CN114096555A - 新型胰腺癌诊断标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供由下式(1)表征的化合物：Xl‑Thr‑Thr‑Ala‑Arg‑X2(式1)，其中将化合物裂解成包含X1的片段1和包含X2的片段2，产生可检测信号。本发明还提供一种用于检测受试者体液中蛋白酶活性的体外方法，包括使体液与根据本发明的化合物接触并检测信号，其中所述体液可以包括来自胰腺癌细胞的水解酶。此外，本发明提供包含根据本发明的化合物和测量缓冲液的试剂盒。另外，本发明提供化合物的用途、所述体外方法或本发明的试剂盒，用于检测胰腺癌，或监测疑似患有胰腺癌、患胰腺癌的风险增加或已经患有胰腺癌的受试者。本发明还提供根据本发明的化合物在治疗胰腺癌的方法中的用途，所述方法包括执行用于检测受试者体液中蛋白酶活性的体外方法，以及治疗受试者的胰腺癌，其中已在受试者中检测到蛋白酶活性。

Description

新型胰腺癌诊断标志物
技术领域
本发明涉及用于诊断胰腺癌的化合物。本发明尤其涉及适合于检测样本中的蛋白水解酶的显色肽。
背景技术
胰腺癌通常预后很差，因为通常确诊的时候已经是晚期了。由于这种癌症的动态变化，五年存活率是罕见的。全世界每年约有250,000例胰腺癌确诊，而在波兰则有3,500例。不幸的是，绝大多数病例以死亡告终(超过80％)。目前仍然需要可靠、快速且不复杂的诊断方法来检测胰腺癌。早期诊断将增加手术治疗的机会，这可以显著延长患者的生存期。
癌细胞的起始、生长和传播过程涉及许多因素，包括许多蛋白水解酶。这组蛋白质能够将蛋白质和肽水解成更小的片段。蛋白水解酶介导细胞外基质的降解，从而允许癌细胞定植新组织，并形成新血管(血管生成)，从而促进营养物质向肿瘤的有效输送。此外，由于肿瘤生长过程导致健康细胞死亡，因此存在蛋白水解酶。所有这些过程形成了肿瘤特有的蛋白水解酶谱。
先前已经描述了显色肽分子在蛋白水解酶的影响下分解，导致被测溶液颜色的变化或增加。这种显色效应是发色团(例如4-硝基苯胺或5-氨基-2-硝基苯甲酸)释放的结果。
此类肽衍生物可从以下出版物中获知：
1.Erlanger BF,Kokowsky N,Cohen W.The preparation and properties oftwo new chromogenic substrates of trypsin.Arch Biochem Biophys.1961Nov；95:271-8.
2.Hojo K,Maeda M,Iguchi S,Smith T,Okamoto H,Kawasaki K.Amino aC1dsand peptides.XXXV.FaC1 le preparation of p-nitroanilide analogs by the solid-phase method.Chem Pharm Bull(Tokyo).2000Nov；48(l 1):1740-4.
先前已经描述了用于检测和测量蛋白酶表达的方法。所公开的方法基于与特定多肽特异性结合的分离抗体和编码特定多肽的多核苷酸的PCR。蛋白酶活性的证明通过与显色分子缀合的适当合成肽底物的水解来测量，其中蛋白酶裂解所述合成底物并且测量在底物水解期间释放的色原的吸光度。(CA 2 425 829)。
根据本发明的优选化合物以这样的方式开发，使得信号，例如如果该化合物与胰腺癌患者的尿样接触，则可以检测到这样一个信号，例如颜色在380-440nm范围内增加。如果该化合物与健康人士或诊断患有其他类型癌症的患者的尿样接触，则不会发生这种效应。
本发明人已经发现这种信号，例如来自释放的显色化合物或荧光供体/受体对分离后的荧光信号可用于检测患有胰腺癌的受试者的尿液中蛋白水解酶的存在。化合物的酶法水解导致产生可检测的差异，例如游离发色团分子(分别为ANB-NH2-5-氨基-2-硝基苯甲酸的酰胺或pNA-对硝基苯胺)的释放，其在320-480nm处显示吸光度。
本发明的化合物尤其提供了(i)一种用于检测胰腺癌的快速和非侵入性诊断方法，(ii)一种适用于胰腺癌早期检测的方法，(iii)一种能够成功用于胰腺癌的筛查的方法，(iv)在癌症发展的早期阶段进行完整的诊断过程，以引入更有效的治疗方法。
发明内容
第一方面，本发明涉及由下式(1)表征的化合物：
Xl-Thr-Thr-Ala-Arg-X2 (式1)，
其中将化合物裂解成包含X1的片段1和包含X2的片段2，产生可检测信号。所述化合物包含根据SEQ ID NO:1所示的四肽Thr-Thr-Ala-Arg。
第二方面，本发明涉及一种用于检测受试者体液中蛋白酶活性的体外方法，包括使体液与根据本发明第一方面的化合物接触并检测信号，其中所述体液可以包括来自胰腺癌细胞的水解酶，特别是蛋白酶。
第三方面，本发明涉及包含根据本发明第一方面的化合物和测量缓冲液的试剂盒。
第四方面，本发明涉及根据本发明第一方面的化合物的用途、根据本发明第二方面的方法或根据本发明第三方面的试剂盒用于检测胰腺癌，或监测疑似患有胰腺癌、患胰腺癌的风险增加或患有胰腺癌的受试者。
第五方面，本发明涉及根据本发明第一方面的化合物在治疗胰腺癌的方法中的用途，该方法包括步骤(a)实施本发明的第二方面的方法，和步骤(b)治疗在步骤(a)中检测到蛋白酶活性，特别是蛋白酶活性增加的受试者的胰腺癌。
具体实施方式
在下面详细描述本发明之前，应理解本发明不限于本文所述的特定方法学、方案和试剂，因为它们够可以变化。还应理解，本文所用术语仅用于描述特定实施例，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。优选地，本文使用的术语如下词汇表所定义：“A multilingual glossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”,Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.and Kolbl,H.eds.(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland).
本说明书全文引用了若干文献。本文引用的每个文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、操作指南等)，无论是上文还是下文，均通过引用整体并入本文。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权因在现有发明而早于此类公开。
为实施本发明，除非另有说明，否则均采用化学、生物化学和重组DNA技术的常规方法，腔以下领域文献中说明了这些常规方法，(cf,e.g.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor 1989).
在整篇说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和诸如“包括”的变体应被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤组。除非内容另有明确规定，否则在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一”和“该”包括复数所指对象。
下面将描述本发明的元件。这些元件与特定实施例一起列出，然而，应当理解，它们可以以任何方式和以任何数量组合以创建附加实施例。不同描述的示例和优选实施例不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施例。该描述应当被理解为支持并包含实施例，这些实施例将明确描述的实施例与任何数量的公开和/或优选的元件相结合。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合都应被认为是本申请的描述所公开的。
专利说明书和权利要求中使用的术语和缩写应理解如下：
在本发明的上下文中，“可检测信号”是指例如由任何标记产生的任何信号，所述标签包括磁性标签、荧光部分、酶、化学发光探针、金属颗粒、非金属胶体粒子、聚合物染料粒子、颜料分子、颜料粒子、电化学活性物质、半导体纳米晶体或其他纳米粒子，包括量子点或金粒子。标签可以是例如发色团、荧光团、量子点或放射性标记。
在本发明的上下文中，表述“发色团”用于指具有“显色特性”的化合物。表述“显色特性”是指化合物形成有色产物的能力。
在本发明的上下文中，表述“荧光团”用于指具有“荧光特性”的化合物。表述“荧光特性”是指化合物形成荧光发射产物的能力。
本发明的荧光染料包括以下类别的染料：黄原胶(例如荧光素)、吖啶(例如吖啶黄)、恶嗪(例如恶嗪1)、Cynine(例如Cy7/Cy 3)、苯乙烯基染料(例如Dye-28)、香豆素(例如Alexa Fluor 350)、卟啉(例如叶绿素B)、金属配体复合物(例如PtOEPK)、荧光蛋白(例如APC、R-藻红蛋白)、纳米晶体(例如Q量子点705)、苝(例如Lumogen Red F300)和酞菁(例如IRDYETM700DX)以及这些类别染料的缀合物和组合。
量子点是由元素周期表中II-VI族或III-V族元素(例如CdSe、CdTe、InP)的原子组成的半导体。其他替代方案包括任何两种染料系统。
在本发明的上下文中，NMP是指A-甲基吡咯烷酮。
在本发明的上下文中，DMF是指二甲基甲酰胺。
在本发明的上下文中，DCM是指二氯甲烷。
在本发明的上下文中，pNA是指4-硝基苯胺，也可称为对硝基苯胺。
在本发明的上下文中，ABZ是指2-氨基苯甲酸。
在本发明的上下文中，ANB-NH2是指5-氨基-2-硝基苯甲酸的酰胺。
在本发明的上下文中，AFC是指7-酰胺基-4-三氟甲基香豆素。
