정 완충제 (measurement buffer)를 포함하는 키트에 관한 것이다.
제4 측면에서, 본 발명은 췌장암의 검출, 또는 췌장암이 의심되거나 췌장암 발병 위험성이 증가되거나 또는 췌장암에 걸린 적 있는 개체에 대한 모니터링에 있어, 본 발명의 제1 측면에 따른 화합물, 본 발명의 제2 측면에 따른 방법 또는 본 발명의 제3 측면에 따른 키트의 용도에 관한 것이다.
제5 측면에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 제2 측면에 따른 방법을 수행하는 단계, 및 (b) 단계 (a)에서 프로테아제 활성이, 특히 프로테아제 활성의 증가가 검출된 개체에서 췌장암을 치료하는 단계를 포함하는, 췌장암 치료 방법에서 본 발명의 제1 측면에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다.
도 1은 암으로 진단된 환자의 뇨 샘플 (샘플 -10) 및 건강한 개체의 뇨 샘플 (11-25)에서 기질 (1) ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2의 가수분해율을 나타낸 것이다. 아라비아 숫자는 선택 샘플의 번호를 나타낸다. 도 1은, 샘플 1-10 모두 분해되고, 샘플 3과 10의 경우에는 ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2 기질의 분해가 2번 및 9번보다 더 효율적으로 발생함을 보여준다. 이러한 결과는 단백질분해를 담당하는 효소의 활성 및 양적 차이로 인한 것일 수 있다. 아울러, 도 1은, 식 2의 화합물의 용액을 건강한 개체의 뇨 샘플과 인큐베이션하였을 때 흡광도 증가가 관찰되지 않으며, 즉 시험 화합물이 가수분해되지 않는다는 것을, 보여준다. 이러한 결과는 췌장암의 특징적인 단백질 분해 효소가 존재하지 않는다는 것을 의미한다.
도 2는 암으로 진단된 환자의 뇨 샘플 (샘플 -10) 및 건강한 개체의 뇨 샘플 (11-25)에서 기질 (2) ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-pNA의 가수분해율을 나타낸 것이다. 아라비아 숫자는 선택 샘플의 번호를 나타낸다. 상기 도 1에서와 비슷한 결과가 수득된다.
도 3은 기질 (1) ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB NH2의 가수분해 정도와 pH 환경 간의 연관성을 나타낸 것이다. 검사한 pH 값은 x 축에 표시된다. 반응 환경의 단백질분해 활성과 pH 간의 연관성을 분석하였다. 실험 결과, 검사한 물질이 염기성 pH에서 최대 활성을 가진 효소 하나 이상을 가진 것으로 확인되었다.
도 4는 췌장암으로 진단된 사람의 뇨를 포함하여 무작위 선정한 시스템의 RP HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다. 화합물 2종, 즉 (1) (ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2, 도시) 및 (2) (ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-pNA, 도시 안함)은 ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg 펩타이드 단편과 발색단 (각각 ANB-NH2 또는 pNA)으로 분해된다. A: 200 mM Tris-HCl 완충제, pH 8.0에서의 ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB NH2 기질. B: 췌장암 진단 환자의 뇨에서의 ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB NH2 기질의 가수분해.
본 발명을 아래에서 상세히 설명하기에 앞서, 본원에 언급된 구체적인 방법, 프로토콜 및 시약들은 변경할 수 있으므로 본 발명이 이들로 한정되지 않는 것으로 이해하여야 한다. 본원에 사용된 용어는 구체적인 구현예를 단지 설명하기 위한 목적일 뿐 첨부된 청구항에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것인 아닌 것으로 이해하여야 한다. 달리 정의되지 않은 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 당해 기술 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 바람직하게는, 본원에 사용된 용어는 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)에 기술된 바와 같이 정의된다.
몇가지 문헌들이 본 발명의 내용 전체에서 인용된다. (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조사의 명세서, 설명서 등을 비롯한) 본원에 인용된 전술한 또는 후술한 문헌들은 각각 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다. 본 발명의 어떠한 개시내용도 본 발명이 선행 발명에 의한 그러한 개시내용을 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 실시에는, 달리 언급되지 않은 한, 당해 기술 분야의 문헌에 설명된 화학, 생화학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법들이 채택된다 (예, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
후술한 명세서 및 청구항 전체에서, 달리 요구되지 않은 한, 용어 "들을 포함한다"와 "을 포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형어는 언급된 정수 또는 단계 또는 정수나 단계의 군을 가지는 것을 내포하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수나 단계의 군을 제외하는 것은 아니다. 본 명세서와 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수형 ("a", "an" 및 "the")은 문맥상 명확하게 명시되지 않은 한 복수의 언급을 포함한다.
이하 본 발명의 요소들이 설명될 것이다. 이들 요소는 구체적으로 구현예와 함께 열거되지만, 이는 임의의 수단 및 임의의 개수로 조합하여 추가적인 구현예들을 구성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양하게 설명된 예들과 바람직한 구현예들은 본 발명을 명시적으로 기술한 구현예들로만 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이러한 기술은 명시적으로 기술된 구현예들을 임의 개수의 개시되거나 및/또는 바람직한 요소들과 조합하는, 구현예들을 뒷받침하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 아울러, 본 출원에서 설명된 모든 요소들에 대한 임의의 순열 및 조합도 문맥상 달리 지시되지 않은 한 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
발명의 설명 및 청구항에서 사용된 용어 및 약어는 다음과 같이 이해되어야 한다:
본 발명의 맥락에서, "검출가능한 신호"는 자기 표지물질, 형광성 모이어티, 효소, 화학발광성 프로브, 금속 입자, 비-금속 콜로이드 입자, 폴리머성 염료 입자, 색소 입자, 색소 분자, 전기화학적 활성 종, 반도체 나노결정 또는 양자점 또는 금 입자 등의 기타 나노입자를 비롯한 임의의 표지물질에 의해 발생되는 신호 등의 임의의 신호를 지칭한다. 표지물질은 예를 들어 발색단, 형광단, 양자점 또는 방사성 표지물질일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 표현 "발색단"은 "발색 특성"을 가진 화합물을 지칭한다. 표현 "발색 특성"은 화합물이 유색 산물을 생성할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, 표현 "형광단"은 "형광 특성"을 가진 화합물을 지칭하는데 사용된다. 표현 "형광 특성"은 화합물이 형광을 방출하는 산물을 생성할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 형광 염료는 다음과 같은 계열의 염료를 포함한다: 크산텐 (예, 플루오레세인), 아크리딘 (예, 아크리딘 옐로우), 옥사진 (예, 옥사진 1), 시닌 (예, Cy7 / Cy 3), 스티릴 염료 (예, Dye-28), 쿠마린 (예, Alexa Fluor 350), 포르핀 (예, 클로로필 B), 금속-리간드-착물 (예, PtOEPK), 형광 단백질 (예, APC, R-피코에리트린), 나노결정 (예, QuantumDot 705), 페릴렌 (예, Lumogen Red F300)및 프탈로시아닌 (예, IRDYE™700DX) 뿐 아니라 이들 계열의 염료들의 접합체 및 조합체.
양자점은 주기율표에서 II-VI 또는 III-V 족 원소들로 구성된 반도체이다 (예를 들어, CdSe, CdTe, InP). 다른 대안은 임의의 2종의 염료 시스템을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, NMP는 N-메틸피롤리돈을 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, DMF는 다이메틸포름아미드를 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, DCM은 메틸렌 클로라이드를 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, pNA는 4-니트로아닐린을 지칭하며 또한 파라-니트로아닐린을 지칭할 수도 있다.
본 발명의 맥락에서, ABZ는 2-아미노벤제노익산을 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, ANB-NH2는 5-아미노-2-니트로벤조산의 아미드를 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, AFC는 7-아미도-4- 트리플루오로메틸쿠마린을 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, Boc는 tert-부틸옥시카르보닐 기를 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, Fmoc는 9-플루오레닐메톡시카르보닐 기를 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, TFA는 트리플루오로아세트산을 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "췌장암"은 가장 넓은 의미로 사용되며, 췌장으로부터 기원한 모든 암을 지칭한다. 췌장암은 서브타입 외분비암, 내분비암, 췌장모세포종, 췌장의 육종 및 림프종을 포괄한다. 외분비암으로는 선암종, 특히 관 선암종 (ductal adenocarcinomas) 뿐 아니라 낭성 종양 (cystic tumour) 및 선방 세포의 암 등이 있다. 내분비암으로는 가스트린종, 인슐린종, 소마스타틴종, 비포마 (VIPoma) 및 글루카곤종 등이 있다. 또한, 췌장은 (괄호 안의 해당 TNM 분류(들)에 따라 정의되는) 하기 병기들을 포함한다: 0기 (Tis, N0, M0), IA기 (T1, N0, M0), IB기 (T2, N0, M0), IIA기 (T3, N0, M0), IIB기 (T1-3, N1, M0), III기 (T4, any N, M0) 및 IV 기 (any T, any N, M1).
본 발명에 따른 펩타이드, 바람직하게는, 발색성 또는 형광성 펩타이드는 당해 기술 분야에서 공지된 고체 지지체 상에서 펩타이드 합성을 수행함으로써 수득할 수 있다. 고체 지지체는 반응 진행 중에 제거되는 Fmoc 기를 가진 수지 형태일 수 있다. 이 과정을 수행하기 위해 사용되는 수지는 적절하게 준비되어야 한다. 이러한 수지의 준비는 소수성 용매로 반복 세척함으로써 부피를 팽창시키는 것을 포함한다.
Fmoc 보호기는 20% 용매 용액으로 세척함으로써 수지에서 제거하여야 한다.
발색성 펩타이드를 수득하는 공지된 공정들은 적절한 시간 및 화학량론적 조건 하에 개별 구성성분들을 부착시키는 것을 수반한다. 이러한 부착 공정은 개별 요소 (아미노산 유도체)를 부착하고 잔류물을 세척 제거한 다음 보호기를 제거하여 다시 세척하는, 후속적인 단계들로 구성된다. 이 사이클은 각 아미노산 잔기에 대해 반복 수행된다. 만들어진 펩타이드는 산성 조건에서의 반응을 통해 수지로부터 분리된다. 그런 후, 여과하여 수지로부터 용액이 분리되고, 이후 수득한 용액에 비-극성 용매를 첨가함으로써 펩타이드를 석출시킨다. 그런 다음 펩타이드 침전물을 원심분리한다.
발색성 펩타이드를 수득하는 공지된 방법은 고체 지지체 상에서, 부분적으로 완충제 중에서 수행되는 공정을 기반으로 한다. 아미드 수지는 고체 지지체로서 이용되고, 소수성 용매 혼합물은 용액으로 이용된다.
본 발명에 따른 화합물은 Hojo et al., Chem Pharm Bull (Tokyo), 2000에 기술된 방법을 이용해 제조하였다. 상세한 합성 설명은 아래 실시예 부분에서 확인할 수 있다.
아울러, 본 발명에 따른 펩타이드에 양자점이 연결될 수 있다. 양자점은 고 발광성이나, 금속 나노입자의 존재시 소광된다. 비올로겐 (예, 메틸비올로겐 또는 프로필 비올로겐-설페이트 (PVS))도 소광제 (quencher)로 이용할 수 있다.
프로테아제가 컨센서스 서열을 절단하면, 양자점이 해리되어, 빛이 발생한다.
제1 측면에서, 본 발명은 화합물이 X1을 포함하는 단편 1과 X2를 포함하는 단편 2로 절단되면 검출가능한 신호가 발생되는, 식 1: X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2 (식 1)을 특징으로 하는 화합물을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 서열 Thr-Thr-Ala-Arg는 가수분해 효소가 접근가능하며, 특히 화합물을 X1-Thr-Thr-Ala-Arg-OH (단편 1) 및 NH2-X2 (단편 2)로 전달하는 가수분해 효소가 접근가능하다.
가수분해 효소는 프로테아제이거나 또는 수종의 프로테아제들의 조합일 수 있다.
