PL239994B1 - Dwuniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, klon komórkowy, kompozycja farmaceutyczna, sposób in vitro wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, jednoniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania - Google Patents

Dwuniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, klon komórkowy, kompozycja farmaceutyczna, sposób in vitro wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, jednoniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania Download PDF

Info

Publication number
PL239994B1
PL239994B1 PL421954A PL42195417A PL239994B1 PL 239994 B1 PL239994 B1 PL 239994B1 PL 421954 A PL421954 A PL 421954A PL 42195417 A PL42195417 A PL 42195417A PL 239994 B1 PL239994 B1 PL 239994B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
prodh
expression
sequence
nucleic acid
cell
Prior art date
Application number
PL421954A
Other languages
English (en)
Other versions
PL421954A1 (pl
Inventor
Jerzy PAŁKA
Ka Jerzy Pał
Ilona Zaręba
Nafis RAHMAN
Man Na Fis Rah
Arkadiusz SURAŻYŃSKI
Arkadiusz Surażyński
Wojciech Miltyk
Original Assignee
Univ Medyczny W Bialymstoku
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Medyczny W Bialymstoku filed Critical Univ Medyczny W Bialymstoku
Priority to PL421954A priority Critical patent/PL239994B1/pl
Priority to PCT/PL2018/000061 priority patent/WO2018236232A1/en
Publication of PL421954A1 publication Critical patent/PL421954A1/pl
Publication of PL239994B1 publication Critical patent/PL239994B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

PL 239 994 B1
Opis wynalazku
Dziedzina wynalazku
Wynalazek dotyczy dziedziny wyciszania ekspresji genów, w szczególności zaprojektowanej specyficznej podwójnej nici kwasu nukleinowego, zwłaszcza dwuniciowego kwasu deoksyrybonukleinowego (dsDNA) oraz dwuniciowego kwasu rybonukleinowego (dsRNA), do zastosowania do wyciszenia ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, czyli dehydrogenazy prolinowej (PRODH)/oksydazy prolinowej (POX). Dokładniej, przedmiotem niniejszego wynalazku jest dwuniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, wektor ekspresyjny zawierający taki kwas nukleinowy, komórka gospodarza zawierająca taki wektor ekspresyjny lub kwas nukleinowy, klon komórkowy zawierający taki kwas nukleinowy lub wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna zawierająca taki kwas nukleinowy lub wektor ekspresyjny, sposób in vitro wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i zastosowania dwuniciowego kwasu nukleinowego. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także jednoniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania. Wynalazek dotyczy ponadto wspomnianych powyżej cząsteczek kwasów nukleinowych do zastosowania w terapii, jako lek, w diagnostyce, w leczeniu i/lub profilaktyce zaburzeń charakteryzujących się zaburzonym metabolizmem proliny, poprzez wyciszenie ekspresji genu kodującego białko PROH/POX, do wytwarzania mikromacierzy identyfikujących ekspresję transkryptu kodującego białko PRODH/POX.
Stan techniki
Oksydaza prolinowa (POX) znana również jako dehydrogenaza prolinowa (PRODH) jest mitochondrialnym enzymem zależnym od nukleotydów flawinowych (Donald SP, Sun XY, Hu CA, Yu J, Mei JM, Valle D, et al. Proline oxidase, encoded by p53-induced gene-6, catalyzes the generation of proline-dependent reactive oxygen species. Cancer Res. 2001 ;61 (5): 1810-5; Phang JM, Donald SP, Pandhare J, Liu Y. The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways. Amino Acids. 2008;35(4):681-90)). Sekwencja tego enzymu jest znana i dostępna w bazie NCBI (National Center of Biotechnology Information). Przykładowo w bazie tej dostępna jest sekwencja ludzka, mianowicie kompletna sekwencja PRODH 1 człowieka (GenBank: AF120278.1; data dostępu: 15.05.2014), wariant transkrypcyjny 1 (tv1) (NCBI Reference Sequence: NM_016335.4; data dostępu: 15.05.2014) i wariant transkrypcyjny 2 (tv2) (NCBI Reference Sequence: NM_001195226.1; data dostępu:
15.05.2014). Sekwencje białek PRODH/POX z innych organizmów są także znane i publicznie dostępne w bazach danych, podobnie jak sekwencje kodujących je kwasów nukleinowych. Sekwencje te są konserwowane w bardzo dużym stopniu w różnych organizmach, takich jak wirusy, bakterie, rośliny, zwierzęta, w tym ssaki i człowiek. Enzym ten katalizuje przekształcenie proliny w kwas A1-pirolino-5-karboksylowy (P5C). W trakcie tego procesu elektrony są transportowane do łańcucha oddechowego przyczyniając się do wytworzenia ATP albo bezpośrednio redukują tlen, produkując reaktywne formy tlenu (ROS). Schemat cyklu prolinowego w komórce został przedstawiony na Fig. 1. (Fig. 1). Wiadomo, że w zależności od środowiska komórkowego i sytuacji metabolicznej w ramach cyklu prolinowego możliwa jest albo 1) aktywacja PRODH/POX, w wyniku czego wytwarzana cząsteczka ATP, która uzupełnia niedobory energii i promuje przeżycie komórek (zobacz, na przykład, Phang JM, Donald SP, Pandhare J, Liu Y. The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways. Amino Acids. 2008;35(4):681-90; Hu CA, Donald SP, Yu J, Lin WW, Liu Z, Steel G, et al. Overexpression of proline oxidase induces proline-dependent and mitochondria-mediated apoptosis. Mol Cell Biochem. 2007;295(1-2):85-92; Liu Y, Bordiert GL, Surazynski A, Hu CA, Phang JM. Proline oxidase activates both intrinsic and extrinsic pathways for apoptosis: the role of ROS/superoxides, NFAT and MEK/ERK signaling. Oncogene. 2006;25(41):5640-7), albo 2) aktywacja przez ROS kaspazy-9 i kaspazy-3, które zapoczątkowują apoptozę (zobacz, na przykład, Liu W, Phang JM. Proline dehydrogenase (oxidase), a mitochondrial tumor suppressor, and autophagy under the hypoxia microenvironment. Autophagy. 2012;8(9): 1407-9; Martindale JL, Holbrook NJ. Cellular response to oxidative stress: signaling for suicide and survival. J Cell Physiol. 2002; 192(1):1 -15; Raha S, Robinson BH. Mitochondria, oxygen free radicals, and apoptosis. Am J Med Genet. 2001;106(1):62-70; Phang JM. The regulatory functions of proline and pyrroline-5-carboxyIic acid. Curr Top Cell Regul. 1985;25:91-132; Phang JM, Pandhare J, Liu Y. The metabolism of proline as microenvironmental stress substrate. J Nutr. 2008;138(10):2008S-15S).
PL 239 994 B1
Prawdopodobnie obydwa te procesy, to znaczy zarówno produkcja ATP jak i ROS, zachodzą jednocześnie. Jednakże mechanizm kierowania komórki na ścieżkę apoptozy lub przeżycia nie został dotąd poznany.
Zatem ważnym etapem utylizacji proliny jest jej konwersja do P5C w mitochondriach, powodująca generowane ATP lub ROS, jak pokazano na Fig. 1 i Fig. 2. Intensywność tego procesu i jego wpływ na apoptozę/autofagię jest prawdopodobnie regulowany stanem energetycznym komórki, jednakże hipotezę tę potwierdzają nieliczne badania (zobacz, na przykład, Liu W, Phang JM. Proline dehydrogenase (oxidase), a mitochondrial tumor suppressor, and autophagy under the hypoxia microenvironment. Autophagy. 2012;8(9): 1407-9; Phang JM, Liu W, Hancock C, Christian KJ. The proline regulatoryaxis and cancer.Front Oncol. 2012;2(60):1-12).
W mitochondriach bowiem P5C ulega przekształceniu do kwasu glutaminowego pod wpływem dehydrogenazy P5C, a kwas glutaminowy do kwasu α-ketoglutarowego pod wpływem dehydrogenazy glutaminianowej. Przemiany te niejako włączają kwas α-ketoglutarowy w cykl kwasów trójkarboksylowych (TCA). W przypadku defektu cyklu TCA, kwas glutaminowy może opuścić mitochondrium i w cytoplazmie ulec przekształceniu do P5C pod wpływem syntetazy P5C, który przekształca się w prolinę pod wpływem reduktazy P5C (Fig. 1). Cytoplazmatyczna prolina może być albo wykorzystana do biosyntezy kolagenu (zobacz, na przykład, Maxwell SA, Rivera A. Proline oxidase induces apoptosis in tumor cells, and its expression is frequently absent or reduced in renal carcinomas. J Biol Chem. 2003;278(11):9784-9), albo ponownie ulec transportowi do mitochondrium tworząc tzw. cykl prolinowy, generujący ROS, które mogą indukować apoptozę (Fig. 1) (zobacz, na przykład, Phang JM. The regulatory functions of proline and pyrroline-5-carboxylic acid. Curr Top Cell Regul. 1985;25:91-132; Phang JM, Pandhare J, Liu Y. The metabolism of proline as microenvironmental stress substrate. J Nutr. 2008;138(10):2008S-15S); Liu W, Phang JM. Proline dehydrogenase (oxidase), a mitochondrial tumor suppressor, and autophagy under the hypoxia microenvironment. Autophagy. 2012;8(9): 1407-9)).
Można zatem wysunąć hipotezę, że ROS są generowane przez intensywną przemianę proliny w P5C, czyli w warunkach nasilonego obrotu cyklu prolinowego. Ma to miejsce w przypadku zwiększonej dostępności proliny jako substratu dla PRODH/POX oraz zwiększonej aktywności prolidazy uwalniającej prolinę z połączeń dipeptydowych. Taka sytuacja może również mieć miejsce, gdy P5C nie może być przekształcony w mitochondriach do glutaminianu i kwasu alfa-ketoglutarowego, metabolitu cyklu TCA, z powodu przeciążenia cyklu TCA przez metabolity lub mutacje enzymów cyklu TCA (zobacz, na przykład, Eddy AA, Giachelli CM. Renal expression of genes that promote interstitial inflammation and fibrosis in rats with protein-overload proteinuria. Kidney Int. 1995;47(6): 1546-57).
Zaburzony metabolizm proliny w konsekwencji prowadzi do powstania szeregu zaburzeń i/lub chorób, takich jak między innymi choroby nowotworowe, w szczególności rak sutka, zespół Ehlersa-Danlosa (zaburzenie elastyczności skóry), zespół Marfana, wrodzona łamliwość kości (zwiększona skłonność do złamań kości). Dotychczasowe badania in vitro nad rolą ekspresji PRODH/POX oraz znaczeniem dostępności proliny jako substratu tego enzymu w regulacji apoptozy/autofagii prowadzone były w modelach komórkowych w krótkim przedziale czasowym (do 24 h). Wyniki tych badań istotnie sugerują, że podwyższone stężenie proliny w cytoplazmie przy wysokiej aktywności PRODH/POX sprzyja apoptozie. W przypadku obniżonej aktywności PRODH/POX przy wysokim stężeniu proliny zachodzi proces autofagii (w ciągu 24 h) (zobacz, na przykład, Liu W, Phang JM. Proline dehydrogenase (oxidase), a mitochondrial tumor suppressor, and autophagy under the hypoxia microenvironment. Autophagy. 2012;8(9): 1407-9; Phang JM, Liu W, Hancock C, Christian KJ. The proline regulatory axis and cancer. Front Oncol. 2012;2(60): 1-12)).
Metody obniżania ekspresji białek i genów je kodujących są znane. Obniżenie ekspresji można uzyskać poprzez:
i) całkowitą lub częściową delecję/modyfikację fragmentu genomu;
ii) zastosowanie specyficznych inhibitorów oddziałujących bezpośrednio z otrzymanym białkiem lub pośrednio poprzez odziaływanie z czynnikami transkrypcyjny mi wpływającymi na zapoczątkowanie ekspresji danego białka; lub iii) po-transkrypcyjne wyciszenie ekspresji genów.
Po-transkrypcyjne wyciszenie ekspresji genów polega na wyciszeniu ekspresji kodowanego przez te geny białka, bez wpływu na sekwencję całego genomu. Można to uzyskać poprzez wykorzystanie interferencji RNA, zwanej inaczej RNAi (zobacz, na przykład, Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 2002;296(5567):550-3.). Proces ten polega na specyficznej degradacji docelowego mRNA przy udziale
PL 239 994 B1 homologicznych sekwencji krótkich fragmentów RNA. Dokładniej, mechanizm RNAi polega na indukowaniu degradacji mRNA lub blokowaniu jego translacji przez krótkie, niekodujące cząsteczki RNA, wśród których można wyróżnić shRNA (ang. short-hairpin RNA), siRNA (ang. Small interfering RNA) oraz miRNA (ang. microRNA). Mechanizmy RNAi przedstawiono na figurze 5 (Fig. 5). Wspólną cechą tych cząsteczek jest silne oddziaływanie z matrycowym mRNA prowadzące do degradacji mRNA lub inhibicji translacji, zapobiegając w końcowym efekcie powstaniu produktu - białka (zobacz, na przykład, Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 2002;296(5567):550-3; Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer Cell. 2002;2(3):243-7; Mollaie HR, Monavari SH, Arabzadeh SA, Shamsi-Shahrabadi M, Fazlalipour M, Afshar RM. RNAi and miRNA in viral infections and cancers. Asian Pac J Cancer Prev. 2013;14(12):7045-56; EP OK. siRNAs and shRNAs: Tools for protein knockdown by gene silencing https://www.labome.com/method/siRNAs- and-shRNAs-Tools-for-Protein-Knockdown-by-Gene-Silencing.html: Mater Methods; 2013; Williams AE. Functional aspects of animal microRNAs. Cell Mol Life Sci. 2008;65(4):545-213-17).