在本发明的上下文中，Boc是指叔丁氧羰基。
在本发明的上下文中，Fmoc是指9-芴基甲氧基羰基。
在本发明的上下文中，TFA是指三氟乙酸。
在本发明的上下文中，术语“胰腺癌”以最广泛的意义使用并且指所有起源于胰腺的癌症。它包括外分泌癌、内分泌癌、胰腺母细胞瘤、胰腺肉瘤和淋巴瘤等亚型。外分泌癌包括腺癌，特别是导管腺癌，以及囊性肿瘤和腺泡细胞癌。内分泌癌包括胃泌素瘤、胰岛素瘤、生长抑素瘤、VIP瘤和胰高血糖素瘤。它还包括以下阶段(由括号中相应的TNM分类定义)：0期(Tis、NO、M0)、IA期(Tl、NO、M0)、IB期(T2、NO、M0)、IIA期(T3、NO、M0)、IIB期(Tl-3、Nl、M0)、III期(T4、任何N、M0)和IV期(任何T、任何N、M1)。
根据本发明的肽优选显色或荧光肽可以通过在本领域已知的固相支持体上进行肽合成来获得。固相支持体可以是具有Fmoc基团的树脂形式，其在反应过程中被去除。用于执行此过程的树脂应适当制备。该树脂的制备包括通过用疏水性溶剂反复洗涤来增加其体积。
必须通过用20％的溶剂溶液洗涤将Fmoc保护基团从树脂上除去。
获得显色肽的已知方法包括在适当的时间和化学计量条件下连接各个组分。此连接过程由后续阶段组成，其中连接单个元素(氨基酸衍生物)，洗掉残留物，去除保护基团并再次洗涤。对每个氨基酸残基重复该循环。通过在酸性条件下反应，将所得肽与树脂分离。随后，通过过滤将溶液与树脂分离，然后用非极性溶剂从所得溶液中沉淀出肽。然后离心肽沉淀物。
获得显色肽的已知方法基于在固相支持体和部分在缓冲液中进行的过程。酰胺树脂用作固相支持体，疏水性溶剂的混合物用作溶液。
使用Hojo等人，Chem Pharm Bull(Tokyo)，2000中描述的方法制备根据本发明的化合物。可在下面的实施例部分中找到合成的详细描述。
此外，根据本发明的肽可以与量子点连接。量子点是高度发光的，除非因金属纳米粒子的存在而猝灭。紫精(例如甲基紫精或丙紫精磺酸酯(PVS))也可用作猝灭剂。
一旦蛋白酶裂解共有序列，量子点就会被释放并点亮。
第一方面，本发明提供了由式1表征的化合物：X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2(式1)，其中将所述化合物裂解为包含X1的片段1和包含X2的片段2，以产生可检测信号。
在优选的实施例中，序列Thr-Thr-Ala-Arg对于水解酶，特别是将化合物裂解成Xl-Thr-Thr-Ala-Arg-OH(片段1)和NH2-X2(片段2)的水解酶是可接近的。
水解酶可以是蛋白酶或几种蛋白酶的组合。
在裂解化合物时产生的可检测信号可以选自技术人员已知的各种合适的信号。在优选的实施例中，可检测信号是光信号。
在优选的实施例中，X1包含组分C1或由组分C1组成，并且X2包含组分C2或由组分C2组成，并且可检测信号在C1和C2的空间分离时产生，即通过肽Thr-Thr-Ala-Arg的水解裂解产生。
X1除了包含C1外，还可以例如在C1的任一侧包含一个或多个氨基酸。X2除了包含C2外，还可以例如在C2的任一侧包含一个或多个氨基酸。因此，在裂解之前，C1和C2可被包含Thr-Thr-Ala-Arg或由其组成的4至20个氨基酸或5至10个氨基酸的氨基酸序列隔开。在优选的实施例中，C1和C2被不超过10个氨基酸隔开。
在优选的实施例中，可检测信号是吸收或荧光的变化。所述变化可以是增加或减少。在优选的实施例中，可检测信号是在300-500nm，特别是380-430nm处吸光度强度的增加。
在优选的实施例中，C1和C2之一是在波长1处具有最大吸收1(AMI)的发色团，并且化合物在不同于波长1的波长2处具有最大吸收2(AM2)。因此，如果在化合物裂解前后在波长2处测量吸收，则会检测到吸收增加。
特别优选的是，在裂解时，发色团以游离形式释放。裂解后，片段1由X1-Thr-Thr-Ala-Arg组成，而片段2仅由NH2-X2组成。因此，在优选的实施例中，发色团是C2而不是C1。在C2是发色团的情况下，优选X2由C2组成或基本上由C2组成。另一方面，X1可在C1的任一侧包含额外的氨基酸，从而在裂解之前，C1和C2可被比Thr-Thr-Ala-Arg更长的氨基酸序列隔开。
在优选的实施例中，发色团选自对硝基苯胺(pNA)、5-氨基-2-硝基苯甲酸的酰胺(ANB-NH2)、7-酰胺基-4-三氟甲基香豆素(AFC)和3-硝基L-酪氨酸(Tyr3-NO2)。在优选的实施例中，发色团是对硝基苯胺(pNA)。在优选的实施例中，发色团是5-氨基-2-硝基苯甲酸(ANB-NH2)的酰胺。
在优选的实施例中，C1和C2是一对荧光供体和荧光受体。在C1和C2是荧光供体和受体对并且该化合物用于测量化合物裂解后荧光变化的方法的情况下，优选C1和C2被不超过10个氨基酸隔开为了通过荧光受体保证荧光供体的有效猝灭。技术人员知道关键参数是荧光供体和荧光受体之间的距离。因此，在分隔C1和C2的氨基酸序列折叠成稠密或扭曲的二级结构的情况下，导致C1和C2的接近度比线性接头更近，从而可以允许C1和C2之间的空间更长。
在优选的实施例中，该C1和C2对选自2-氨基苯甲酸(ABZ)/pNA、ABZ/ANB-NH2、ABZ/DNP、ABZ/EDDNP、EDANS/DABCYL、TAM/DANSYL、ABZ/Tyr(3-NO2)，特别是C1和C2对选自ABZ/pNA和ABZ/ANB-NH2。优选地，C1和C2的特征在于分子量小于500g/mol，特别是小于400g/mol，更特别小于300g/mol，甚至更特别在100g/mol和200g/mol之间。
该C1和C2对也可以是蛋白质荧光供体和受体对，其选自BFP/GFP、BFP/CFP、BFP/YFP、BFP/DsRed、CFP/GFP、CFP/YFP、CFP/mVenus、CeFP/YFP、CeFP/mVenus、CeFP/mCitrine、CFP/dsRed、CFP/mCherry、mTurquoise/mVenus、GFP/YFP、GFP/DsRed、GFP/RFP、Clover/mRuby、Cy3/C5、Alexa 488/Alexa 555，和FITC/TRITC。技术人员知道如何基于它们的发射和吸收光谱选择合适的蛋白质荧光供体和受体对。
在C1和C2是蛋白质荧光供体和受体对的情况下，必须保证相对较大的蛋白质不会阻碍化合物的裂解，并且序列Thr-Thr-Ala-Arg是可访问的，用于水解酶的裂解。这可以例如通过增加包含根据SEQ ID NO:1的肽的氨基酸序列的长度来实现。
在优选的实施例中，化合物的特征在于式2：
ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2 (式2)。
在优选的实施例中，化合物的特征在于式3：
ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-pNA (式3)。
在裂解由式2或3表征的化合物时，释放游离发色团分子(分别为ANB-NH2或pNA)。因此，可以在380-430nm处检测到吸光度强度的增加。此外，裂解导致荧光供体(ABZ)与荧光受体(分别为ANB-NH2或pNA)在空间上分离。因此，从ABZ发出的荧光不再被淬灭，并且可以在420nm处检测到荧光强度的增加。
第二个方面，本发明提供了一种用于检测受试者体液中蛋白酶活性的体外方法，包括将体液与根据本发明第一方面的化合物接触并检测信号，其中体液可以包含水解酶酶，特别是蛋白酶，其来源于胰腺癌细胞。
在优选的实施例中，体液中存在蛋白酶活性表明存在胰腺癌，体液中不存在蛋白酶活性表明不存在胰腺癌。
在优选的实施例中，本发明提供了一种诊断胰腺癌的方法。
在优选的实施例中，体液选自血液或尿液。在优选的实施例中，体液是尿液。令人惊讶的是，发明人发现根据本发明第一方面的化合物能够检测尿样中的水解酶活性。与健康受试者相比，诊断患有胰腺癌的受试者的水解酶活性显著增加(图1、2)。
在优选的实施例中，受试者患胰腺癌的风险增加，怀疑受试者患有胰腺癌，受试者已经患有胰腺癌或患有胰腺癌。
在优选的实施例中，在具有中性或碱性pH值的测量缓冲液中，化合物以0.1-10mg/ml，特别是0.25-7.5mg/ml，更特别是0.5-5mg/ml，更特别是0.75-2mg/ml，甚至更特别是约1mg/ml的浓度提供，其中所述测量缓冲液的pH值优选为在6.8和8.5之间，更优选为生理pH值，并且将体液样品以以下比例添加到化合物中，比例为1:2至1:10，特别为1:3至1:8，更特别为1:4至1:6，甚至更特别地约1:5。
在本说明书的上下文中，表述“中性pH值”是指约7.0的pH值。在本说明书的上下文中，表述“生理pH值”是指约7.4的pH值。
在优选的实施例中，检测信号包括测量吸光度或荧光。
在优选的实施例中，检测信号包括测量在300-500nm，特别是380-430nm，优选在25-40℃，特别是36-38℃下40-60分钟的吸光度强度。
在优选的实施例中，吸光度的增加表明水解酶活性的存在。
第三方面，本发明提供了包含根据本发明第一方面的化合物和测量缓冲液的试剂盒。
第四方面，本发明提供了根据第一方面的化合物的用途、根据第二方面的方法或根据第三方面的试剂盒，用于检测胰腺癌，或在监测发展为胰腺癌的风险增大或疑似患有胰腺癌或之前患有胰腺癌的受试者。