화합물의 절단시 발생하는 검출가능한 신호는 당업자에게 공지된 다양한 적절한 신호들로부터 선택할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 검출가능한 신호는 광학적 신호이다.
바람직한 구현예에서, X1은 구성성분 C1을 포함하거나 또는 이로 구성되고, X2는 구성성분 C2를 포함하거나 또는 이로 구성되며, C1과 C2의 공간적인 분리시, 즉 펩타이드 Thr-Thr-Ala-Arg의 가수분해 절단에 의해 검출가능한 신호가 발생한다.
X1은, C1과 더불어, 예를 들어 C1 양쪽의 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. X2는 C2와 더불어 예를 들어 C2 양쪽의 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 따라서, C1 및 C2는 절단되기 전 Thr-Thr-Ala-Arg를 포함하거나 또는 이로 구성되는 아미노산 4-20개 또는 아미노산 5-10개로 된 아미노산 서열에 의해 떨어져 존재할 수 있다. 바람직한 구현예에서, C1과 C2는 10개 이하의 아미노산들에 의해 이격된다.
바람직한 구현예에서, 검출가능한 신호는 흡광 또는 형광의 변화이다. 이러한 변화는 증가 또는 감소일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 검출가능한 신호는 300-500 nm, 특히 380-430 nm에서의 흡광 강도의 증가이다.
바람직한 구현예에서, C1과 C2 중 하나는 파장 1에서 최대 흡광도 1 (AM1)을 나타내는 발색단이고, 화합물은 파장 1과는 다른 파장 2에서 최대 흡광도 2 (AM2)를 나타낸다. 따라서, 화합물의 절단 전과 절단 후 파장 2에서 흡광도를 측정하면, 흡광도의 증가가 검출될 것이다.
특히 바람직하게는, 절단시, 발색단이 유리 형태로 해리된다. 절단시, 단편 1은 X1-Thr-Thr-Ala-Arg로 구성되고, 단편 2는 NH2-X2로만 구성된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 발색단은 C1이 아닌 C2이다. C2가 발색단일 경우, 바람직하게는, X2는 C2로 구성되거나 또는 C2로 필수적으로 구성된다. 한편, X1은 C1 양쪽에 부가적인 아미노산을 포함할 수 있으며, 그래서 절단 전 C1과 C2는 Thr-Thr-Ala-Arg보다 더 긴 아미노산 서열에 의해 이격되어 있을 수 있다.
바람직한 구현예에서, 발색단은 파라-니트로아닐린 (pNA), 5-아미노-2-니트로벤조산의 아미드 (ANB-NH2), 7-아미도-4-트리플루오로메틸쿠마린 (AFC) 및 3-니트로 L-티로신 (Tyr3-NO2)으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 발색단은 파라-니트로아닐린 (pNA)이다. 바람직한 구현예에서, 발색단은 5-아미노-2-니트로벤조산의 아미드 (ANB-NH2)이다.
바람직한 구현예에서, C1 및 C2는 형광 도너와 형광 어셉터로 이루어진 한쌍이다. C1 및 C2가 형광 도너와 형광 어셉터 쌍이고 화합물의 절단시 형광의 변화를 측정하는 방식으로 화합물을 이용할 경우, 바람직하게는, C1 및 C2는 형광 어셉터에 의한 형광 도너의 효과적인 소광을 보장하기 위해 10개 이하의 아미노산에 의해 떨어져 배치된다. 당업자라면, 주요 파라미터가 형광 도너와 형광 어셉터 간의 거리임을 알 것이다. 따라서, C1과 C2 사이에 존재하는 아미노산 서열이 압축된 또는 비틀린 2차 구조로 접힐 경우, C1과 C2의 인접성은 선형적인 링커의 경우와 비교해 더 가까워지므로, C1과 C2 사이에 더 긴 스페이서도 허용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, C1과 C2 쌍은 2-아미노벤조산 (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 특히 C1 및 C2 쌍은 ABZ/pNA 및 ABZ/ANB-NH2로부터 선택된다. 바람직하게는, C1 및 C2는 분자량 500 g/mol 미만, 구체적으로 400 g/mol 미만, 더 구체적으로 300 g/mol 미만, 보다 더 구체적으로 100 내지 200 g/mol을 특징으로 한다.
C1과 C2의 쌍은 또한 BFP/GFP, BFP/CFP, BFP/YFP, BFP/DsRed, CFP/GFP, CFP/YFP, CFP/mVenus, CeFP/ YFP, CeFP/mVenus, CeFP/mCitrine, CFP/dsRed, CFP/mCherry, mTurquoise/mVenus, GFP/YFP, GFP/DsRed, GFP/RFP, Clover/mRuby, Cy3/C5, Alexa 488/Alexa 555 및 FITC/TRITC로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 형광 도너 및 어셉터 쌍일 수 있다. 당업자라면 방출 및 흡광 스펙트럼을 토대로 적절한 단백질 형광 도너 및 어셉터 쌍을 선택하는 방법을 알 것이다.
C1 및 C2가 단백질 형광 도너 및 어셉터 쌍일 경우, 단백질의 비교적 큰 크기가 화합물의 절단을 저지하지 않고, 서열 Thr-Thr-Ala-Arg가 가수분해 효소에 의한 절단에 접근가능하도록 보장되어야 한다. 이는, 예를 들어, 서열번호 1에 따른 펩타이드를 포함하는 아미노산 서열의 길이 증가를 통해 달성할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 화합물은 식 2를 특징으로 한다:
ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2 (식 2).
바람직한 구현예에서, 화합물은 식 3을 특징으로 한다:
ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-pNA (식 3).
식 2 또는 3을 특징으로 하는 화합물이 절단되면, 유리 발색단 분자 (각각 ANB-NH2 또는 pNA)가 해리된다. 따라서, 흡광도 강도 증가는 380-430 nm에서 검출할 수 있다. 아울러, 절단되면, 형광 어셉터 (각각 ANB-NH2 또는 pNA)로부터 형광 도너 (ABZ)의 공간적인 분리가 이루어진다. 따라서, ABZ로부터 방출되는 형광이 더이상 소광되지 않고, 420 nm에서 형광 강도 증가를 검출할 수 있다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 화합물을 췌장암 세포로부터 유래하는 가수분해 효소, 특히 프로테아제를 포함할 수 있는 체액과 접축시키고 신호를 검출하는 것을 포함하는, 개체의 체액에서 프로테아제 활성을 검출하는 시험관내 방법을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 체액에 프로테아제 활성의 존재는 췌장암의 존재를 의미하고, 체액에 프로테아제 활성의 부재는 췌장암의 부재를 의미한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 췌장암 진단 방법을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 체액은 혈액 또는 뇨로부터 선택한다. 바람직한 구현예에서, 체액은 뇨이다. 놀랍게도, 본 발명자들은, 본 발명에 따른 화합물이 뇨 샘플에서 가수분해 효소의 활성을 검출할 수 있음을, 발견하였다. 가수분해 효소의 활성은 건강한 개체와 비교해 췌장암으로 진단된 개체에서 현저하게 높다 (도 1, 2).
바람직한 구현예에서, 개체는 췌장암 발병 위험이 크거나, 췌장암이 의심되거나, 췌장암을 앓은 적이 있거나 또는 췌장암에 걸린 개체이다.
바람직한 구현예에서, 화합물은 중성 또는 염기성 pH, 바람직하게는 pH 6.8-8.5, 더 바람직하게는 생리학적 pH의 측정 완충제에 0.1-10 mg/ml, 구체적으로 0.25-7.5 mg/ml, 더 구체적으로 0.5-5 mg/ml, 더 구체적으로 0.75-2 mg/ml, 보다 더 구체적으로 약 1 mg/ml의 농도로 제공되며, 체액 샘플은 화합물에 1:2 내지 1:10, 구체적으로 1:3 내지 1:8, 더 구체적으로 1:4 내지 1:6, 보다 더 구체적으로 약 1:5의 비율로 첨가된다.
본 명세서의 맥락에서, 표현 "중성 pH"는 pH 대략 7.0을 의미한다. 본 명세서의 맥락에서, 표현 "생리학적 pH"는 pH 대략 7.4를 의미한다.
바람직한 구현예에서, 신호의 검출은 흡광도 또는 형광의 측정을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 신호 검출은 300-500 nm, 특히 380-430 nm에서, 바람직하게는, 40-60분 동안 25-40℃에서, 특히 36-38℃에서 흡광도 강도를 측정하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 흡광도 증가는 가수분해 효소의 활성의 존재를 의미한다.
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 화합물과 측정 완충제를 포함하는 키트를 제공한다.
제4 측면에서, 본 발명은 췌장암의 검출, 또는 췌장암이 의심되거나 췌장암 발병 위험이 크거나 또는 췌장암에 걸린 적 있는 개체에 대한 모니터링에 있어, 제1 측면에 따른 화합물, 제2 측면에 따른 방법 또는 제3 측면에 따른 키트의 용도를 제공한다.
제2 측면의 방법을 이용하고자 하는 목적에 따라, 용어 "개체"는 여러가지 제한을 가질 수 있다. 예를 들어, 그 방법이 췌장암을 진단하거나 또는 췌장암에 대해 개체를 스크리닝하는데 이용하고자 한다면, 개체는 췌장암이 있는 것으로 확인되지 않은 것이며, 즉 췌장암이 있을 수도 또는 없을 수도 있다. 이러한 예에서, 개체는 바람직하게는 췌장암 발병 위험성이 증가되거나 또는 췌장암이 의심되거나 또는 췌장암을 앓은 적 있는 (즉, 검출가능한 췌장암이 치유된) 개체이다. "위험성 증가"는 일반적으로 암 또는 췌장암에 대한 한가지 이상의 위험 인자가 개체, 바람직하게는 일반적으로 암, 또는 췌장암에 대한 미국 암 학회에 의해 정의되는 바와 같이, 개체로부터 기인할 수 있다는 것을 의미한다. 췌장암의 위험 인자에 대한 예는, 담배 소비 (특히 흡연), 과도한 알코올 섭취, 비만, 2형 당뇨병, 직업 (드라이 클리닝 및 금속 가공 산업에서 사용되는 특정 화학제에 대해 작업장에서의 노출), 만성 췌장염, 50세 이상 (특히 65세 이상), 남성 성별, 민족 (특히 아프리카계 미국인 및 아프리카계 카리브해 남성 (Caribbean men of African ancestry)), 췌장암 가족력 (특히, 1촌), 및 유전성 증후군 또는 소인 (예, BRCA1 또는 BRCA2 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 유전성 유방암 및 난소암 증후군; PALB2 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 유전성 유방암; p16/CDKN2A 유전자의 돌연변이에 의해 유발되며 피부 및 눈 흑색종과 관련있는 FAMMM (familial atypical multiple mole melanoma); 통상적으로 PRSS1 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 가족성 췌장염; 가장 흔하게는 MLH1 또는 MSH2 유전자의 결함에 의해 유발되는, 유전성 비-용종성 결장직장 암 (HNPCC)으로도 알려진 Lynch 증후군; 또는 STK11 유전자의 결함에 의해 유발되는 Peutz-Jeghers 증후군)이다.
췌장암은 전술한 임의 서브타입 및 병기일 수 있으며, 즉 임의의 서브타입 및/또는 병기의 존재 또는 부재가 검출될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 대조군 대비 더 높은 프로테아제의 활성 또는 양의 상당 수준의 존재는 췌장암의 존재를 의미하고, 대조군과 동일하거나 더 낮은 프로테아제의 활성 또는 양의 상당 수준의 부재는 췌장암의 부재를 의미한다.