Obecnie dostępne są w sprzedaży zestawy umożliwiające wyciszenie ekspresji PRODH/POX i/lub kodującego go genu, przykładowo w ThermoFisher Scientific czy Santa Cruz Biotechnology. Jednakże obecnie wytwórcy takich dostępnych zestawów nie gwarantują uzyskania określonego efektu czy powtarzalności, czy też efektywności wyciszania docelowego genu. Ponadto brak jest oficjalnych danych na temat skuteczności wyciszenia za pomocą takich produktów.
Ponadto obecnie dostępne w sprzedaży są sekwencje startowe (startery) do ilościowej i jakościowej analizy ekspresji genów, na przykład z zastosowaniem metody łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) i jej modyfikacji, takich jak między innymi metoda PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR), i ilościowa metoda PCR w czasie rzeczywistym (RT-QPCR), jednak sekwencje nie są wystarczająco specyficzne wobec sekwencji kodującej PRODH/POX i nie pozwalają na uzyskanie wydajnego i powtarzalnego wyciszenia ekspresji białka PRODH/POX czy też kodującej to białko sekwencji kwasu nukleinowego.
W świetle powyższego wydaje się, że obniżona aktywność PRODH/POX w zależności od dostępności proliny może stanowić mechanizm włączający komórkowy tryb apoptozy lub autofagii. Dostarczenie zatem środków pozwalających na efektywne wyciszanie ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX ma istotne znaczenie dla możliwości uzyskania regulacji cyklu prolinowego i środki takie mogą znaleźć wiele zastosowań terapeutycznych, profilaktycznych i diagnostycznych, w szczególności w kontroli ekspresji PRODH/POX, zwłaszcza w zaburzeniach i chorobach charakteryzujących się zaburzonym metabolizmem proliny.
W dziedzinie niniejszego wynalazku istnieje zatem zapotrzebowanie na skuteczne i wiarygodne środki i sposoby pozwalające na wyciszanie ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX w sposób wydajny, powtarzalny i skuteczny, umożliwiając degradację mRNA PRODH/POX lub inhibicję translacji, zapobiegając w końcowym efekcie powstaniu produktu - białka PRODH/POX, a także nadające się do zastosowania w terapii i profilaktyce zaburzeń i chorób charakteryzujących się zaburzonym metabolizmem proliny, w tym nowotworów, w szczególności raka sutka. W dziedzinie niniejszego wynalazku istnieje także zapotrzebowanie na środki do identyfikacji i monitorowania metabolizmu proliny w komórce oraz do diagnostyki wskazanych powyżej chorób.
Celem wynalazku jest w szczególności dostarczenie środków do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX poprzez wykorzystanie zjawiska interferencji RNA (RNAi), zwłaszcza shRNA, pozwalających na skuteczne, powtarzalne i wydajne wyciszanie ekspresji PRODH/POX.
Krótki opis wynalazku
Powyższe cele zostały osiągnięte dzięki rozwiązaniom zastrzeganym w załączonych zastrzeżeniach patentowych.
Niniejszy wynalazek dostarcza związków, środków, kompozycji i sposobów do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX w komórce. Taką komórką może być komórka prokariotyczna, taka jak komórka bakteryjna, albo komórka eukariotyczna, zwłaszcza komórka zwierzęca, w szczególności komórka ssacza, taka jak komórka ludzka. Ewentualnie taką komórką może być komórka roślinna. Cząsteczki kwasów nukleinowych według niniejszego wynalazku można zsyntetyzować chemicznie lub enzymatycznie, lub na drodze ekspresji. Rozwiązania według wynalazku znajdują wiele zastosowań przemysłowych, w szczególności terapeutycznych, profilaktycznych, diagnostycznych, jak również w analizach genomowych, inżynierii genetycznej i farmakogenomice.
PL 239 994 B1
Z badań twórców niniejszego wynalazku prowadzonych w dłuższym przedziale czasowym (po kilku pasażach) wynika, że komórki z wyciszoną ekspresją PRODH/POX w obecności proliny ulegały apoptozie. Pozwala to sądzić, że wyciszenie PRODH/POX poprzez autofagię może prowadzić do apoptozy.
Powyższą obserwację wspierają wyniki badań jak przedstawiono poniżej, wskazujące, że zmniejszona ekspresja PRODH/POX oraz zwiększona dostępność proliny (pochodzącej z rozkładu glicyloproliny (GlyPro) przez prolidazę powoduje obniżenie biosyntezy DNA.
Wykazana w badaniach twórców niniejszego wynalazku indukcja autofagii w komórkach z wyciszoną ekspresją genu kodującego białko PRODH/POX zachodzi w obecności proliny. Niedobór tego aminokwasu, spowodowany np. zahamowaniem aktywności enzymatycznej prolidazy lub utylizacją tego aminokwasu w procesie biosyntezy kolagenu, prowadzi do apoptozy. Powyższe badania sugerują, że obniżona aktywność PRODH/POX w zależności od dostępności wewnątrzkomórkowej proliny może stanowić mechanizm włączający komórkowy tryb apoptozy lub autofagii.
Powyższą hipotezę wspierają wyniki badań, wskazujące, że zmniejszona ekspresja genu kodującego białko PRODH/POX oraz zwiększona dostępność proliny (pochodzącej z rozkładu imidopeptydów, np. glicylo-proliny (GlyPro) poprzez prolidazę) powoduje obniżenie biosyntezy DNA i biosyntezy kolagenu (Fig. 3). Natomiast aktywność prolidazy oraz stężenie wewnątrzkomórkowej proliny jest zwiększone.
Funkcjonalne znaczenie wyciszenia ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX można zaobserwować w analizie ekspresji markerów apoptozy i autofagii jak przedstawiono schematycznie na Figurze 4 (Fig. 4). W komórkach z prawidłową ekspresją białka PRODH/POX, GlyPro indukuje głównie ekspresję PRODH/POX, p53, aktywnej kaspazy-3 i -9. Natomiast w komórkach z wyciszoną ekspresją białka PRODH/POX dochodzi głównie do zwiększonej ekspresji białka bekliny 1, Atg7, AMPKa, HIF-1 a, mTOR, iNOS i NF-kB.
Indukcja autofagii w komórce z wyciszoną ekspresją genu kodującego PRODH/POX zachodzi w obecności proliny. Natomiast w komórce z prawidłową ekspresją PRODH/POX i w przypadku zwiększonej dostępności proliny, spowodowanej zwiększoną aktywnością enzymatyczną prolidazy lub zahamowaniem utylizacji proliny w procesie biosyntezy kolagenu, dochodzi do apoptozy.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest dwuniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX w komórce, przy czym ten dwuniciowy kwas nukleinowy zawiera nić sensowną i nić antysensowną o długości co najmniej 19 nukleotydów każda, które są komplementarne do siebie, przy czym ten dwuniciowy kwas nukleinowy stanowi dwuniciowy kwas deoksynukleinowy (dsDNA), w którym nić sensowna zawiera pierwszą sekwencję: GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2), a nić antysensowna zawiera drugą sekwencję: AGCTGATCTGGTCACACATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5), komplementarną do mRNA kodującego białko PRODH/POX, i przy czym ten dwuniciowy kwas nukleinowy po wprowadzeniu do komórki wykazującej ekspresję genu kodującego białko PRODH/POX wycisza ekspresję tego genu.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również dwuniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX w komórce, przy czym ten dwuniciowy kwas nukleinowy zawiera nić sensowną i nić antysensowną o długości co najmniej 19 nukleotydów każda, które są komplementarne do siebie, przy czym ten dwuniciowy kwas nukleinowy stanowi dwuniciowy kwas rybonukleinowy (dsRNA), w którym nić sensowna zawiera pierwszą sekwencję zawierającą sekwencję GCAUGUGUGACCAGAUCAGCU (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8), a nić antysensowna zawiera drugą sekwencję AGCUGAUCUGGuCaCACAUGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 11), komplementarną do mRNA kodującego białko PRODH/POX, i przy czym ten dwuniciowy kwas nukleinowy po wprowadzeniu do komórki wykazującej ekspresję genu kodującego białko PRODH/POX wycisza ekspresję tego genu.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także wektor ekspresyjny do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, charakteryzujący się tym, że zawiera dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej.
Korzystnie wektor ekspresyjny według wynalazku stanowi plazmid, transpozon lub wirus.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że zawiera dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej, lub wektor jak określono powyżej, przy czym korzystnie komórka ta wybrana jest spośród komórki prokariotycznej, takiej jak komórka bakteryjna, i komórki eukariotycznej, takiej jak komórka zwierzęca, zwłaszcza komórka ssacza, w szczególności komórka ludzka.
PL 239 994 B1
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto klon komórkowy z wyciszoną ekspresją genu kodującego białko PRODH/POX, charakteryzujący się tym, że zawiera dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej, lub wektor ekspresyjny jak określono powyżej.
Korzystnie klon komórkowy według wynalazku stanowi klon komórek MCF-7 zawierający jako dwuniciowy kwas nukleinowy dsDNA, który zawiera sekwencję GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) i sekwencję AGCTGATCTGGTCACACATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5).
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna do wyciszania ekspresji genu kodującego PRODH/POX w organizmie, charakteryzująca się tym, że zawiera dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej, lub wektor ekspresyjny jak określono powyżej, oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik lub rozcieńczalnik.
Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera dsDNA, który zawiera pierwszą sekwencję: GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) oraz drugą sekwencję: AGCTGATCTGGTCACACATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5).
Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera dsRNA, który zawiera pierwszą sekwencję: GCAUGuGuGACCAGAUCAGCU (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8) oraz drugą sekwencję: AGCUGAUCUGGUCACACAUGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1l).
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto sposób in vitro wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX w komórce, polegający na tym, że obejmuje on etapy, w których:
(a) wprowadza się dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej, lub wektor jak określono powyżej; oraz (b) utrzymuje się komórkę z wprowadzonym dwuniciowym kwasem nukleinowym lub wektorem z etapu (a) w warunkach i przez czas wystarczający do osiągnięcia wyciszenia ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX w komórce.
Korzystnie w sposobie według wynalazku w etapie a) wprowadza się dsDNA zawierający sekwencję GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) i sekwencję: AGCTGATCTGGTCACACATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5).
Korzystnie w sposobie według wynalazku w etapie a) wprowadza się dsRNA, korzystnie zawierający sekwencję GCAUGUGUGACCAGAUCAGCU (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8) i sekwencję AGCUGAUCUGGUCACACAUGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 11).
Korzystnie w sposobie według wynalazku wyciszanie ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX uzyskuje się z zastosowaniem metody RNAi, korzystnie opartej na shRNA, miRNA, lub siRNA.
Korzystniej w sposobie według wynalazku do wyciszania ekspresji tego genu stosuje się metodę RNAi opartą shRNA, który to shRNA zawiera korzystnie parę sekwencji: GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) i AGCTGATCTGGTCACACATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5) połączonych ze sobą w orientacji 5’-3’ łącznikiem nukleotydowym o długości 5 do 15 nukleotydów oraz sekwencji GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) i AGCTGATCTGGTCACACATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5) połączonych ze sobą w orientacji 3’-5’ łącznikiem nukleotydowym o długości 5 do 15 nukleotydów.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej do zastosowania w terapii.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej do zastosowania w leczeniu i/lub profilaktyce zaburzenia lub choroby charakteryzującej się zaburzonym metabolizmem proliny, korzystnie choroby nowotworowej, zwłaszcza raka sutka.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej do zastosowania do hamowania wzrostu i/lub proliferacji komórki nowotworowej.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej do zastosowania do indukcji apoptozy i/lub autofagii w komórce, w szczególności w komórce nowotworowej.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej do zastosowania do regulacji metabolizmu proliny w organizmie.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej do zastosowania w diagnostyce.
PL 239 994 B1
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej do zastosowania w diagnostyce chorób charakteryzujących się zaburzonym metabolizmem proliny, korzystnie choroby nowotworowej, zwłaszcza raka sutka.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej do zastosowania do wytwarzania linii komórkowej wykazującej wyciszoną ekspresję genu kodującego PRODH/POX.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej do zastosowania do wytwarzania klonu komórek wykazującego wyciszoną ekspresję genu kodującego białko PRODH/POX, korzystnie klonu komórek MCF-7 z wyciszoną ekspresją genu kodującego białko PRODH/POX.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto jednoniciowy kwas nukleinowy do oznaczania ekspresji transkryptu genu kodującego białko PRODH/POX w komórce, przy czym ten jednoniciowy kwas nukleinowy zawiera sekwencję o długości co najmniej 19 nukleotydów, która jest komplementarna do mRNA kodującego białko PRODH/POX, przy czym ten jednoniciowy kwas nukleinowy stanowi jednoniciowy kwas deoksynukleinowy, przy czym ten jednoniciowy kwas deoksynukleinowy stanowi sekwencja zawierająca nić sensowną zawierającą sekwencję: GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) albo sekwencja zawierająca nić antysensowną zawierającą sekwencję: AGCTGATCTGGTCaCaCATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5).
