PL244818B1 - Związek-marker diagnostyczny raka wątroby, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka wątroby, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego - Google Patents
Związek-marker diagnostyczny raka wątroby, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka wątroby, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego Download PDFInfo
- Publication number
- PL244818B1 PL244818B1 PL439405A PL43940521A PL244818B1 PL 244818 B1 PL244818 B1 PL 244818B1 PL 439405 A PL439405 A PL 439405A PL 43940521 A PL43940521 A PL 43940521A PL 244818 B1 PL244818 B1 PL 244818B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- compound
- ser
- formula
- liver cancer
- abz
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 168
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 132
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 128
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 49
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 12
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 86
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 33
- KZZWQCKYLNIOBT-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-nitrobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(O)=O)=C1 KZZWQCKYLNIOBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 19
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 18
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 13
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims description 12
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 9
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000002271 resection Methods 0.000 claims description 6
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 5-(2-aminoethylamino)naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(NCCN)=CC=CC2=C1S(O)(=O)=O SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- AIUKPEQJKQUQKZ-UHFFFAOYSA-N n'-(2,4-dinitrophenyl)ethane-1,2-diamine Chemical compound NCCNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O AIUKPEQJKQUQKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 22
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 21
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 49
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 49
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 25
- GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N DMF Natural products CC1=CC=C(C)O1 GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 12
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N tetrachloro-1,4-benzoquinone Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C(Cl)C1=O UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 8
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- -1 9-fluorenylmethoxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100074988 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) nmp-1 gene Proteins 0.000 description 6
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tris[(dimethylamino)methyl]phenol Chemical compound CN(C)CC1=CC(CN(C)C)=C(O)C(CN(C)C)=C1 AHDSRXYHVZECER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 5
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 5
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 5
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 5
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012317 TBTU Substances 0.000 description 4
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Chemical group 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 2
- KSDTXRUIZMTBNV-INIZCTEOSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)butanedioic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 KSDTXRUIZMTBNV-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CCEJTEOJAKTTFU-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-nitrobenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC(N)=CC=C1[N+]([O-])=O CCEJTEOJAKTTFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 2
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- FODJWPHPWBKDON-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-4-oxobutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 FODJWPHPWBKDON-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 2-nitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFDUHJPVQKIXHO-UHFFFAOYSA-N 3-aminobenzoic acid Chemical group NC1=CC=CC(C(O)=O)=C1 XFDUHJPVQKIXHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DIBZLYZXTSVGLN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N N-phenyl amine Natural products NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000549556 Nanos Species 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Lys Chemical group NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CO OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003228 intrahepatic bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NC1=CC=CC=C1 VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1019—Tetrapeptides with the first amino acid being basic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest nowy związek chemiczny - marker diagnostyczny — do zastosowania medycznego, dokładniej w diagnostyce nowotworowej, w szczególności w diagnostyce raka wątroby. Przedmiotem wynalazku jest także sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika, w szczególności pochodzącej z komórek raka wątroby, z użyciem takiego związku. Przedmiotem zgłoszenia jest ponadto sposób in vitro diagnozowania raka wątroby, z użyciem takiego związku, zestaw zawierający taki związek oraz zastosowanie takiego związku do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka wątroby i zastosowanie takiego związku do diagnozowania raka wątroby. Przedmiotem zgłoszenia jest także taki związek do zastosowania jako marker diagnostyczny raka wątroby oraz o sposób leczenia raka wątroby obejmujący etap przeprowadzania sposobu diagnozowania raka wątroby jak określono powyżej z zastosowaniem takiego związku.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy związek chemiczny - marker diagnostyczny - do zastosowania medycznego, dokładniej w diagnostyce nowotworowej, w szczególności w diagnostyce raka wątroby. Przedmiotem wynalazku jest także sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika, pochodzącej z komórek raka wątroby, z użyciem takiego związku, sposób in vitro diagnozowania raka wątroby, z użyciem takiego związku, zestaw zawierający taki związek, taki związku do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka wątroby, taki związek do zastosowania do diagnozowania raka wątroby oraz taki związek do zastosowania jako marker diagnostyczny raka wątroby.
Stan techniki
W roku 2018 na raka wątroby zachorowało 850 tys. pacjentów i był szóstym najczęstszym nowotworem złośliwym na świecie. Raka wątroby charakteryzują późne objawy, bardzo szybki postęp choroby i wysoka śmiertelność. W roku 2018 na świecie zmarło 782 tys. pacjentów z powodu raka wątroby. Do roku 2030 rak wątroby będzie, po raku płuc i raku trzustki, trzecią najbardziej śmiertelną chorobą nowotworową. Wczesne stadium i zmiany przedrakowe w przebiegu raka wątroby nie wywołują objawów. Z tego powodu wczesne wykrycie choroby jest trudne i dochodzi do niego rzadko. U większości chorych rak ten wykrywany jest przypadkowo jako zmiana ogniskowa w czasie USG wykonywanego z innych powodów. Rozpoznanie wiąże się z przeżyciem 5-letnim jedynie na poziome 12%. Obecnie pacjenci są diagnozowani w późnym stadium choroby, w którym leczenie jest bardzo ograniczone. Wczesne wykrycie wiąże się z poprawą rokowania. Leczenie operacyjne raka wątroby jest jedyną skuteczną metodą, która może doprowadzić do wyleczenia raka wątroby. Niestety jedynie około 30% pacjentów, u których został rozpoznany rak wątroby, kwalifikuje się do leczenia chirurgicznego. Pięcioletnie przeżycie chorych poddawanych chirurgicznemu leczeniu o założeniu radykalnym wynosi 60-80%. Nie ma żadnego badania laboratoryjnego, w tym również „markera nowotworowego”, ani zestawu badań, które pozwalałyby na wczesne i pewne rozpoznanie raka wątroby. Jedyny z dostępnych markerów nowotworowych - alfa fetoproteina (AFP) - uznawana powszechnie za dobry wskaźnik raka wątroby nie jest przydatny do wczesnego rozpoznawania raka wątroby, ponieważ ani nie wykrywa wszystkich przypadków, ani nie jest specyficzna tylko dla raka wątroby. AFP wykrywa 10-20% guzów na wczesnym etapie. U 20-25% chorych z rakiem wątroby stężenia AFP są prawidłowe, nawet wówczas, gdy guz jest pokaźnych rozmiarów.
Wiadomo, że proces inicjacji, wzrostu i przerzutowania komórek nowotworu złośliwego przebiega przy udziale wielu czynników, w tym wielu enzymów, w szczególności enzymów hydrolitycznych, zwłaszcza proteolitycznych. Takie enzymy katalizują rozpad enzymatyczny (hydrolityczny lub proteolityczny) białek i peptydów na mniejsze ich fragmenty. Proces ten umożliwia komórkom nowotworowym rozrost przez kolonizację nowych tkanek, wzmożenie procesu tworzenia naczyń krwionośnych (angiogenezy) co umożliwia efektywne dostarczanie substancji odżywczych do guza nowotworowego. Ponadto, enzymy te powstają także w wyniku obumierania komórek zdrowych na skutek procesu rozrostu guza. Wszystkie te procesy tworzą charakterystyczny i swoisty profil aktywności enzymatycznej (proteolitycznej) komórek nowotworowych, charakterystyczny dla guza nowotworowego.
Znane są w dziedzinie chromogeniczne cząsteczki peptydowe, które ulegają rozpadowi enzymatycznemu na mniejsze fragmenty z powstaniem zmiany lub wzrostu zabarwienia badanego roztworu. Ten efekt chromogeniczny jest następstwem uwalniania chromoforu (np. 4-anilidu lub kwasu 2-aminobenzoesowego) z chromogenicznej cząsteczki peptydowej.
Tego typu chromogeniczne cząsteczki peptydowe i ich zastosowania znane są, przykładowo, z publikacji autorstwa Erlanger BF, Kokowsky N, Cohen W., “The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin”, Arch Biochem Biophys., listopad 1961; 95:271-8 oraz Hojo K, Maeda M, Iguchi S, Smith T, Okamoto H, Kawasaki K. Amino acids and peptides. XXXV. “Facile preparation of p-nitroanilide analogs by the solid-phase method”, Chem Pharm Bull (Tokyo), listopad 2000; 48(11): 1740-4.
Jak dotąd nie opisano jednak zastosowania tej klasy związków w diagnostyce raka wątroby. W stanie techniki znane są także sposoby otrzymywania peptydów chromogenicznych polegające na przyłączaniu poszczególnych elementów składowych w odpowiednich warunkach czasowych i stechiometrycznych. Taki proces przyłączania składa się z kolejnych etapów, w których poszczególne elementy (pochodne aminokwasowe) są przyłączane, pozostałości odmywane i kolejno grupy ochronne usuwane i ponownie przemywane. Taki cykl powtarzany jest dla każdej reszty aminokwasowej. Otrzymany peptyd oddzielany jest od żywicy poprzez reakcję w warunkach kwasowych. Kolejno roztwór oddzielany jest od żywicy w procesie sączenia, a następnie z otrzymanego roztworu peptyd wytrącany jest rozpuszczalnikiem niepolarnym.