특정 구현예에서, 제2 측면에 따른 방법은 췌장암을 검출하기 위한 하나 이상의 추가적인 수단을 이용함으로써 췌장암의 검출을 확증하는 것을 더 포함한다. 추가적인 수단은 암 마커 (또는 "바이오마커") 또는 통례적인 (비-마커) 검출 수단일 수 있다. 암 마커는 예를 들어 DNA 메틸화 마커, 돌연변이 마커 (예, SNP), 항원 마커, 단백질 마커, miRNA 마커, 암 특이적인 대사산물 또는 발현 마커일 수 있다. 통례적인 수단은 예를 들어 생검 (예, 예를 들어 단백질 또는 발현 마커에 대한 염색법이 추가되거나 또는 추가되지 않은 시각적인 생검 검사), 이미징 기법 또는 신체, 예를 들어 촉각 검사일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 췌장암을 검출하기 위한 추가적인 수단은 신체 검사 (간 또는 담낭의 팽창, 황달, 즉 피부의 황화 및 눈의 백색 (white of the eyes)), CT 스캔, MRI, 담췌관조영술 (특히, 내시경 역행 담췌관조영술, 자기 공명 담췌관조영술 또는 경피간담조영술), 혈관조영술 (특히, X선 혈관조영술, CT 혈관조영술 또는 MR 혈관조영술), 복부 초음파, 내시경 초음파, PET 스캔, 혈액 검사 (특히, 빌리루빈, CA 19-9 또는 CEA 검사) 및 생검으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에서, 용어 "를 나타내는" 또는 "의미한다"는 표시하고자 하는 것을 식별 또는 특정하는 행위를 지칭한다. 당해 기술 분야의 당업자들이 이해하는 바와 같이, 이러한 평가는 바람직하게는 정확하지만, 보통 개체들 100%에서 정확한 것은 아닐 수 있다. 그러나, 이 용어는 통계학적으로 유의한 개체 비율에서 정확하게 나타낼 수 있어야 한다. 그 비율이 통계학적으로 유의한지는 여러가지 잘 알려진 통계학적 평가 도구, 예를 들어 신뢰구간의 결정, p 값 결정, 스튜던트 t-검정, 만-휘트니 검정 등을 이용하여 당해 기술 분야의 당업자에 의해 쉽게 확인할 수 있다. 상세한 내용은 Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983에서 제공된다. 바람직한 신뢰구간은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%이다. p 값은 바람직하게는 0.05, 0.01 또는 0.005이다.
본원에서, 표현 "존재 또는 부재를 검출하는 방법"은 개체가 암을 가지고 있는지의 유무를 결정하는 것을 지칭한다. 당해 기술 분야의 당업자들에게 이해되는 바와 같이, 이러한 평가는 바람직하게는 정확하지만, 보통 개체들 100%에서 정확한 것은 아닐 수 있다. 그러나, 이 용어는 통계학적으로 유의한 개체 비율에서 정확하여야 한다. 통계학적 유의성 및 적절한 신뢰구간과 p 값에 대한 내용은 상기를 참조한다.
본원에서, 용어 "진단"은 개체가 암을 가지고 있는지 또는 아닌지를 확인하는 것을 지칭한다. 본원에 기술된 바와 같은 프로테아제 활성의 분석에 의한 진단은 프로테아제 활성의 분석으로 검출된 암을 확증하기 위해 본원에 기술된 추가적인 수단이 보충될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 진단은 바람직하게는 정확하지만, 보통 개체들 100%에서 정확한 것은 아닐 수 있다. 그러나, 이 용어는 통계학적으로 유의한 개체 비율에서 정확한 진단이 이루어질 수 있어야 한다. 통계학적 유의성 및 적절한 신뢰구간과 p 값에 대한 내용은 상기를 참조한다.
본원에서, 표현 "개체 집단에 대한 스크리닝"은 개체 집단의 샘플을 제1 측면에 따른 방법으로 이용하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 개체는 암 위험이 증가되거나, 암이 의심되거나 또는 암에 걸린 적 있는 개체이다. 특히, 본원에 언급된 한가지 이상의 위험 인자는 집단 개체들로부터 기인할 수 있다. 특정 구현예에서, 집단 개체 전체에서 동일한 한가지 이상의 위험 인자가 요인일 수 있다. 예를 들어, 집단은 심각한 알코올 섭취 및/또는 담배 소비를 특징으로 하는 개체로 구성될 수 있다. 용어 "스크리닝"은 집단 개체들에서 전술한 바와 같이 진단하는 것을 의미하며, 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같이 추가적인 수단을 이용한 확증인 것으로 이해되어야 한다. 당해 기술 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 스크리닝 결과는 바람직하게는 정확하지만, 보통 개체들 100%에서 정확한 것은 아닐 수 있다. 그러나, 이 용어는 통계학적으로 유의한 개체 비율에서 정확한 진단이 이루어질 수 있어야 한다. 통계학적 유의성 및 적절한 신뢰구간과 p 값에 대한 내용은 상기를 참조한다.
본원에서, 용어 "모니터링"은 치료 시술 중에 또는 일정한 기간 동안에, 전형적으로 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 5년, 10년 또는 임의의 다른 기간 동안 진단한 암을 동반 (accompaniment)하는 것을 의미한다. 용어 "동반"은, 암의 상태, 특히 암의 상태 변화를 정해진 임의 유형의 주기적인 시간 범위, 예를 들어 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 또는 24개월일 수 있는 치료 기간 동안 매일 또는 1개월 당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15회 (1일 1회 이하)로 프로테아제 활성의 수준에 기반하여, 특히 양적 변화에 기반하여 검출하는 것을 의미한다. 수준 또는 양적 변화는 또한 치료 특이적인 현상을, 예를 들어 매회 치료 사이클 또는 약물/요법 시술 전 및/또는 시술 후 확인할 수 있다. 사이클은 치료 한 라운드에서 다음 라운드가 개시될 때까지의 시간이다. 암 치료는 통상적으로 1회 치료가 아니며, 일련의 치료 코스이다. 코스는 통상적으로 3-6개월 소요되지만, 그보다 더 길거나 짧을 수도 있다. 치료 코스 동안에, 통상적으로 치료 사이클은 4-8회이다. 통상적으로, 치료 사이클은 신체가 회복하도록 치료의 중단을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 모니터링 결과는 바람직하게는 정확하지만, 보통 개체들 100%에서 정확한 것은 아닐 수 있다. 그러나, 이 용어는 통계학적으로 유의한 개체 비율에서 정확한 모니터링 결과가 달성될 수 있어야 한다. 통계학적 유의성 및 적절한 신뢰구간과 p 값에 대한 내용은 상기를 참조한다.
제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2 측면에 따른 방법을 수행하는 단계, 및 프로테아제 활성이, 특히 프로테아제 활성 증가가 검출된 개체에서 췌장암을 치료하는 단계를 포함하는, 췌장암 치료 방법에서 본 발명의 제1 측면에 따른 화합물의 용도를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2 측면에 따른 방법을 수행하고, 프로테아제 활성이, 특히 프로테아제 활성 증가가 검출된 개체에서 췌장암을 치료하는 것을 포함하는, 췌장암의 치료 방법을 제공한다.
본원에서, 암과 관련하여 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 암의 진행을 저지하기 위한 목적의 치료학적 치료를 의미한다. 유익한 또는 요망하는 임상적인 결과로는, 비-제한적으로, 증상의 해소, 질환의 기간 단축, 병리학적 상태의 안정화 (특히 악화되지 않음), 질환의 진행 속도 저하, 병리학적 상태의 개선 및/또는 (부분 및 완전) 관해, 바람직하게는 검출가능한 이러한 상태를 포함한다. 성공적인 치료가 반드시 완치를 의미하는 것은 아니지만, 비치료시 예상되는 생존과 비교해 생존 연장을 의미할 수도 있다. 바람직한 구현예에서, 치료는 제1선 치료이며, 즉, 이전에 암 치료되지 않은 것이다. 암 치료는 치료 용법 (treatment regimen)을 수반한다.
본원에서, "치료 용법"은 질환과 이용가능한 시술 및 약물 측면에서 개체를 치료하는 방식을 지칭한다. 암 치료 용법에 대한 비-제한적인 예는 화학요법, 수술 및/또는 방사선 또는 이들의 조합이다. 본 발명에서 암의 조기 검출은 구체적으로 외과적 치료, 특히 근치적 절제를 허용할 수 있다. 특히, 용어 "치료 용법"은 아래에서 정의되는 하나 이상의 항암제 또는 요법의 실시를 지칭한다. 본원에서, 용어 "항암제 또는 요법"은 항-증식성, 항암성 및/또는 제암성 (carcinostatic) 특성의, 화학적, 물리적 또는 생물 제제 또는 요법 또는 수술을 이의 조합을 포괄하여 지칭한다.
화학 항암제 또는 요법은 알킬화제, 항-대사산물제, 식물 알칼로이드 (plant alkaloyd) 및 테르페노이드 (terpenoid) 및 토포이소머라제 저해제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 알킬화제는 플라티늄-기반의 화합물이다. 일 구현예에서, 플라티늄-기반의 화합물은 시스플라틴 (cisplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 에프타플라틴 (eptaplatin), 로바플라틴 (lobaplatin), 네다플라틴 (nedaplatin), 카보플라틴 (carboplatin), 이프로플라틴 (iproplatin), 테트라플라틴 (tetraplatin), 로바플라틴 (lobaplatin), DCP, PLD-147, JMl 18, JM216, JM335 및 사트라플라틴 (satraplatin)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
물리적 항암제 또는 요법은 방사선 요법 (예, 근치적 방사선치료, 보조적 방사선치료, 고식적 (palliative) 방사선치료, 텔레라디오치료 (teleradiotherapy), 근접조사치료 (brachytherapy) 또는 대사적 방사선치료 (metabolic radiotherapy)), 광선치료 (phototherapy) (예를 들어, 헤마토포르포린 (hematoporphoryn) 또는 포토프린 II (photofrin II)) 및 발열요법으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
수술은 근치적 절제, 고식적 수술, 예방적 수술 또는 세포감소술 (cytoreductive surgery)일 수 있다. 전형적으로, 이는 적출 (excision), 예를 들어 Baron and Valin (Rec. Med. Vet, Special Canc. 1990; 11(166):999-1007)에 기술된 바와 같이, 관절낭내 적출, 변연, 광범위 적출 또는 근치적 적출 (radical excision)을 수반한다.