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto jednoniciowy kwas nukleinowy do oznaczania ekspresji transkryptu genu kodującego białko PRODH/POX w komórce, przy czym ten jednoniciowy kwas nukleinowy zawiera sekwencję o długości co najmniej 19 nukleotydów, która jest komplementarna do mRNA kodującego białko PRODH/POX, przy czym ten jednoniciowy kwas nukleinowy stanowi jednoniciowy kwas rybonukleinowy, przy czym ten jednoniciowy kwas rybonukleinowy stanowi sekwencja zawierająca nić sensowną zawierającą sekwencję GCAUGUGUGACCAGAUCAGCU (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8), albo sekwencja zawierająca nić antysensowną zawierającą sekwencję AGCUGAUCUGGUCACaCaUGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 11).
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także jednoniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej do zastosowania do wytwarzania mikromacierzy do identyfikacji ekspresji transkryptu genu kodującego białko PRODH/POX.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także jednoniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej do zastosowania do uzyskania sekwencji co najmniej części długości cDNA lub mRNA genu kodującego białko PRODH/POX w komórce.
Korzystnie taki jednoniciowy kwas nukleinowy według wynalazku stanowi jednoniciowy kwas deoksynukleinowy, który stanowi sekwencja zawierająca nić sensowną: GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2), albo sekwencja zawierająca nić antysensowną: AGCTGATCTGGTCACACATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5).
Korzystnie taki jednoniciowy kwas nukleinowy według wynalazku stanowi jednoniciowy kwas rybonukleinowy, który stanowi sekwencja zawierająca nić sensowną GCAUGUGUGACCAGAUCAGCU (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8), albo sekwencja zawierająca nić antysensowną AGCUGAUCUGGUCACACAUGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 11).
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także jednoniciowy kwas nukleinowy jak określono powyżej do zastosowania do diagnostyki chorób charakteryzujących się zaburzonym metabolizmem proliny, korzystnie choroby nowotworowej, zwłaszcza raka sutka.
Szczegółowy opis wynalazku
Wyciszenie ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i/lub ekspresji tego białka przyczynia się do indukcji zmian funkcjonalnych w komórkach i indukcji szlaków sprzyjających przeżyciu komórki, m.in. zmniejszenia syntezy DNA i kolagenu oraz zwiększonej aktywności prolidazy.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem wyciszanie ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX uzyskiwane jest poprzez po-transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX.
Zaprojektowane przez twórców niniejszego wynalazku sekwencje kwasu nukleinowego mogą zostać skutecznie stosowane do wyciszania ekspresji białka PRODH/POX, zwłaszcza poprzez wykorzystanie zjawiska interferencji RNA (RNAi), dokładniej poprzez indukowanie degradacji mRNA lub blokowanie jego translacji przez krótkie, niekodujące cząsteczki RNA, takie jak shRNA, siRNA i mikroRNA. Zaprojektowane i wytworzone przez twórców niniejszego wynalazku sekwencje charakteryzują się dużą specyficznością do sekwencji kodujących białko PRODH/POX i w konsekwencji powodują bardzo skuteczne i bardzo wydajne wyciszanie ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, co potwierdzają
PL 239 994 B1 między innymi uzyskane wyniki doświadczeń z wyciszeniem ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX jak przedstawiono poniżej. Cząsteczki te wykazują silne oddziaływanie na matrycowy mRNA, co prowadzi w rezultacie do degradacji mRNA lub inhibicji translacji białka PRODH/POX, zapobiegając w końcowym efekcie powstaniu produktu - białka i zmianę wykorzystania substratu w cyklu prolinowym, co przekłada się w komórce, na przykład komórce nowotworowej, na długotrwały stan niedoboru energetycznego pochodzącego z konwersji proliny do P5C jako alternatywnego źródła energii oraz nagromadzenia proliny jako cząsteczki o wysokim potencjale oksydo-redukcyjnym. W przypadku komórek nowotworowych prowadzi to do ich śmierci, co pozwala na zastosowanie rozwiązań według wynalazku w jako leków, zwłaszcza w leczeniu i/lub profilaktyce tego rodzaju chorób.
Twórcy niniejszego wynalazku wysunęli przypuszczenie, że wysoka zawartość proliny i wysoka aktywność PRODH/POX mogą sprzyjać indukcji apoptozy. Nie można jednak wykluczyć, że niska aktywność PRODH/POX, która sprzyja autofagii, może stanowić pośredni etap w indukcji apoptozy. Nagromadzenie proliny w cytoplazmie (z produktów degradacji kolagenu) i brak możliwości jej utylizacji w mitochondriach (z powodu niskiej aktywności PRODH/POX) zaburza równowagę oksydacyjno-redukcyjną, prowadząc w rezultacie do indukcji apoptozy. Prolina bowiem obdarzona jest potencjałem redukującym, który wymaga szybkiej utylizacji w celu zapewnienia równowagi oksydacyjno-redukcyjnej pomiędzy mitochondriami i cytoplazmą.
Twórcy niniejszego wynalazku wysnuli ponadto przypuszczenie, że intensywność utylizacji proliny do P5C i wpływ tego procesu na apoptozę zależy od dostępności substratu, a także dalszych przemian P5C. Dostępność substratu (proliny) zapewnia enzym cytoplazmatyczny, prolidaza, która odzyskuje prolinę z imidodipeptydów pochodzących z produktów degradacji białek, a głównie kolagenu. Natomiast głównym mechanizmem utylizacji proliny jest biosynteza kolagenu. Jednak utylizacja proliny w mitochondriach ma poważniejsze konsekwencje metaboliczne niż utylizacja tego aminokwasu w procesie biosyntezy kolagenu.
Powyższe hipotezy wspierają wyniki badań przeprowadzonych przez twórców niniejszego wynalazku, które wskazują, że zmniejszona ekspresja genu kodującego PRODH/POX oraz zwiększona dostępność proliny (pochodzącej z rozkładu glicylo-proliny (GlyPro) przez prolidazę) powoduje obniżenie biosyntezy DNA. Wykazana w tych badaniach indukcja autofagii w komórkach z wyciszoną ekspresją PRODH/POX zachodzi w obecności proliny. Niedobór tego aminokwasu, spowodowany np. zahamowaniem aktywności enzymatycznej prolidazy lub utylizacją tego aminokwasu w procesie biosyntezy kolagenu może prowadzić do apoptozy. Powyższe badania potwierdzają zatem, że obniżona aktywność PRODH/POX w zależności od dostępności wewnątrzkomórkowej proliny może stanowić mechanizm włączający komórkowy tryb apoptozy lub autofagii.
Z wyników badań przeprowadzonych przez twórców niniejszego wynalazku, które prowadzono w dłuższym przedziale czasowym (po kilku pasażach), wynika, że w obecności proliny komórki z wyciszoną ekspresją PRODH/POX ulegały apoptozie. Pozwala to sądzić, że wyciszenie ekspresji genu PRODH/POX poprzez skierowanie komórki na szlak autofagii będzie prowadzić do apoptozy, dzięki czemu możliwe jest zastosowanie rozwiązań według niniejszego wynalazku w szeregu zastosowań medycznych, w szczególności w terapii, leczeniu i/lub profilaktyce chorób charakteryzujących się zaburzonym metabolizmem proliny, a także szeregu zastosowań diagnostycznych.
Zaprojektowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem dwuniciowe cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być stosowane do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, w szczególności z zastosowaniem technologii RNAi. Zgodnie z wynalazkiem możliwe jest uzyskanie wyciszenia ekspresji genu kodującego PRODH/POX z zastosowaniem cząsteczek dsRNA lub dsDNA. Efektywność takiego wyciszania sięga 50% jak wynika z przedstawionych poniżej badań.
Wyciszanie ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX można uzyskać poprzez zastosowanie metody RNAi. Przykładowo można zastosować metodę RNAi wykorzystującą shRNA, która bazuje na sekwencji DNA, która następnie zostaje wprowadzona do wektora w standardowy sposób przy użyciu metod i środków znanych w tej dziedzinie (zobacz przykładowo Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 2002;296(5567):550-3; EP OK. siRNAs and shRNAs: Tools for protein knockdown by gene silencing https://www.labome.com/method/siRNAs-and-shRNAs-Tools-for-Protein-Knockdown-by-Gene-Silencing.html: Mater Methods; 2013).
PL 239 994 B1
Przykładowo, wprowadzenie sekwencji w postaci siRNA prowadzi do „jednorazowego”/krótkotrwałego wyciszenia ekspresji białka. Związane jest to z faktem, iż w przypadku użycia siRNA nie dochodzi do powielenia sekwencji w komórce. Użycie tej metody daje efekt krótkotrwałego wyciszenia ekspresji docelowego białka zależny od mechanizmów adaptacyjnych komórki.
Wprowadzenie sekwencji w postaci miRNA powoduje podobny efekt jak w przypadku użycia sekwencji w postaci siRNA. Różnicę stanowi fakt, że w przypadku miRNA wystarczająca jest zasadnicza komplementarność sekwencji wprowadzonej do sekwencji docelowej mRNA.
Wprowadzenie sekwencji w postaci shRNA powoduje stabilne, długotrwałe wyciszenie ekspresji białka docelowego. W przeciwieństwie do użycia siRNA lub miRNA, cząsteczki shRNA wprowadzone za pomocą wektora ulegają powieleniu powodując ciągłą ich obecność w komórce gospodarza bez ingerencji w genomową sekwencję DNA komórki czy organizmu. W związku ze stałą ich obecnością dochodzi do ciągłej degradacji transkryptu kodującego białko docelowe, co blokuje proces translacji, przez co nie powstaje produkt białkowy.
Wektor ekspresyjny według wynalazku może stanowić dowolny plazmid, sekwencja transpozonu lub wirus, korzystnie wybrany spośród lentiwirusów lub retrowirusów, które nadają się do wprowadzenia do komórki prokariotycznej lub eukariotycznej i ekspresji tak wprowadzonych sekwencji. Wektor z insertem (zaprojektowanym kwasem deoksynukleinowym według niniejszego wynalazku) wprowadza się do komórki, z wytworzeniem komórki gospodarza, gdzie sekwencja kwasu nukleinowego zostaje przepisana na RNA, czyli ulega transkrypcji do RNA, która ulega „złożeniu” wzajemnie komplementarnych łańcuchów w wyniku czego powstaje charakterystyczna struktura dwuniciowa nazywana „spinką do włosów” (ang. short harpin RNA, shRNA). Struktura ta pod wpływem enzymu DICER zostaje przekształcona w dwuniciową sekwencję, która zostaje rozdzielona na pojedyncze nici oligonukleotydowe, które następnie z kompleksem enzymatycznym RISC łączą się z komplementarnym fragmentem na nici mRNA, hamując translację białka będącego przedmiotem zainteresowania w komórce. W przypadku wprowadzenia sekwencji przy użyciu plazmidu dochodzi do stabilnego (długotrwałego) wyciszenia ekspresji docelowego białka, wynikającego z wielokrotnego powielania sekwencji w postaci DNA, która następnie przepisywana jest na sekwencję RNA mającą możliwość „łączenia się” z sekwencją mRNA kodującą docelowe białko.
Innym przykładowym sposobem uzyskania wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX z wykorzystaniem metody RNAi jest wprowadzenie sekwencji według wynalazku w postaci siRNA. Wprowadzanie sekwencji w postaci siRNA przeprowadzane jest w standardowy sposób przy użyciu metod i środków znanych w tej dziedzinie (zobacz przykładowo Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 2002; 296(5567):550-3; EP OK. siRNAs and shRNAs: Tools for protein knockdown by gene silencing https://www.labome.com/method/siRNAs-and-shRNAs-Tools-for-Protein-Knockdown-by-Gene-Silencing.html: Mater Methods; 2013). Prowadzi to do „jednorazowego” (krótkotrwałego) wyciszenia ekspresji białka. Związane jest to z faktem, iż w przypadku użycia siRNA nie dochodzi do powielenia sekwencji w komórce. Zastosowanie tej metody daje efekt krótkotrwałego wyciszenia ekspresji docelowego białka zależny od mechanizmów adaptacyjnych komórki. Użycie sekwencji w postaci siRNA pozwala na zbadanie znaczenia krótkotrwałego zaburzenia (wyciszenia) ekspresji danego białka oraz poznanie mechanizmów adaptacyjnych komórki w stosunku do tego zaburzenia.