W stenie techniki nie są znane jednakże ani chromogeniczne związki peptydowe odpowiednie do swoistego i wczesnego diagnozowania raka wątroby ani sposoby ich otrzymywania.
W dziedzinie istnieje zatem pilne zapotrzebowanie na „marker nowotworowy” raka wątroby, który pozwalałby na wczesne, czułe i swoiste rozpoznanie raka wątroby w sposób nieinwazyjny i wiarygodny oraz na sposoby diagnostyczne i sposoby leczenia wykorzystujące taki marker diagnostyczny.
Celem wynalazku jest zatem dostarczanie nowego, swoistego markera diagnostycznego raka wątroby oraz sposobów diagnostycznych wykorzystujących taki marker do bezinwazyjnego, szybkiego, czułego, swoistego, wczesnego wykrywania raka wątroby, który byłby odpowiedni także do badań przesiewowych, a także sposobów leczenia wykorzystujących taki marker.
Cele te zrealizowano dzięki wynalazkom zdefiniowanym w załączonych zastrzeżeniach patentowych, przy czym korzystne jego warianty zostały zdefiniowane w zastrzeżeniach zależnych.
Krótki opis wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest związek o wzorze 1:
X11-Lys2-Ser3-Ser4-Asp5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym związek ten ulega rozpadowi enzymatycznemu na fra gmenty X1-Lys-Ser-Ser-Asp-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
Taki związek według wynalazku ulega korzystnie rozpadowi hydrolitycznemu, korzystnie proteolitycznemu.
Korzystnie w związku według wynalazku para cząsteczek C1 i C2 jest wybrana jest z grupy składającej się z: kwasu 2-aminobeznoesowego (ABZ)/kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB), (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2), korzystnie parę C1 i C2 stanowi Korzystnie związek według wynalazku stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Lys-Ser-Ser- Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA (wzór 3).
Korzystniej związek według wynalazku ulega rozpadowi hydrolitycznemu z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-OH oraz fragmentu 2: ANB-NH2.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika, pochodzącej z komórek raka wątroby, obejmujący:
a) kontaktowanie próbki płynu ustrojowego ze związkiem o wzorze 1:
X11-Lys2-Ser3-Ser4-Asp5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1 -Lys-Ser-Ser-Asp-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2), i
b) wykrywanie mierzalnego sygnału optycznego, który powstaje poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
W takim sposobie wykrywania aktywności enzymatycznej według wynalazku aktywność enzymatyczną stanowi korzystnie aktywność hydrolityczna, korzystniej aktywność proteolityczna.
W takim sposobie wykrywania aktywności enzymatycznej według wynalazku jako wspomniany związek korzystnie stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA (wzór 3).
W takim sposobie wykrywania aktywności enzymatycznej według wynalazku jako wspomniany płyn ustrojowy stosuje się mocz, korzystnie mocz ludzki.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób in vitro diagnozowania raka wątroby, w którym wykrywa się obecność lub nieobecność raka wątroby u osobnika poprzez pomiar w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej swoistej dla raka wątroby, przy czym brak wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na nieobecność raka wątroby, zaś obecność wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na obecność raka wątroby, i przy czym w do pomiaru wspomnianej aktywności enzymatycznej stosuje się związek o wzorze 1:
X11-Lys2-Ser3-Ser4-Asp5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Lys-Ser-Ser-Asp-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
W takim sposobie wykrywania diagnozowania raka wątroby według wynalazku wykrywanie aktywności enzymatycznej przeprowadza się sposobem wykrywania aktywności enzymatycznej jak określono powyżej.
W takim sposobie wykrywania diagnozowania raka wątroby według wynalazku wspomnianą próbkę płynu ustrojowego korzystnie inkubuje się ze wspomnianym związkiem w buforze pomiarowym o pH obojętnym lub pH zasadowym, korzystnie fizjologicznym, w zakresie proporcji 1:2 do 1:10 korzystnie 1:5 próbki do buforu pomiarowego.
W takim sposobie wykrywania diagnozowania raka wątroby według wynalazku wspomniany związek korzystnie stosuje się w stężeniu 0,1-10 mg/ml, w szczególności 0,25-7,5 mg/ml.
W takim sposobie wykrywania diagnozowania raka wątroby według wynalazku jako wspomniany związek korzystnie stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA (wzór 3).
W takim sposobie wykrywania diagnozowania raka wątroby według wynalazku jako wspomnianą próbkę korzystnie stosuję się próbkę moczu, korzystniej moczu ludzkiego.
W takim sposobie wykrywania diagnozowania raka wątroby według wynalazku pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej korzystnie obejmuje pomiar intensywności absorbancji w zakresie 300500 nm, korzystniej 380-430 nm, w szczególności 405 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze z przedziału 25-40°C, korzystniej 36-38°C.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zestaw zawierający dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej i bufor pomiarowy.
W takim zestawie według wynalazku związek korzystnie stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA (wzór 3).
Przedmiotem wynalazku jest także dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka wątroby.
Przedmiotem wynalazku jest również dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania do diagnozowania raka wątroby.
Korzystnie w takim zastosowaniu diagnozowanie raka wątroby obejmuje wykrywanie pierwotnego raka wątroby, wykrywanie choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka wątroby i/lub wykrywanie wznowy raka wątroby.
Korzystnie związek w takich zastosowaniach według wynalazku stanowi związek o wzorze 2: ABZLys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA (wzór 3).
Przedmiotem wynalazku jest ponadto dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej do zastosowania jako marker diagnostyczny do wykrywania raka wątroby.
Korzystnie jako taki związek do zastosowania jako marker diagnostyczny według wynalazku stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA (wzór 3).
Zgodnie z wynalazkiem opisano tu sposób leczenia raka wątroby, w którym
a) wykrywa się obecność aktywności enzymatycznej swoistej dla raka wątroby dowolnym sposobem jak określono powyżej w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego, i
b) gdy we wspomnianej próbce stwierdzi się występowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej, podejmuje się leczenie raka wątroby u osobnika.
W takim sposobie leczenia, po zakończeniu leczenia zgodnie z punktem b), można przeprowadzać monitorowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej swoistej dla raka wątroby w określonych odstępach czasu.
W takim sposobie leczenia jako próbkę można stosować próbkę moczu, na przykład moczu ludzkiego.
W takim sposobie leczenia jako wspomniany związek można stosować związek o wzorze 2: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA (wzór 3).
Szczegółowy opis wynalazku
Należy rozumieć, że niniejszy wynalazek jest zdefiniowany w załączonych zastrzeżeniach. Niniejszy opis ilustruje różne, nieograniczające, wykonania wynalazku i przykłady jego realizacji. Niniejszy wynalazek nie ogranicza się do jakiejkolwiek konkretnej metodologii, protokołu czy odczynników stosowanych do jego realizacji, o ile nie wskazano inaczej. Zastosowane pojęcia oraz określenia naukowe i techniczne mają znaczenia powszechnie znane i stosowane przez specjalistów w dziedzinie niniejszego wynalazku. Dla wyjaśnienia jednak następujące określenia i skróty zastosowane w opisie i zastrzeżeniach patentowych, należy rozumieć następująco:
Związek chromogeniczny lub inaczej cząsteczka chromogeniczna oznacza związek posiadający właściwości chromogeniczne. Właściwości chromogeniczne oznaczają zdolność związku do tworzenia produktu barwnego.
Związek fluorescencyjny lub inaczej cząsteczka fluorogeniczna oznacza związek posiadający właściwości fluorogeniczne. Właściwości fluorogeniczne oznaczają zdolność związku do tworzenia produktu emitującego fluorescencję.