根据第二方面的方法的使用，术语“受试者”可能有不同的限制。例如，如果该方法用于检测胰腺癌或筛查有关胰腺癌的受试者，则该受试者不知道患有胰腺癌，即它可能患有或可能没有胰腺癌。在这个例子中，受试者优选增加发展为或疑似患有胰腺癌，或之前患有胰腺癌(即，之前检测到的胰腺癌已被治愈)的风险增加。“风险增加”是指一种或多种一般癌症或胰腺癌的风险因素可归因于受试者，优选如美国癌症协会对一般癌症或胰腺癌所定义的。胰腺癌风险因素的例子有：烟草消费(特别是吸烟)、大量饮酒、肥胖、2型糖尿病、职业(工作场所接触干洗和金属加工行业使用的某些化学品)、慢性胰腺炎、年龄50岁或以上(特别是65岁或以上)、男性、种族(特别是非洲裔美国人和加勒比人的非洲血统)、胰腺癌家族史(特别是一级亲属)，并且有遗传综合征或倾向(例如由BRCA1或BRCA2基因突变引起的遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征；由PALB2基因突变引起的遗传性乳腺癌；家族性非典型多发性黑素瘤(FAMMM)综合征，由pl6/CDKN2A基因突变引起的，同时与皮肤和眼部黑色素瘤有关；家族性胰腺炎，通常由PRSS1基因突变引起；林奇综合征，也称为遗传性非息肉性结肠直肠癌(HNPCC)，最常由MLH1或MSH2基因缺陷引起；或由STK11基因缺陷引起的Peutz-Jeghers综合征)。
胰腺癌可以是如上定义的任何亚型和阶段，即可以检测任何亚型和/或阶段的存在或不存在。
在一个优选的实施例中，存在显著量的蛋白酶活性，或存在大于对照的量的蛋白酶活性，表明存在胰腺癌，并且不存在显著量的蛋白酶活性，或不存在等于或小于对照的量的蛋白酶活性，表明不存在胰腺癌。
在一个特定的实施例中，第二方面的方法还包括通过使用一种或多种用于检测胰腺癌的其他手段来确认对胰腺癌的检测。其他手段可以是癌症标志物(或“生物标志物”)或常规(非标志物)检测手段。癌症标志物可以是例如DNA甲基化标志物、突变标志物(例如SNP)、抗原标志物、蛋白质标志物、miRNA标志物、癌症特异性代谢物或表达标志物。常规手段可以例如是活组织检查(例如，使用或不使用染色方法例如蛋白质或表达标记物的视觉活检检查)、成像技术或物理，例如，触觉检查。在优选的实施例中，用于胰腺癌检测的其他手段选自身体检查(肝脏或胆囊肿胀、黄疸，即皮肤和眼白变黄)、CT扫描、MRI、胰胆管造影术(特别是内窥镜检查逆行胰胆管造影、磁共振胰胆管造影或经皮经肝胆管造影)、血管造影(特别是X射线血管造影、CT血管造影或MR血管造影)、腹部超声、内窥镜超声、PET扫描、血液检查(特别是胆红素、CA 19-9或CEA)和活检。
本文所用术语“指示”是指识别或指定要指示的事物的行为。如本领域技术人员将理解的，这种评估通常对于100％的受试者可能不是正确的，尽管它优选地是正确的。然而，该术语要求可以对受试者的统计显著性部分做出正确指示。
本领域技术人员可以使用几种众所周知的统计评估工具来确定某一部分是否在统计学上是重要的，例如用于确定置信区间、确定p值、Student's t检验、Mann-Whitney检验等。Dowdy and Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York 1983中提供了详细信息。首选的置信区间为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，至少95％。p值优选为0.05、0.01或0.005。
如本文所用的关于胰腺癌的短语“检测存在或不存在的方法”是指确定受试者是否患有癌症。如本领域技术人员将理解的，虽然这种评估优选地是正确的，但通常对于100％的受试者可能不是正确的。然而，该术语要求可以对受试者的统计显著部分做出正确指示。有关统计显著性和合适的置信区间和p值的描述，请参见上文。
如本文所用，术语“诊断”是指确定受试者是否患有癌症。通过如本文所述的蛋白酶活性分析进行的诊断可以补充有如本文所述的进一步方法，以确认通过蛋白酶活性分析检测到的癌症。如本领域技术人员将理解的，虽然诊断优选地是正确的，但通常对于100％的受试者可能不是正确的。然而，该术语要求可以对受试者的统计显著部分做出正确的诊断。有关统计显着性和合适的置信区间和p值的描述，请参见上文。
如本文所用的关于本说明书的癌症的短语“筛选受试者群体”是指第一方面的方法用于受试者群体中的用途。优选地，受试者患有癌症、怀疑患有癌症或已经患有癌症的风险增加。特别地，本文所述的一种或多种风险因素可归因于人群的受试者。在一个具体的实施例中，相同的一个或多个风险因素可归因于群体的所有受试者。例如，群体可能由以大量饮酒和/或烟草消费为特征的受试者组成。应当理解，术语“筛查”是指对群体受试者的上述诊断，并且优选使用如本文所述的进一步手段来确认。如本领域技术人员将理解的，虽然筛查结果优选是正确的，但是通常对于100％的受试者可能不是正确的。然而，该术语要求对于具有统计学意义的受试者部分可以获得正确的筛选结果。有关统计显著性和合适的置信区间和p值的描述，请参见上文。
如本文所用，术语“监测”是指在治疗期间或在特定时间段期间，通常在至少1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、3年、5年、10年或任何其他时间段的确诊的癌症的伴随情况。术语“伴随”是指可以基于蛋白酶活性的量，特别是基于任何类型的周期性时间段中的量的变化来检测癌症的状态，尤其是这些状态的变化，例如，在治疗过程中每天或每月1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次(每天不超过一次测定)测定，最长可达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15或24个月测定。数量或数量的变化也可以在治疗特定事件时确定，例如在每个治疗周期或药物/治疗给药之前和/或之后确定。一个周期是一轮治疗到下一轮治疗开始之间的时间。癌症治疗通常不是单一的治疗，而是一个疗程。
一个疗程通常需要3到6个月，但可以多余3到6个月的疗程或小于3到6个月的疗程，在治疗过程中，通常有4到8个治疗周期。通常一个治疗周期包括治疗休息，以使身体恢复。如本领域技术人员将理解的，监测的结果尽管优选是正确的，但是对于100％的受试者通常可能不是正确的。然而，该术语要求对于具有统计显著性的对象部分可以获得正确的监测结果。有关统计显著性和合适的置信区间和p值的描述，请参见上文。
第五方面，本发明提供了根据本发明的第一方面的化合物在治疗胰腺癌的方法中的用途，该方法包括实施根据本发明的第二方面的方法的步骤，并治疗已检测到蛋白酶活性，特别是蛋白酶活性增加的受试者的胰腺癌。
另一方面，本发明提供了一种治疗胰腺癌的方法，包括实施根据本发明第二方面的方法，并治疗已检测到蛋白酶活性，特别是蛋白酶活性增加的受试者的胰腺癌。
如本文所用，关于癌症的术语“治疗”是指治疗性治疗，其中目标是减慢癌症的进展。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病长度的缩短、病理状态的稳定(特别是不恶化)、疾病进展的减缓、病理状态的改善和/或缓解(部分和全部)，最好是可检测的。成功的治疗并不一定意味着治愈，但与不进行治疗的预期生存率相比，它也可能意味着延长生存期。在一个优选的实施例中，治疗是一线治疗，即之前没有治疗过癌症。癌症治疗涉及治疗方案
如本文所用，术语“治疗方案”是指根据疾病和可用手术和药物治疗受试者。癌症治疗方案的非限制性实例是化学疗法、手术和/或辐射或其组合。本发明能够实现癌症的早期检测，特别是允许手术治疗，尤其是治愈性切除术。特别地，术语“治疗方案”是指施用一种或多种如下定义的抗癌剂或疗法。如本文所用，术语“抗癌剂或疗法”是指具有抗增殖、抗癌和/或制癌特性的化学、物理或生物试剂或疗法，或手术，包括其组合。
化学抗癌剂或疗法可选自烷化剂、抗代谢物、植物碱和萜类化合物以及拓扑异构酶抑制剂。优选地，烷基化剂是铂基化合物。在一个实施例中，铂基化合物选自顺铂、奥沙利铂、依铂、洛铂、奈达铂、卡铂、异丙铂、四铂、洛铂、DCP、PLD-147、JM1 18、JM216、JM335和赛特铂。
物理抗癌剂或疗法可以选自放射疗法(例如治愈性放射疗法、辅助放射疗法、姑息性放射疗法、远程放射疗法、近距离放射疗法或代谢放射疗法)、光疗法(使用例如血卟啉或光敏素II)和热疗。
手术可以是根治性切除术、姑息性手术、预防性手术或细胞减灭术。通常，它涉及切除，例如Baron和Valin(Rec.Med.Vet,SpeC1al Cane.1990；11(166):999-1007)中描述的囊内切除术、边缘切除术、广泛切除术或根治性切除术。
生物抗癌剂或疗法可选自抗体(例如，刺激免疫反应破坏癌细胞的抗体，例如瑞妥昔单抗或阿仑单抗，通过与免疫细胞受体结合而刺激免疫反应以及阻止免疫细胞攻击“自身”细胞的抑制信号的抗体，例如易普利姆玛，干扰肿瘤生长所需蛋白质作用的抗体，例如贝伐单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗，或与药物，优选是细胞杀伤物质，如毒素，化疗或放射性分子，偶联抗体，例如Y-替伊莫单抗、I-托西莫单抗或ado-曲妥珠单抗)、细胞因子(例如干扰素或白介素，例如INF-α和IL-2)、疫苗(例如包含癌症相关抗原的疫苗，例如西普鲁塞)、溶瘤病毒(例如天然溶瘤病毒，如呼肠孤病毒、新城疫病毒或腮腺炎病毒，或基因工程病毒，例如麻疹病毒、腺病毒、痘苗病毒或疱疹病毒，优先靶向携带癌症相关抗原的细胞)、基因治疗剂(例如DNA或RNA替代改变的肿瘤抑制因子，阻断癌基因的表达，改善受试者的免疫系统，使癌细胞对化疗、放疗或其他治疗更敏感，诱导细胞自杀或赋予抗血管生成作用)和过继性T细胞(例如，针对抗肿瘤活性选择的受试者收获的肿瘤侵袭T细胞，或受试者收获的T细胞经过基因改造以识别癌症相关抗原)。