Możliwe jest także wprowadzenie sekwencji do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX w postaci miRNA, co powoduje podobny efekt jak w przypadku zastosowania metody siRNA. Różnicę stanowi fakt, że w przypadku zastosowania miRNA wystarczająca jest zasadnicza komplementarność sekwencji wprowadzonej do sekwencji docelowej mRNA, przykładowo komplementarność na długości co najmniej 15 do 17 nukleotydów. Wprowadzanie sekwencji w postaci miRNA przeprowadzane jest w standardowy sposób przy użyciu metod i środków znanych w tej dziedzinie (zobacz przykładowo Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism and Function. Cell, 2004; 116:281-297; Khvorova A, Reynolds A, Jayasena SD. Functional siRNA and miRNAs Exhibit Strand Bias. Cell, 2003;115:209-216; Thompson DW, Bracken CP, Goodall GJ. Exprimental strategies for microRNA target identification. Nucleic Acids Res, 2011 ; 16:6845-6853; Zhao J, Liu Y. Virus-based MicroRNA Silencing, http://www.bio-protocol.org/el714; Li JF, Zhang D, Sheen J. Epitope-tagged protein-based artificial microRNA (ETPamir) screens for optimized gene silencing in plants. Nat Protoc. 2014;4:939-949).
PL 239 994 B1
Stosowane w niniejszym opisie pojęcia naukowe i techniczne mają zwykłe znaczenie stosowane w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek. Poniższe definicje dostarczone są celem ułatwienia czytelnikowi realizacji niniejszego wynalazku.
Stosowane tu określenie PRODH/POX odnosi się do białka, będącego enzymem, mianowicie dehydrogenazy prolinowej (PRODH) zwanej także oksydazą prolinową (POX). Może to być białko ssacze, zwłaszcza ludzkie, a także białko roślinne lub bakteryjne albo wirusowe. Sekwencje białek PRODH/POX w różnych organizmach są bardzo podobne. Ogólnie jest to enzym mitochondrialny zależny od nukleotydów flawinowych. Sekwencja tego enzymu jest znana i dostępna pod numerem dostępu GenBankTM NM_016335, przy czym jest to sekwencja ludzka. Sekwencje aminokwasowe białka PRODH/POX z innych gatunków, jak również kodujące je sekwencje kwasów nukleinowych, są znane i publicznie dostępne.
W kontekście niniejszego wynalazku terminy „wyciszanie ekspresji genu kodującego białko” lub w skrócie „wyciszanie ekspresji” w odniesieniu do genu kodującego białko PRODH/POX, odnosi się tutaj do przynajmniej częściowej i/lub całkowitej supresji ekspresji genu PRODH/POX, co przejawia się zmniejszeniem ilości transkrybowanego mRNA genu PRODH/POX i/lub degradacją takiego transkryptu poniżej poziomu obserwowanego w nieobecności kwasu nukleinowego według wynalazku. Prowadzi to w konsekwencji do co najmniej częściowego zablokowania powstawania białka PRODH/POX i co najmniej częściowej supresji aktywności tego białka PRODH/POX. W zależności od użytej metody wprowadzania oraz rodzaju wprowadzanych sekwencji do komórki gospodarza można uzyskać różny poziom wyciszenia ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX. Obliczyć poziom ten można z następującego wzoru:
% wyciszenia = (ekspresja PRODH/POX w komórkach kontrolnych) - (ekspresja PRODH/POX w komórkach badanych)/ (ekspresja PRODH/POX w komórkach kontrolnych).
Zasadniczo poziom wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX można określić w dowolnej komórce wykazującej ekspresję PRODH/POX, i z zastosowaniem dowolnej odpowiedniej metody wykrywania ekspresji genów. Przykładowe, nieograniczające, metody, które można wykorzystać do tego celu, podano w przykładach poniżej.
Dwuniciowy kwas nukleinowy w kontekście niniejszego wynalazku oznacza dwuniciowy kwas rybonukleinowy (dsRNA) lub dwuniciowy kwas deoksyrybonukleinowy (dsDNA).
Termin „dwuniciowy RNA”, dsRNA, w stosowanym tu znaczeniu odnosi się do kompleksu cząsteczek kwasu rybonukleinowego posiadających strukturę dupleksu zawierającą dwie antyrównoległe i zasadniczo komplementarne nici kwasu rybonukleinowego, zwane nicią sensowną i antysensowną. Dwie nici tworzące strukturę dupleksu mogą być różnymi częściami jednej większej cząsteczki RNA lub mogą być oddzielnymi cząsteczkami RNA. Oddzielne cząsteczki tworzące dsRNA określane są jako siRNA („krótki interferujący RNA”) lub miRNA (microRNA, mikro RNA). Jeżeli dwie nici są częścią jednej większej cząsteczki, a zatem jeżeli pomiędzy nimi występuje odcinek nukleotydów, zwany łącznikiem nukleotydowym, pomiędzy końcem 3’ jednej nici a końcem 5’ drugiej nici tworzącej strukturę dupleksu, to powstaje struktura RNA określana jako „struktura spinki do włosów z pętlą”, „RNA o strukturze spinki do włosów z pętlą” lub „shRNA”. Długość takiego łącznika nukleotydowego może być różna, przykładowo może mieć on długość, nieograniczająco, 5 do 15 nukleotydów, jak wiadomo w tej dziedzinie. Jego sekwencja może być także dowolna, pod warunkiem że pozwala na utworzenie struktury pętli. Nici dsRNA mogą mieć taką samą lub różną liczbę nukleotydów, ale minimalna długość wynosi 19 nukleotydów. Poza dupleksową strukturą, dsRNA może zawierać jeden lub więcej nawisów nukleotydowych, zwanych sekwencjami flankującymi, które mogą korzystnie stanowić miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne.
Termin „dwuniciowy kwas deoksynukleinowy”, dsDNA, w kontekście niniejszego wynalazku odnosi się cząsteczki kwasu deoksynukleinowego posiadającej strukturę dupleksu zawierającą dwie antyrównoległe i zasadniczo komplementarne nici kwasu nukleinowego, zwane nicią sensowną i antysensowną. Dwie nici tworzące strukturę dupleksu DNA mogą być różnymi częściami jednej większej cząsteczki DNA lub mogą być oddzielnymi cząsteczkami DNA. Jeżeli dwie nici są częścią jednej większej cząsteczki DNA, pomiędzy nimi występuje odcinek nukleotydów, zwany łącznikiem nukleotydowym, zlokalizowany pomiędzy końcem 3’ jednej nici a końcem 5’ drugiej nici tworzącej strukturę dupleksu. Długość takiego łącznika nukleotydowa może być różna, przykładowo może mieć on długość, nieograniczająco, 5 do 15 nukleotydów, jak wiadomo w tej dziedzinie. Jego sekwencja może być także dowolna, pod warunkiem że pozwala na utworzenie struktury pętli. Nici dsDNA mogą mieć taką samą lub różną liczbę nukleotydów, ale minimalna długość wynosi 19 nukleotydów. Poza dupleksową strukturą, dsDNA
PL 239 994 B1 może zawierać jeden lub więcej nawisów nukleotydowych, zwanych sekwencjami flankującymi, które mogą korzystnie stanowić miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne.
Jednoniciowy kwas nukleinowy w kontekście niniejszego wynalazku oznacza jednoniciowy kwas rybonukleinowy (ssRNA) lub jednoniciowy kwas deoksyrybonukleinowy (ssDNA).
Termin „jednoniciowy RNA” lub „ssRNA” w stosowanym tu znaczeniu odnosi się do pojedynczych cząsteczek kwasu rybonukleinowego posiadających strukturę pojedynczego fragmentu nici (strukturę linearną) zawierającej jedną nić sensowną lub jedną nić antysensowną, które są zasadniczo komplementarne do matrycy nici kwasu rybonukleinowego. Pojedyncze nici ssRNA mogą ewentualnie tworzyć strukturę dupleksu, na przykład w przypadku RNAi z zastosowaniem shRNA, albo mogą być różnymi częściami jednej większej cząsteczki RNA, albo mogą być oddzielnymi cząsteczkami RNA.
Termin „jednoniciowy kwas deoksynukleinowy”, ssDNA, w kontekście niniejszego wynalazku odnosi się do pojedynczych cząsteczek kwasu deoksynukleinowego posiadających strukturę pojedynczego fragmentu nici (strukturę linearną) zawierającą jedną nić sensowną lub jedną nić antysensowną, które są zasadniczo komplementarne do matrycy nici kwasu deoksyrybonukleinowego. Pojedyncze nici ssDNA mogą ewentualnie tworzyć strukturę dupleksu, na przykład w przypadku RNAi z zastosowaniem shRNA, albo mogą być różnymi częściami jednej większej cząsteczki DNA, albo mogą być oddzielnymi cząsteczkami DNA.
Termin „nić sensowna” w kontekście niniejszego wynalazku oznacza sekwencję nukleotydową (w orientacji 5’-3’) cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku wykazującą zasadniczą komplementarność do docelowej sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku.
Termin „nić antysensowną” oznacza sekwencję nukleotydową (w orientacji 3’-5’) kwasu nukleinowego według wynalazku wykazującą zasadniczą komplementarność do docelowej sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku.
Sekwencja docelowa kwasu nukleinowego w stosowanym tu znaczeniu odnosi się do co najmniej części sekwencji nukleotydowej cząsteczki mRNA utworzonej podczas transkrypcji genu PRODH/POX pochodzenia zwierzęcego, zwłaszcza pochodzenia ssaczego, zwłaszcza ludzkiego oraz pochodzenia roślinnego, która ma ulec wyciszeniu.
Przykładowo sekwencje mRNA wariantu transkryptu 1 i 2 genu PRODH człowieka przedstawiono odpowiednio na figurach 7 i 8.
W kontekście niniejszego wynalazku przez pojęcia „komplementarność” i „zasadnicza komplementarność” rozumie się, że sekwencja kwasu nukleinowego jest komplementarna w co najmniej 70% na części swojej długości do mRNA kodującego białko PRODH/POX, korzystnie w co najmniej 80%, korzystniej w co najmniej 90% lub nawet w 100%. Przykładowo zasadnicza komplementarność do uzyskania wyciszenia ekspresji genu kodującego białko PROH/POX zgodnie z niniejszym wynalazkiem wymaga komplementarności na długości co najmniej 15 do 17 nukleotydów korzystnie 15 do 19, nukleotydów. Dzięki temu można uzyskać efektywność wyciszenia sięgającą 50%. Sposoby oznaczania komplementarności, w tym odsetka komplementarności, są znane w tej dziedzinie.
Pojęcie wektor ekspresyjny w kontekście niniejszego wynalazku oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję kodującą co najmniej jeden kwas nukleinowy według wynalazku w sposób umożliwiający ekspresję po wprowadzeniu do komórki i/lub organizmu.
Sekwencje dsDNA i dsRNA zawierają w swojej sekwencji fragment nici odpowiednio DNA i RNA, który jest komplementarny do sekwencji DNA lub RNA kodującej białko PRODH/POX.
Przez komórkę gospodarza rozumie się w kontekście niniejszego wynalazku dowolną komórkę eukariotyczną, taką jak komórka roślinna, zwierzęca, zwłaszcza komórka ssacza, w szczególności komórka ludzka, albo komórkę prokariotyczną, taką jak komórka bakteryjna, zawierającą wprowadzoną co najmniej jedną sekwencję kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku lub co najmniej jeden wektor ekspresyjny według wynalazku. Komórki gospodarza zgodnie z niniejszym wynalazkiem można wytwarzać w dowolny sposób znany w tej dziedzinie.
Zaburzenie lub choroba związana z zaburzonym metabolizmem proliny w kontekście niniejszego wynalazku oznacza dowolną chorobę, stan lub zaburzenie, w których metabolizm proliny jest zaburzony czy też nieprawidłowy. Przykładowymi zaburzeniami i chorobami charakteryzującymi się zaburzonym metabolizmem proliny jest nowotwór, taki jak rak sutka, zespół Ehlersa-Danlosa (zaburzenie elastyczności skóry), zespół Marfana, wrodzona łamliwość kości (zwiększona skłonność do złamań kości), bądź objawy niedoboru prolidazy, takie jak zaburzenie gojenia ran, niedobory immunologiczne, owrzodzenia podudzi itp. Zawartość proliny w komórce jest wypadkową procesu degradacji białek zawierających
PL 239 994 B1 prolinę (głównie kolagenu) oraz procesów utylizacji tego aminokwasu. Prolina jest uwalniana z imidopeptydów poprzez enzym cytoplazmatyczny prolidazę. Wolna prolina może być wykorzystana w biosyntezie kolagenu lub ulec konwersji w mitochondriach do kwasu pirolidyno-5-karboksylowego. Zaburzenie tych procesów może prowadzić do zwłóknienia tkanek (nadmierna biosynteza kolagenu) lub osłabienia funkcji podporowych tkanek np. kości (niedostateczne biosynteza kolagenu). W przypadku niedostatków energetycznych prolina może zostać wykorzystana jako alternatywne źródło energii poprzez konwersję do kwasu piroIidyno-5-karboksylowego (P5C) w mitochondrium produkując ATP lub reaktywne formy tlenu (ROS). Produkcja ATP służy przeżyciu komórki w warunkach niedoboru energetycznego, natomiast generacja ROS indukuje proces programowanej śmierci komórki (apoptozy). Utylizacja proliny w mitochondriach z jednej strony zmniejsza dostępność tego aminokwasu do procesu biosyntezy kolagenu i wpływa na przebudowę zrębu łącznotkankowego, z drugiej strony przyczynia się do reorganizacji metabolizmu energetycznego komórki. Konsekwencją zaburzeń metabolizmu proliny może być zespół Ehlersa-Danlosa (zaburzenie elastyczności skóry), zespół Marfana, wrodzona łamliwość kości (zwiększona skłonność do złamań kości), bądź objawy niedoboru prolidazy takie jak: zaburzenie gojenia ran, niedobory immunologiczne, owrzodzenia podudzi tp. Zaburzenie ekspresji PRODH/POX może wpływać na powyższe zjawiska. Zmniejszenie ekspresji PRODH/POX może zatem ograniczać utylizację proliny w mitochondriach i zwiększać jej dostępność do procesu biosyntezy kolagenu. W komórkach nowotworowych obniżenie ekspresji PRODH/POX może indukować długotrwałą autofagię, która prowadzi do apoptozy, co skutkuje śmiercią komórek nowotworowych. Obniżenie ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX pozwala zatem na leczenie chorób charakteryzujących się zaburzonym metabolizmem proliny, w szczególności nowotworu, zwłaszcza raka sutka. Obniżenie ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX może zatem pozwalać na leczenie także innych chorób charakteryzujących się zaburzonym metabolizmem proliny, takich jak zespół Ehlersa-Danlosa, zespół Marfana czy wrodzona łamliwość kości.