NMP to N-metylopirolidon; DMF to dimetyloformamid; DCM to chlorek metylenu, inaczej dichlorometan; pNA to 4-nitroanilina, inaczej para-nitroanilina; ABZ to kwas 2-aminobeznoesowy, ANB-NH2 to amid kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego; Boc to grupa tert-butyloksykarbonylowa; Fmoc to grupa 9-fluorenylometoksykarbonylowa; zaś TFA to kwas trifluorooctowy.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie rak wątroby należy rozumieć jako rak (nowotwór złośliwy) pierwotny wątroby rozwijający się z tkanek znajdujących się w wątrobie. Rakiem wątroby jest najczęściej rak wątrobowokomórkowy (ok. 90%); rzadziej rak wewnątrzwątrobowych przewodów (dróg) żółciowych. Stosowane tu pojęcie rak wątroby obejmuje zatem wszelkie nowotwory złośliwe wątroby rozwijające się z tkanek znajdujących się w wątrobie.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie diagnozowanie raka wątroby należy rozumieć jako rozpoznawanie tej choroby, w szczególności na jej wczesnym etapie, na którym inne metody diagnostyczne są zbyt mało czułe lub/i swoiste. W stosowanym tu znaczeniu diagnozowanie raka wątroby obejmuje także wykrywanie choroby resztkowej po chirurgicznym wycięciu raka wątroby oraz wykrywanie wznowy raka wątroby po wcześniej zakończonym leczeniu raka wątroby.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie leczenie raka wątroby należy rozumieć jako leczenie na wczesnym etapie rozwoju choroby, pozwalające na istotne wydłużenie czasu przeżycia oraz poprawę jakości życia chorych.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie monitorowanie należy rozumieć jako diagnostykę choroby resztkowej (ang. Minimal Residual Disease (MRD)) - obecności małej liczby przetrwałych w organizmie (w trakcie leczenia lub w remisji) komórek nowotworowych, w ilościach niewykrywanych standardowo stosowanymi metodami diagnostycznymi, a także wznowy raka wątroby.
W kontekście niniejszego wynalazku pojęcie osobnik należy rozumieć jako człowieka lub ssaka, u którego podejrzewa się występowanie raka wątroby, ewentualnie jako człowieka lub ssaka należącego do grupy zwiększonego ryzyka wystąpienia raka wątroby, albo człowieka lub ssaka po resekcji raka wątroby lub po zakończonym leczeniu raka wątroby. Osobnikiem jest korzystnie człowiek.
Związki według wynalazku mają właściwości chromogeniczne dzięki obecności chromofora oraz fluorogeniczne, tj. zawierają cząsteczki donora i akceptora fluorescencji. Dzięki swojej budowie, opracowanej w taki sposób, że obserwowany jest wzrost barwy w przedziale długości fali 380-440 nm swoiście w wyniku kontaktu badanej próbki płynu ustrojowego od osobnika badanego z rakiem wątroby, a jednocześnie nie jest obserwowany taki efekt w reakcji z próbką płynu ustrojowego osobnika zdrowego lub z diagnozą innego typu nowotworu, związki te pozwalają na wykrywanie aktywności enzymatycznej swoistej dla raka wątroby, a w szczególności diagnozowanie raka wątroby w sposób swoisty i czuły, również na wczesnym etapie rozwoju tego raka. Osobnikiem badanym jest korzystnie człowiek. Płynem ustrojowym jest korzystnie mocz, korzystniej ludzki.
W pierwszym aspekcie niniejszego wynalazku dostarczony jest nowy związek chemiczny o wzorze 1:
X11-Lys2-Ser3-Ser4-Asp5-X26 (wzór 1), przy czym X1 stanowi pochodna aminokwasowa lub fragment peptydowy zawierający cząsteczkę C1 lub X1 składa się z takiej cząsteczki C1, a X2 stanowi pochodna aminokwasowa lub fragment peptydowy zawierający cząsteczkę C2 lub X1 składa się z takiej cząsteczki C2, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji. Cyfry w indeksie górnym oznaczają kolejne pozycje reszt w związku według wynalazku oraz kolejność ich dołączania podczas syntezy. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem można w tym kontekście wymiennie stosować także zapis wzoru 1 bez podawania numeracji reszt. Rdzeń wszystkich związków według wynalazku stanowi tetrapeptyd o wskazanej sekwencji 4 aminokwasów (Lys-Ser-Ser-Asp), którą przedstawiono także w Wykazie sekwencji jako sekwencję nr 1.
Związek według wynalazku ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Lys-Ser-Ser-Asp-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2. Taki mierzalny sygnał optyczny jest mierzony sposobem pomiaru zmiany absorpcji/fluorescencji po rozpadzie enzymatycznym związku. Korzystnie cząsteczki C1 i C2 są rozdzielone od siebie nie więcej niż 10 resztami aminokwasowymi, co zapewnia wydajne wygaszanie donora fluorescencji przez akceptor fluorescencji. Dla znawcy oczywistym jest, że kluczowym czynnikiem jest odległość pomiędzy donorem i akceptorem fluorescencji. Zatem, w przypadkach, gdy sekwencja aminokwasowa oddzielająca cząsteczkę C1 i C2 jest zwinięta w skręconą lub skondensowaną strukturę drugorzędową, skutkującą zbliżeniem cząsteczek C1 i C2 w stosunku do struktury pierwszorzędowej, odległość między cząsteczkami C1 i C2 może być większa niż 10 reszt aminokwasowych.
Taki związek, dzięki swoim właściwościom chromogenicznym oraz posiadaniu miejsca reaktywnego w pozycji 5 pozwalającego na rozpad enzymatyczny (korzystnie proteolityczny) na mniejsze fragmenty, jest szczególnie odpowiedni do stosowania go jako marker diagnostyczny, w szczególności swoisty marker diagnostyczny raka wątroby, w szczególności do zastosowania we wczesnym wykrywaniu raka wątroby.
W korzystnych wykonaniach związek według wynalazku ulega rozpadowi hydrolitycznemu, korzystnie proteolitycznemu.
W korzystnych wykonaniach para cząsteczek C1 i C2 jest wybrana jest z grupy składającej się z: kwasu 2-aminobenzoesowego (ABZ)/kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB), (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2), przy czym korzystniej parę cząsteczek C1 i C2 stanowi ABZ/pNA lub ABZ/ANB-NH2.
W korzystnych wykonaniach związek według wynalazku stanowi:
związek o wzorze 2:
ABZ1-Lys2-Ser3-Ser4-Asp5-ANB6-NH2 (wzór 2), lub związek o wzorze 3:
ABZ1-Lys2-Ser3-Ser4-Asp5-X26 (wzór 3), w których ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego, zaś pNA oznacza 4-anilinę.
Taki związek ulega korzystniej rozpadowi hydrolitycznemu z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-OH oraz fragmentu 2: ANB-NH2 w przypadku związku o wzorze 2, zaś w przypadku związku o wzorze 3 z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-OH oraz fragmentu 2: pNA. Fragmenty 2 stanowią zatem chromofory w postaci wolnej.
Separacja przestrzenna cząsteczek C1 i C2 będąca następstwem rozpadu enzymatycznego związku według wynalazku powoduje powstanie mierzalnego sygnału optycznego, ponieważ fluorescencja emitowana z donora fluorescencji nie jest już wygaszana przez akceptor fluorescencji. Taki mierzalny sygnał optyczny można wykrywać korzystnie przy długości fali 300-500 nm, korzystniej 380430 nm.
Związki według wynalazku można otrzymywać znanymi sposobami. Przykładowo można je otrzymać z zastosowaniem sposobu otrzymywania peptydów chromogenicznych polegającego na prowadzeniu procesu na nośniku w postaci żywicy, posiadającej grupę Fmoc, którą usuwa się w trakcie prowadzenia reakcji. Przykładowo może to być żywica amidowa, np. TentaGel S RAM lub RinkAmide, ale można także zastosować dowolną inną żywicę dostępną na rynku. Używana żywica do prowadzenia tego procesu powinna zostać odpowiednio przygotowana. Przygotowanie tej żywicy polega na zwiększeniu jej objętości poprzez wielokrotne przemywanie rozpuszczalnikami hydrofobowymi.
Korzystnie stosuje się żywicę o osadzeniu 0,23 mmol/g. Z żywicy tej należy usunąć grupę ochronną Fmoc poprzez przemywanie 20% roztworem rozpuszczalnika.
Następnie, znane procesy otrzymywania peptydów chromogen obejmują przyłączanie poszczególnych elementów składowych w odpowiednich warunkach czasowych i stechiometrycznych. Ten proces przyłączania składa się z kolejnych etapów, w których poszczególne elementy (pochodne aminokwasowe) są przyłączane, pozostałości odmywane i kolejno grupy ochronne usuwane i ponownie przemywane. Taki cykl powtarzany jest dla każdej reszty aminokwasowej. Otrzymany peptyd oddzielany jest od żywicy poprzez reakcję w warunkach kwasowych. Następnie roztwór oddzielany jest od żywicy w procesie sączenia, a następnie z otrzymanego roztworu peptyd wytrącany jest rozpuszczalnikiem niepolarnym. Uzyskany w ten sposób osad peptydu jest wirowany.
Szczegółowy sposób syntezy związków według wynalazku opisano poniżej i w Przykładzie 1 poniżej.