생물학적 항암제 또는 요법은 항체 (예, 레툭시맵 (retuximab) 또는 알렘투주밥 (alemtuzubab) 등의 암 세포를 파괴하는 면역 반응을 자극하는 항체, 이필리무맵 (ipilimumab) 등의 면역 세포가 "자기" 세포를 공격하지 못하게 방지하는 저해성 신호가 면역 세포의 수용체에 결합함으로써 면역 반응을 자극하는 항체, 베박시주맵 (bevacizumab), 세투시맵 (cetuximab) 또는 파니투무맵 (panitumumab) 등의 종양 증식에 필수적인 단백질의 작용을 간섭하는 항체, 또는 Y-이브리투모맵 티욱세탄 (Y-ibritumomab tiuxetan), I-토시투모맵 (tositumomab) 또는 아도-트라스투주맵 엠탄신 (ado-trastuzumab emtansine) 등의, 약물, 바람직하게는 독소, 화학치료제 또는 방사성 분자와 같은 세포-사멸 물질이 접합된 항체), 사이토카인 (예, INF-α 및 IL-2 등의 인터페론 또는 인터루킨), 백신 (예, sipuleucel-T 등의 암-관련 항원을 포함하는 백신), 암용해성 바이러스 (예, 레오바이러스 (reovirus), 뉴캐슬병 바이러스 또는 유행성 이하선염 바이러스와 같은 암용해성 천연 바이러스, 또는 암-관련 항원을 보유한 세포를 우선적으로 타겟팅하는 홍역 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스 또는 헤르페스 바이러스 등의 유전자 조작된 바이러스), 유전자 요법제 (예, 변형된 종양 억제인자를 치환하거나, 발암 유전자의 발현을 차단하거나, 개체의 면역 시스템을 개선하거나, 암 세포를 화학요법, 방사선치료 또는 기타 치료에 더 민감하게 만들거나, 세포 자살을 유도하거나 또는 항-혈관신생 효과를 부여하는 DNA 또는 RNA) 및 입양 T 세포 (예, 항종양 활성을 위해 선택된 개체-회수된 종양-침입성 T 세포, 또는 암-관련 항원을 인지하도록 유전자 변형된 개체-회수된 T 세포)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 항암 약물은 아비라테론 아세테이트 (Abiraterone Acetate), ABVD, ABVE, ABVE-PC, AC, AC-T, ADE, Ado-트라스투주맵 엠탄신 (Ado-Trastuzumab Emtansine), 아파티닙 다이말리에이트 (Afatinib Dimaleate), 알데스루킨 (Aldesleukin), 알렘투주맵 (Alemtuzumab), 아미노레불린산 (Aminolevulinic Acid), 아나스트로졸 (Anastrozole), 아프레피탄트 (Aprepitant), 삼산화비소 (Arsenic Trioxide), 아스파라기나제 에르위니아 크리산테미 (Erwinia chrysanthemi), 액시티닙 (Axitinib), 아자시티딘 (Azacitidine), BEACOPP, 벨리노스타트 (Belinostat), 벤다무스틴 하이드로클로라이드 (Bendamustine Hydrochloride), BEP, 베박시주맵 (Bevacizumab), 벡사로텐 (Bexarotene), 비칼루타미드 (Bicalutamide), 블레오마이신 (Bleomycin), 보르테조밉 (Bortezomib), 보수티닙 (Bosutinib), 브렌툭시맵 베도틴 (Brentuximab Vedotin), 부설판 (Busulfan), 카바지탁셀 (Cabazitaxel), 카보잔티닙-S-말레이트 (Cabozantinib-S-Malate), CAF 카펙시타빈 (Capecitabine), CAPOX, 카르보플라틴 (Carboplatin), 카보플라틴-탁솔 (CARBOPLATIN-TAXOL), 카르필조밉 (Carfilzomib), 카르무스틴 (Carmustine), 카르무스틴 임플란트 (Carmustine Implant), 세리티닙 (Ceritinib), 세툭시맵 (Cetuximab), 클로람부실 (Chlorambucil), 클로람부실-프레드니손 (CHLORAMBUCIL-PREDNISONE), CHOP, 시스플라틴, 클로파라빈 (Clofarabine), CMF, COPP, COPP-ABV, 크리조티닙 (Crizotinib), CVP, 사이클로포스파미드, 시타라빈 (Cytarabine), 시타라빈 (Cytarabine), 리포조말 (Liposomal), 다브라페닙 (Dabrafenib), 다카르바진 (Dacarbazine), 닥티노마이신 (Dactinomycin), 다사티닙 (Dasatinib), 다우노루비신 하이드로클로라이드 (Daunorubicin Hydrochloride), 데시타빈 (Decitabine), 데가렐릭스 (Degarelix), 데니루킨 디프티톡스 (Denileukin Diftitox), 데노수맵 (Denosumab), 덱스라족산 하이드로클로라이드 (Dexrazoxane Hydrochloride), 도세탁셀 (Docetaxel), 독소루비신 하이드로클로라이드 (Doxorubicin Hydrochloride), 독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀, 엘트롬보파그 올라민 (Eltrombopag Olamine), 엔잘루타미드 (Enzalutamide), 에피루비신 하이드로클로라이드 (Epirubicin Hydrochloride), EPOCH, 에리불린 메실레이트 (Eribulin Mesylate), 에를로티닙 하이드로클로라이드 (Erlotinib Hydrochloride), 에토포시드 포스페이트 (Etoposide Phosphate), 에베롤리무스 (Everolimus), 엑세메스탄 (Exemestane), FEC, 필그라스팀 (Filgrastim), 플루다라빈 포스페이트 (Fludarabine Phosphate), 플루오로우라실, FU-LV, 풀베스트란트 (Fulvestrant), 게피티닙 (Gefitinib), 겜시타빈 하이드로클로라이드 (Gemcitabine Hydrochloride), 겜시타빈-시스플라틴 (GEMCITABINE-CISPLATIN), 겜시타빈-옥살리플라틴 (GEMCITABINE-OXALIPLATIN), 겜투주맵 오조가미신 (Gemtuzumab Ozogamicin), 글루카르피다제 (Glucarpidase), 고세렐린 아세테이트 (Goserelin Acetate), HPV 2가 백신, 재조합 HPV 4가 백신, Hyper-CVAD, 이브리투모맵 티욱세탄 (Ibritumomab Tiuxetan), 이브루티닙 (Ibrutinib), ICE, 이델랄리십 (Idelalisib), 이포스파미드 (Ifosfamide), 이마티닙 (Imatinib), 메실레이트, 이미퀴모드 (Imiquimod), 요오드 131 토시투모맵 (Tositumomab) 및 토시투모맵, 이필리무맵 (Ipilimumab), 이리노테칸 하이드로클로라이드 (Irinotecan Hydrochloride), 이사베필론 (Ixabepilone), 라파티닙 다이토실레이트 (Lapatinib Ditosylate), 레날리도미드 (Lenalidomide), 레트로졸 (letrozole), 루코보린 칼슘 (leucovorin Calcium), 루프롤라이드 아세테이트 (Leuprolide Acetate), 리포조말 시타라빈 (Liposomal Cytarabine), 로무스틴 (Lomustine), 메클로레타민 하이드로클로라이드 (Mechlorethamine Hydrochloride), 메게스트롤 아세테이트 (Megestrol Acetate), 머캅토퓨린 (Mercaptopurine), 메스나 (Mesna), 메토트렉세이트 (Methotrexate), 미토마이신 C (Mitomycin C), 미토잔트론 하이드로클로라이드 (Mitoxantrone Hydrochloride), MOPP, 넬라라빈 (Nelarabine), 닐로티닙 (Nilotinib), 오비누투주맵 (Obinutuzumab), 오파투무맵 (Ofatumumab), 오마세탁신 메페숙시네이트 (Omacetaxine Mepesuccinate), OEPA, OFF, OPPA, 옥살리플라틴 (Oxaliplatin), 파클리탁셀 (Paclitaxel), 파클리탁셀 알부민-안정화된 나노입자 제형 (Paclitaxel Albumin-stabilized Nanoparticle Formulation), PAD, 팔리페르민 (Palifermin), 팔로노세트론 하이드로클로라이드 (Palonosetron Hydrochloride), 파미드로네이트 다이소듐 (Pamidronate Disodium), 파니투무맵 (Panitumumab), 파조파닙 하이드로클로라이드 (Pazopanib Hydrochloride), 페가스파르가제 (Pegaspargase), 페그인터페론 Alfa-2b (Peginterferon Alfa-2b), 펨브롤리주맵 (Pembrolizumab), 페메트렉세드 다이소듐 (Pemetrexed Disodium), 퍼투주맵 (Pertuzumab), 플레리사포르 (Plerixafor), 포말리도미드 (Pomalidomide), 포나티닙 하이드로클로라이드 (Ponatinib Hydrochloride), 프랄라트렉세이트 (Pralatrexate), 프레드니손 (Prednisone), 프로카르바진 하이드로클로라이드 (Procarbazine Hydrochloride), 라듐 223 다이클로라이드, 랄록시펜 하이드로클로라이드 (Raloxifene Hydrochloride), 라무키루맵 (Ramucirumab), 라스부리카제 (Rasburicase), R-CHOP, R-CVP, 재조합 HPV 2가 백신, 재조합 HPV 4가 백신, 재조합 인터페론 Alfa-2b, 레고라페닙 (Regorafenib), 리툭시맵 (Rituximab), 로미뎁신 (Romidepsin), 로미플로스팀 (Romiplostim), 룩솔리티닙 포스페이트 (Ruxolitinib Phosphate), 실툭시맵 (Siltuximab), 시플루셀-T (Sipuleucel-T), 소라페닙 토실레이트 (Sorafenib Tosylate), STANFORD V, 서니티닙 말레이트 (Sunitinib Malate), TAC, Talc, 타목시펜 사이트레이트 (Tamoxifen Citrate), 테모졸로미드 (Temozolomide), 템시롤리무스 (Temsirolimus), 탈리도미드 (Thalidomide), 토포테칸 하이드로클로라이드 (Topotecan Hydrochloride), 토레미펜 (Toremifene), 토시투모맵 (Tositumomab) 및 I 131 요오드 토시투모맵 (Tositumomab), TPF, 트라메티닙 (Trametinib), 트라스투주맵 (Trastuzumab), 반데타닙 (Vandetanib), VAMP, VeIP, 베무라페닙 (Vemurafenib), 빈블라스틴 설페이트 (Vinblastine Sulfate), 빈크리스틴 설페이트 (Vincristine Sulfate), 빈크리스틴 설페이트 리포좀, 비노렐빈 타르트레이트 (Vinorelbine Tartrate), 비스모데깁 (Vismodegib), 보리노스타트 (Vorinostat), XELOX, Ziv-아필리베르셉트 (Ziv-Aflibercept) 및 졸레드론산 (Zoledronic Acid) 또는 이의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 화합물의 제조 방법을 제공한다.
바람직한 구현예에서, ABZ가 2-아미노벤조산이고; ANB-NH2가 5-아미노-2-니트로벤조산의 아미드인, 식 ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-ANB-NH2 6을 특징으로 하는 화합물은, 고체 지지체에서, 바람직하게는 Fmoc 기를 가진 고체 지지체 상에서 수행되는 공정에 따라 제조한다. 고체 지지체는, 공정 개시 전, 준비한다: 소수성 용매, 바람직하게는 다이메틸포름아미드, 메틸렌 클로라이드 또는 N-메틸피롤리돈으로 반복 세척하여 부피를 팽창시키고, 바람직하게는 다이메틸포름아미드, 메틸렌 클로라이드 또는 N-메틸피롤리돈 등의 용매 중의 10-30% 피페리딘 용액으로 세척하여 Fmoc 보호기를 제거한다. 그런 후, 공정은 후속 단계들로 수행된다:
a) 수지에 5-아미노-2-니트로벤조산 ANB를 증착하기에 앞서, 고체 지지체를 DMF 중의 3-6% N-메틸모르폴린 (NMM) 용액 및 DMF로 순차적으로 헹군다. 그런 후, DMF 중의 ANB 용액을 준비하여, 여기에 TBTU, DMAP 및 마지막으로 다이이소프로필에틸아민 (DIPEA)을 폴리머 증착에 대하여 다음과 같이 과량으로 첨가한다: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6. 수득된 혼합물을 수지에 첨가하여 균질해질 때까지 혼합한 다음, 수지를 감압 하에 여과 추출하여, DMF, DCM 및 이소프로판올과 같은 용매로 헹군다. 다음으로, 헥사플루오로포스페이트-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N ',N'-테트라메틸우로늄 (HATU)과 헥사플루오로포스페이트-O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 (HBTU)을 과량으로 순차적으로 사용해, ANB를 수지에 결합시키고, 끝나면 고체 지지체를 DMF, DCM 및 이소프로판올로 연속적으로 헹군 후 조심스럽게 건조한다.
b) ANB에 아미노산 잔기의 부착은 아미노산 유도체 Fmoc-Arg (Pbf)-OH와의 반응을 이용해 수행하며, 수지에 대해 아미노산 유도체를 적어도 5배 몰 과량으로 무수 피리딘에 용해하여, 이를 ANB가 증착된 수지에 접촉시킨다. 그런 후, 이 전체를 20℃ 미만으로 낮추고, POCl3를 사용된 아미노산 유도체의 양에 대해 1:1 비율로 첨가하여 혼합한다. 혼합 공정은 실온에서 수행한 다음 승온된 온도에서 수행하고; 반응이 완료되면 수지를 감압 하에 여과 추출해 DMF 및 MeOH로 헹군 후 조심스럽게 건조하고; 수득된 중간산물 화합물은 아실화 공정에 투입한다.
c) 수득된 중간산물 화합물의 아실화는 아미노산 유도체, 바람직하게는 Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr (tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH 및 마지막으로 Boz-Abz-OH를 순차적으로 사용해 수행한다. 아실화는 잔기 6에서 1까지 단계적으로 커플링제로서 다이이소프로필카르보디이미드를 과량으로 사용해 수행한다. 각 단계가 끝나면, 수지를 DMF로 헹구고, (바람직하게는) 아미노산 유도체의 부착을 모니터링하는 클로라닐 검사를 거친다.
d) Fmoc 보호기 제거는 DMF 중의 10-30% 피페리딘 용액으로 세척한 다음 용매: DMF, 이소프로판올 및 메틸렌 클로라이드 각각으로 헹굼으로써 수행한다.
e) 수지로부터 펩타이드의 분리는 혼합물: TFA, 페놀, 물 및 TIPS를 각각 88:5:5:2 v/v/v/v 비율로 이용해 수행하고; 혼합물을 1시간 이상, 바람직하게는 3시간 동안 교반한 다음 수득되는 석출물을 감압 하에 여과 추출하여 다이에틸 에테르로 헹구고, 수득되는 펩타이드를 원심분리한다.
f) 최종 완료된 산물의 준비는 펩타이드를 초음파를 이용해 물에 용해하고 동결건조함으로써 수행한다.