Istotę wynalazku stanowią sekwencje kwasu nukleinowego, które powodują wyciszenie ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX w komórce, zwłaszcza w komórce eukariotycznej, takiej jak komórka prokariotyczna, taka jak komórka bakteryjna, albo komórka eukariotyczna, taka jak komórka zwierzęca, zwłaszcza komórka ssacza, w szczególności komórka ludzka. Sekwencje w zależności od użytej metody wprowadzenia do komórki łączą się z mRNA kodującym białko PRODH/POX blokując proces translacji, a w konsekwencji prowadząc do degradacji mRNA kodującego białko PRODH/POX. Rezultatem tego procesu jest brak lub zmniejszona ekspresja białka PRODH/POX.
Wyciszenie ekspresji PRODH/POX prowadzi do zaburzenia metabolizmu proliny poprzez blokadę degradacji proliny w mitochondrium w komórce powodując zaburzenie funkcjonowania komórki. Zaburzenia te wynikające z zaburzeń potencjału oksydoredukcyjnego w komórce, powodują skierowanie komórki na drogę autofagii, która w dłuższej perspektywie może prowadzić do apoptozy.
W zależności od użytej metody wprowadzenia sekwencji do komórki gospodarza można uzyskać różny poziom wyciszenia ekspresji białka PRODH/POX. Obliczyć to można ze wzoru:
% wyciszenia = (ekspresja PRODH/POX w komórkach kontrolnych) - (ekspresja PRODH/POX w komórkach badanych)/ (ekspresja PRODH/POX w komórkach kontrolnych)
Zgodnie z wynalazkiem można uzyskać efektywność wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX wynoszącą co najmniej 10%, zwłaszcza co najmniej 15%, zwłaszcza co najmniej 20%, zwłaszcza co najmniej 30%, zwłaszcza co najmniej 35%, zwłaszcza co najmniej 40%, zwłaszcza co najmniej 45%, zwłaszcza co najmniej 50%, zwłaszcza co najmniej 55% a nawet 100%.
W tabelach 1 i 2 poniżej zostały przedstawione sekwencje oligonukleotydowe do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX.
Dokładniej, w Tabeli 1 przedstawiono sekwencje oligonukleotydowe według wynalazku wyciszające ekspresję genu kodującego białko PRODH/POX bazujące na sekwencji DNA. Natomiast w Tabeli 2 przedstawiono sekwencje oligonukleotydowe wyciszające ekspresję genu kodującego białko PRODH/POX bazujące na sekwencji RNA.
PL 239 994 B1
Tabela 1. Sekwencje DNA do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX
Sekwencja docelowa PRODH PRODH tv.l 502-522 i PRODH rv. 2 87-107 PRODH tv. 1 1790-1810 i PRODH tv. 2 1374-1394 PRODH tv. 1 1837-1857 i PRODH tv. 2 1422-1442 Sekwencja docelowa PRODH PRODH tv.l 502-522 i PRODH tv. 2 87-107 PRODH tv. 1 1790-1810 i PRODH tv. 2 1374-1394 PRODH tv. 1 1837-1857 i PRODH tv. 2 1422-1442
Sekwencja 5' - 3' CTAGGACAGAGGCTATTCAAC GCATGTGTGACCAGATCAGCT GTGTACAAGTACGTGCCCTAT Sekwencja 3’ - 5’ GTTGAATAGCCTCTGTCCTAG AGCTGATCTGGTCACACATGC ATAGGGCACGTACTTGTACAC
Numer identyfikacyjny । sekwencji I 2 1 (według | wynalazku) i Numer identyfikacyjny sekwencji 5 (według wynalazku)
Nazwa PRODH DNA 2 PRODH DNA 1 PRODH DNA 3 Nazwa PRODH DNA 2 PRODH DNA 1 PRODH DNA 3
PL 239 994 B1
Tabela 2. Sekwencje RNA wyciszające ekspresję białka PRODH/POX bazujące na sekwencji RNA.
CM CM
3
en m
—— CM CM
o CM o CM
1 cn w-· 1 CC|
00 00
CM CM CM
CM £ CM £
ci Ł Ϊ Ł 5:
Ol Ϊ: S Q
9 o 9 O
0 0ζ as o CK a:
X a. cl X £ a. cl
Q O os OL es Ϊ 02-522 i 790-1810 837-1857 Q O OS Ł a S 02-522 i 790-1810 i 837-1857
O O
o u
8 8
**» *•«1 Ό
Ź £ cd £ > '-w
U c i 5: a i a: a:
o 9 o O U Ot 0) CJ
i o 0> O O 0) o
as OS a; 4> ft: os oe
<Λ a. a. a. a. a.
u P P P 0 0
0 0 <
< P P 0 P 0
u u < 0
P u 0 0 0 P
p 0 < P P 0
< 0 0 < 0
P P 0 P
P 0 0 < 0 0
u U P 0 P <
u 0 0 P
0 0 < 0 0
0 0 P 0 0 0
0 P < <
ίη u < P rA 0 P 0
Λ < u < «U P < 0
V 0 < Qk 0 0
5 0 P P Ł> P 0 0
0 0 s < P
P P ^3 0 P
(Λ 0 0 P 0 0 <
>»
α a
Ο Q C3 -X ę. ¢7 c ług ilazku) yfikacyj ćT c u ług ilazku)
Ε 3 Ζ ident ί u Έ § oo * r σ* E □ Z idem £ u o 11 (wed wyna CM
ϊ: 3: ~ 3:
Cd £ δ 2 o i § < 0) < C3 s ® i OD. A 1 o> <
ed as Z o* Z as Z 3 as Z as z os Z
ζ a. o: a. os a. os Z a. cc a. ca a. as
PL 239 994 B1
Przedmiotem wynalazku może także być wektor ekspresyjny do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODDH/POX. Taki wektor zawiera wprowadzone sekwencje kwasu nukleinowego według wynalazku. Takim wektorem może być korzystnie dowolny plazmid, w szczególności pozwalający na ekspresję co najmniej jednej wprowadzonej sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku. Wektor ekspresyjny według wynalazku może zawierać elementy kontroli ekspresji połączone w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami kwasu nukleinowego według wynalazku w celu umożliwienia wydajnej ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku po wrowadzeniu do komórki, takie jak promotor, sygnały inicjacji i terminacji translacji. Wektorem według wynalazku korzystnie może być także transpozon lub wirus, taki jak lentiwirus lub retrowirus. Takie wektory wytwarza się sposobami znanymi w tej dziedzinie, a powstałe w rezultacie klony można wprowadzać do odpowiednich komórek z wytworzeniem komórek gospodarza, w standardowy sposób, taki jak lipofekcja, elektroporacja, szok termiczny czy metody chemiczne.
Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza zawierająca taki wektor ekspresyjny. Komórką gospodarza może być komórka prokariotyczna, taka jak komórka bakteryjna, ale także komórka eukariotyczna, taka jak komórka zwierzęca, a zwłaszcza komórka ssacza, w szczególności komórka ludzka. Takie komórki gospodarza mogą być wytwarzane w standardowy sposób znany w tej dziedzinie, przy użyciu komercyjne dostępnych środków i warunków zalecanych przez ich producentów.
Przedmiotem wynalazku jest także klon komórkowy z wyciszoną ekspresją genu kodującego białko PRODH/POX zawierający kwas nukleinowy według wynalazku lub wektor według wynalazku. Klon komórkowy według wynalazku wytwarza się w standardowy sposób znany w tej dziedzinie z zastosowaniem kwasu nukleinowego lub wektora według wynalazku, dzięki czemu wytworzony klon wykazuje wyciszoną ekspresję genu kodującego białko PRODH/POX. Przykładowo klon komórkowy można wytwarzać zgodnie z niniejszym wynalazkiem poprzez transfekcję odpowiedniej komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym według wynalazku lub też z zastosowaniem innych metod wprowadzania kwasów nukleinowych do komórki, na przykład z zastosowaniem strzelby genowej, jak jest to znane w tej dziedzinie. Klon komórkowy według wynalazku stanowi korzystnie klon komórek raka sutka MCF-7 zawierający wektor według wynalazku, korzystnie w postaci plazmidu, jak opisano poniżej.
Ujawniono tu również, że dwuniciowe kwasy nukleinowe według niniejszego wynalazku mogą być stosowane do wytwarzania organizmu transgenicznego innego niż człowiek z wyciszoną ekspresją genu kodującego białko PRODH/POX, takiego jak transgeniczne zwierzę inne niż człowiek. Takie organizmy transgeniczne można wytwarzać w sposób znany w tej dziedzinie, na przykład poprzez transfekcję. Wytworzony w taki sposób organizm transgeniczny z wyciszoną ekspresją genu kodującego białko PRODH/POX, taki jak zwierzę transgeniczne inne niż człowiek, może zawierać co najmniej jedną komórkę zawierającą co najmniej jeden kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku albo wektor według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna jak opisano powyżej, która może być stosowana do celów terapeutycznych i/lub profilaktycznych w zaburzeniach lub chorobach charakteryzujących się zaburzonym metabolizmem proliny jak opisano powyżej. Takie kompozycje farmaceutyczne wytwarza się standardowymi sposobami znanymi specjalistom. Kompozycja według wynalazku zawiera dopuszczalny farmaceutycznie nośnik lub rozcieńczalnik. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem zastosować można dowolne dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i rozcieńczalniki, czyli substancje odpowiednie do zastosowań farmaceutycznych, jak wiadomo w tej dziedzinie. Odpowiednie do zastosowania w kompozycjach farmaceutycznych nośniki i rozcieńczalniki są znane. Kompozycję według wynalazku można podawać dowolną drogą podawania, przykładowo dojelitowo, jak na przykład doustnie, albo pozajelitowo, jak na przykład we wstrzyknięciu dożylnym, domięśniowym, podskórnym itp. Można ją także podawać miejscowo, w sposób ukierunkowany.
Zastosowanie przemysłowe
Zaprojektowane i wytworzone przez twórców niniejszego wynalazku sekwencje kwasu nukleinowego o podwójnej nici wyciszają ekspresję białka PRODH/POX na drodze po-transkrypcyjnego wyciszania ekspresji genu kodującego PRODH/POX, w szczególności poprzez wykorzystanie zjawiska interferencji RNA (RNAi), w szczególności poprzez indukowanie degradacji mRNA lub blokowaniu jego translacji przez krótkie, niekodujące cząsteczki RNA, takie jak shRNA, siRNa i mikroRNA. Pozwala to na zastosowanie rozwiązań według wynalazku do modulowania, a w szczególności wyciszania ekspresji białka PRODH/POX i w konsekwencji modyfikacji metabolizmu proliny w komórce jak przedstawiono na Fig. 3, 4 i 6.
PL 239 994 B1
Zaprojektowane i wytworzone przez twórców niniejszego wynalazku sekwencje kwasu nukleinowego mogą służyć do modyfikacji istniejących już linii komórkowych, tworzenia nowych linii komórkowych lub organizmów transgenicznych, takich jak na przykład nowego klonu komórek MCF-7 z wyciszoną ekspresją PRODH/POX, jak przedstawiono na Fig. 3 i 6.
Ponadto zaprojektowane i wytworzone przez twórców niniejszego wynalazku sekwencje kwasu nukleinowego mogą być stosowane do badania ekspresji białka PRODH/POX jako sekwencje startowe (primery) w reakcjach PCR i ich modyfikacjach (m.in. RT-PCR, RT-QPCR) oraz do tworzenia mikromacierzy identyfikujących ekspresję transkryptu kodującego białko PRODH/POX. Rozwiązania według wynalazku mogą być stosowane do badania regulacji metabolizmu komórkowego, tworzenia testów diagnostycznych, oceny stopnia złośliwości nowotworu i związanego z tym prognostycznego czasu przeżycia, a także poprzez modyfikację regulacji ekspresji białka mogą być stosowane jako jedna ze składowych w terapii, zwłaszcza w terapii przeciwnowotworowej, lub terapii innych chorób charakteryzujących się zaburzonym metabolizmem proliny.