Sposób syntezy związków według wynalazku polega na tym, że proces prowadzi się na nośniku w postaci żywicy, korzystnie posiadającej grupę Fmoc, przy czym nośnik przed rozpoczęciem procesu przygotowuje się poprzez zwiększenie jego objętości przez wielokrotne przemywanie rozpuszczalnikami hydrofobowymi, korzystnie dimetyloformamidem, chlorkiem metylenu lub N-metylopirolidonem, i usunięcie grupy ochronnej Fmoc, korzystnie poprzez przemywanie 10-30% roztworem piperydyny, w rozpuszczalnikach, takich jak dimetyloformamid, chlorek metylenu lub N-metylopirolidon. Następnie przeprowadza się sposób w kolejnych etapach:
a) osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego ANB (lub innego chromoforu odpowiedniego do zastosowania zgodnie z wynalazkiem jak zdefiniowano w zastrzeżeniach) na żywicy poprzedza się przemyciem nośnika 3-6% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF, po czym przygotowuje się roztwór ANB w DMF, do którego dodaje się kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6, tak przygotowaną mieszaninę dodaje się do żywicy i miesza się do uzyskania jednorodności, po czym żywicę odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i przemywa rozpuszczalnikami, takimi jak DMF, DCM i izopropanolem, a następnie kontynuuje się przyłączanie ANB do żywicy poprzez zastosowanie heksafluorofosforanu O -(7-azabenzotriazol-1-ilo)-N,N,N’,N’-tetrametylouroniowego (HATU), a potem heksafluorofosforanu O -(benzotriazol-1-ilo)-N,N,N’,N’- tetrametylouroniowego (HBTU) w ilościach nadmiarowych, a po zakończeniu przemywa się nośnik kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i łagodnie suszy się;
b) przyłączanie reszty aminokwasowej do ANB prowadzi się poprzez reakcję z pochodną aminokwasową Fmoc-Asp(OtBu)-OH, przy czym co najmniej pięciokrotny nadmiar molowy pochodnej aminokwasowej w stosunku do żywicy rozpuszcza się w bezwodnej pirydynie i kontaktuje się z żywicą z osadzonym ANB, po czym całość chłodzi się do temperatury nie niższej niż -20°C, a następnie dodaje się POCI3 w stosunku 1:1 do użytej ilości pochodnej aminokwasowej i całość miesza się, po czym proces mieszania prowadzi się w temperaturze pokojowej, a następnie w podwyższonej temperaturze, zaś po zakończeniu reakcji żywicę odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, przemywa się DMF oraz MeOH i łagodnie suszy się, po czym uzyskany związek przejściowy poddaje się procesowi acylowania przyłączając kolejno fragment Ser-Ser-Lys;
c) acylowanie uzyskanego związku przejściowego prowadzi się przy zastosowaniu pochodnej aminokwasowej, korzystnie Fmoc-Ser(OtBu)OH, i kolejno Fmoc-Ser(OtBu)-OH, następnie Fmoc-Lys(Boc)-OH i w końcowym etapie syntezy Boc-Abz-OH, przy czym acylowanie prowadzi się etapowo od reszty 6 do 1 z wykorzystaniem diizopropylokarbodiimidu jako środka sprzęgającego, który stosuje się w nadmiarze, a po zakończeniu każdego etapu żywicę przemywa się DMF, i korzystnie podaje testowi chloroanilowemu (test na obecność wolnych grup aminowych), w którym monitoruje się przyłączenia pochodnej aminokwasowej;
d) usunięcie grupy ochronnej Fmoc prowadzi się poprzez przemywanie roztworem 10-30% piperydyny w DMF i kolejnymi przemywaniami każdym z rozpuszczalników: DMF, izopropanolem i chlorkiem metylenu;
e) odszczepianie peptydu od żywicy przeprowadza się stosując mieszaninę TFA:fenol:woda:TIPS przy zachowaniu stosunków odpowiednio 88:5:5:2 v/v/v/v, przy czym mieszaninę miesza się przez okres co najmniej jednej godziny, korzystnie trzy godziny, a uzyskany osad odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym przemywa się eterem dietylowym i uzyskany peptyd odwirowuje się;
f) przygotowanie gotowego produktu przeprowadza się poprzez rozpuszczenie peptydu w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddaje liofilizacji.
W drugim aspekcie niniejszego wynalazku dostarczony jest sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej, korzystnie proteolitycznej, obecnej w płynie ustrojowym osobnika, w szczególności pochodzącej z komórek raka wątroby, obejmujący a) kontaktowanie próbki płynu ustrojowego ze związkiem według wynalazku i b) wykrywanie mierzalnego sygnału optycznego, który powstaje poprzez separację przestrzenną cząsteczek obecnych w związku według wynalazku C1 i C2. W korzystnym wykonaniu tego aspektu osobnikiem badanym jest w takim przypadku człowiek. W innym korzystnym wykonaniu tego aspektu płynem ustrojowym jest mocz, w szczególności ludzki.
W korzystnym wykonaniu tego aspektu stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA.
W trzecim aspekcie niniejszego wynalazku dostarczony jest sposób in vitro diagnozowania raka wątroby, w którym wykrywa się obecność lub nieobecność raka wątroby u osobnika poprzez pomiar w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej, swoistej dla raka wątroby, przy czym brak wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na nieobecność raka wątroby, zaś obecność wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na obecność raka wątroby, i przy czym do pomiaru w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej jak określono powyżej stosuje się dowolny związek według wynalazku jak określono powyżej. Takie wykrywanie aktywności enzymatycznej korzystnie przeprowadza się z zastosowaniem opisanych powyżej sposobów wykrywania aktywności enzymatycznej jak omówiono powyżej. W korzystnym wykonaniu tego aspektu osobnikiem jest człowiek. W korzystnym wykonaniu tego aspektu płynem ustrojowym jest mocz, w szczególności ludzki. W korzystnym wykonaniu tego aspektu aktywność enzymatyczną swoistą dla raka wątroby stanowi aktywność proteolityczna. W korzystnym wykonaniu tego aspektu stosuje się związek o wzorze 2: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 lub związek o wzorze 3: ABZLys-Ser-Ser-Asp-pNA.
Ponadto, w korzystnym wykonaniu tego aspektu pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej w sposobach według wynalazku obejmuje pomiar intensywności absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, zwłaszcza 405 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze w zakresie 25-40°C, korzystnie 36-38°C. Dzięki, czemu otrzymuje się maksymalnie intensywny mierzalny optyczny sygnał wynikający ze wzrostu absorbancji lub fluorescencji.
Ponadto, w korzystnych wykonaniach wspomnianych sposobów według wynalazku prowadzi się pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej z zastosowaniem związku według wynalazku w zakresie stężeń 0,1-10 mg/ml, korzystniej w stężeniu 1 mg/ml, w korzystnych wykonaniach wspomnianych sposobów według wynalazku badaną próbkę inkubuje się ze związkiem według wynalazku w buforze pomiarowym o pH obojętnym lub zasadowym, korzystnie fizjologicznym, z próbką płynu ustrojowego, korzystnie ludzkiego moczu, w zakresie proporcji 1:2 do 1:10, korzystnie 1:5 próbki (np. moczu) do buforu pomiarowego. Próbka korzystnie pochodzi od osoby skierowanej do diagnozy wątroby raka. Korzystnie mierzy się intensywność absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, zwłaszcza 405 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze w zakresie 25-40°C, korzystnie 36-38°C. W powyższych warunkach otrzymujemy maksymalnie intensywny mierzalny sygnał optyczny wynikający ze wzrostu absorbancji lub fluorescencji.
W czwartym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza zestaw zawierający dowolny związek według wynalazku i bufor pomiarowy. Bufory pomiarowe znane są w dziedzinie, przy czym odpowiedni do zastosowania w zestawie według wynalazku bufor to na przykład, ale nieograniczająco, bufor Tris-HCl. W korzystnym wykonaniu w takim zestawie według wynalazku wspomniany związek stanowi związek o wzorze 2: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA (wzór 3).
W piątym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza związek według wynalazku do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka wątroby. W szóstym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza związek według wynalazku do zastosowania do diagnozowania raka wątroby. Korzystnie diagnozowanie raka wątroby obejmuje zgodnie z wynalazkiem wykrywanie pierwotnego raka wątroby, wykrywanie choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka wątroby i/lub wykrywanie wznowy raka wątroby.
W siódmym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza związek według wynalazku do zastosowania jako marker diagnostyczny do wykrywania raka wątroby. W korzystnych wykonaniach tego aspektu takim związkiem jest związek o wzorze 2: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA(wzór 3). Opisano tu ponadto sposób leczenia raka wątroby, w którym
a) wykrywa się obecność aktywności enzymatycznej swoistej dla raka wątroby dowolnym sposobem według wynalazku jak określono powyżej w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego, i
b) gdy we wspomnianej próbce stwierdzi się występowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej, podejmuje się leczenie raka wątroby u osobnika.
W jednym wariancie takiego sposobu leczenia po zakończeniu leczenia zgodnie z punktem b), można przeprowadzać monitorowanie wspomnianej aktywności enzymatycznej swoistej dla raka wątroby w określonych odstępach czasu jak wiadomo w dziedzinie, np. co tydzień, co kilka tygodni, co miesiąc, co kilka miesięcy, co rok lub w dowolnych innych odstępach uznanych przez specjalistę zastosowane, celem wykrywania choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka wątroby lub pojawienia się wznowy. Ponadto, w jednym wariancie takiego sposobu leczenia jako próbkę do badania można stosować próbkę moczu, korzystnie moczu ludzkiego. W jednym wariancie takiego sposobu leczenia jako wspomniany związek można stosować związek o wzorze 2: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA (wzór 3).