바람직한 구현예에서, ABZ가 2-아미노벤조산이고; pNA가 파라니트로아닐리드인 ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-pNA6를 특징으로 하는 화합물은, 고체 지지체, 바람직하게는 Fmoc 기를 가진 고체 지지체 상에서 수행되는 공정에 따라 제조한다. 공정 개시 전, 고체 지지체를 준비한다: 소수성 용매, 바람직하게는 다이메틸포름아미드, 메틸렌 클로라이드 또는 N-메틸피롤리돈으로 반복 세척하여 부피를 팽창시키고, 바람직하게는 다이메틸포름아미드, 메틸렌 클로라이드 또는 N-메틸피롤리돈 등의 용매 중의 10-30% 피페리딘 용액으로 세척하여 Fmoc 보호기를 제거한 다음 후속 단계들로 공정을 수행한다:
a) 수지에 3번째 아미노산 (Fmoc-Ala)의 부착은 수지 증착에 대해 9배 몰 과량으로 적절한 아미노산 유도체를 무수 메틸렌 클로라이드에 용해하여 사용함으로써 수행한다. 혼합물을 실온에서 적어도 2시간 동안 교반하고; 반응이 끝나면 수지를 감압 하에 여과 추출한 다음 DMF 및 MeOH로 헹구고 건조한다.
b) 후속 단계에서, 이하 아실화로 언급되는 아미노산 잔기의 부착을 수행하고, 유도체 Fmoc-Thr(tBu)-OH를 사용한 다음 Fmoc-Thr(tBu)-OH 및 Boc-ABZ-OH를 사용하며; 각 단계에 앞서, 수지를 DMF로, 바람직하게는 5분 동안 헹구고; 후속 부착에서는, 커플링제, 바람직하게는 다이이소프로필카르보디이미드를 과량으로 사용한다. 이 과정을 2회 반복하고, 각 단계 후 수지를 DMF로 헹군 다음, 바람직하게는 아미노산 유도체의 부착을 모니터링하는 클로라닐 검사로 검사한다.
c) Fmoc 보호기의 제거는 DMF 중의 10-30% 피페리딘 용액으로 세척한 다음 용매: DMF, 이소프로판올 및 메틸렌 클로라이드 각각으로 헹굼으로써 수행한다.
d) 화합물 (ABZ1-Thr(tBu)2-Thr (tBu)3-Ala4-OH)이 수득될 때까지, 단계 b)에서 c)를 반복 실시하고; 잔기 6에서 3까지 합성한 다음 제조된 화합물을 고체 지지체로부터 각각 88:5:5:2, v/v/v/v 비율의 혼합물 TFA: 페놀: 물: TIPS를 사용해 탈착시키고, 이때 계속 교반한다. 적어도 2시간 후, 플라스크의 내용물을 감압 하에 여과 추출하고, 석출물을 다이에틸 에테르로 헹군다. 그런 후, 석출물을 바람직하게는 20분간 원심분리하고, 초음파를 사용해 물에 용해한 다음 동결건조한다.
e) Fmoc-Arg (Pbf)-pNA 합성은 다음 단계들로 수행한다; 제1 단계로, 2 mmol Fmoc-Arg (Pbf)를 무수 테트라하이드로푸란 (THF)에 2 mmol N-메틸모르폴린 (NMM)의 존재 하에 용해하고, 아미노산 유도체의 카르복시 기를 2 mmol 이소부틸 클로라이드로 활성화한다. 10분간 활성화 후, 3 mmol p-니트로아닐린을 첨가하여 반응을 (바람직하게는) 2시간 동안 (바람직하게는) -15℃에서, 이후 실온에서 1일간 수행한다. 반응이 완료되면, 용매를 증발시키고, 건조 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해한 다음; 수득되는 용액을 NaCl 포화 수용액, 10% 구연산, 5% 소듐 바이카보네이트로 순차적으로 헹구고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조한 후; 에틸 아세테이트를 감압 증류하고, 건조 잔류물을 건조한다.
f) 보호된 펩타이드 ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH와 파라니트로아닐리드 Arg (Pbf)의 조합은 하기 공정을 토대로 한다: 보호된 펩타이드 ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH를 소량의 DCM에 용해한 다음 TFFH (테트라메틸플루오로포름아미드)를 사용해 바람직하게는 30분 동안 바람직한 온도 0℃에서 활성화한 후, 촉매량의 DMAP와 Fmoc-Arg(Pbf)5-pNA6를 첨가한다. 반응은 바람직하게는 실온에서 24시간 동안 수행한 다음 용매를 증발시키고, 수득한 용액에 혼합물 TFA: 페놀: 물: TIPS (88:5:5:2, v/v/v/v)를 부어 바람직하게는 3시간 동안 혼합하여 측쇄 보호기를 제거한다.
g) 최종 산물은 펩타이드를 물에 초음파를 사용해 용해한 다음 동결건조하여 준비한다.
실시예
본 발명은 하기 비-제한적인 실시예들을 들어 예시된다.
실시예 1: 화합물 ABZ 1 - Thr 2 - Thr 3 - Ala 4 - Arg 5 - ANB -NH 2 6 의 합성
1. 발색성 펩타이드의 준비
a) 합성 제1 단계는 Fmoc/tBu 화학, 즉 보호기를 이용해 고체 지지체 상에서 고상 합성을 통해 발색성 펩타이드를 수득하는 것이다.
ABZ가 2-아미노벤조산이고; ANB-NH2가 5-아미노-2-벤조산의 아미드이고; ANB가 5-아미노-2-벤조산인 서열 ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-ANB-NH2 6의 화합물을 하기 아미노산 유도체를 이용한 고상 화학 합성 공정으로 수득하였다.
Boc-ABZ, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ala, Fmoc-Arg(Pbf), ANB
화합물, 즉 단백질 분해 효소의 작용에 의한 화합물의 가수분해와 관련있는 췌장암 검출용 진단 마커의 합성을, 5-아미노-2-벤조산을 ANB-NH2 아미드로 변환할 수 있는 고체 지지체 상에서 수행하였다:
- 예를 들어 아미드 수지, 예를 들어 RAPP Polymere (Germany) 사의 TentaGel S RAM, 예를 들어 증착율 0.23 mmol/g의 수지.
Rink Amide (Germany) 등의 다른 상업적으로 이용가능한 아미드 수지를 사용할 수도 있다.
화합물을 실험실 셰이커를 사용해 수동으로 합성하였다. 대부분의 단계는, 고상 합성을 위한 25 mL 소결 시린지를 반응조로 사용하였다.
수득한 모든 최종 화합물에는 서열 1번 위치 (즉, N-말단)에 ABZ 2-아미노벤조산을, 6번 위치 (C-말단)에 ANB 5-아미노-2-니트로벤조산 분자를 가진다. ABZ는 형광 도너로 작용하고, ANB (5-아미노-2-벤조산)은 형광 소광체 및 발색단으로 작용한다. 펩타이드는 화합물의 5번 위치에서 아미노산 잔기들 사이에 위치한, 적어도 (바람직하게는) 하나의 반응 부위 Arg-ANB-NH2를 서열에 가지고 있다. 아미노산 유도체의 부착을 수반하는 합성은 잔기 6에서 1까지, 즉 C-말단에서 N-말단으로 이루어진다.
b) TentaGel S RAM 수지에 ANB의 증착:
펩타이드 합성은 증착율이 0.23 mmol/g인 TentaGel S RAM 수지 (Rapp Polymere)에서 수행하였다. 제1 단계에서, 세척 사이클에 의한 루즈닝 (loosening) 등으로, 수지를 준비하였다. 이후, NMP 중의 20% 피페리딘 용액을 사용해 고체 지지체로부터 Fmoc 아미노 기 보호를 제거한 다음 용매 세척 사이클을 수행하였다. 유리 아미노 기의 존재를 검증하기 위해, 클로라닐 검사를 수행하였다.
용매 세척 사이클:
DMF 1 x 10분
IsOH 1 x 10분
DCM 1 x 10분
Fmoc 보호기의 제거:
DMF 1 x 5분
20% 피페리딘 / NMP 1 x 3분
20% 피페리딘 / NMP 1 x 8분
용매 세척 사이클:
DMF 3 x 2분
IsOH 3 x 2분
DCM 3 x 2분
c) 클로라닐 검사:
클로라닐 검사는 반응조 - 시린지로부터 유리 앰플로 수지 그레인 (grain) 몇개를 (스파튤러를 사용해) 넣고, 여기에 톨루엔 중의 p-클로라닐 포화 용액 100 ㎕와 신선한 아세트알데하이드 50 ㎕를 첨가하는 과정으로 이루어진다. 10분 후, 그레인의 색 컨트롤을 수행하였다.
이 단계에서, 검사 수행 후, 그레인은 녹색이 되었으며, 이는 유리 아미노 기의 존재를 의미한다. 수지에서 9-플루오레닐메톡시카르보닐의 탈보호를 검증한 후, 다음 단계, ANB 유도체 (5-아미노-2-니트로벤조산)의 부착을 진행할 수 있다.
d) 고체 지지체에 5-아미노-2-니트로벤조산의 증착
펩타이드 라이브러리 - 펩타이드 혼합물의 합성에서 제1 단계는 수지 1 g에 ANB를 증착하는 것이다. 발색단을 부착하기 전에, 반응에 사용되는 수지를 용매, DMF, DCM 및 다시 DMF로 헹군 다음 고체 지지체 관능기에서 Fmoc 보호기를 제거하였다. Fmoc 보호기를 제거하는 1회 사이클은 하기 단계들을 포함한다:
Fmoc 보호기의 제거:
20% 피페리딘 / NMP 1 x 3분
20% 피페리딘 / NMP 1 x 8분
e) 세척
DMF 3 x 2분
IsOH 3 x 2분
DCM 3 x 2분
f) 유리 아미노 기의 존재에 대한 클로라닐 검사.
유리 아미노 기를 가진 수지를 DMF 중의 5% N-메틸모르폴린 (NMM) 용액 및 DMF로 순차적으로 헹구었다. Fmoc 보호기의 제거와 세척 사이클 공정은 메리필드 (Merrifield) 용기에서 수행하였다. 별개의 플라스크에서, ANB를 DMF에 용해한 다음 TBTU, DMAP 및 마지막으로 다이이소프로필에틸아민 (DIPEA)을 폴리머 증착에 대하여 다음과 같이 과량으로 첨가하였다: ANB/TBTU/DMA/DIPEA, 3:3:2:6. 준비된 혼합물을 수지에 첨가하여, 3시간 동안 교반하였다. 수지를 감압 하에 여과 추출하여, DMF, DCM 및 이소프로판올로 헹구었으며, 전체 아실화 공정을 2회 반복하였다. 헥사플루오로포스페이트-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 (HATU), 이후 헥사플루오로포스페이트-O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N'N '-테트라메틸우로늄 (HBTU)을 사용해 수지에 ANB를 부착하는 후속 반응을 수행하였다. 마지막 단계에서는 수지를 DMF, DCM 및 이소프로판올로 순차적으로 헹구고, 공기 건조하였다.
g) ANB에 C-말단 아미노산 잔기 부착
대응되는 아미노산 유도체 (수지 증착에 대해 9배 몰 과량으로 사용)를 피리딘에 용해하여, ANB가 증착된 수지가 수용된 플라스크로 옮겼다. 전체 내용물을 -15℃로 냉각시켰다 (얼음조: NH4Cl 1중량부, NaNO3 1중량부, 얼음 1중량부). 원하는 온도에 도달하면, POCl3를 (사용한 아미노산 유도체 양에 대해 1:1 비율로) 첨가하고, 전체를 자기 교반기에서 교반하였다: -15℃에서 20분, 실온에서 30분 및 40℃에서 6시간 (오일조). 반응 완료 후, 수지를 감압 하에 여과 추출하고, DMF 및 MeOH로 헹군 후 건조시켰다.