Sekwencje docelowe pokazujące miejsce przyczepu starterów (primerów) do sekwencji mRNA kodującego białko PRODH/POX z wyróżnieniem wariantu transkryptu 1 (tv.1) i wariantu transkryptu 2 (tv.2) przedstawiono w powyższej Tabeli 1.
W poniższej Tabeli 3 pokazano sekwencje DNA, które mogą zostać użyte do analizy ekspresji białka PRODH/POX jako startery (sekwencje startowe, primery) w reakcjach PCR i ich modyfikacjach, takich jak między innymi RT-PCR, RT-QPCR lub do namnożenia danego fragmentu genu kodującego białko PRODH/POX.
Rozwiązania według niniejszego wynalazku pozwalają na uzyskanie wyciszenia ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX. Niniejszy wynalazek może być zatem stosowany do wyciszania ekspresji i regulacji białka PRODH/POX oraz metabolizmu proliny (Fig. 3, 4 i 6) poprzez użycie między innymi metod bazujących na RNAi, zwłaszcza shRNA, siRNA lub mikroRNA. Zgodnie z wynalazkiem możliwe jest wykorzystanie zarówno kwasów nukleinowych deoksynukleinowych, jak i rybonukleinowych.
PL 239 994 B1 «'ΰ1
Tabela 3. Sekwencje DNA do analizy ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX: Sekwencje te pozwalają na powstanie określonej §
ę o a N 8.
2.
•o i
N o ea o o
&
o ε ε ea S*
Ś o CL g
PL 239 994 Β1
Numer identyfikacyjny sekwencji Numer identyfikacyjny sekwencji 5 (według wynalazku) 1309 nukleotydów ctaggacagaggctattcaacaagctcatgaagatgaccttctatgggcattttgtagccggggaggaccaggagtcc atccagcccctgcttcggcactacagggccttcggtgtcagcgccatcctggactatggagtggaggaggacctgagc cccgaggaggcagagcacaaggagatggagtcctgcacctcagctgcggagagggatggcagtggcacgaataagcgg gacaagcaataccaggcccaccgggccttcggggaccgcaggaatggtgtcatcagtgcccgcacctacttctacgcc aaigaggccaagtgcgacagccacatggagacattcttgcgctgcatcgaagcctcaggtagagtcagcgatgacggc ttcatagccattaagctcacagcactggggagaccccagtttctgctgcagttctcagaggtgctggccaagtggagg tgcttctttcaccaaatggctgtggagcaagggcaggcgggcctggctgccatggacaccaagctggaggtggcggtg ctgcaggaaagtgtcgcaaagttgggcalcgcatccagggctgagattgaggactggttcacggcagagaccctggga gtgtctggcaccatggacctgctggactggagcagcctcatcgacagcaggaccaagctgtccaagcacttggtagtc cccaacgcacagacaggacagctggagcccctgctgtcccggttcactgaggaggaggagctacagatgaccaggatg ctacagcggatggatgtcctggccaagaaagccacagagatgggcgtgcggctgatggtggatgccgagcagacctac ttccagccggccatcagccgcctgacgciggagatgcagcggaagttcaaigtggagaagccgctcatcitcaacaca taccagtgctacctcaaggatgcctatgacaatgtgaccctggacgtggagctggctcgccgtgagggctggtgtttt ggggccaagctggtgcggggcgcatacctggcccaggagcgagcccgtgcggcagagatcggctatgaggaccccatc aaccccacgtacgaggccaccaacgccatgtaccacaggtgcctggactacgtgttggaggagctgaagcacaacgcc aaggccaaggtgatggtggcctcccacaatgaggacacagtgcgctttgcactgcgcaggatggaggagctgggcclg catcctgctgaccaccaggtgtactttggacagctgctaggcatgtgtgaccagatcagct (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 14) Numer identyfikacyjny sekwencji
Długość transkryptu
Sekwencja 5’ - 3’ CTAGGACAGAGGCTATTCAAC Sekwencja 3' -5' AGCTGATCTGGTCACACATGC Wariant 2 Sekwencja 5’ -3' CTAGGACAGAGGCTATTCAAC
PL 239 994 Β1
Numer identyfikacyjny sekwencji Długość tran skryptu 1336 nukleotydów ctaggacagaggctattcaacaagctcatgaagatgaccttctatgggcattttgtagccggggaggaccaggagtcc atccagcccctgcttcggcactacagggccttcggtgtcagcgccalcctggactatggagtggaggaggacctgagc cccgaggaggcagagcacaaggagatggagtcctgcacctcagctgcggagagggatggcagtggcacgaataagcgg ; gacaagcaataccaggcccaccgggccttcggggaccgcaggaatggigtcatcagtgcccgcacctacttctacgcc aat gaggccaagtgcgacagccacatggagac attcttgcgctgcatcgaagcctcaggtagagtcagcgatgac ggc ttcatagccattaagctcacagcactggggagaccccagtttctgctgcagttctcagaggtgctggccaagtggagg tgcttctttcaccaaatggctgtggagcaagggcaggcgggcctggctgccatggacaccaagctggaggtggcggtg ctgcaggaaagtgtcgcaaagttgggcatcgcatccagggctgagattgaggactggttcacggcagagaccctggga gtgtctggcaccatggacctgctggactggagcagcctcatcgacagcaggaccaagctgtccaagcacttggtagtc cccaacgcacagacaggacagctggagcccctgctgtcccggttcactgaggaggaggagctacagatgaccaggatg ctacagcggatggatgtcctggccaagaaagccacagagatgggcgtgcggctgatggtggatgccgagcagacctac ttccagccggccatcagccgcctgacgctggagatgcagcggaagttcaatgtggagaagccgctcatcttcaacaca taccagtgctacctcaaggatgcctatgacaatgtgaccctggacgtggagctggctcgccgtgagggctggtgtttt ggggccaagctggtgcggggcgcatacctggcccaggagcgagcccgtgcggcagagatcggctatgaggaccccatc aaccccacgtacgaggccaccaacgccatgtaccacaggtgcctggactacgtgttggaggagctgaagcacaacgcc aaggccaaggtgatggtggcctcccacaatgaggacacagtgcgctttgcactgcgcaggatggaggagctgggcctg catcctgctgaccaccaggtgtactttggacagctgctaggcatgtgtgaccagatcagct (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 15) Numer identyfikacyjny sekwencji Numer identyfikacyjny sekwencji
Sekwencja 3’ - 5’ ATAGGGCACGTACTTGTACAC Wariant 1 _____i Sekwencja 5’ - 3’ CTAGGACAGAGGCTATTCAAC Sekwencja 3’ - 5’ ATAGGGCACGTACTTGTACAC
TT
PL 239 994 Β1
30
Cl d ©D W) «9 L>
Pi d 3 S>
OD O cs
OD
CO co CO es
OD <3 W OD Q
W) S ϋ 60 aa
GD
00 ca oo co — 00 Pi “ OD
CO CS cb 00 co
BO 00 óo
S) oo d — oo 3
5D Sd m Pi ?? S>
CS O 00 cl
6D
M) C3 CdD £3
C3
60
00 o 60 «
00 cs 60 00 oo d OD Λ W) ΰΰ O 30 s> oh
OD OD
Kb co eS
CO Cl CD
OD co co 60
U OD o d ou y
GD eo
C3
OD co
CD cc
CD cl cS eS OD d DO Cl U 00 OD O cl cs a CD es d
CO
00 ¢5 Pi
OD OD CS
N) OD
OD OD
C3 00 <3 bO s
¢3 ©O 00 C3 Q 3» d 00 a 50 a W) <3 ¢3
OD ϋ
U 00 d y co y od es 00 60 60 60 ć3
00
CS
CS <s
OD 60
50 Cl 00 <0 o <1 00 60 cs
OD
OD
BO cl oo oo d d o d O 00 d 00 d Q OO 00 d 60 OD d 00
OD OD d d 60
Ή L> π
OD
OD 00
6D S
CD 8
DO 1=
CS
OD ca cl es Cl o 60 «3
L>
d
OD
CD d 00 CO OD 00
OD cl o OD
Cl o
DO cS O co cl u Cl es Cl οχ, d ” pi 60 -* d
OD OD
OD
CS
C3 «3 «3 bO 30
OD es có S> co es 60
6D 00 d aó 60 op cb
OD d 8 d 60 Cl o d
OD cl OD OD eS 6D OD CS d OD
OD OD
OD
OD CS OD OD
OD
OD OD
OD
OD
U 50 es u es cd dd
OD ci El
CJ cl 60 oo pi d pi o
CD
CS CS co d co co co w 2 00 «
00
BO 00 00
Śo
OD OD d 2P 3 cl u CS u 00 d es 00
OD OD 60 o OD 60 Cl
OD u OD -50 d
CS 00 d
CD CS CO CD CS CD
00 d
60 60 S tg y. 60 —' eO pi d d 00 d U d u υ d d d 6D d d u u
00
Cl cs 60 60
O Cl 00 00 p d d 00 2? ób d Pr 60 d
CO cl op a cl 60 CD cl 60 oo d OD OD cl U 6D O 00
00 oo
CS
CS 60 Cl
X BO ί& 6o y Pi 60 « υ o δ Sb y co OD to CD d u d cs OD OD es
Cl
60 pi oó op d o 00 00
OD ao 5 t 1 . .
S -do eb ^o ~ “ 1
CS & a o a
CS d d pp o o y u 50 00 £ a
CO d a 00 00 o 60
CO
CS aó es
CS o 00 υ CS d
2? oo 00
00 ci
O d
CS eS
OD
OD
S op 60 oo d d cl pi cb oo
Cl 00 pp eo ao Cl CS <J d cb υ N ω E
60
OD
CS Cl
00 ύ d 60 O 60 ω S U υ
Niniejszy wynalazek zostanie poniżej zilustrowany za pomocą przykładów wykonania i figur, które nie mają jednak w jakikolwiek sposób ograniczać zakresu ochrony wynalazku jak zdefiniowano w zastrzeżeniach patentowych.
Krótki opis figur
Fig. 1 przedstawia schemat cyklu prolinowego w komórce: Pro - prolina; PRODH/POX - oksydaza prolinowa/dehydrogenaza prolinowa; P5C - kwas A1-pirolino-5-karboksylowy; ROS - reaktywne formy tlenu; ATP - adenozyno-5’-trifosforan; Glu - glutamina; α-KG - a-ketoglutaran; p53 - białko p53; X - przykładowy aminokwas, np. glicyna; HIF-1 a - czynnik indukowany hipoksją 1.
Fig. 2 przedstawia schemat drogi utylizacji proliny w komórce. Pro - prolina; PRODH/POX - oksydaza prolinowa/dehydrogenaza prolinowa; shRNA PRODH/POX - sekwencja wyciszająca PRODH/POX wprowadzona z zastosowaniem RNAi opartej na shRNA; P5C - kwas A1-pirolino-5-karboksylowy; ROS - reaktywne formy tlenu; ATP - adenozyno-5’-trifosforan; GlyPro - glicylo-prolina; AMPK - kinaza białkowa aktywowana przez AMP; AKT-kinaza aktynowa; mTOR-kinaza mTOR; HIF-1 a-czynnik indukowany hipoksją 1; VEGF - czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego; TNF - czynnik martwicy nowotworu; IL-1 - interleukina 1; COX-2 - cyklooksygenaza 2; NF-κΒ - czynnik transkrypcyjny.
PL 239 994 B1
Fig. 3 przedstawia wpływ wyciszenia ekspresji PRODH/POX i dodatku glicylo-proliny (GlyPro) na przeżywalność (A), biosyntezę DNA (B), biosyntezę kolagenu (C), aktywność prolidazy (D) oraz na stężenie wewnątrzkomórkowej proliny (E) w komórkach raka sutka (MCF-7) oraz komórkach z wyciszoną ekspresją pRoDH/POX (MCF-7shPRODH/POX).
Fig. 4 przedstawia ekspresję β-aktyny, PRODH/POX, białka p53, kaspazy-3 i -9 (forma totalna i aktywna), białka PARP (forma totalna i aktywna), białka PUMA, iNOS, NF-kB, HIF-1a, mTOR, COX-2, AMPK-α i -β, Atg5, Atg7 oraz beklin-1 w komórkach raka sutka (MCF-7) oraz komórkach z wyciszoną ekspresją POX (MCF-7shPRODH/POX).
Fig. 5 Uproszczony schemat działania shRNA, siRNA oraz mikroRNA. mRNA - matrycowy RNA; DICER - białko DICER; RISC - kompleks białkowy o aktywności endorybonukleazy; siRNA - krótkie interferujące RNA; shRNA - (short harpin RNA) RNA w formie spinki do włosów; miRNA - mikroRNA.