在一个实施例中，所述一种或多种抗癌药物选自：醋酸阿比特龙、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、ADE、阿杜单抗、阿法替尼二马来酸盐、醛类白血病、阿来曲单抗、氨基乙酰丙酸、阿那曲唑、安普雷明、三氧化二砷、天冬酰胺酶、欧文氏菌、阿西替尼、阿扎胞苷、BEACOPP、贝利斯他、盐酸苯达莫司汀、BEP、贝伐单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、博莱霉素、硼替佐米、博斯汀替尼、布伦图昔单抗、韦多汀、白消芬、卡巴齐他塞尔、卡博沙替尼-S-苹果酸、卡培他滨、卡波克斯、卡铂、卡铂-紫杉醇、卡非佐米、卡莫司汀、卡莫司汀植入物、西妥昔单抗、氯霉素、氯霉素强的松、CHOP、顺铂、氯法拉滨、CMF、COPP、COPP-ABV、环唑替尼、CVP、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷、脂质体、达布拉非尼、达卡巴嗪、达卡巴嗪、达沙替尼、盐酸柔红霉素、地西他滨、去甲雷利、去甲白素二夫替托克、地诺昔单抗、盐酸右唑嗪、多西紫杉醇、盐酸阿霉素、，盐酸阿霉素脂质体、依托波帕醇胺、恩扎鲁胺、盐酸表阿霉素、EPOCH、甲磺酸艾日布林、盐酸埃罗替尼、磷酸依托泊苷、依维莫司、依西美坦、FEC、非格列司汀、磷酸氟达拉宾、氟尿嘧啶、FU-LV、氟维司坦、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉米妥珠单抗-奥佐霉素、葡糖胞苷酶、醋酸戈舍林、HPV二价疫苗、重组HPV四价疫苗、高CVAD、伊布单抗-妥昔他坦、伊布替尼、ICE、依地利昔布、异环磷酰胺、伊马替尼、甲磺酸、咪喹莫特、碘131-托昔单抗和托昔单抗、伊普利单抗、盐酸奥替比隆、二磺酸拉帕替尼、来那度胺、来曲唑、亚叶酸钙、醋酸亮丙瑞林、阿糖胞苷脂质体、洛莫司汀、盐酸甲氯雷他敏、醋酸甲地孕酮、巯基嘌呤、甲磺酸钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、盐酸丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、MOPP、奈拉滨、尼罗替尼、奥比努珠单抗、奥法图单抗、奥马西他辛、甲培他辛、OEPA、OFF、OPPA、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定纳米颗粒制剂、PAD、帕利夫明、盐酸帕洛司琼、帕米膦酸二钠、帕尼妥单抗、盐酸帕佐帕尼、培门冬酶、聚乙二醇干扰素α-2b、培美曲塞二钠、培妥珠单抗、普利沙韦、泊马利多胺、盐酸波那替尼、普拉特雷酯、强的松、盐酸丙卡巴嗪、二氯化镭223、盐酸雷洛昔芬、雷莫昔单抗、拉布立克酶、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒二价疫苗、重组人乳头瘤病毒四价疫苗、重组干扰素α-2b、雷戈拉非尼、利妥昔单抗、罗米地平、罗米泊昔单抗、磷酸鲁索利替尼、粉妥昔单抗、思普勒替尔、甲苯磺酸索拉非尼、斯坦福V、苹果酸舒尼替尼、TAC、滑石粉、柠檬酸他莫昔芬、替莫唑胺、替西罗莫司、沙利度胺、盐酸拓扑替康、托瑞米芬、托西妥单抗和碘131托西妥单抗、TPF、曲美替尼、曲妥珠单抗、范德坦单抗、VAMP、VelP、维穆拉非尼、硫酸长春花碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、维莫吉布、伏立诺他汀、XELOX、阿柏西普，和唑来膦酸或其盐。
另一方面，本发明提供制备根据本发明第一方面的化合物的方法。
在优选的实施例中，根据在优选具有Fmoc基团的固相支持体上进行的工艺制备由式ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-ANB-NH2 6表征的化合物，其中ABZ为2-氨基苯甲酸，ANB-NH2为5-氨基-2-硝基苯甲酸的酰胺。在开始该工艺之前，制备该固相支持体：通过使用疏水性溶剂，优选二甲基甲酰胺、二氯甲烷或N-甲基吡咯烷酮，反复洗涤并优选通过在诸如二甲基甲酰胺、二氯甲烷或N-甲基吡咯烷酮等溶剂中使用10-30％的哌啶溶液洗涤，移除Fmoc保护基团来增加其体积。接下来，在后续阶段执行该过程：
a)在树脂上沉积5-氨基-2-硝基苯甲酸ANB之前，先用DMF中3-6％的N-甲基吗啉(NMM)溶液清洗固相支持体，然后用DMF清洗。接下来，制备DMF中的ANB溶液，向DMF中的ANB溶液添加TBTU、DMAP以及最终添加的二异丙基乙胺(DIPEA)，与聚合物沉积相关的过量率如下：ANB/TBTU/DMAP/DIPEA，3:3:2:6。将所得混合物添加到树脂中并混合直至均匀，然后在减压下过滤树脂并用溶剂，如DMF、DCM和异丙醇，清洗。接下来，使用O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)，然后使用O-(苯并三唑-1-基)--N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，继续使ANB与树脂结合，在完成后，用DMF、DCM和异丙醇依次清洗固相支持体，并轻轻干燥，
b)使用与Fmoc Arg(Pbf)-OH的氨基酸衍生物的反应将氨基酸残基附着到ANB上，将相对于树脂的至少五倍摩尔过量的氨基酸衍生物溶解在无水吡啶中，并与沉积ANB的树脂接触。接下来，将整个冷却至不低于20℃的温度，并以与所用氨基酸衍生物量的1:1比例添加POCl3，并混合。混合过程在室温下进行，然后在高温下进行；反应完成后，在减压下过滤树脂，用DMF和MeOH清洗并轻轻干燥；所得中间化合物经过酰化过程。
c)利用氨基酸衍生物，优选Fmoc-Ala-OH，然后是Fmoc-Thr(tBu)-OH，接着是Fmoc-Thr(tBu)-OH，最后是Boz-Abz-OH，进行所得中间化合物的酰化。使用过量使用的二异丙基碳二亚胺作为偶联剂，从残留物6到1分阶段进行酰化。在每个步骤结束时，用DMF清洗树脂，并(优选)进行氯苯胺试验，其中监测氨基酸衍生物的附着。
d)通过使用DMF中的10-30％哌啶溶液清洗，然后使用DMF、异丙醇和二氯甲烷中的每种溶剂清洗，来去除Fmoc保护基团。
e)使用混合物：TFA、苯酚、水和TIPS从树脂中分离肽，同时分别保持88:5:5:2v/v/v/v的比率；将混合物搅拌至少1小时，优选3小时，并在减压下过滤所得沉淀物，用乙醚洗涤，并离心所得肽。
f)通过超声波将肽溶解在水中，然后进行冻干，最后制得成品。
在优选的实施例中，根据在优选具有Fmoc基团的固相支持体上进行的工艺制备以ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-pNA6为特征的化合物，其中ABZ为2-氨基苯甲酸，pNA为对硝基苯胺。在开始该工艺之前，制备该固相支持体：通过使用疏水性溶剂，优选二甲基甲酰胺、二氯甲烷或N-甲基吡咯烷酮，反复洗涤，并优选通过在诸如二甲基甲酰胺、二氯甲烷或N-甲基吡咯烷酮等溶剂中的10-30％的哌啶溶液洗涤来移除Fmoc保护基团，从而增加其体积；然后在后续阶段执行该工艺：
a)使用适当的氨基酸衍生物使第三个氨基酸残基(Fmoc-Ala)附着到树脂，其中氨基酸衍生物为树脂沉积物的9倍摩尔过量，树脂沉积物溶解在无水二氯甲烷中。然后在室温下搅拌混合物至少两小时；反应完成后，在减压下过滤树脂，并用DMF和MeOH清洗树脂，然后将其干燥。
b)在随后的步骤中，进行氨基酸残基的附着(以下称为酰化)，并使用Fmoc-Thr(tBu)-OH的衍生物，然后使用Fmoc-Thr(tBu)-OH和Boc-ABZ-OH；在每个步骤之前，先用DMF清洗树脂，清洗时间最好为5分钟；在随后的附着中，使用偶联剂，优选过量使用的二异丙基碳二亚胺。该程序重复两次，每一步后，用DMF清洗树脂，最好进行氯苯胺试验，其中监测氨基酸衍生物的附着情况。
c)通过用DMF中的10-30％哌啶溶液清洗，然后用DMF、异丙醇和二氯甲烷中的每种溶剂清洗，去除Fmoc保护基。
d)重复步骤b)至c)，直到获得化合物(ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH)为止；从残留物6到3进行合成，然后在搅拌的同时，使用混合物：TFA：苯酚：水：TIPS(比例分别为88:5:5:2，v/v/v/v)从固相支持体上分离所得化合物。至少两小时后，在减压下过滤掉烧瓶中的内容物，并用乙醚清洗沉淀物。然后将沉淀物离心20分钟，通过超声波将离心后的沉淀物溶解在水中，然后冻干。
e)Fmoc-Arg(Pbf)-pNA的合成分阶段进行；在第一阶段，在2mmol N-甲基吗啉(NMM)存在下，将2mmol的Fmoc-Arg(Pbf)溶解在无水四氢呋喃(THF)中，并用2mmol的异丁基氯活化氨基酸衍生物的羧基。活化10分钟后，添加3mmol对硝基苯胺，并在-15℃(优选)温度下反应(优选)2小时，然后在室温下反应一天。反应完成后，蒸发溶剂，将干残留物溶解在乙酸乙酯中；
然后用饱和NaCl水溶液、10％柠檬酸、5％碳酸氢钠依次清洗所得溶液，并经无水硫酸钠干燥；乙酸乙酯在减压下蒸馏，干燥残留物。
f)基于以下过程将受保护肽ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH与对硝基苯胺Arg(Pbf)结合：将受保护肽ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH溶解在少量DCM中，然后用TFFH(四甲基氟甲酰胺)在优选温度0℃下优选活化30分钟，之后添加催化量的DMAP和FmocArg(Pbf)5-pNA6。反应最好在室温下进行24小时，之后蒸发溶剂，将所得溶液与去除侧保护的混合物一起倒入：TFA：苯酚：水：TIPS(88:5:5:2，v/v/v)，并优选混合3小时。
g)通过使用超声波将肽溶解在水中，然后进行冻干处理来制备成品。