Zalety niniejszego wynalazku polegają na dostarczeniu nowego związku chemicznego o właściwościach sprawiających, że nadaje się on do zastosowania do szybkiego, bezinwazyjnego diagnozowania raka wątroby, pozwalającego przy tym na wykrywanie raka wątroby na wczesnym etapie jego rozwoju. Kolejną zaletą jest to, że sposoby diagnostyczne według wynalazku mogą być z powodzeniem stosowane w badaniach przesiewowych. Daje to możliwość wykonania pełnej diagnostyki na wczesnym etapie rozwoju nowotworu i w konsekwencji skuteczniejszego leczenia. Wczesne rozpoznanie daje możliwość leczenia operacyjnego, które znacząco wydłuża przeżycie pacjenta. Jest to także istotne w przypadku monitorowania skuteczności przeprowadzonego leczenia chirurgicznego i/lub chemioterapeutycznego raka wątroby, dzięki możliwości wykrywania choroby resztkowej lub ewentualnej wznowy.
Niniejszy wynalazek zostanie teraz zilustrowany na poniższych figurach i w poniższych przykładach, które jednak nie mają na celu ograniczenia w żaden sposób zakresu wynalazku zdefiniowanego w zastrzeżeniach patentowych.
Krótki opis figur
Fig. 1 przedstawia stopień hydrolizy substratu - ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 - w próbkach moczu ze zdiagnozowanym rakiem wątroby (próbki 1-20) i moczu pochodzących od osób zdrowych (21-40). Cyfry arabskie oznaczają numer wybranej próbki moczu.
Fig. 2 przedstawia wyniki analizy chromatograficznej rozpadu substratu, tj. ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2, w próbce moczu z rakiem wątroby.
Fig. 3 przedstawia stopień hydrolizy substratu - ABZ1-Lys2-Ser3-Ser4-Asp5-ANB6-NH2 - w próbkach moczu ze zdiagnozowanym nowotworem (próbki 1 i moczu pochodzącym od osób z diagnozą innej choroby nowotworowej (2-9). Cyfry arabskie oznaczają numer wybranej próbki moczu. Wyniki te wykazują selektywność rozpadu substratu wobec moczu pacjentów z rakiem wątroby względem próbek moczu od pacjentów chorych na inne nowotwory.
Fig. 4 przedstawia zależność stopnia hydrolizy substratu - ABZ1-Lys2-Ser3-Ser4-Asp5-ANB6-NH2, od środowiska pH.
Przykłady
Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, niestanowiące jednak jego ograniczenia. O ile nie wskazano inaczej, w poniższych przykładach stosowano znane i/lub komercyjnie dostępne urządzenia, metody, warunki reakcji, odczynniki i zestawy, takie jakie powszechnie stosuje się w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek i jakie są zalecane przez wytwórców odpowiednich odczynników i zestawów.
Przykład 1 : Synteza związku według wynalazku
W przykładzie tym przedstawiono syntezę reprezentatywnego związku według niniejszego wynalazku, mianowicie: ABZ1-Lys2-Ser3-Ser4-Asp5-ANB6-NH2. Pozostałe peptydy według wynalazku można zsyntetyzować w analogiczny sposób. Cyfry w indeksie górnym oznaczają kolejne pozycje reszt w związku według wynalazku oraz kolejność ich dołączania podczas syntezy. Związek według wynalazku można zamiennie przedstawić analogicznym wzorem bez podawania pozycji reszt, co nie zmienia kolejności reszt w związku według wynalazku, gdyż pozostaje ona bez zmian.
1. Otrzymanie peptydu chromogenicznego
a) Pierwszym etapem syntezy było otrzymanie peptydu chromogenicznego który otrzymano metodą syntezy w fazie stałej - na nośniku stałym - z wykorzystaniem chemii Fmoc/tBu, czyli z użyciem osłon.
Związek o sekwencji ABZ1-Lys2-Ser3-Ser4-Asp5-ANB6-NH2, gdzie ABZ oznacza kwas 2-aminobenzoesowy, a ANB-NH2 oznacza amid kwasu 5-amino-2-benzoesowego, zaś ANB to kwas 5-amino-2-benzoesowy, otrzymano na drodze syntezy chemicznej w fazie stałej z wykorzystaniem następujących pochodnych aminokwasowych.
Boc-ABZ, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ser(OtBu), Fmoc-Asp(OtBu).
Syntezę związku według wynalazku, czyli markera diagnostycznego do wykrywania raka wątroby, prowadzono na nośniku stałym umożliwiającym przekształcenie kwasu 5-amino-2-benzoesowego w amid ANB-NH2, mianowicie żywicy amidowej TentaGel S RAM firmy RAPP Polymere (Niemcy) o osadzeniu 0,23 mmol/g. Można jednakże zastosować dowolną inną żywicę amidową np. Rink Amide (Niemcy).
Syntezę związku prowadzono w sposób manualny z zastosowaniem wytrząsarki laboratoryjnej. Przez większość etapów reaktorami była strzykawka zakończona spiekiem do syntezy w fazie stałej o pojemności 25 ml.
Wszystkie otrzymywane końcowe związki zawierały w swojej sekwencji w pozycji 1, czyli na N-końcu, kwas 2-aminobenzoesowy (ABZ), zaś w pozycji 6, czyli na C-końcu, cząsteczkę kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB), ABZ pełni tu rolę donora fluorescencji, natomiast ANB - kwas 5-amino-2-benzoesowy pełni rolę wygaszacza fluorescencji i jednocześnie chromoforu. Peptydy w swojej sekwencji zawierały co najmniej i korzystnie jedno miejsce reaktywne zlokalizowane pomiędzy resztami aminokwasowymi Asp-ANB-NH2, tj. w pozycji 5 związku. Syntezę polegająca na przyłączaniu pochodnych aminokwasowych prowadzi się od reszty 6 do 1, czyli od końca C do N.
b) Osadzenie ANB na żywicy TentaGel S RAM:
Syntezę peptydów wykonano na żywicy TentaGel S RAM firmy Rapp Polymere o osadzeniu 0,23 mmol/g. W pierwszym etapie przygotowano żywicę, w tym dokonano spulchnienia żywicy poprzez cykl przemywań. Kolejno przystąpiono do usunięcia z nośnika osłony grupy aminowej Fmoc za pomocą 20% roztworu piperydyny w NMP. Następnie przeprowadzono cykl przemywań rozpuszczalnikami. W celu potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych wykonano test chloranilowy.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 1 x 10 minut
IsOH 1 x 10 minut
DCM 1 x 10 minut
Usunięcie osłony Fmoc:
DMF 1 x 5 minut
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty.
c) Test chloranilowy:
Test chloranilowy polegał na przeniesieniu, za pomocą łopatki, kilku ziaren żywicy z reaktora strzykawki - do szklanej ampułki, do której następnie dodano 100 μl nasyconego roztworu p-chloranilu w toluenie i 50 μl świeżego aldehydu octowego. Po upływie 10 minut przeprowadzono kontrolę zabarwienia ziaren.
Na tym etapie po przeprowadzeniu testu otrzymano zielone zabarwienie ziaren, które świadczyło o obecności wolnych grup aminowych. Po potwierdzeniu usunięcia osłon 9-fluorenylometoksykarbonylowych z żywicy można było przystąpić do kolejnego etapu, przyłączania pochodnej ANB (kwasu 5-amino-2-nitrobenozesowego).
d) Osadzenie kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego na nośniku stałym
Pierwszym etapem syntezy biblioteki peptydowej - mieszaniny peptydów, było osadzenie ANB na 1 g żywicy. Przed przyłączeniem chromoforu przemyto żywicę używaną do reakcji następującymi rozpuszczalnikami: DMF, DCM i ponownie DMF, po czym usunięto osłonę Fmoc- z grupy funkcyjnej nośnika. Jeden cykl usuwania osłony Fmoc- obejmował następujące etapy:
Usunięcie osłony Fmoc-:
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut
e) Przemywanie
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty.