다음 단계에서, 잔기 (알라닌)를 P2 위치에 부착하였다.
각각의 아미노산 잔기를 부착하기 전에 수지를 5분간 DMF로 세척하였다. 후속 부착에서는 다이이소프로필카르보디이미드를 커플링제로 사용하였다. 공정을 2회 반복하였다.
각 아실화 후, 수지 세척 사이클을 개시한 후 클로라닐 검사를 수행해 수지의 유리 아미노 기에 아미노산 유도체의 부착을 모니터링하였다.
용매 세척 사이클:
DMF 3 x 2분
IsOH 3 x 2분
DCM 3 x 2분
클로라닐 검사:
검사 결과, 처음 2번의 커플링 후 그레인의 색이 처음에는 녹색, 다음에는 회색으로, 다른 아실화를 수행하여야 했으며, 그 결과 클로라닐 검사로 검사한 수지 그레인은 무색이었다. 이는 TentaGel S RAM 수지에 ANB가 부착되었음을 의미하며, 다음 단계인 펩타이드 합성으로 넘어갈 수 있다.
h) 다른 보호된 아미노산 잔기의 부착:
보호된 아미노산 알라닌 유도체를 부착하기 위해, 반응조에서 수지를 ANB 부착 잔기와 함께 DMF로 헹군 다음 아미노 기에서 Fmoc 탈보호를 수행하였다.
Fmoc 보호기의 제거:
DMF 1 x 5분
20% 피페리딘 / NMP 1 x 3분
20% 피페리딘 / NMP 1 x 8분
용매 세척 사이클:
DMF 3 x 2분
IsOH 3 x 2분
DCM 3 x 2분
클로라닐 검사:
클로라닐 검사에서 수지 그레인의 녹색으로 입증된 바와 같이 양성 결과가 관찰되었다. 이로써 다음 단계, Fmoc-Thr (tBu)-OH 아미노산 잔기의 부착으로 넘어갈 수 있었다.
아미노산 유도체의 부착:
커플링 과정 전에 수지를 DMF로 헹구었다. 보호된 글루탐산 잔기의 부착시 커플링 혼합물의 조성은 변화없이 유지하였다.
각 아실화 종료시, 용매 세척 사이클을 해당 공정에 따라 수행한 다음 용액에서 유리 아미노 기의 존재에 대해 클로라닐 검사를 수행하였다.
용매 세척 사이클:
DMF 3 x 2분
IsOH 3 x 2분
DCM 3 x 2분
클로라닐 검사:
2번째 아실화 후 수행한 검사에서 수지 그레인은 무색이었으며, 따라서 다음 합성 단계, 즉 다른 보호된 아미노산 유도체 - 트레오닌 및 2-아미노벤조산 분자의 도입을 진행할 수 있었다. 커플링 공정은 앞서 기술된 공정에 따라 수행하였다.
상기 언급된 잔기를 부착한 후 수행한 검사에서 양성 결과가 확인되었다: 수지 그레인은 무색이었다.
2. 고체 지지체로부터 펩타이드 제거
합성 후, 자기 교반기 상의 둥근 바닥형 플라스크에서 혼합물 TFA: 페놀: 물: TIPS (88:5:5:2, v/v/v/v)를 사용해 고체 지지체로부터 아미드 ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2 펩타이드를 제거하였으며, 동시에 측쇄 보호기를 제거하였다.
3시간 후, 플라스크의 내용물을 소결 (Schott) 깔때기 상에서 감압 하에 여과 추출한 다음 다이에틸 에테르로 헹구었다. 형성된 침전물을 SIGMA 2K30 centrifuge (Laboratory Centrifuges)에서 20분간 원심분리하였다. 원심분리 후 수득한 침강물을 물에 초음파를 적용해 용해하고, 동결건조하였다.
새로운 화합물의 실체/특징 - HPLC 분석, MS
HPLC 조건: RP Bio Wide Pore Supelco C8 250 mm 4 mm 컬럼, A 상 시스템 0.1% TFA / 물, B: 80% 아세토니트릴 / A), 유속 1 ml/min, 226 nm에서 UV 검출.
화합물 수득이 검증되었다.
실시예 2: 식: ABZ1 - Thr2 - Thr3 - Ala4 - Arg5 - pNA6의 화합물 제조
해당 아미노산 유도체와 부가적인 치환기를 사용해 실시예 1에 기술된 바와 비슷한 방식으로 공정을 수행하였으며, 본 공정은 일부는 용액에서, 일부는 고체 지지체 상에서 수행하였다.
p- 니트로아닐리드 Ala의 제조
a) 합성의 제1 단계는 Fmoc/tBu 화학을 이용한 고상 합성을 통해 보호된 펩타이드를 수득하는 것이다.
하기 아미노산 유도체를 이용한 고상 화학 합성에 의해 ABZ가 2-아미노벤조산인 ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH 화합물을 수득하였다:
Boc-ABZ, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ala.
화합물은 고상 지지체에서 합성하였다:
- 2-클로로-클로로트리틸 수지, 예를 들어 Iris BIOTECH GMBH (Germany) 사 제품, 증착율 1.6 mmol Cl/(기)g.
화합물을 실험실 셰이커를 사용해 수동으로 합성하였다. 전체 단계 동안, 고상 합성을 위해 25 mL 소결 시린지를 반응조로 사용하였다.
펩타이드 합성은 고체 지지체, 예를 들어, 증착율 1.6 mmol Cl/(기)g의 Iris BIOTECH GMBH (Germany) 사의 2-클로로-클로로트리틸 수지 상에서 수행하였다. 제1 단계에서, 수지를 세척 사이클로 루즈닝하였다. 이후, 20% 피페리딘/NMP 용액을 사용해 고체 지지체로부터 Fmoc 아미노 기 보호를 제거하였다. 그런 후, 용매 세척 사이클을 수행하였다. 유리 아미노 기의 존재를 검증하기 위해, 클로라닐 검사를 수행하였다.
용매 세척 사이클:
DMF 1 x 10분
IsOH 1 x 10분
DCM 1 x 10분
Fmoc 보호기의 제거:
DMF 1 x 5분
20% 피페리딘 / NMP 1 x 3분
20% 피페리딘 / NMP 1 x 8분
용매 세척 사이클:
DMF 3 x 2분
IsOH 3 x 2분
DCM 3 x 2분
b) 클로라닐 검사:
클로라닐 검사는 반응조 - 시린지로부터 유리 앰플로 수지 그레인 몇개를 (스파튤러를 사용해) 넣고, 여기에 톨루엔 중의 p-클로라닐 포화 용액 100 ㎕와 신선한 아세트알데하이드 50 ㎕를 첨가하는 과정으로 이루어진다. 10분 후, 그레인의 색 컨트롤 수행한다.
이 단계에서, 검사를 수행한 후, 그레인은 녹색이 되었으며, 이는 유리 아미노 기의 존재를 의미한다. 수지에서 9-플루오레닐메톡시카르보닐의 탈보호를 검증한 후, Fmoc-Ala 유도체의 부착을 개시하였다.
c) 고체 지지체 상에 Fmoc-Ala의 임베딩
펩타이드 라이브러리 합성에서 제1 단계는 수지 1 g에 Fmoc-Ala를 증착하는 것이다. 아미노산 유도체를 부착하기 전에, 반응에 사용되는 수지를 용매, 즉 DMF (다이메틸포름아미드), DCM (메틸렌 클로라이드) 및 다시 DMF로 헹군 다음, 고체 지지체 관능기에서 Fmoc 보호기를 제거하였다. Fmoc 보호기를 제거하는 1회 사이클은 하기 단계를 포함한다:
Fmoc 보호기의 제거:
20% 피페리딘 / NMP 1 x 3분
20% 피페리딘 / NMP 1 x 8분
세척
DMF 3 x 2분
IsOH 3 x 2분
DCM 3 x 2분
유리 아미노 기의 존재에 대한 클로라닐 검사.
유리 아미노 기를 가진 수지를 DMF로 헹구었다. 별개의 플라스크에서, Fmoc-Ala을 DMF에 용해하였다. 다음으로, TBTU, DMAP 및 마지막으로 다이이소프로필에틸아민 (DIPEA)을 폴리머 증착에 대하여 다음과 같이 과량으로 첨가하였다: Fmoc-Pro/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6. 수득한 혼합물을 수지에 투입하여, 3시간 동안 교반하였다. 수지를 감압 하에 여과 추출한 다음 DMF, DCM 및 이소프로판올로 헹구었으며, 전체 아실화 공정을 2회 반복하였다. 헥사플루오로포스페이트-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N ',N'-테트라메틸우로늄 (HATU), 이후 헥사플루오로포스페이트-O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N'N'-테트라메틸우로늄 (HBTU)을 사용해 수지에 Fmoc-Pro를 부착하는 후속 반응을 수행하였다. 마지막 단계에서는 수지를 DMF, DCM 및 이소프로판올로 순차적으로 헹구고, 공기 건조하였다.
c. 다른 보호된 아미노산 잔기의 부착
보호된 트레오닌 유도체를 부착하기 위해, 반응조에서 수지를 Fmoc-Ala 잔기와 함께 DMF로 헹군 다음 아미노 기에서 Fmoc 탈보호를 수행하였다.
Fmoc 보호기의 제거:
DMF 1 x 5분
20% 피페리딘 / NMP 1 x 3분
20% 피페리딘 / NMP 1 x 8분
용매 세척 사이클:
DMF 3 x 2분
IsOH 3 x 2분
DCM 3 x 2분
클로라닐 검사:
클로라닐 검사에서 수지 그레인의 녹색으로 입증된 바와 같이 양성 결과가 관찰되었다. 이로써 다음 단계, Fmoc-Thr (tBu)-OH 아미노산 잔기의 부착으로 넘어갈 수 있었다.
아미노산 유도체의 부착:
커플링 과정 전에 수지를 DMF에서 헹구었다. 보호된 글루탐산 잔기의 부착시 커플링 혼합물의 조성은 변동없이 유지하였다.
각 아실화 종료시, 용매 세척 사이클을 해당 공정에 따라 수행한 다음 용액에서 유리 아미노 기의 존재에 대해 클로라닐 검사를 수행하였다.
용매 세척 사이클:
DMF 3 x 2분
IsOH 3 x 2분
DCM 3 x 2분
클로라닐 검사:
2번째 아실화 후 수행한 검사에서 수지 그레인은 무색이었으며, 따라서 다음 합성 단계, 즉 다른 보호된 아미노산 유도체 - 트레오닌 및 2-아미노벤조산 분자의 도입을 진행할 수 있었다. 커플링 공정은 앞서 기술된 공정에 따라 수행하였다.
상기 언급된 잔기를 부착한 후 수행한 검사에서 양성 결과가 확인되었다: 수지 그레인은 무색이었다.
d) 측쇄 보호를 유지하면서 고체 지지체로부터 펩타이드의 제거
합성 완료 후, 자기 교반기 상의 둥근 바닥형 플라스크에서 혼합물, 즉 아세트산: TFE (트리플루오로에탄올): DCM (2:2:6, v/v/v)를 사용해, 보호된 ABZ-Thr(tBu)-Th (tBu)-Ala-OH 펩타이드를 측쇄 보호를 유지하면서 수지에서 제거하였다.