附图说明
图1示出了确诊患有癌症的患者的尿液样本(样本1-10)和健康个体的尿液样本(11-25)中底物(1)ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2的水解速率。阿拉伯数字表示所选尿液样本的编号。图1显示，所有样本1-10均已分解，但对于样本3和10而言，ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2底物的降解效率高于材料2或9。产生这一结果的原因可能是负责蛋白质水解的酶的活性和数量存在差异。
此外，图1显示，用具有式2所示化合物溶液来孵育来自健康个体(未诊断出癌症)的尿液样本不会导致吸光度增加，因此不会发生试验化合物水解。结果表明，缺乏胰腺癌特有的蛋白水解酶。
图2示出了诊断出患有癌症的患者的尿液样本(样本1-10)和健康个体的尿液样本(11-25)中底物水解(2)ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg pNA的速率。阿拉伯数字表示所选尿液样本的编号。获得了如上针对图1所述的类似结果。
图3示出了底物水解度(1)ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg ANB NH2与pH环境之间的关系。测试的pH值显示在x轴上。评估了蛋白水解活性与反应环境pH值之间的关系。实验结果表明，受试材料至少有一种酶在碱性pH下表现出最大活性。
图4示出了随机选择的系统的RP HPLC分析，该系统包含诊断出含有胰腺癌的人的尿液。两种化合物(1)(ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg ANB-NH2，已示出)和(2)(ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg pNA，未示出)分解为ABZ-Thr-Ala-Arg肽片段和发色团(分别为ANB-NH2或pNA)。A:200mM Tris-HCl缓冲液中的ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg和NH2底物，pH8.0。B：诊断为胰腺癌患者尿液中ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg和NH2底物的水解。
实施例
本发明通过以下非限制性实施例来说明。
实施例1：化合物ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-ANB-NH2 6的合成
1.显色肽的制备
a)合成的第一阶段是通过固相合成，使用Fmoc/tBu化学，即使用保护剂-在固相支持体上获得显色肽。
通过使用以下氨基酸衍生物在固相化学合成过程中获得一种序列为ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-ANB-NH2 6的化合物，其中ABZ为2-氨基苯甲酸，ANB-NH2为5-氨基-2-苯甲酸的酰胺，ANB为5-氨基-2-苯甲酸。
Boc-ABZ，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Ala，Fmoc-Arg(Pbf)，ANB
在可以实现5-氨基-2-苯甲酸转换为ANB-NH2酰胺的固相支持体上进行化合物的合成，该化合物为检测胰腺癌的诊断标志物，其中胰腺癌的诊断与在蛋白水解酶的影响下进行的该化合物的水解有关，其中ANB-NH2酰胺为：
-例如酰胺树脂，例如来自RAPP Polymere(德国)的TentaGel S RAM，例如沉积量为0.23mmol/g。
可以使用其他市购酰胺树脂，包括Rink Amide(德国)。
使用实验室摇床手动合成该化合物。在大多数步骤中，固相合成用25ml烧结注射器用作反应器。
所有获得的最终化合物在其序列的位置1(即在N端)含有ABZ 2-氨基苯甲酸，在位置6(在C端)含有ANB 5-氨基-2-硝基苯甲酸分子。ABZ作为荧光供体，而ANB(5-氨基-2-苯甲酸)作为荧光猝灭剂和发色团。肽在其序列中包含至少(且优选)一个反应位点，位于化合物5位的氨基酸残基Arg-ANB-NH2之间。涉及氨基酸衍生物附着的合成从残基6到1进行，即从C端到N端进行。
b)ANB在TentaGel S RAM树脂上的沉积：
在TentaGel S RAM树脂(Rapp Polymere)上进行肽合成，沉积量为0.23mmol/g。在第一阶段，制备树脂，包括通过清洗循环使其松动。随后，用NMP中20％哌啶溶液从固相支持体上去除Fmoc氨基保护，并进行溶剂清洗周期。为了确认游离氨基的存在，进行了氯苯胺试验。
溶剂清洗周期：
DMF 1x10分钟
IsOH 1x10分钟
DCM 1x10分钟
去除Fmoc保护：
DMF 1x5分钟
20％NMP哌啶1x3分钟
20％NMP哌啶1x8分钟
溶剂清洗周期：
DMF 3x2分钟
IsOH 3x2分钟
DCM 3x2分钟
c)氯苯胺试验：
氯苯胺试验包括(使用抹刀)将反应器-注射器-中的几粒树脂转移到玻璃安瓿中，向玻璃安瓿添加100pL对氯苯胺甲苯饱和溶液和50pL新鲜乙醛。10分钟后，进行颗粒颜色控制。
在此阶段，在进行试验后，获得绿色颗粒颜色，表明存在游离氨基。在确认从树脂中去除了9-芴基甲氧基羰基保护后，可以进入下一阶段，即ANB衍生物(5-氨基-2-硝基苯甲酸)的附着。
d)5-氨基-2-硝基苯甲酸在固相支持体上的沉积
合成肽库(肽的混合物)的第一步是在1g树脂上沉积ANB。在附着发色团之前，用以下溶剂-DMF、DCM和DMF清洗用于反应的树脂，然后从固相支持体官能团中去除Fmoc保护。去除Fmoc保护的一个周期包括以下步骤：
去除Fmoc保护：
20％NMP哌啶1x3分钟
20％NMP哌啶1x8分钟
e)清洗
DMF 3x2分钟
IsOH 3x2分钟
DCM 3x2分钟
f)用于检测是否存在游离氨基的氯苯胺试验。
用5％的在DMF中的N-甲基吗啉(NMM)溶液清洗含游离氨基的树脂，然后用DMF清洗。去除Fmoc保护的程序和清洗周期在Merrifield容器中进行。在单独的烧瓶中，将ANB溶解在DMF中，随后按照与聚合物沉积相关的过量添加TBTU，DMAP，最后二异丙基乙胺(DIPEA)：ANB/TBTU/DMA/DIPEA，3:3:2:6。将由此制备的混合物添加到树脂中并搅拌3小时。在减压下过滤树脂，用DMF、DCM和异丙醇清洗，并重复整个酰化过程两次。O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐-(HATU)和O-(苯并三唑-1-基)--N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)进行ANB附着到树脂上的后续反应。最后一步，用DMF、DCM和异丙醇依次清洗树脂，并将其风干。
g)C端氨基酸残基附着到ANB
相应的氨基酸衍生物(相对于树脂沉积的9倍摩尔过量)溶解在吡啶中，并转移到含有沉积有ANB树脂的烧瓶中。整个冷却至-15℃(冰浴：1份(按重量计)NH4C1，1份(按重量计)NaNO3，1份(按重量计)冰)。达到所需温度后，添加POC13(与所用氨基酸衍生物量的比例为1:1)，并在磁搅拌器上搅拌整个溶液：其中在-15℃下搅拌20分钟，在室温下搅拌30分钟，在40℃下搅拌6小时(油浴)。完成反应后，在减压下过滤树脂，用DMF和MeOH清洗树脂，然后让其干燥。
下一步，将残基(丙氨酸)附着到P2位置。
每次附着氨基酸残基之前，先用DMF清洗树脂5分钟。二异丙基碳二亚胺用作后续附着中的偶联剂。这个过程重复了两次。
每次酰化后，开始树脂清洗周期，然后进行氯苯胺试验，以监测氨基酸衍生物与树脂游离氨基的附着情况。
溶剂清洗周期：
DMF 3x2分钟
IsOH 3x2分钟
DCM 3x2分钟
氯苯胺试验：
根据试验结果，在前两次耦合后，颗粒的颜色首先是绿色，然后再是灰色，因此有必要进行另一次酰化，因此，通过氯苯胺试验测试的树脂颗粒是无色的。这表明ANB附着在TentaGel S RAM树脂上，使肽合成进入下一阶段。
h)进一步保护的氨基酸残基的附着：
用DMF清洗树脂和反应器中附着的ANB残留物，然后从氨基上解除Fmoc的保护，以附着受保护的氨基酸丙氨酸衍生物。
去除Fmoc保护：
DMF 1x5分钟
20％NMP哌啶1x3分钟
20％NMP哌啶1x8分钟
溶剂清洗周期：
DMF 3x2分钟
IsOH 3x2分钟
DCM 3x2分钟
氯苯胺试验：
氯苯胺试验产生了阳性结果，树脂颗粒为绿色就证明了这一点。这使得进入下一阶段-Fmoc-Thr(tBu)-OH氨基酸残基的附着。
氨基酸衍生物的附着：
在偶联过程之前，先在DMF中清洗树脂。当附着受保护的谷氨酸残基时，偶联混合物的组成保持不变。
在每次酰化结束时，根据给定程序进溶剂清洗周期，然后进行溶液中游离氨基存在的氯苯胺试验。
溶剂清洗周期：
DMF 3x2分钟
IsOH 3x2分钟
DCM 3x2分钟
氯苯胺试验：
在第二次酰化后进行的试验中，树脂颗粒无色，这使得能够进入合成的下一阶段，即引入另一种受保护的氨基酸衍生物-苏氨酸和2-氨基苯甲酸分子。耦合过程遵循前面讨论的过程。
附着上述残留物后进行的试验显示阳性结果：树脂颗粒呈无色。
2.从固相支持体上去除肽
合成后，将ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2肽酰胺从固相支持体上移除，同时去除磁搅拌器上圆底烧瓶中的混合物：TFA：苯酚：水：TIPS(88:5:5:2，v/v/v/v)的侧保护。