f) Test chloranilowy
Żywicę z wolną grupą aminową przemyto 5% roztworem N-metylomorfoliny (NMM) w DMF, a następnie DMF. Procedurę usuwania osłony Fmoc- oraz cykl przemywań przeprowadzono w naczynku Merrifielda. W osobnej kolbie rozpuszczono ANB w DMF i dodawano kolejno TBTU, DMAP, a na koniec diizopropyloetyloaminę (DIPEA) w następujących nadmiarach w stosunku do osadzenia polimeru: ANB/TBTU/DMAP/DIPEA, 3:3:2:6 v/v/v/v. Tak przygotowaną mieszaninę dodano do żywicy i mieszano przez 3 godziny. Żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF, DCM i izopropanolem, a całą procedurę acylowania powtórzono dwa razy. Do przeprowadzenia kolejnych reakcji przyłączania ANB do żywicy zastosowano heksafluorofosforan-O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)- N,N,N’,N’-tetrametylouroniowy (HATU), a potem heksafluorofosforan-O -(benzotriazol-1-ilo)-N,N,N’,N’-tetrametylouroniowy (HBTU). W ostatnim etapie żywicę przemyto kolejno DMF, DCM oraz izopropanolem i suszono na powietrzu.
g) Przyłączenie C-końcowej reszty aminokwasowej (Fmoc-Asp(OtBu)) do ANB Odpowiednią pochodną aminokwasową (9-krotny nadmiar molowy w stosunku do osadzenia żywicy) rozpuszczono w pirydynie i przeniesiono do kolby zawierającej żywicę z osadzonym ANB. Całość chłodzono do uzyskania temperatury -15°C (łaźnia lodowa: 1 cz. wagowa NH4CI, 1 cz. wagowa NaNOs, 1 cz. wagowa lodu). Po osiągnięciu żądanej temperatury dodano POCI3 (w stosunku 1:1 do użytej ilości pochodnej aminokwasowej) i całość mieszano na mieszadle magnetycznym: 20 minut w -15°C, 30 minut w temperaturze pokojowej oraz 6 godzin w 40°C (łaźnia olejowa). Po zakończeniu reakcji żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, przemyto DMF oraz MeOH i zostawiono do wysuszenia.
W kolejnym etapie przyłączono resztę w pozycji P2(Fmoc-Ser(OtBu).
Wszystkie przyłączania reszt aminokwasowych poprzedzono przemywaniem żywicy za pomocą DMF przez 5 minut. W kolejnych przyłączaniach stosowano diizopropylokarbodiimid jako środek sprzęgający. Procedurę powtarzano dwukrotnie.
Po każdym z acylowań rozpoczynano cykl przemywań żywicy, a następnie wykonywano test chloranilowy, w celu monitorowania przyłączania pochodnej aminokwasowej do wolnych grup aminowych żywicy.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzonych testów po dwóch pierwszych sprzęganiach zabarwienie ziaren najpierw było zielone, a następnie szare, więc konieczne było przeprowadzenie kolejnego acylowania, w wyniku którego ziarna żywicy badanej testem chloranilowym były bezbarwne. Świadczyło to o przyłączeniu ANB do żywicy TentaGel S RAM, co pozwoliło przejść do następnego etapu syntezy peptydu.
h) Przyłączanie kolejnych chronionych reszt aminokwasowych:
Żywicę wraz z przyłączonym fragmentem ANB-Asp(OtBu) - znajdującą się w reaktorku przemyto za pomocą DMF, a następnie przystąpiono do deprotekcji osłony Fmoc z grupy aminowej w celu przyłączenia chronionej pochodnej aminokwasowej Ser(tBu).
Usunięcie osłony Fmoc:
DMF 1 x 5 minut
20% piperydyna w NMP 1 x 3 minuty
20% piperydyna w NMP 1 x 8 minut
Cykl przemywań rozpuszczalnikami:
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
W wyniku przeprowadzenia testu chloranilowego otrzymano wynik pozytywny, o czym świadczyło zielone zabarwienie ziaren żywicy. Pozwoliło to na rozpoczęcie kolejnego etapu - przyłączania reszty aminokwasowej Fmoc-Ser(tBu)-OH.
Przyłączanie pochodnej aminokwasowej
Wykonywane sprzęgania poprzedzono przemywaniem żywicy w DMF. Podczas przyłączania chronionej reszty seryny skład mieszaniny sprzęgającej pozostawał bez zmian. Po zakończeniu każdego z acylowań stosowano cykl przemywań rozpuszczalnikami według podanej procedury, a następnie przeprowadzono test chloranilowy na obecność wolnych grup aminowych w roztworze.
Cykl przemywań rozpuszczalnikami
DMF 3 x 2 minuty
IsOH 3 x 2 minuty
DCM 3 x 2 minuty.
Test chloranilowy:
Ziarna żywicy podczas testu przeprowadzonego po drugim acylowaniu były bezbarwne, co pozwoliło na przejście do kolejnego etapu syntezy, jakim było wprowadzenie kolejnej chronionej pochodnej aminokwasowej - Lys(Boc) i cząsteczki kwasu 2-aminobenzoesowego. Procesy sprzęgania odbyły się zgodnie z procedurą omówioną wcześniej.
Testy przeprowadzone po przyłączeniu wyżej wymienionych reszt wykazały wyniki pozytywne, ziarna żywicy były bezbarwne.
2. Usuwanie peptydu z nośnika
Po zakończeniu syntezy amid peptydu ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 usunięto z nośnika wraz z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych za pomocą mieszaniny: TFA : fenol : woda : TIPS (88:5:5:2, v/v/v/v) w kolbie okrągłodennej na mieszadle magnetycznym.
Po upływie 3 godzin zawartość kolby odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem na lejkach ze spiekiem Schotta przemywając eterem dietylowym. Powstały osad odwirowano na wirówce SIGMA 2K30 (Laboratory Centrifuges) w czasie 20 minut. Osad otrzymany po wirowaniu rozpuszczano w wodzie przy pomocy ultradźwięków, a następnie poddano liofilizacji. W analogiczny sposób można przeprowadzić otrzymywanie pozostałych związków według niniejszego wynalazku.
Potwierdzenie tożsamości/charakterystykę nowego związku według wynalazku przeprowadzono z zastosowaniem analizy HPLC. Warunki tej analizy HPLC były następujące: kolumna RP Bio Wide Pore Supelco C8,250 mm 4 mm, układ faz A 0,1% TFA w wodzie, B: 80% acetonitrylu w A), przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy 226 nm. Przeprowadzona analiza potwierdziła otrzymanie związku według wynalazku.
Przykład 2: Badanie właściwości peptydu według wynalazku jako markera nowotworowego
Badanie aktywności nowych związków według wynalazku wykonano na grupie 20 chorych z diagnozą raka wątroby z wykorzystaniem reprezentatywnego związku według wynalazku. Mechanizm działania związków według wynalazku, w tym reprezentatywnego związku o wzorze 2, polega na swoistym rozpadzie enzymatycznym, dokładniej hydrolizie enzymatycznej, w takim miejscu, które prowadzi do uwolnienia wolnych cząsteczek chromoforów, odpowiednio, ANB-NH2 (amidu kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego) w przypadku związku o wzorze 2 lub pNA (para nitro anilidu) w przypadku związku o wzorze 3, które wykazują absorbancję przy długości fali 320-480 nm, zwłaszcza 380430 nm, w szczególności 405 nm. Pozostałe związki według wynalazku cechują się analogicznym mechanizmem działania. W tym celu reprezentatywny związek według wynalazku, ABZ1-Lys2-Ser3-Ser4-Asp5-ANB6-NH2, rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (w stężeniu 0,5 mg/ml), a następnie 50 μl takiego roztworu zmieszano z 120 μl buforu (200 mM Tris-HCl, pH 8,0) i 80 μl moczu osoby chorej na raka wątroby. Pomiar wykonano w płytce 96 dołkowej przeznaczonej do pomiaru absorbancji,
PL 244818 Β1 a każdą próbkę analizowano w trzech powtórzeniach w temperaturze 37°C. Czas trwania pomiaru wynosił 60 minut. W czasie pomiaru monitorowano długość fali charakterystyczną dla uwalniającego się chromoforu (ANB-NH2) przy długości fali 405 nm (zakres 380-430 nm).
Jak pokazano na Fig. 1 analiza RP HPLC losowo wybranego systemu zawierającego mocz pochodzący od osoby z diagnozą raka wątroby wskazuje na to, że związek według wynalazku rozpada się na fragment peptydowy ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-OH i grupę chromoforową związku (ANB-NH2).
W wyniku pomiaru wzrost zabarwienia roztworu w czasie zaobserwowano we wszystkich próbkach moczu pochodzących od osób z diagnozą raka wątroby. Obserwowana wielkość wzrostu absorbancji w czasie jest różna dla każdej z badanych próbek. Odmienny efekt uzyskano dla 20 próbek osób zdrowych, gdyż w żadnym z 20 badanych próbek moczu nie zaobserwowano wzrostu absorbancji w zakresie diagnostycznym.