2시간 후, 플라스크의 내용물을 소결 (Schott) 깔때기 상에서 감압 하에 여과 추출한 다음 아스트리젠트 (astringent) 혼합물로 헹구었다. 용액을 헥산 (1:10 v/v)으로 헹구고, 감압 증발한 후 동결건조하였다.
e) 파라니트로아닐리드 Arg 유도체의 화학 합성
혼합 무수물 방법으로 Fmoc-Arg(Pbf)-pNA를 합성하였다. 제1 단계에서, 2 mmol Fmoc-Arg (Pbf)를 무수 테트라하이드로푸란 (THF)에 2 mmol N-메틸모르폴린 (NMM)의 존재 하에 용해하였다. 아미노산 유도체의 카르복시기를 2 mmol 이소부틸 클로라이드로 활성화한다. 10분간 활성화 후, 3 mmol p-니트로아닐린을 첨가하였다. 반응을 2시간 동안 -15℃에서, 이후 실온에서 24시간 동안 수행하였다. 반응이 완료되면, 용매를 증발시키고, 건조 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해하였다. 수득한 용액을 NaCl 포화 수용액, 10% 구연산, 5% 소듐 바이카보네이트로 순차적으로 헹구었다. 수득한 용액을 무수 소듐 설페이트 상에서 건조한 후, 에틸 아세테이트를 감압 증류하고, 건조 잔류물을 진공 데시케이터에서 P2O5 및 KOH 상에서 건조하였다.
f) 보호된 펩타이드와 파라니트로아닐리드 Arg (Pbf)의 커플링
보호된 ABZ1-Thr(tBu)2-Thr (tBu)3-Ala4-OH 펩타이드를 소량의 DCM에 용해한 다음 TFFH (테트라메틸플루오로포름아미드)를 사용해 30분 동안 0℃에서 활성화하였다. 그 후, 촉매량의 DMAP와 Arg (Pbf)-pNA를 첨가하였다. 반응을 바람직하게는 실온에서 24시간 동안 수행한 다음 용매를 증발시켰다. 수득한 용액에 혼합물 TFA: 페놀: 물: TIPS (88:5:5:2, v/v/v/v)를 부어 3시간 동안 자기 교반기 상의 둥근 바닥형 플라스크에서 혼합하여 측쇄 보호를 제거하였다.
그 후, 플라스크에 차가운 다이에틸 에테르를 넣고, 형성되는 석출물을 고속 원심분리기에서 5,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 수득된 침강물은 초음파를 사용해 물에 용해한 다음 동결건조하였다.
새로운 화합물의 실체/특징 - HPLC 분석, MS
HPLC 조건: RP Bio Wide Pore Supelco C8 250 mm 4 mm 컬럼, A 상 시스템 0.1% TFA / 물, B: 80% 아세토니트릴 / A), 유속 1 mL/min, 226 nm에서 UV 검출. 화합물의 수득이 검증되었다.
실시예 3
새로운 화합물의 활용 실험을 췌장암으로 진단된 환자 10명으로 구성된 군에서 수행하였다. 이를 위해, 식 2: ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2의 화합물 또는 식 3: ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-pNA의 화합물을 다이메틸 설폭사이드에 (0.5 mg/mL 농도로) 용해하고; 이 용액 50 ㎕를 완충제 (200 mM Tris-HCl, pH 8.0) 120 ㎕ 및 췌장암 환자의 뇨 80 ㎕과 혼합하였다. 측정은 흡광도를 측정하는 용도로 설계된 96웰 플레이트에서 수행하였으며, 각각의 샘플을 37℃에서 트리플리케이트로 분석하였다. 측정 시간은 60분이었다. 측정 중에 해리된 발색단 (ANB-NH2 또는 pNA)의 파장 특징을 405 nm (범위 380-430 nm)에서 모니터링하였다.
측정 결과, 췌장암으로 진단된 환자로부터 수득한 모든 뇨 샘플들은 시간 경과에 따라 용액의 색이 진해졌다. 관찰된 경시적인 흡광도 증가는 검사 샘플별로 상이하였다. 건강한 개체의 뇨 샘플 15개 중 어느 것에서도 진단 범위에서 흡광도 증가는 관찰되지 않아, 다른 결과가 수득되었다.
본 분석은 췌장암 진단에서 실시예에 따른 화합물의 용도를 검증해준다. 새로운 화합물의 작용 기전은 그 위치에서 320-480 nm, 특히 380-430 nm에서 흡광하는 유리 발색단 분자 ANB-NH2 - 5-아미노-2-니트로벤조산의 아미드 또는 pNA - 파라-니트로아닐린을 각각 해리시키는 효소적 가수분해를 기반으로 한다.
표 1 - 도 1에 도시된 값
1 0.128 0.152 0.2109
2 0.00532 0.00469 0.04912
3 0.07457 0.07826 0.07178
4 0.03727 0.03636 0.03044
5 0.02734 0.01944 0.02312
6 0.04416 0.04476 0.04487
7 0.02666 0.02332 0.025
8 0.02045 0.02486 0.02345
9 0.00647 0.00797 0.00596
10 0.08668 0.11456 0.08522
그외 11-25의 값들은 0이다.
표 2 - 도 2에 도시된 값
1 0.22 0.189 0.2109
2 0.07457 0.07826 0.07178
3 0.01632 0.01669 0.01723
4 0.01727 0.01636 0.01044
5 0.05734 0.05944 0.06152
6 0.05416 0.05476 0.05487
7 0.02666 0.02332 0.025
8 0.02045 0.02486 0.02345
9 0.01947 0.01797 0.01896
10 0.11668 0.11456 0.10522
그외 11-25의 값들은 0이다.
표 3 - 도 3에 도시된 값
3 0 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
6 0 0 0
7 0 0 0
8 0.07661 0.07534 0.09735
9 0 0 0
본 발명은 추가적으로 하기에 관한 것이다:
1. 화학적 화합물 - 하기 일반식의 진단 마커:
ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-X6 (식 1)
상기 식에서,
ABZ는 2-아미노벤조산이고,
X는 ANB-NH2 또는 pNA이되, 여기서 ANB-NH2는 5-아미노-2-벤조산의 아미드이고,
ANB는 5-아미노-2-니트로벤조산이고,
pNA는 파라-니트로아닐린이다.
2. 고체 지지체, 바람직하게는 Fmoc 기를 가진 고체 지지체 상에서 공정을 수행하는 것을 기반으로 하는, 화학적 화합물 - 진단 마커의 수득 방법:
ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-ANB-NH2 6, (식 2)
상기 식에서,
ABZ는 2-아미노벤조산이고,
ANB-NH2는 5-아미노-2-니트로벤조산의 아미드임,
공정을 개시하기 전에, 고체 지지체를 준비한다: 소수성 용매, 바람직하게는 다이메틸포름아미드, 메틸렌 클로라이드 또는 N-메틸피롤리돈으로 반복 세척하여 부피를 팽창시키고, 바람직하게는 다이메틸포름아미드, 메틸렌 클로라이드 또는 N-메틸피롤리돈과 같은 용매 중의 10-30% 피페리딘 용액으로 세척함으로써 Fmoc 보호기를 제거한다. 그런 후, 공정을 후속 단계로 수행한다:
a) 수지 상에 5-아미노-2-니트로벤조산 ANB를 증착시키기 전에 DMF 중의 3-6% N-메틸모르폴린 (NMM) 용액 및 DMF로 순차적으로 헹군다. 그런 후, DMF 중의 ANB 용액을 준비해, 폴리머 증착에 대해 다음과 같이 과량으로 TBTU, DMAP 및 마지막으로 다이이소프로필에틸아민 (DIPEA)을 첨가한다: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6. 수득된 혼합물을 수지에 첨가해 균질해질 때까지 혼합한 후, 수지를 감압 하에 여과 추출하여, DMF, DCM 및 이소프로판올과 같은 용매로 헹군다. 그런 후, 헥사플루오로포스페이트-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 (HATU), 다음으로 헥사플루오로포스페이트-O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 (HBTU)을 과량으로 사용해 수지에 ANB를 연속적으로 결합시키고, 완료 후 고체 지지체를 DMF, DCM 및 이소프로판올로 순차적으로 세척한 다음 조심스럽게 건조한다,
b) 아미노산 유도체 Fmoc-Arg (Pbf)-OH와의 반응을 통해 ANB에 아미노산 잔기를 부착시키고, 수지에 대해 아미노산 유도체를 적어도 5배 몰 과량으로 무수 피리딘에 용해하여 ANB가 증착된 수지와 접촉시킨다. 그런 후, 전체 내용물을 20℃ 미만의 온도로 냉각시키고, 사용된 아미노산 유도체의 양에 대해 1:1 비율로 POCl3를 첨가해 혼합한다. 실온에서, 그리고 이후 승온된 온도에서 혼합 공정을 수행하고; 반응 완료 후, 수지를 감압 하에 여과 추출해 DMF 및 MeOH로 헹구고 조심스럽게 건조하며; 수득한 중간산물 화합물에 대해 아실화 공정을 수행한다.
c) 제조된 중간산물 화합물에 대한 아실화는, 아미노산 유도체, 바람직하게는 Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr (tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH 및 마지막으로 Boz-Abz-OH를 순차적으로 사용해 수행한다. 아실화는 커플링제로서 다이이소프로필카르보디이미드를 과량으로 사용해 잔기 6에서 1까지 단계적으로 수행한다. 각 단계 완료 후, 수지를 DMF로 헹구고, (바람직하게는) 클로라닐 검사를 수행하여 아미노산 유도체의 부착을 모니터링한다.
d) DMF 중의 10-30% 피페리딘 용액으로 세척한 다음 용매 DMF, 이소프로판올 및 메틸렌 클로라이드 각각으로 세척하여, Fmoc 보호기의 제거를 수행한다.
e) TFA, 페놀, 물 및 TIPS 혼합물을 각각 88:5:5:2 v/v/v/v 비율로 유지하면서 사용해 수지로부터 펩타이드를 분리하고; 혼합물을 1시간 이상, 바람직하게는 3시간 이상 교반하고, 수득되는 석출물을 감압 하에 여과 추출한 다음 다이에틸 에테르로 헹구고, 제조된 펩타이드를 원심분리한다.
f) 펩타이드를 초음파를 사용해 물에 용해한 다음 동결건조하여, 최종 제품을 준비한다.