3小时后，在烧结(Schott)漏斗上减压过滤烧瓶中的内容物，并用乙醚清洗内容物。产生的沉淀物在SIGMA 2K30离心机(实验室离心机)上离心20分钟。离心后获得的沉淀物通过超声波溶解在水中并冻干。
一种新化合物的特性/特性-HPLC分析，MS
HPLC条件：RP Bio-Wide Pore Supelco C8 250mm 4mm柱，0.1％TFA水相体系，B:80％乙腈A相体系，流速1ml/min，在226nm处紫外检测。
确认获得该化合物。
实施例2：下式所示化合物的制备：ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-pNA6
按照实施例1中所述类似方式来执行该方法，不同之处在于使用了相应的氨基酸衍生物和附加取代基，并且该方法部分在溶液中实施，部分在固相支持体上实施。
对硝基苯胺的制备
a)合成的第一阶段是使用Fmoc/tBu化学通过固相合成获得受保护肽。
ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH化合物，其中ABZ为2-氨基苯甲酸，通过使用以下氨基酸衍生物的固相化学合成获得：
ABZ，Fmoc Thr(tBu)，Fmoc-Ala。
该化合物在固相支持体上合成：
-2-氯-氯三酰树脂，例如来自Iris BIOTECH GMBH(德国)，沉积1.6mmol Cl/g基团。
使用实验室摇床手动合成该化合物。在所有阶段中，固相合成用25ml烧结注射器用作反应器。
在固相支持体上进行肽合成：2-氯-氯三苯基树脂，例如来自Iris BIOTECH GMBH(德国)，沉积1.6mmol Cl/g基团。在第一阶段，在清洗循环中使树脂松动。随后，用20％哌啶NMP溶液从固相支持体上去除Fmoc氨基保护。然后进行溶剂清洗周期。为了确认游离氨基的存在，进行了氯苯胺试验。
溶剂清洗周期：
DMF1x10分钟
IsOH 1x10分钟
DCM 1x10分钟
去除Fmoc保护：
DMF 1x5分钟
20％NMP哌啶1x3分钟
20％NMP哌啶1x8分钟
溶剂清洗周期：
DMF 3x2分钟
IsOH 3x2分钟
DCM 3x2分钟
b)氯苯胺试验：
氯苯胺试验包括(用抹刀)将反应器(注射器)中的几粒树脂转移到玻璃安瓿中，向玻璃安瓿中添加100pL对氯苯胺甲苯饱和溶液和50pL新鲜乙醛。10分钟后，进行颗粒颜色控制。
在这一阶段，试验后，颗粒呈绿色，表明存在游离氨基。确认从树脂中去除了9-芴基甲氧羰基保护后，开始附着Fmoc Ala衍生物
c)将Fmoc Ala嵌入固相支持体上
合成肽库的第一步是在1g树脂上沉积Fmoc-Ala。在附着氨基酸衍生物之前，使用以下溶剂，DMF(二甲基甲酰胺)和DCM(二氯甲烷)，清洗用于反应的树脂，然后再次使用DMF清洗，之后从固相支持体官能团中去除Fmoc保护。一个Fmoc保护去除周期包括以下步骤：
去除Fmoc保护：
20％NMP哌啶1x3分钟
20％NMP哌啶1x8分钟
清洗
DMF 3x2分钟
IsOH 3x2分钟
DCM 3x2分钟
用于检测是否存在游离氨基的氯苯胺试验。
用DMF清洗含游离氨基的树脂。在单独的烧瓶中，将Fmoc-Ala溶解在DMF中。接下来，将TBTU、DMAP和最终的二异丙基乙胺(DIPEA)过量添加到聚合物沉积物中：Fmoc-Pro/TBTU/DMAP/DIPEA，3:3:2:6。将所得混合物添加到树脂中并搅拌3小时。在减压下过滤树脂，用DMF、DCM和异丙醇清洗，并重复整个酰化过程两次。O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐-(HATU)和O-(苯并三唑-1-基)--N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)进行Fmoc-Pro附着到树脂上的后续反应。最后一步，用DMF、DCM和异丙醇依次清洗树脂，并将其风干。
C进一步保护的氨基酸残基的附着：
用DMF清洗树脂和反应器中附着的Fmoc-Ala残基，然后从氨基上解除Fmoc的保护，以附着受保护的苏氨酸衍生物。
去除Fmoc保护：
DMF 1x5分钟
20％NMP哌啶1x3分钟
20％NMP哌啶1x8分钟
溶剂清洗周期
DMF 3x2分钟
IsOH 3x2分钟
DCM 3x2分钟
氯苯胺试验：
氯苯胺试验产生了阳性结果，树脂颗粒为绿色就证明了这一点。这使得进入下一阶段-Fmoc-Thr(tBu)-OH氨基酸残基的附着。
氨基酸衍生物的附着：
在偶联过程之前，先在DMF中清洗树脂。当附着受保护的谷氨酸残基时，偶联混合物的组成保持不变。
在每次酰化结束时，根据给定程序进溶剂清洗周期，然后进行溶液中游离氨基存在的氯苯胺试验。
溶剂清洗周期：
DMF 3x2分钟
IsOH 3x2分钟
DCM 3x2分钟
氯苯胺试验：
在第二次酰化后进行的试验中，树脂颗粒无色，这使得能够进入合成的下一阶段，即引入另一种受保护的氨基酸衍生物-苏氨酸和2-氨基苯甲酸分子。耦合过程遵循前面讨论的过程。
附着上述残留物后进行的试验显示阳性结果：树脂颗粒呈无色。
d)从固相支持体上去除肽，同时保持侧基保护
合成完成后，从固相支持体中去除受保护的ABZ-Thr(tBu)-Th(tBu)-Ala-OH肽，并在磁性搅拌器上的圆底烧瓶中保留混合物：乙酸：TFE(三氟乙醇)：DCM(2:2:6，v/v/v)的侧保护
2小时后，在烧结(Schott)漏斗上减压过滤烧瓶中的内容物，并用收敛性混合物清洗内容物。用己烷(1:10v/v)洗涤溶液，减压蒸发，然后冻干。
e)对硝基苯胺Arg衍生物的化学合成
采用混合酸酐法合成了Fmoc-Arg(Pbf)-pNA。第一步，在2mmol N-甲基吗啉(NMM)存在下，将2mmol的Fmoc-Arg(Pbf)溶解在无水四氢呋喃(THF)中。用2mmol的异丁基氯活化氨基酸衍生物的羧基。活化10分钟后，添加3mmol对硝基苯胺。反应在-15℃下进行2小时，然后在室温下进行24小时。完成反应后，蒸发溶剂，将干残留物溶解在乙酸乙酯中。用饱和NaCl水溶液、10％柠檬酸和5％碳酸氢钠依次清洗所得溶液。所得溶液经无水硫酸钠干燥，乙酸乙酯在减压下蒸馏，并且干燥的残留物在真空干燥器中经P2O5和KOH干燥。
f)受保护的肽与对硝基苯胺Arg(Pbf)的偶联
将受保护肽ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH溶解在少量DCM中，随后在0℃下用TFFH(四甲氟甲酰胺)活化30分钟。然后添加催化量的DMAP和Arg(Pbf)-pNA。反应在室温下进行24小时，之后溶剂蒸发。将所得溶液与去除侧保护的混合物：TFA：苯酚：水：TIPS(88:5:5:2，v/v/v)一起倒入，并在磁性搅拌器上的圆底烧瓶中混合3小时。
此后，向烧瓶中添加冷乙醚，并在5000rpm的高速离心机中离心产生的沉淀物20分钟。离心后获得的沉淀物通过超声波溶解在水中，然后冻干。
一种新化合物的特性/特性-HPLC分析，MS
HPLC条件：RP Bio-Wide Pore Supelco C8 250mm 4mm柱，0.1％TFA水相体系，B:80％乙腈A相体系，流速1ml/min，在226nm处紫外检测。
确认获得该化合物。
实施例3
在一组10名诊断患有胰腺癌的患者身上进行新化合物的应用研究。为此，将式2：ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2或式3：ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg pNA的化合物溶解于二甲基亚砜中(浓度为0.5mg/mL)；将50μl该溶液与120μl缓冲液(200mM Tris-HCl，pH 8.0)和80μl胰腺癌患者尿液进行混合。在旨在用于测量吸光度的96孔板中进行测量，并在37℃下对每个样品进行一式三份的分析。测量持续时间为60分钟。在测量过程中，在405nm(范围380-430nm)处监测释放的发色团(ANB-NH2或pNA)的波长特性。
测量的结果是，诊断患有胰腺癌患者的所有尿液样本溶液的颜色随着时间的推移而增加。对于每个测试样本而言，观察到的吸光度随时间的增加情况有所不同。15份健康人样本获得了不同的效果，因为15份受测试尿液样本在诊断范围内的吸光度增加。
根据这些实施例，分析证实了这些化合物在胰腺癌诊断中的应用。新化合物的作用机理基于其在该位置的酶水解，这导致释放游离发色团分子，分别为5-氨基-2-硝基苯甲酸的ANB-NH2-酰胺或pNA-对硝基苯胺，其在320-480nm处，尤其是380-430nm处显示吸光度。
表1-图1所示的数值
1 0.128 0.152 0.2109
2 0.00532 0.00469 0.04912
3 0.07457 0.07826 0.07178
4 0.03727 0.03636 0.03044
5 0.02734 0.01944 0.02312
6 0.04416 0.04476 0.04487
7 0.02666 0.02332 0.025
8 0.02045 0.02486 0.02345
9 0.00647 0.00797 0.00569
10 0.08668 0.11456 0.08522
所有其他值1 1-25等于0
表2-图2中所示的值
1 0.22 0.189 0.2109
2 0.07457 0.07826 0.07178
3 0.01632 0.01669 0.01723
4 0.01727 0.01636 0.01044
5 0.05734 0.05944 0.06152
6 0.05416 0.05476 0.05487
7 0.02666 0.02332 0.025
8 0.02045 0.02486 0.02345