Fig. 5 przedstawia uproszczony schemat działania shRNA, siRNA oraz microRNA. mRNA - matrycowy RNA; DICER - białko DICER; RISC - kompleks białkowy o aktywności endorybonukleazy; siRNA krótkie interferujące RNA; shRNA - (shortharpin RNA) RNA w formie spinki do włosów; miRNA - mikroRNA.
Fig. 6 przedstawia ekspresję białka PRODH/POX w komórkach MCF-7 i MCF-7shPRODH/POX badaną metodą Western blot. Komórki MCF-7 to komórki kontrolne, a komórki MCF-7shPRODH/POX to komórki transfekowane sekwencjami shRNA PRODH/POX według wynalazku (klony 1-3). Klon 1 MCF-7shPODH/POX zawiera sekwencję o numerze identyfikacyjnym 2 i sekwencję o numerze identyfikacyjnym 5 (według wynalazku). Opisany tu klon 2 MCF-7shPRODH/POX zawiera sekwencję o numerze identyfikacyjnym 1 i sekwencję o numerze identyfikacyjnym 4. Opisany tu klon 3 MCF-7shPRODH/POX zawiera sekwencję o numerze identyfikacyjnym 3 i sekwencję o numerze identyfikacyjnym 6. Podane powyżej prążków wartości reprezentują stopień obniżenia ekspresji genu kodującego PRODH/POX w odniesieniu do kontroli. Homogenat komórkowy fibroblastów (FIBRO) użyty został jako kontrola ujemna, zaś homogenat komórkowy komórek raka okrężnicy DLD-1 jako kontrola dodatnia.
Fig. 7 przedstawia sekwencję mRNA wariantu 1 transkryptu dehydrogenazy prolinowej 1 (PRODH) u gatunku Homo sapiens w formie cDNA (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 17). Na przedstawionej sekwencji oznaczona została sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2 i sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3. Poszczególne nukleotydy są w kolumnach 10-znakowych. Objaśnienia: 1) sekwencja o lokalizacji 502 do 522 (tctaggacag aggctattca ac) to sekwencja o numerze identyfikacyjnym numer 1; 2) sekwencja o lokalizacji 1790 do 1810 (g catgtgtgac cagatcagct) to sekwencja o numerze identyfikacyjnym numer 2; 3) sekwencja o lokalizacji 1837 do 1857 (gtgt acaagtacgt gccctat) to sekwencja o numerze identyfikacyjnym numer 3.
Fig. 8 przedstawia sekwencję mRNA wariantu 2 transkryptu dehydrogenazy prolinowej 1 (PRODH) u gatunku Homo sapiens (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 18) w formie cDNA. Na przedstawionej sekwencji oznaczona została sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2 i sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3. Poszczególne nukleotydy są w kolumnach 10-znakowych. Objaśnienia: 1) sekwencja o lokalizacji 87 do 107 (ctag gacagaggct attcaac) to sekwencja o numerze identyfikacyjnym numer 1; 2) sekwencja o lokalizacji 1374 do 1394 (gcatgt gtgaccagat cagct) to sekwencja o numerze identyfikacyjnym numer 2; 3) sekwencja o lokalizacji 1422 do 1442 (gtgtacaag tacgtgccct at) to sekwencja o numerze identyfikacyjnym numer 3.
Niniejszy wynalazek zostanie teraz zilustrowany w poniższych przykładach, które jednak nie mają na celu ograniczenie w żaden sposób zakresu wynalazku zdefiniowanego w zastrzeżeniach patentowych. O ile nie wskazano inaczej wszelkie metody, odczynniki i parametry są takie jakie powszechnie stosuje się w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek i jakie są zalecane przez ich wytwórców.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1
Zaprojektowanie i wytworzenie sekwencji shRNA • wybranie odpowiedniego fragmentu genu
Analizę sekwencji nukleotydowej mRNA genu kodującego białko PRODH/POX, przeprowadzono na podstawie sekwencji dostępnej w bazie NCBI (National Center of Biotechnology Information) dotyczącej kompletnej sekwencji PrOdH 1 (GenBank: AF120278.1; data dostępu: 15.05.2014), wariant transkrypcyjny 1 (tv1) (NCBI Reference Sequence: NM_016335.4; data dostępu: 15.05.2014) i wariant transkrypcyjny 2 (tv2) (NCBI Reference Sequence: NM_001195226.1; data dostępu: 15.05.2014). Na tej podstawie wytypowano potencjalne miejsca „przyczepu” sekwencji wyciszającej. Zaprojektowane sekwencje przedstawia Tabela 1 i 2.
• zaprojektowanie struktury sekwencji shRNA dla genu kodującego PRODH/POX
PL 239 994 Β1
Sekwencje zostały zaprojektowane przy użyciu programu AsiDesigner online tool (http://sysbio.kribb.re.kr:8080/AsiDesiqner/menuDesiqner.isf), następnie sekwencje DNA zostały zsyntetyzowane przez firmę Genomed (Genomed S. A., Warszawa). Sekwencje oczyszczane były przy użyciu HPLC.
W Tabeli 4 i 5 zostały przedstawione sekwencje oligonukleotydowe do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX według wynalazku oparte odpowiednio na sekwencjach DNA i RNA. W poniższych tabelach łącznik nukleotydowy pomiędzy sekwencjami według wynalazku został oznaczony jako yyy, natomiast sekwencje flankujące sekwencje według wynalazki zostały oznaczone jako xxx. Zarówno sekwencja łącznika (yyy), jak i sekwencje flankujące (xxx) mogą być dowolne.
S o
Q O £ X o &
c u £ X u co
C3 £
Sekwencja docelowa PRODHI PRODH tv. 1 502-522 PRODH tv. 2 87-107 PRODH tv. / 1790-1810 PRODH tv. 2 1374-1394 PRODH tv. / 1837-1857 PRODH tv. 2 1422-1442
Sekwencja (5'- 3’) xxxCTAGGACAGAGGCTATTCAAC yyy GTTGAATAGCCTCTGTCCTAGxxx xxxCTAGGACAGAGGCTATTCAAC yyy GTTGAATAGCCTCTGTCCTAGxxx xxxGCATGTGTGACCAGATCAGCT yyy AGCTGATCTGGTCACACATGCxxx xxxGCATGTGTGACCAGATCAGCT yyy AGCTGATCTGGTCACACATGCxxx xxxGTGTACAAGTACGTGCCCTAT yyy AT AGGGCACGTACTTGTACACxxx xxxGTGTACAAGTACGTGCCCTAT yyy AT AGGGCACGTACTTGTACACxxx
lL ii £ a tŁ Di
Nazwa PRODH DNA 2 PRODH DNA 1 PRODH DNA 3
cć ta e c
PL 239 994 Β1
Przykład 2
Wytworzenie wektora plazmidowego do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i prokariotycznej komórki gospodarza z wyciszoną ekspresją genu kodującego białko PRODH/POX zawierającej taki wektor plazmidowy
Przygotowanie wektora plazmidowego • Namnożenie wektora
PL 239 994 B1
Do badań wykorzystano wektor plazmidowy pSuper.puro w formie kolistej (OligoEngine, Seattle, WA, USA; VEC-PBS-0008) z umieszczonym genem oporności na ampicylinę i puromycynę. Wektor został wprowadzony do bakterii E. coli NEB 10-beta (Bio Labs, Ipswich, United Kingdom) metodą szoku cieplnego (heat-shock) w standardowy sposób. Następnie zawiesina komórek została posiana w standardowy sposób na płytkę z pożywką bakteryjną (pożywka LB z dodatkiem agaru) zawierającą antybiotyk selekcyjny (ampicylina). Komórki pozostawiono w inkubatorze przez 24 h w standardowych warunkach (temperatura 37°C z pełną wilgotnością, 5% CO2). Po tym czasie, z kolonii bakteryjnych założono hodowlę płynną (pożywka LB) zawierającą antybiotyk selekcyjny (ampicylina) i inkubowano przez 24 godziny w standardowy sposób.
• Wykonanie miniprepu i sprawdzenie jakościowe DNA plazmidowego
Z założonych hodowli płynnych wyizolowano DNA plazmidowy za pomocą NucleoSpin® Plasmid (Macherey-Nagel, Duren, Germany). Wyizolowany DNA plazmidowy został zmierzony za pomocą urządzenia NanoDrop i następnie poddany rozdziałowi elektroforetycznemu w żelu agarozowym w standardowy sposób.
• Przecięcie wektora i izolacja z żelu agarozowego
Plazmidowy DNA został poddany działaniu enzymów restrykcyjnych Bglll i HINDIII w standardowy sposób zgodnie z zaleceniami producenta stosowanego zestawu (Promega, Medison, USA). Linearyzacja plazmidu została sprawdzona za pomocą rozdziału elektroforetycznego. Plazmid w postaci liniowej został wycięty z żelu i następnie oczyszczony za pomocą komercyjnie dostępnego zestawu oczyszczającego w standardowy sposób.
Wprowadzenie insertu do wektora plazmidowego i wytworzenie prokariotycznej komórki gospodarza z wyciszoną ekspresją genu kodującego białko PRODH/POX zawierającej wektor plazmidowy według wynalazku
W pierwszym etapie poszczególne pary sekwencji shRNA zostały poddane hybrydyzacji do matrycy (annealing) w standardowy sposób. Mieszanina shRNA i wektora została poddana następnie procesowi ligacji w standardowy sposób zgodnie z zaleceniami producenta stosowanego zestawu. Wektor z insertem został wprowadzony do bakterii E.coli NEB 10-beta metodą szoku cieplnego w standardowy sposób. Transformowane bakterie zostały wysiane na selekcyjne podłoża bakteryjne (pożywka LB z dodatkiem agaru i ampicyliny) w standardowy sposób. Po 24-godzinnej inkubacji w standardowych warunkach klony dodatnie, będące komórkami gospodarza z wyciszoną ekspresją genu kodującego białko PRODH/POX, zostały poddane weryfikacji metodą PCR poprzez cięcie enzymami restrykcyjnymi (Bglll i HINDIII) i rozdział elektroforetyczny w żelu agarozowym w standardowy sposób znany w tej dziedzinie. Po uzyskaniu dodatnich wyników wykonana była powtórna transformacja bakteryjna potwierdzonym we wcześniejszym etapie konstruktem DNA jak opisano wcześniej. Po powtórnej dodatniej weryfikacji klonów bakteryjnych izolowano plazmidowy DNA, który następnie stosowano do transfekcji komórek MCF-7. Uzyskane wyniki potwierdzają, że dzięki zastosowaniu wektora według wynalazku uzyskano prokariotyczne komórki gospodarza z wyciszoną ekspresją genu kodującego białko PRODH/POX.
P r z y k ł a d 3
Wytworzenie eukariotycznego klonu komórkowego z wyciszoną ekspresją genu kodującego białko PRODH/POX zawierającego wektor plazmidowy według wynalazku
Transfekcja komórek eukariotycznych • Weryfikacja komórek pod kątem oporności na antybiotyk
Komórki raka sutka MCF-7 (HTB-22; ATCC, Manassas, VA, USA) poddano wstępnej selekcji z puromycyną (antybiotyk selekcyjny) przez okres 2 tygodni w celu ustalenia dawki bójczej antybiotyku dla tych komórek w standardowy sposób.
• Przygotowanie komórek
Komórki MCF-7 hodowane były w standardowych warunkach (temperatura 37°C z pełną wilgotnością, 5% CO2) w pożywce suplementowanej zgodnie z zaleceniami producenta.
• Transfekcja komórek wektorem plazmidowym
Komórki MCF-7 transfekowano wektorami plazmidowymi zawierającymi zaprojektowaną sekwencję przy użyciu Lipofectaminy w pożywce hodowlanej OPTI-DMEM (Gibco, Thermo Scientific Fischer) w standardowy sposób. Po 24-godzinnej inkubacji pożywkę transfekcyjną usunięto, komórki hodowano w pożywce zalecanej przez dostawcę komórek MCF-7 oraz antybiotykiem selekcyjnym puromycyną, o stężeniu końcowym 1 μg/ml. Komórki poddane były 14-dniowej selekcji z antybiotykiem puromycyną w standardowy sposób. Po okresie selekcji uzyskane klony poddane były weryfikacji
PL 239 994 B1 w standardowy sposób. W uzyskanym ekstrakcie białkowym oznaczono ekspresje białka PRODH/POX metodą Western Blot (Fig. 6) i efektywność wyciszania genu kodującego białko PRODH/POX poprzez pomiar densytometryczny. Ekspresję białka PRODH/POX uzyskano poprzez zastosowanie przeciwciała koziego anty-PRODH/POX (Everest Biotech, Upper Heylord, UK). Pomiar densytometryczny wykonano przy użyciu programu ImageJ. Wytworzono trzy klony komórkowe: klon 1 MCF-7shPRODH/POX zawierający sekwencję o numerze identyfikacyjnym 2 i sekwencję o numerze identyfikacyjnym 5 (według wynalazku); klon drugi MCF-7shPRODH/POX zawierający sekwencje o numerze identyfikacyjnym 1 i sekwencję o numerze identyfikacyjnym 4 oraz klon 3 MCF-7shPRODH/POX zawierający sekwencję o numerze identyfikacyjnym 3 i sekwencję o numerze identyfikacyjnym 6. Jak widać na big, 6. ekspresja białka PRODH/POX w komórkach MCF-7 i MCF-7 z wyciszoną ekspresją genu kodującego białko PROD/POX poprzez transfekcję sekwencjami shRNA PRODH/POX według wynalazku (MCF-7shPRODH/POX) (klony komórkowe 1 do 3) jest wyraźnie inna, Mianowicie, ekspresja białka PRODH/POX była zahamowana w przypadku klonu w komórkowych MCF-7 transfekowanych sekwencjami shRNA PRODH/POX według wynalazku (klony 1 do 3 na Fig. 6). Wyraźnie widoczna jest różnica w intensywności prążków dla klonów komórkowych 1 do 3 (Ścieżki 2 do 4) w porównaniu z kontrola dodatnią (homogenat komórek raka okrężnicy DLD-1) (Ścieżka 6) i natywnych (kontrolnych) komórkach MCF-7 (Ścieżka 1). Różnica ta świadczy o efektywności wyciszania ekspresji genu kodującego PRODH/POX. Efektywność wyciszania ekspresji uzyskana z zastosowaniem klonu 1 wyniosła 39,49%. Efektywność wyciszania ekspresji uzyskana z zastosowaniem klonu 1 wyniosła 49,57%. Efektywność wyciszania ekspresji uzyskana z zastosowaniem klonu 3 wyniosła 13,42%. Uzyskane wyniki świadczą o uzyskaniu klonu komórkowego z wyciszoną ekspresja genu kodującego białko PRODH/POX, a tym samym o skutecznym i wydajnym hamowaniu ekspresji genu kodującego białku PRODH/POX dzięki zastosowaniu sekwencji kwasów nukleinowych według wynalazku w komórce eukariotycznej.