3. 공정이 고체 지지체, 바람직하게는 Fmoc 기를 가진 고체 지지체 상에서 수행되는 것을 기반으로 하는, 화학적 화합물 - 진단 마커의 수득 방법:
ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-pNA6 (식 3)
상기 식에서,
ABZ는 2-아미노벤조산이고,
pNA는 파라니트로아닐리드임,
공정을 개시하기 전에, 고체 지지체를 준비한다: 소수성 용매, 바람직하게는 다이메틸포름아미드, 메틸렌 클로라이드 또는 N-메틸피롤리돈으로 반복 세척하여 부피를 팽창시키고, 바람직하게는 다이메틸포름아미드, 메틸렌 클로라이드 또는 N-메틸피롤리돈과 같은 용매 중의 10-30% 피페리딘 용액으로 세척함으로써 Fmoc 보호기를 제거하며; 그런 후, 공정은 후속 단계로 수행한다:
a) 수지에 3번째 아미노산 잔기 (Fmoc-Ala)의 부착은 무수 메틸렌 클로라이드에 용해된 적절한 아미노산 유도체를 수지 증착에 대해 9배 몰 과량으로 사용해 수행한다. 그런 후, 혼합물을 실온에서 적어도 2시간 동안 교반하고; 반응 완료 후, 수지를 감압 하에 여과 추출해 DMF 및 MeOH로 헹군 후 건조한다.
b) 후속 단계들에서, 이하 아실화로 지칭되는 아미노산 잔기의 부착을 수행하며, 유도체 Fmoc-Thr(tBu)-OH를 사용한 다음 Fmoc-Thr(tBu)-OH 및 Boc-ABZ-OH를 순차적으로 사용하고; 각 단계에 앞서 수지를 DMF로 바람직하게는 5분간 세척하고; 후속적인 부착에서는, 커플링제, 바람직하게는 다이이소프로필카르보디이미드를 과량으로 사용한다. 이 공정을 2회 반복하고, 각 단계 후 수지를 DMF로 헹구고, 바람직하게는 아미노산 유도체의 부착을 모니터링하는 클로라닐 검사로 검사한다.
c) DMF 중의 10-30% 피페리딘 용액으로 세척한 다음 용매 DMF, 이소프로판올 및 메틸렌 클로라이드 각각으로 세척하여, Fmoc 보호기의 제거를 수행한다.
d) 화합물 (ABZ1-Thr(tBu)2-Thr (tBu)3-Ala4-OH)이 수득될 때까지 단계 b)-c)를 반복 실시하고; 합성은 잔기 6에서 3까지 수행한 다음 제조된 화합물을 TFA: 페놀: 물: TIPS 혼합물을 각각 88:5:5:2 v/v/v/v 비율로 사용해 교반 중에 수지로부터 탈착시킨다. 적어도 2시간 후, 플라스크의 내용물을 감압 하에 여과 추출하고, 석출물을 다이에틸 에테르로 헹군다. 그 후, 석출물을 바람직하게 20분간 원심분리하고, 초음파를 이용해 물에 용해한 다음 동결건조한다.
e) Fmoc-Arg (Pbf)-pNA 합성을 다음 단계로 수행한다; 제1 단계에서, 2 mmol Fmoc-Arg (Pbf)를 무수 테트라하이드로푸란 (THF)에 2 mmol N-메틸모르폴린 (NMM)의 존재 하에 용해하고, 아미노산 유도체의 카르복시기를 2 mmol 이소부틸 클로라이드로 활성화한다. 10분간 활성화 후, 3 mmol p-니트로아닐린을 첨가하여 반응을 (바람직하게는) 2시간 동안 (바람직하게는) -15℃에서, 이후 실온에서 1일간 수행한다. 반응이 완료되면, 용매를 증발시키고, 건조 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해한 다음; 수득되는 용액을 NaCl 포화 수용액, 10% 구연산, 5% 소듐 바이카보네이트로 순차적으로 헹구고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조한 후; 에틸 아세테이트를 감압 증류하고, 건조 잔류물을 건조한다.
f) 보호된 펩타이드 ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH와 파라니트로아닐리드 Arg (Pbf)의 조합은 하기 공정을 토대로 한다: 보호된 펩타이드ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH를 소량의 DCM에 용해한 다음 TFFH (테트라메틸플루오로포름아미드)를 사용해 바람직하게는 30분 동안 바람직한 온도 0℃에서 활성화한 후, 촉매량의 DMAP와 Fmoc-Arg(Pbf)5-pNA6를 첨가한다. 반응은 바람직하게는 실온에서 24시간 동안 수행한 다음 용매를 증발시키고, 수득한 용액에 혼합물 TFA: 페놀: 물: TIPS (88:5:5:2, v/v/v/v)를 부어 바람직하게는 3시간 동안 혼합하여 측쇄 보호를 제거한다.
g) 최종 산물은 펩타이드를 물에 초음파를 사용해 용해한 다음 동결건조하여 준비한다.
4. 췌장암 진단 방법은 다음과 같은 공정을 토대로 한다: 0.1-10 mg/mL (바람직하게는 1 mg/mL) 농도 범위의 일반식 1의 화학적 화합물을 측정 완충제에서 중성 또는 염기성 pH, 바람직하게는 생리학적 pH에서 소량의 인간 뇨와 1:2 내지 1:10 (바람직하게는, 1:5 뇨 샘플 : 측정 완충제)의 비율로 인큐베이션하고, 300-500 nm, (바람직하게는 380-430 nm) 범위에서 흡광 강도를 25-40℃ (바람직하게는 36-38℃) 범위의 온도에서 40-60분에 걸쳐 측정한다.
아울러, 본 발명은 특히 하기 항목에 관한 것이다:
1. X1을 포함하는 단편 1과 X2를 포함하는 단편 2로 절단되면 검출가능한 신호를 발생시키는, 식 1을 특징으로 하는 화합물:
X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2 (식 1)
2. 서열 Thr-Thr-Ala-Arg이 가수분해 효소, 특히 화합물을 X1-Thr-Thr-Ala-Arg-OH (단편 1)와 NH2-X2 (단편 2)로 절단하는 가수분해 효소에 대해 접근가능한, 항목 1에 따른 화합물.
3. X1이 구성성분 C1을 포함하거나 또는 이로 구성되고, X2가 구성성분 C2를 포함하거나 또는 이로 구성되며, C1과 C2의 공간적 분리시 검출가능한 신호가 발생되는, 항목 1 또는 2에 따른 화합물.
4. C1과 C2 중 하나, 특히 C2가 파장 1에서 최대 흡광도 1 (AM1)을 가진 발색단이고, 화합물이 파장 1과는 다른 파장 2에서 최대 흡광도 2 (AM2)를 가지는, 항목 1-3 중 어느 하나에 따른 화합물.
5. C1 및 C2가 형광 도너 및 형광 어셉터 쌍인, 항목 1-4 중 어느 하나에 따른 화합물.
6. C1 및 C2 쌍이 2-아미노벤조산 (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 특히 C1 및 C2 쌍이 ABZ/pNA 및 ABZ/ANB-NH2로부터 선택되는, 항목 1-5 중 어느 하나에 따른 화합물.
7. 항목 1-6 중 어느 하나에 따른 화합물을, 췌장암 세포로부터 유래한 가수분해 효소, 특히 프로테아제를 포함할 수 있는 체액과 접촉시키고, 신호를 검출하는 것을 포함하는, 개체의 체액에서 프로테아제 활성을 검출하는 시험관내 방법.
8. 개체에서 췌장암의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 것이며, 체액내 프로테아제의 활성 존재는 췌장암의 존재를 의미하고, 체액내 프로테아제 활성의 부재는 췌장암의 부재를 의미하는 것인, 항목 7에 따른 시험관내 방법.
9. 췌장암을 진단하기 위한 것인, 항목 7에 따른 시험관내 방법.
10. 체액이 뇨인, 항목 7-9 중 어느 하나에 따른 시험관내 방법.
11. 화합물이 중성 또는 염기성 pH, 바람직하게는 생리학적 pH의 측정 완충제에 0.1-10 mg/ml, 구체적으로 0.25-7.5 mg/ml, 더 구체적으로 0.5-5 mg/ml, 더 구체적으로 0.75-2 mg/ml, 보다 더 구체적으로 약 1 mg/ml의 농도로 제공되고, 체액을 화합물에 1:2 내지 1:10, 구체적으로 1:3 내지 1:8, 더 구체적으로 1:4 내지 1:6, 보다 더 구체적으로 약 1:5의 비율로 첨가하는, 항목 7-10 중 어느 하나에 따른 방법.
12. 신호의 검출은 흡광도 또는 형광 측정을 포함하고, 구체적으로 300-500 nm, 더 구체적으로 380-430 nm에서, 바람직하게는 40-60분 동안 25-40℃, 특히 36-38℃에서 흡광 강도의 측정을 포함하는, 항목 7-11 중 어느 하나에 따른 방법.
13. 항목 1-6 중 어느 하나에 따른 화합물 및 측정 완충제를 포함하는 키트.
14. 췌장암 검출, 또는 췌장암이 의심되거나 췌장암 발병 위험성이 증가되거나 또는 췌장암에 걸린 적 있는 개체에 대한 모니터링에 있어, 항목 1-6 중 어느 하나에 따른 화합물, 항목 7-12 중 어느 하나에 따른 방법, 또는 항목 13에 따른 키트의 용도.
15. 하기 단계를 포함하는, 췌장암 치료 방법에 사용하기 위한 항목 1-6 중 어느 하나에 따른 화합물:
a. 항목 7-12 중 어느 하나에 따른 방법을 수행하는 단계, 및
b. 단계 a.에서 프로테아제 활성이, 특히 프로테아제 활성의 증가가 검출된 개체에서 췌장암을 치료하는 단계.
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Claims (13)

  1. 식 1을 특징으로 하는 화합물로서:
    X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2 (식 1)
    상기 화합물이 X1을 포함하는 단편 1과 X2를 포함하는 단편 2로 절단되면, 검출가능한 신호가 발생되고,
    X1이 구성성분 C1을 포함하거나 또는 이로 구성되고, X2가 구성성분 C2를 포함하거나 또는 이로 구성되며, 상기 화합물의 가수분해 절단에 의해 C1과 C2가 공간적으로 분리되면 검출가능한 신호가 발생되고,
    C1 및 C2가 형광 도너 (fluorescence donor) 및 형광 어셉터 (fluorescence acceptor) 쌍인, 화합물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열 Thr-Thr-Ala-Arg에 가수분해 효소, 특히 화합물을 X1-Thr-Thr-Ala-Arg-OH (단편 1)와 NH2-X2 (단편 2)로 절단하는 가수분해 효소가 접근가능한, 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    C1과 C2 중 하나, 특히 C2가 파장 1에서 최대 흡광도 1 (AM1)을 나타내는 발색단이고, 상기 화합물이 파장 1과는 다른 파장 2에서 최대 흡광도 2 (AM2)를 나타내는, 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    C1 및 C2 쌍이 2-아미노벤조산 (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 특히 C1 및 C2 쌍이 ABZ/pNA 및 ABZ/ANB-NH2로부터 선택되는, 화합물.
  5. 개체의 체액에서 프로테아제 활성을 검출하는 시험관내 방법으로서,
    체액을 화합물과 접촉시키고, 신호를 검출하는 것을 포함하고,
    상기 체액이 췌장암 세포로부터 유래한 가수분해 효소, 특히 프로테아제를 포함할 수 있으며,
    상기 화합물이 식 1을 특징으로 하고:
    X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2 (식 1)
    상기 화합물이 X1을 포함하는 단편 1과 X2를 포함하는 단편 2로 절단되면 검출가능한 신호가 발생되는, 시험관내 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    개체에서 췌장암의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 것이며, 체액내 프로테아제 활성의 존재는 췌장암의 존재를 의미하고, 체액내 프로테아제 활성의 부재는 췌장암의 부재를 의미하는 것인, 시험관내 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    췌장암을 진단하기 위한 것인, 시험관내 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 체액이 뇨인, 시험관내 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물이 중성 또는 염기성 pH, 바람직하게는 생리학적 pH의 측정 완충제에 0.1-10 mg/ml, 구체적으로 0.25-7.5 mg/ml, 더 구체적으로 0.5-5 mg/ml, 더 구체적으로 0.75-2 mg/ml, 보다 더 구체적으로 약 1 mg/ml의 농도로 제공되고, 상기 체액이 상기 화합물에 1:2 내지 1:10, 구체적으로 1:3 내지 1:8, 더 구체적으로 1:4 내지 1:6, 보다 더 구체적으로 약 1:5의 비율로 첨가되는, 방법.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 신호의 검출이 흡광도 또는 형광의 측정을 포함하고, 구체적으로 300-500 nm, 더 구체적으로 380-430 nm에서, 바람직하게는 40-60분 동안 25-40℃, 특히 36-38℃에서 흡광 강도의 측정을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 측정 완충제를 포함하는 키트.
  12. 췌장암의 검출, 또는 췌장암이 의심되거나 췌장암 발병 위험성이 증가되거나 또는 췌장암에 걸린 적 있는 개체에 대한 모니터링에 있어, X1을 포함하는 단편 1과 X2를 포함하는 단편 2로 화합물의 절단시 검출가능한 신호가 발생되는 식 1을 특징으로 하는 화합물, 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 상기 화합물과 측정 완충제를 포함하는 키트의 용도:
    X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2 (식 1),
  13. 하기 단계를 포함하는, 췌장암 치료 방법:
    a. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 단계, 및
    b. 단계 a.에서 프로테아제 활성이, 특히 프로테아제 활성의 증가가 검출된 개체에서 췌장암을 치료하는 단계.
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