9 0.01947 0.01797 0.01896
10 0.11668 0.11456 0.10522
所有其他值11-25等于0
表3-图3所示的数值
3 0 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
6 0 0 0
7 0 0 0
8 0.07661 0.07534 0.09735
9 0 0 0
本发明还涉及
1.一种化合物-以下通式所示的诊断标记物：
ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-X6(式1)，其中：
ABZ是2-氨基苯甲酸，
X为ANB-NH2或pNA，
其中ANB-NH2为5-氨基-2-苯甲酸的酰胺，
ANB为5-氨基-2-硝基苯甲酸，
pNA是对硝基苯胺。
2.一种获得化合物的方法-诊断标记物的方法基于以下所述事实，所述化合物为
ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-ANB-NH2 6 (式2)
其中，
ABZ为2-氨基苯甲酸，
ANB-NH2为5-氨基-2-硝基苯甲酸的酰胺，
在开始该工艺之前，制备所述固相支持体：通过使用疏水性溶剂，优选二甲基甲酰胺、二氯甲烷或N-甲基吡咯烷酮，反复洗涤并优选通过在诸如二甲基甲酰胺、二氯甲烷或N-甲基吡咯烷酮等溶剂中使用10-30％的哌啶溶液洗涤，移除Fmoc保护基团来增加其体积。接下来，在后续阶段执行该工艺：
a)在树脂上沉积5-氨基-2-硝基苯甲酸ANB之前，先用DMF中3-6％的N-甲基吗啉(NMM)溶液清洗所述固相支持体，然后用DMF清洗。接下来，制备DMF中的ANB溶液，向DMF中的ANB溶液添加TBTU、DMAP以及最终添加的二异丙基乙胺(DIPEA)，与聚合物沉积相关的过量量如下：ANB/TBTU/DMAP/DIPEA，3:3:2:6。将所得混合物添加到树脂中并混合直至均匀，然后在减压下过滤树脂并用溶剂，如DMF、DCM和异丙醇，清洗。接下来，使用O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)，然后使用O-(苯并三唑-1-基)--N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，继续使ANB与树脂结合，在完成后，用DMF、DCM和异丙醇依次清洗固相支持体，并轻轻干燥，
b)使用与Fmoc Arg(Pbf)-OH的氨基酸衍生物的反应将氨基酸残基附着到ANB上，将相对于树脂的至少五倍摩尔过量的氨基酸衍生物溶解在无水吡啶中，并与沉积ANB的树脂接触。接下来，将整个冷却至不低于20℃的温度，并以与所用氨基酸衍生物量的1:1比例添加POCl3，并混合。混合过程在室温下进行，然后在高温下进行；反应完成后，在减压下过滤树脂，用DMF和MeOH清洗并轻轻干燥；所得中间化合物经过酰化过程。
c)利用氨基酸衍生物，优选Fmoc-Ala-OH，然后是Fmoc-Thr(tBu)-OH，接着是Fmoc-Thr(tBu)-OH，最后是Boz-Abz-OH，进行所得中间化合物的酰化。使用过量使用的二异丙基碳二亚胺作为偶联剂，从残留物6到1分阶段进行酰化。在每个步骤结束时，用DMF清洗树脂，并(优选)进行氯苯胺试验，其中监测氨基酸衍生物的附着。
d)通过使用DMF中的10-30％哌啶溶液清洗，然后使用DMF、异丙醇和二氯甲烷中的每种溶剂清洗，来去除Fmoc保护基团。
e)使用混合物：TFA、苯酚、水和TIPS从树脂中分离肽，同时分别保持88:5:5:2v/v/v/v的比率；将混合物搅拌至少1小时，优选3小时，并在减压下过滤所得沉淀物，用乙醚洗涤，并离心所得肽。
f)通过超声波将肽溶解在水中，然后进行冻干，最后制得成品。
3.一种获得化合物的方法-诊断标记物的方法基于以下所述事实，所述化合物为
ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-pNA6 (式3)
其中ABZ为2-氨基苯甲酸，pNA为对硝基苯胺，
该事实为在优选具有Fmoc基团的固相支持体上实施该工艺。在开始该工艺之前，制备该固相支持体：通过使用疏水性溶剂，优选二甲基甲酰胺、二氯甲烷或N-甲基吡咯烷酮，反复洗涤，并优选通过在诸如二甲基甲酰胺、二氯甲烷或N-甲基吡咯烷酮等溶剂中的10-30％的哌啶溶液洗涤来移除Fmoc保护基团，从而增加其体积；然后在后续阶段执行该工艺：
a)使用适当的氨基酸衍生物使第三个氨基酸残基(Fmoc-Ala)附着到树脂，其中氨基酸衍生物为树脂沉积物的9倍摩尔过量，树脂沉积物溶解在无水二氯甲烷中。然后在室温下搅拌混合物至少两小时；反应完成后，在减压下过滤树脂，并用DMF和MeOH清洗树脂，然后将其干燥。
b)在随后的步骤中，进行氨基酸残基的附着(以下称为酰化)，并使用Fmoc-Thr(tBu)-OH的衍生物，然后使用Fmoc-Thr(tBu)-OH和Boc-ABZ-OH；在每个步骤之前，先用DMF清洗树脂，清洗时间最好为5分钟；在随后的附着中，使用偶联剂，优选过量使用的二异丙基碳二亚胺。该程序重复两次，每一步后，用DMF清洗树脂，最好进行氯苯胺试验，其中监测氨基酸衍生物的附着情况。
c)通过用DMF中的10-30％哌啶溶液清洗，然后用DMF、异丙醇和二氯甲烷中的每种溶剂清洗，去除Fmoc保护基。
d)重复步骤b)至c)，直到获得化合物(ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH)为止；从残留物6到3进行合成，然后在搅拌的同时，使用混合物：TFA：苯酚：水：TIPS(比例分别为88:5:5:2，v/v/v/v)从固相支持体上分离所得化合物。至少两小时后，在减压下过滤掉烧瓶中的内容物，并用乙醚清洗沉淀物。然后将沉淀物离心20分钟，通过超声波将离心后的沉淀物溶解在水中，然后冻干。
e)Fmoc-Arg(Pbf)-pNA的合成分阶段进行；在第一阶段，在2mmol N-甲基吗啉(NMM)存在下，将2mmol的Fmoc-Arg(Pbf)溶解在无水四氢呋喃(THF)中，并用2mmol的异丁基氯活化氨基酸衍生物的羧基。活化10分钟后，添加3mmol对硝基苯胺，并在-15℃(优选)温度下反应(优选)2小时，然后在室温下反应一天。反应完成后，蒸发溶剂，将干残留物溶解在乙酸乙酯中；
然后用饱和NaCl水溶液、10％柠檬酸、5％碳酸氢钠依次清洗所得溶液，并经无水硫酸钠干燥；乙酸乙酯在减压下蒸馏，干燥残留物。
f)基于以下过程将受保护肽ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH与对硝基苯胺Arg(Pbf)结合：将受保护肽ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH溶解在少量DCM中，然后用TFFH(四甲基氟甲酰胺)在优选温度0℃下优选活化30分钟，之后添加催化量的DMAP和FmocArg(Pbf)5-pNA6。反应最好在室温下进行24小时，之后蒸发溶剂，将所得溶液与去除侧保护的混合物一起倒入：TFA：苯酚：水：TIPS(88:5:5:2，v/v/v)，并优选混合3小时。
g)通过使用超声波将肽溶解在水中，然后进行冻干处理来制备成品。
4.诊断胰腺癌的方法基于以下过程：将浓度范围为0.1-10mg/mL(优选1mg/mL)的通式1所示化合物在中性或碱性pH(优选生理性)下与少量比例范围为1:2至1:10的人类尿液在测量缓冲液中孵育(尿液样本与测量缓冲液的比优选为：5)，在25-40℃(优选36-38℃)的温度下，在40-60分钟内测量300-500nm(优选380-430nm)范围内的吸光度强度。
此外，本发明特别涉及以下项目：
1.一种由下式1表征的化合物1：
Xl-Thr-Thr-Ala-Arg-X2 (式1)，
其中将所述化合物裂解成包含X1的片段1和包含X2的片段2，产生可检测信号。
2.根据项目1所述的化合物，其中序列Thr-Thr-Ala-Arg对于水解酶，特别是将化合物裂解成Xl-Thr-Thr-Ala-Arg-OH(片段1)和NH2-X2(片段)的水解酶2)是可接近的。
3.根据项目1或2所的化合物，其中X1包含组分C1或由组分C1组成并且X2包含组分C2或由组分C2组成，并且所述可检测信号在C1和C2的空间分离时产生。
4.根据项目1至3中任一项所述的化合物，其中C1和C2之一是在波长1处具有最大吸收1(AMI)的发色团，并且所述化合物在不同于所述波长1的波长2处具有最大吸收2(AM2)。
5.根据项目1至4中任一项所述的化合物，其中C1和C2是一对荧光供体和荧光受体。
6.根据项目1至5中任一项所述的化合物，其中C1和C2对选自2-氨基苯甲酸(ABZ)/pNA、ABZ/ANB-NH2、ABZ/DNP、ABZ/EDDNP、EDANS/DABCYL、TAM/DANSYL、ABZ/Tyr(3-NO2)，特别是C1和C2对选自ABZ/pNA和ABZ/ANB-NH2。
7.一种用于检测受试者体液中蛋白酶活性的体外方法，包括将体液与如项目1至6中任一项所述的化合物接触并检测信号，其中所述体液可以包含水解酶酶，特别是蛋白酶，其来源于胰腺癌细胞。
8.根据项目7所述的用于检测受试者中是否存在胰腺癌的体外方法，其中体液中存在蛋白酶活性表明存在胰腺癌，体液中不存在蛋白酶活性表明不存在胰腺癌。
9.根据项目7或项目8所述的用于诊断胰腺癌的体外方法。
10.根据项目7至9中任一项所述的体外方法，其中所述体液为尿液。