Przeprowadzane badania wskazują, że wszystkie próbki 1-20 od osób chorych na raka wątroby (oznaczone literą W) uległy rozpadowi, lecz w przypadku próbek 3 i 11 rozpad substratu, tj. ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2, zachodził mniej wydajnie niż w przypadku próbek 2 czy 19. Taki rezultat może być spowodowany różnicą w aktywności, jak i ilości enzymów odpowiedzialnych za rozpad enzymatyczny (proteolizę). Ponadto wyniki przedstawione w poniższej Tabeli 1 wskazują, że inkubacja roztworu substratu - związku według wynalazku - z próbkami moczu pochodzącymi od osób zdrowych (bez zdiagnozowanego nowotworu, oznaczone cyframi arabskimi kolejno od 21 do 40) nie prowadzi do wzrostu absorbancji, a zatem nie zachodzi hydroliza badanego związku. Rezultat wskazuje na brak obecności enzymów proteolitycznych charakterystycznych dla nowotworu wątroby.
Tabela 1. Wyniki analizy absorbancji
| W1 | 0,032210 | 0,033510 | 0,021090 |
| W2 | 0,022760 | 0,020370 | 0,028840 |
| W3 | 0,012680 | 0,013740 | 0,026100 |
| W4 | 0,028970 | 0,027180 | 0,028120 |
| W5 | 0,170970 | 0,144490 | 0,168400 |
| W6 | 0,020350 | 0,019660 | 0,025130 |
| W7 | 0,015250 | 0,023930 | 0,010470 |
| W8 | 0,018600 | 0,019900 | 0,018180 |
| W9 | 0,031300 | 0,026350 | 0,027500 |
| WIO | 0,045830 | 0,033220 | 0,037550 |
| Wll | 0,020910 | 0,011560 | 0,015360 |
| W12 | 0,030550 | 0,021260 | 0,018300 |
| W13 | 0,015830 | 0,013830 | 0,014310 |
| W14 | 0,003940 | 0,005250 | 0,004410 |
| W15 | 0,016220 | 0,017180 | 0,012330 |
| W16 | 0,012650 | 0,012510 | 0,007220 |
| W17 | 0,001200 | 0,001800 | 0,001500 |
| W18 | 0,019370 | 0,015390 | 0,019550 |
PL 244818 Β1
| W19 | 0,009100 | 0,009300 | 0,008900 |
| W20 | 0,152780 | 0,186730 | 0,190920 |
| 21 | 0,000000 | 0,000000 | 0.000000 |
| 22 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 23 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 24 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 25 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 26 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 27 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 28 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 29 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 30 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 31 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 32 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 33 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 34 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 35 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 36 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 37 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 38 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 39 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
| 40 | 0,000000 | 0,000000 | 0,000000 |
Ponadto, przeprowadzano badania selektywności rozpadu substratu, tj. związku według wynalazku, w zależności od badanego raka. Wyniki przeprowadzonych badań przedstawiono na Fig. 3 i wskazują one, że badany substrat, tj. ABZ1-Lys2-Ser3-Ser4-Asp5-ANB6-NH2, inkubowany z próbkami pochodzącymi od pacjentów z diagnozą raka jądra, jelita, nerki, prostaty, trzustki, dróg żółciowych, płuca, jajnika odbytnicy nie rozpada się i nie powoduje wzrostu absorbancji we wskazanym zakresie. Wskazuje to na selektywność rozpadu związków według wynalazku, która sprawia, że nadają się one do swoistego wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej wobec raka wątroby oraz swoistego diagnozowania raka wątroby.
W tabeli 2 poniżej przedstawiono wyniki pomiarów uzyskane dla trzech powtórzeń każdej z próbek.
PL 244818 Β1
Tabela 2
| Nowotwór lokalizacja | Pomiar 1 | Pomiar 2 | Pomiar 3 |
| Jądro | 0 | 0 | 0 |
| Jelito | 0 | 0 | 0 |
| Nerka | 0 | 0 | 0 |
| Prostata | 0 | 0 | 0 |
| Trzustka | 0 | 0 | 0 |
| drogi żółciowe | 0 | 0 | 0 |
| Płuco | 0 | 0 | 0 |
| Jajnik | 0 | 0 | 0 |
| Odbytnica | 0 | 0 | 0 |
| Wątroba | 0,0067 | 0,0072 | 0,0056 |
Ponadto przeprowadzono pomiary zależności aktywności proteolitycznej reprezentatywnego związku według wynalazku od odczynu środowiska reakcji. W wyniku tego eksperymentu stwierdzono, że w badanym materiale występuje co najmniej jeden enzym wykazujący maksimum aktywności w pH zasadowym (Fig. 4).
Przeprowadzone analizy potwierdziły przydatność związków według wynalazku w czułym i swoistym wykrywaniu aktywności enzymatycznej swoistej dla raka wątroby, a tym samym ich przydatności także do swoistego diagnozowania raka wątroby, jak również jako markera diagnostycznego raka wątroby. Mechanizm działania związków według wynalazku polega na ich swoistym rozpadzie enzymatycznym w takiej pozycji, która prowadzi do uwolnienia wolnych cząsteczek chromoforów, co powoduje powstanie mierzalnego sygnału optycznego, który można wykorzystywać do celów diagnostycznych, w szczególności w diagnozowaniu raka wątroby zgodnie z niniejszym wynalazkiem, wynalazkiem.
PL 244818 Β1
WYKAZ SEKWENCJI <l IO> URTESTE S.A <120> Nowy marker diagnostyczny raka wątroby <130> 17P49597PL00 <160> l <170> BiSSAP 1.3.6 <210> I <211>4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> I
Lys Ser Ser Asp
Claims (24)
1. Związek o wzorze 1:
X11-Lys2-Ser3-Ser4-Asp5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym związek ten ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Lys-Ser-Ser-Asp-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
2. Związek według zastrz. 1, który to związek ulega rozpadowi hydrolitycznemu, korzystnie proteolitycznemu.
3. Związek według zastrz. 1 albo 2, w którym to związku para cząsteczek C1 i C2 jest wybrana jest z grupy składającej się z: kwasu 2-aminobeznoesowego (ABZ)/kwasu 5-amino-2-nitrobenzoesowego (ANB), (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2), korzystnie parę C1 i C2 stanowi ABZ/pNA lub ABZ/ANB-NH2.
4. Związek według jednego z zastrzeżeń 1 do 3, który to związek stanowi związek o wzorze 2:
ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3:
ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA (wzór 3).
5. Związek według zastrz. 4, który to związek ulega rozpadowi hydrolitycznemu z powstaniem następującego fragmentu 1: ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-OH oraz fragmentu 2: ANB-NH2.
6. Sposób in vitro wykrywania aktywności enzymatycznej obecnej w płynie ustrojowym osobnika, pochodzącej z komórek raka wątroby, obejmujący:
a) kontaktowanie próbki płynu ustrojowego ze związkiem o wzorze 1:
X11-Lys2-Ser3-Ser4-Asp5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X1-Lys-Ser-Ser-Asp-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2), i
b) wykrywanie mierzalnego sygnału optycznego, który powstaje poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
7. Sposób in vitro według zastrz. 6, w którym aktywność enzymatyczną stanowi aktywność hydrolityczna, korzystnie aktywność proteolityczna.
8. Sposób in vitro według zastrz. 6 albo 7, w którym jako wspomniany związek stosuje się związek o wzorze 2:
ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3:
ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA(wzór 3).
9. Sposób według jednego z zastrz. 6 do 8, w którym jako wspomniany płyn ustrojowy stosuje się mocz, korzystnie mocz ludzki.
10. Sposób in vitro diagnozowania raka wątroby, w którym wykrywa się obecność lub nieobecność raka wątroby u osobnika poprzez pomiar w próbce płynu ustrojowego od osobnika badanego aktywności enzymatycznej swoistej dla raka wątroby, przy czym brak wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na nieobecność raka wątroby, zaś obecność wspomnianej aktywności enzymatycznej wskazuje na obecność raka wątroby, i przy czym do pomiaru wspomnianej aktywności enzymatycznej stosuje się związek o wzorze 1:
X11-Lys2-Ser3-Ser4-Asp5-X26 (wzór 1), przy czym X1 zawiera cząsteczkę C1 lub składa się z takiej cząsteczki, a X2 zawiera cząsteczkę C2 lub składa się z takiej cząsteczki, przy czym parę cząsteczek C1 i C2 stanowi para donora fluorescencji i akceptora fluorescencji, i przy czym wspomniany związek ulega rozpadowi enzymatycznemu na fragmenty X 1-Lys-Ser-Ser-Asp-OH (fragment 1) oraz X2 (fragment 2) z powstawaniem mierzalnego sygnału optycznego poprzez separację przestrzenną cząsteczek C1 i C2.
11. Sposób według zastrz. 10, w którym wykrywanie aktywności enzymatycznej przeprowadza się sposobem jak określono w jednym z zastrz. 6 do 9.
12. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 11, w którym wspomnianą próbkę płynu ustrojowego inkubuje się ze wspomnianym związkiem w buforze pomiarowym o pH obojętnym lub pH zasadowym, korzystnie fizjologicznym, w zakresie proporcji 1:2 do 1:10 korzystnie 1:5 próbki do buforu pomiarowego.
13. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 12, w którym wspomniany związek stosuje się w stężeniu 0,1-10 mg/ml, w szczególności 0,25-7,5 mg/ml.
14. Sposób według zastrz. 10 do 13, w którym jako wspomniany związek stosuje się związek o wzorze 2:
ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3:
ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA (wzór 3).
15. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 14, w którym jako wspomnianą próbkę stosuje się próbkę moczu, korzystnie moczu ludzkiego.
16. Sposób według jednego z zastrz. 10 do 15, w którym pomiar wspomnianej aktywności enzymatycznej obejmuje pomiar intensywności absorbancji w zakresie 300-500 nm, korzystnie 380-430 nm, w szczególności 405 nm, w czasie 40-60 minut, w temperaturze z przedziału 25-40°C, korzystnie 36-38°C.
17. Zestaw zawierający związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5 i bufor pomiarowy.
18. Zestaw według zastrz. 17, w którym związek stanowi związek o wzorze 2:
ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3:
ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA (wzór 3).
19. Związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5 do zastosowania do wykrywania aktywności enzymatycznej swoistej dla raka wątroby.
20. Związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5 do zastosowania do diagnozowania raka wątroby.
21. Związek do zastosowania według zastrz. 20, w którym diagnozowanie raka wątroby obejmuje wykrywanie pierwotnego raka wątroby, wykrywanie choroby resztkowej po resekcji chirurgicznej raka wątroby i/lub wykrywanie wznowy raka wątroby.
22. Związek do zastosowania według jednego z zastrz. 19 do 21, w którym związek stanowi związek o wzorze 2:
ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3:
ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA (wzór 3).
23. Związek jak określono w jednym z zastrz. 1 do 5 do zastosowania jako marker diagnostyczny do wykrywania raka wątroby.
24. Związek do zastosowania według zastrz. 23, który to związek stanowi związek o wzorze 2:
ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-ANB-NH2 (wzór 2) lub związek o wzorze 3:
ABZ-Lys-Ser-Ser-Asp-pNA (wzór 3).
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL439405A PL244818B1 (pl) | 2021-11-03 | 2021-11-03 | Związek-marker diagnostyczny raka wątroby, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka wątroby, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego |
| AU2022383746A AU2022383746A1 (en) | 2021-11-03 | 2022-11-02 | Fret enzymatic substrate and uses thereof in liver cancer. |
| PCT/PL2022/050074 WO2023080800A1 (en) | 2021-11-03 | 2022-11-02 | Fret enzymatic substrate and uses thereof in liver cancer. |
| CN202280073391.2A CN118202246A (zh) | 2021-11-03 | 2022-11-02 | Fret酶底物及其在肝癌中的应用 |
| CA3235007A CA3235007A1 (en) | 2021-11-03 | 2022-11-02 | Fret enzymatic substrate and uses thereof in liver cancer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL439405A PL244818B1 (pl) | 2021-11-03 | 2021-11-03 | Związek-marker diagnostyczny raka wątroby, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka wątroby, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL439405A1 PL439405A1 (pl) | 2023-05-08 |
| PL244818B1 true PL244818B1 (pl) | 2024-03-11 |
Family
ID=84689206
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL439405A PL244818B1 (pl) | 2021-11-03 | 2021-11-03 | Związek-marker diagnostyczny raka wątroby, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka wątroby, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118202246A (pl) |
| AU (1) | AU2022383746A1 (pl) |
| CA (1) | CA3235007A1 (pl) |
| PL (1) | PL244818B1 (pl) |
| WO (1) | WO2023080800A1 (pl) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9820012D0 (en) * | 1998-09-14 | 1998-11-04 | Pharmacia & Upjohn Spa | Use of an anthracycline derivative for the treatment of a liver tumor |
| AT501819B1 (de) * | 2005-04-18 | 2007-01-15 | Faustus Forschung Translationa | Verwendung von gallium(iii)-komplexen zur behandlung von tumorerkrankungen der leber |
| CN103608037B (zh) * | 2011-02-01 | 2016-04-13 | 香港大学 | 抗dkk1单克隆抗体用于治疗肝癌的用途 |
| EP2938634A2 (en) * | 2012-12-28 | 2015-11-04 | AbbVie Inc. | Dual specific binding proteins having a receptor sequence |
-
2021
- 2021-11-03 PL PL439405A patent/PL244818B1/pl unknown
-
2022
- 2022-11-02 AU AU2022383746A patent/AU2022383746A1/en active Pending
- 2022-11-02 WO PCT/PL2022/050074 patent/WO2023080800A1/en active Application Filing
- 2022-11-02 CA CA3235007A patent/CA3235007A1/en active Pending
- 2022-11-02 CN CN202280073391.2A patent/CN118202246A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2022383746A1 (en) | 2024-04-04 |
| CN118202246A (zh) | 2024-06-14 |
| WO2023080800A1 (en) | 2023-05-11 |
| PL439405A1 (pl) | 2023-05-08 |
| CA3235007A1 (en) | 2023-05-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0988394B1 (en) | Compositions for the detection of enzyme activity in biological samples and methods of use thereof | |
| US8841083B2 (en) | PSA capture agents, compositions, methods and preparation thereof | |
| JP4912362B2 (ja) | ペプチド固定化基板及びそれを用いた標的タンパク質の測定方法 | |
| CN107530453B (zh) | 用于基质金属蛋白酶的光学探针 | |
| JP2022538862A (ja) | 膵臓がんの新規診断マーカー | |
| Kuriki et al. | Development of a fluorescent probe library enabling efficient screening of tumour-imaging probes based on discovery of biomarker enzymatic activities | |
| PL244818B1 (pl) | Związek-marker diagnostyczny raka wątroby, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka wątroby, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego | |
| PL225341B1 (pl) | Nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów | |
| PL244819B1 (pl) | Związek-marker diagnostyczny raka płuca, sposób wykrywania aktywności enzymatycznej, sposób diagnozowania raka płuca, zestaw zawierający taki związek oraz związek do zastosowania medycznego | |
| WO2023204721A1 (en) | Compound - diagnostic marker for kidney cancer, method lor detecting enzymaticactivity, method for diagnosis of kidney cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of kidney cancer | |
| WO2024005658A1 (en) | Compound-diagnostic marker for uterine body cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of uterine body cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of uterine body cancer | |
| WO2023191647A1 (en) | Compound - diagnostic marker for intestinal cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of intestinal cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of intestinal cancer | |
| EP3431490B1 (en) | Chemical compounds for use as diagnostic markers of inflammation and neoplams, the method for synthesis of the chemical compounds, diagnostic kit for use in diagnosis of inflammatory processes and epithelial neoplasms and in vitro diagnostic method of inflammatory processes and epithelial neoplasms | |
| WO2024072241A1 (en) | Compound - diagnostic marker for ovarian cancer, method for detecting enzymatic activity, method for diagnosis of ovarian cancer, kit comprising the compound, uses of the compound and method for the treatment of ovarian cancer | |
| PL236125B1 (pl) | Związki chemiczne mające zastosowanie jako markery diagnostyczne stanu zapalnego i nowotworów, sposób ich otrzymywania, marker diagnostyczny i metoda diagnozowania procesów zapalnych i nowotworów nabłonkowych | |
| PL241174B1 (pl) | Związek chemiczny-marker diagnostyczny nowotworu trzustki oraz sposób diagnozowania in vitro nowotworu trzustki | |
| PL238575B1 (pl) | Związek oraz jego zastosowanie do wykrywania nowotworów nabłonkowych | |
| PL238699B1 (pl) | Związek chemiczny mający zastosowanie jako marker diagnostyczny nowotworów, sposób otrzymywania, metoda diagnozowania nowotworów nabłonkowych | |
| JP5170407B2 (ja) | 糖尿病合併症検査用試薬 | |
| RU2802849C2 (ru) | Новый маркер для диагностики рака поджелудочной железы | |
| PL238700B1 (pl) | Związki chemiczne mające zastosowanie jako markery diagnostyczne stanu zapalnego i nowotworów do zastosowania jako zestaw diagnostyczny i metoda diagnozowania i różnicowania procesów zapalnych i nowotworów nabłonkowych | |
| WO2022260135A1 (ja) | 固相抽出を利用した蛍光プローブライブラリの調製方法、及びこれを用いた酵素活性計測方法 | |
| PL231469B1 (pl) | Nowy związek, sposób jego otrzymywania, roztwór farmaceutyczny zawierający nowy związek, sposób określania obecności choroby nowotworowej, zestaw do wykrywania nowotworów oraz zastosowanie hydrolizy nowego związku do wykrywania nowotworów | |
| EP1358205B1 (en) | Tetrapeptidic tryptase substrates and assay for tryptase activity using same | |
| JP2023528638A (ja) | 前立腺がんの新規診断マーカー |