11.根据项目7至10中任一项所述的方法，其中在具有中性或碱性pH值，优选生理性pH的测量缓冲液中，所述化合物以0.1-10mg/ml，特别是0.25-7.5mg/ml，更特别是0.5-5mg/ml，更特别是0.75-2mg/ml，甚至更特别是约1mg/ml的浓度提供，其中所述测量缓冲液的pH值优选为在6.8和8.5之间，更优选为生理pH值，并且将体液样品以以下比例添加到化合物中，比例为1:2至1:10，特别为1:3至1:8，更特别为1:4至1:6，甚至更特别地约1:5。
12.根据项目7至10中任一项所述的方法，其中检测信号包括测量在300-500nm，特别是380-430nm处，优选在25-40℃下，特别是36-38℃下40-60分钟的吸光度强度。
13.一种试剂盒，包括如项目1至6中任一项所述的化合物和测量缓冲液。
14.如项目1至6中任一项所述的化合物，如项目7至12中任一项所述的的方法或如项目13所述的的试剂盒在检测胰腺癌，或在监测发展为胰腺癌的风险增大或疑似患有胰腺癌或之前患有胰腺癌的受试者中的用途。
15.根据项目1至6中任一项所述的在用于治疗胰腺癌的化合物，所述方法包括以下步骤：
a.执行如项目1至6中任一项所述的方法，以及
b.治疗已检测到蛋白酶活性，特别是蛋白酶活性增加的受试者的胰腺癌。
SEQUENCE LISTING
<110> 尔特斯特有限公司
<120> 新型胰腺癌诊断标志物
<130> 1091-2 PCT
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Thr Thr Ala Arg
1
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种由下式1表征的化合物1：
Xl-Thr-Thr-Ala-Arg-X2(式1)，
其特征在于，将所述化合物裂解成包含X1的片段1和包含X2的片段2，产生可检测信号，其中X1包含组分C1或由组分C1组成，并且X2包含组分C2或由组分C2组成，并且所述可检测信号通过所述化合物的水解裂解在C1和C2的空间分离时产生，以及其中C1和C2是一对荧光供体和荧光受体。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，序列Thr-Thr-Ala-Arg对于水解酶，特别是将化合物裂解成Xl-Thr-Thr-Ala-Arg-OH(片段1)和NH2-X2(片段2)的水解酶是可接近的。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，C1和C2之一，特别是C2，是在波长1处具有最大吸收1(AMI)的发色团，并且所述化合物在不同于所述波长1的波长2处具有最大吸收2(AM2)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其特征在于，该C1和C2对选自2-氨基苯甲酸(ABZ)/pNA、ABZ/ANB-NH2、ABZ/DNP、ABZ/EDDNP、EDANS/DABCYL、TAM/DANSYL、ABZ/Tyr(3-NO2)，特别是该C1和C2对选自ABZ/pNA和ABZ/ANB-NH2。
5.一种用于检测受试者体液中蛋白酶活性的体外方法，包括将体液与一化合物接触并检测信号，其中所述体液可以包含水解酶酶，特别是蛋白酶，其来源于胰腺癌细胞，以及所述化合物由下式1表征：
Xl-Thr-Thr-Ala-Arg-X2(式1)，
其中将所述化合物裂解成包含X1的片段1和包含X2的片段2，产生可检测信号。
6.根据权利要求5所述的用于检测受试者中是否存在胰腺癌的体外方法，其中体液中存在蛋白酶活性表明存在胰腺癌，体液中不存在蛋白酶活性表明不存在胰腺癌。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的用于诊断胰腺癌的体外方法。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的体外方法，其中所述体液为尿液。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中在具有中性或碱性pH值，优选生理性pH的测量缓冲液中，所述化合物以0.1-10mg/ml，特别是0.25-7.5mg/ml，更特别是0.5-5mg/ml，更特别是0.75-2mg/ml，甚至更特别是约1mg/ml的浓度提供，并且将体液样品以以下比例添加到化合物中，比例为1:2至1:10，特别为1:3至1:8，更特别为1:4至1:6，甚至更特别地约1:5。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的方法，其中检测信号包括测量在300-500nm，特别是380-430nm处，优选在25-40℃下，特别是36-38℃下40-60分钟的吸光度或荧光性，特别是测量吸收强度。
11.一种试剂盒，包括如权利要求1至4中任一项所述的化合物和测量缓冲液。
12.由下式1表征的所述化合物的用途，其中式1为：X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2(式1)，
其中将裂解为包含X1的片段1和包含X2的片段2的所述化合物，产生可检测信号，如权利要求5至10中任一项所述的方法，或包含所述化合物的所述试剂盒和测量缓冲液，用于检测胰腺癌，或在监测疑似患有胰腺癌，发展为胰腺癌的风险增加或之前患有胰腺癌的受试者。
13.一种治疗胰腺癌的方法，所述方法包括以下步骤：
a.执行如权利要求5至10中任一项所述的方法，以及
b.治疗已在步骤a中已检测到蛋白酶活性，特别是蛋白酶活性增加的受试者的胰腺癌。

Claims (14)

1.一种由下式1表征的化合物1：
Xl-Thr-Thr-Ala-Arg-X2(式1)，
其特征在于，将所述化合物裂解成包含X1的片段1和包含X2的片段2，产生可检测信号，其中X1包含组分C1或由组分C1组成，并且X2包含组分C2或由组分C2组成，并且所述可检测信号在C1和C2的空间分离时产生。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，序列Thr-Thr-Ala-Arg对于水解酶，特别是将化合物裂解成Xl-Thr-Thr-Ala-Arg-OH(片段1)和NH2-X2(片段2)的水解酶是可接近的。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，C1和C2之一，特别是C2，是在波长1处具有最大吸收1(AMI)的发色团，并且所述化合物在不同于所述波长1的波长2处具有最大吸收2(AM2)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其特征在于，C1和C2是一对荧光供体和荧光受体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其特征在于，该C1和C2对选自2-氨基苯甲酸(ABZ)/pNA、ABZ/ANB-NH2、ABZ/DNP、ABZ/EDDNP、EDANS/DABCYL、TAM/DANSYL、ABZ/Tyr(3-NO2)，特别是该C1和C2对选自ABZ/pNA和ABZ/ANB-NH2。
6.一种用于检测受试者体液中蛋白酶活性的体外方法，包括将体液与一化合物接触并检测信号，其中所述体液可以包含水解酶酶，特别是蛋白酶，其来源于胰腺癌细胞，以及所述化合物由下式1表征：
Xl-Thr-Thr-Ala-Arg-X2(式1)，
其中将所述化合物裂解成包含X1的片段1和包含X2的片段2，产生可检测信号。
7.根据权利要求6所述的用于检测受试者中是否存在胰腺癌的体外方法，其中体液中存在蛋白酶活性表明存在胰腺癌，体液中不存在蛋白酶活性表明不存在胰腺癌。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的用于诊断胰腺癌的体外方法。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的体外方法，其中所述体液为尿液。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其中在具有中性或碱性pH值，优选生理性pH的测量缓冲液中，所述化合物以0.1-10mg/ml，特别是0.25-7.5mg/ml，更特别是0.5-5mg/ml，更特别是0.75-2mg/ml，甚至更特别是约1mg/ml的浓度提供，并且将体液样品以以下比例添加到化合物中，比例为1:2至1:10，特别为1:3至1:8，更特别为1:4至1:6，甚至更特别地约1:5。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，其中检测信号包括测量在300-500nm，特别是380-430nm处，优选在25-40℃下，特别是36-38℃下40-60分钟的吸光度或荧光性，特别是测量吸收强度。
12.一种试剂盒，包括如权利要求1至5中任一项所述的化合物和测量缓冲液。
13.由下式1表征的所述化合物的用途，其中式1为：X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2(式1)，
其中将裂解为包含X1的片段1和包含X2的片段2的所述化合物，产生可检测信号，如权利要求6至11中任一项所述的方法，或包含所述化合物的所述试剂盒和测量缓冲液，用于检测胰腺癌，或在监测疑似患有胰腺癌，发展为胰腺癌的风险增加或之前患有胰腺癌的受试者。
14.一种治疗胰腺癌的方法，所述方法包括以下步骤：
a.执行如权利要求7至12中任一项所述的方法，以及
b.治疗已在步骤a中已检测到蛋白酶活性，特别是蛋白酶活性增加的受试者的胰腺癌。
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