PL 239 994 Β1
WYKAZ SEKWENCJI <110> Uniwersytet Medyczny w Białymstoku <120> Dwuniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, klon komórkowy, kompozycja farmaceutyczna, sposób in vitro wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, jednoniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania <140> PL17P4046300 (PT60) <141> 2017-06-20 < 160> 18 < 17 0> BiSSAP 1.3,6 < 210> 1 < 211* 21 < 212* DNA < 213> Homo sapiens <400> 1 ctaggacaga ggctattcaa c 21 < 210> 2 < 211> 21 < 212> DNA < 213> Homo sapiens <400> 2 gcatgtgtga ccagatcagc t 21 <210> 3 <211» 21 <212» DNA
PL 239 994 Β1 <213> Homo sapiens <400> 3 gtgtacaagt acgtgcccta t
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4 gttgaatagc ctctgtccta g
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5 agctgatctg gtcacacacg c
<210> 6
<21L> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400* 6 atagggcacg tacttgtaca c <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens
PL 239 994 Β1 <400> 7 cuaggacaga ggcuauucaa c <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 guguacaagu acgugcccua u <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 agcugaucug gucacacaug c <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213* Homo sapiens <400> 10 gcauguguga ccagaucagc u <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens
PL 239 994 Β1 <400> 11 guugaauagc cucuguccua g 21 <210* 12 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 auagggcacg uacuuguaca c 21 <210> 13 <211> 1309 < 212> DNA < 213> Homo sapiens < 400> 13 ctaggacaga ggctattcaa caagctcatg aagatgacct tctatgggca ttttgtagcc60 ggggaggacc aggagtccat ccagcccctg cttcggcact acagggcctt cggtgtcagc120 gccatcctgg actatggagt ggaggaggac ctgagccccg aggaggcaga gcacaaggag180 atggagtcct gcacctcagc tgcggagagg gatggcagtg gcacgaataa gcgggacaag240 caat-accagg cccaccgggc cttcggggac cgcaggaatg gtgccatcag tgcccgcacc300 tacttctacg ccaatgaggc caagtgcgac agccacatgg agacatCctt gcgctgcatc360 gaagcctcag gtagagtcag cgatgacggc ttcatagcca ttaagctcac agcactgggg420 agaccccagt ttctgctgca gttctcagag gtgctggcca agtggaggtg cttctttcac480 caaaEggctg tggagcaagg gcaggcgggc ccggctgcca tggacaccaa gctggaggtg540 gcggtgctgc aggaaagtgt cgcaaagttg ggcatcgcat ccagggctga gattgaggac600
PL 239 994 Β1 tggttcacgg cagagaccct gggagtgtct ggcaccatgg acctgctgga ctggagcagc660 ctcatcgaca gcaggaccaa gctgtccaag cacttggtag tccccaacgc acagacagga720 cagctggagc ccctgctgtc ccggttcact gaggaggagg agctacagac gaccaggatg780 ctacagcgga tggatgtcct ggccaagaaa gccacagaga tgggcgtgcg gctgatggtg640 gatgccgagc agacctactt ccagccggcc atcagccgcc tgacgctgga gatgcagcgg900 aagttcaatg tggagaagcc gctcatcttc aacacatacc agtgctacct caaggatgcc960 tatgacaatg tgaccctgga cgtggagctg gctcgccgtg agggctggtg ttttggggcc1020 aagctggtgc ggggcgcata cccggcccag gagcgagccc gtgcggcaga gatcggctat1080 gaggacccca tcaaccccac gtacgaggcc accaacgcca tgtaccacag gtgcctggac1140 tacgtgttgg aggagctgaa gcacaacgcc aaggccaagg tgatggtgga ctcccacaat1200 gaggacacag tgcgctttgc actgcgcagg atggaggagc tgggcctgca tcctgctgac1260 caccaggtgt actttggaca gctgctaggc atgtgtgacc agatcagct1309 <210> 14 <211> 1309 <212> DNA <213» Homo sapiens <400> 14 ctaggacaga ggctattcaa caagctcatg aagatgacct tctatgggca ttttgtagcc60 ggggaggacc aggagtccat ccagcccctg cttcggcact acagggcctt cggtgtcagc120 gccatcctgg actatggagt ggaggaggac ctgagccccg aggaggcaga gcacaaggag180 atggagtcct gcacctcagc tgcggagagg gatggcagtg gcacgaacaa gcgggacaag240
PL 239 994 Β1 caataccagg cccaccgggc cttcggggac cgcaggaatg gtgtcatcag tgcccgcacc tacttctacg ccaatgaggc caagtgcgac agccacatgg agacattctt gcgctgcatc gaagcctcag gtagagtcag cgatgacggc ttcatagcca ttaagctcac agcactgggg agaccccagt ttctgctgca gttctcagag gtgctggcca agtggaggtg cttctttcac caaatggctg tggagcaagg gcaggcgggc ctggctgcca tggacaccaa gctggaggtg gcggtgctgc aggaaagtgt cgcaaagttg ggcatcgcat ccagggctga gattgaggac tggttcacgg cagagaccct gggagtgtcc ggcaccatgg acctgctgga ctggagcagc ctcatcgaca gcaggaccaa gctgtccaag cacttggtag tccccaacgc acagacagga cagctggagc ccctgctgtc ccggttcact gaggaggagg agctacagat gaccaggatg ctacagegga tggatgtcct ggccaagaaa gccacagaga tgggcgtgcg gctgatggtg gatgccgagc agacctactt ccagccggcc atcagccgcc tgacgctgga gatgcagcgg aagttcaatg tggagaagcc gctcatcttc aacacatacc agtgctacct caaggatgcc tatgacaatg tgaccctgga cgtggagctg gctegccgtg agggctggtg ttttggggcc aagctggtgc ggggcgcata cctggcccag gagcgagccc gtgcggcaga gatcggctat gaggacccca tcaaccccac gtacgaggcc accaacgcca tgtaccacag gtgcctggac tacgtgttgg aggagctgaa gcacaacgcc aaggccaagg tgatggcggc ctcccacaat gaggacacag tgcgctttgc actgcgcagg atggaggagc tgggcctgca tcctgctgac caccaggtgt actttggaca gctgctaggc atgtgtgacc agatcagct <210> 15 <211> 1309 <212> DNA <213> Homo sapiens
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1309
PL 239 994 Β1
<400» 15 ctaggacaga ggctattcaa caagctcatg aagatgacct tctatgggca ttttgtagcc 60
ggggaggacc aggagtccat ccagcccctg cttcggcact acagggcctt cggtgtcagc 120
gccatcctgg actatggagt ggaggaggac ctgagccccg aggaggcaga gcacaaggag 180
atggagtcct gcacctcagc tgcggagagg gatggcagtg gcacgaataa gcgggacaag 240
caataccagg cccaccgggc cttcggggac cgcaggaatg gtgtcatcag tgcccgcacc 300
tacttctacg ccaatgaggc caagtgcgac agccacatgg agacattctt gcgctgcatc 360
gaagcctcag gtagagtcag cgatgacggc ttcatagcca ttaagctcac agcactgggg 420
agaccccagt ttctgctgca gctctcagag gcgctggcca agtggaggtg cttctttcac 480
caaatggctg tggagcaagg gcaggcgggc ctggctgcca tggacaccaa gctggaggtg 540
gcggtgctgc aggaaagtgt cgcaaagttg ggcatcgcat ccagggctga gattgaggac 600
tggttcacgg cagagaccet gggagtgtct ggcaccatgg acctgctgga ctggagcagc 660
ctcatcgaca gcaggaccaa gctgtccaag cacttggtag tccccaacgc acagacagga 720
cagctggagc ccctgctgtc ccggttcact gaggaggagg agctacagat gaccaggatg 780
ctacagcgga tggatgtcct ggccaagaaa gccacagaga tgggcgtgcg gctgatggtg 840
gatgccgagc agacctactt ccagccggcc atcagccgcc tgacgctgga gatgcagcgg 900
aagttcaatg tggagaagcc gctcatcttc aacacatacc agtgctacct caaggatgcc 960
tatgacaatg tgaccctgga cgtggagctg gctcgccgtg agggctggtg ttttggggcc 1020
aagctggtgc ggggcgcata cctggcccag gagcgagccc gtgcggcaga gatcggctat 1080 gaggacccca tcaaccccac gtacgaggcc accaacgcca tgtaccacag gtgcctggac 1140
PL 239 994 Β1 tacgCgttgg aggagctgaa gcacaacgcc aaggccaagg tgatggtggc ctcccacaat1200 gaggacacag tgcgctttgc actgcgcagg atggaggagc tgggcctgca tcctgctgac1260 caccaggtgt actttggaca gctgctaggc atgtgtgacc agatcagct1309 <210* 16 <211> 1356 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 ctaggacaga ggctattcaa caagctcatg aagacgacct tctatgggca ttttgtagcc60 ggggaggacc aggagtccat ccagcccctg cttcggcact acagggcctt cggtgtcagc120 gccatcctgg actatggagt ggaggaggac ctgagccccg aggaggcaga gcacaaggag180 atggagtcct gcacctcagc tgcggagagg gatggcagtg gcacgaataa gcgggacaag240 caataccagg cccaccgggc cttcggggac cgcaggaatg gtgccatcag tgcccgcacc300 tacttctacg ccaatgaggc caagtgcgac agccacatgg agacattctt gcgctgcatc360 gaagcctcag gtagagtcag cgatgacggc ttcatagcca ttaagctcac agcactgggg420 agaccccagt ttctgctgca gttctcagag gtgctggcca agtggaggtg cttctttcac480 caaatggccg cggagcaagg gcaggcgggc ctggctgcca tggacaccaa gctggaggtg540 gcggtgctgc aggaaagtgt cgcaaagttg ggcatcgcat ccagggctga gattgaggac600 tggttcacgg cagagaccct gggagtgr.ct ggcaccatgg acctgctgga ctggagcagc660 ctcatcgaca gcaggaccaa gctgtccaag cacttggtag tccccaacgc acagacagga720 cagctggagc ccctgctgtc ccggttcact gaggaggagg agctacagat gaccaggatg780 ctacagcgga tggatgtcct ggccaagaaa gccacagaga tgggcgtgcg gctgatggtgΘ40
PL 239 994 Β1
gatgccgagc agacctactt ccagccggcc atcagccgcc tgacgctgga gatgcagcgg 900
aagttcaatg tggagaagcc gctcatcttc aacacatacc agtgctacct caaggatgcc 960
tatgacaatg tgaccctgga cgtggagctg gctcgccgtg agggctggtg ttttggggcc 1020
aagctggtgc ggggcgcata cctggcccag gagcgagccc gtgcggcaga gatcggctat 1080
gaggacccca tcaaccccac gtacgaggcc accaacgcca tgtaccacag gtgcctggac 1140
tacgtgttgg aggagctgaa gcacaacgcc aaggccaagg tgatggtggc ctcccacaat 1200
gaggacacag tgcgctttgc actgcgcagg atggaggagc tgggcctgca tcctgctgac 1260
caccaggtgt actttggaca gctgctaggc atgtgtgacc agatcagctt cccgctgggc 1320
caggccggct accccgtgta caagtacgcg ccccat 1356
<210> 17 <211> 2423 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 17 ggtctcactc tgttgctgtc ttcacggaga gcaggagcag aggctttgag aagccagtgg 60
gccttggcct cagccctgcc ggcagagggt ccccaccatg cagctgaagt gccagggtgc 120
ttgtgaagtc taagcccttg tctggcattt gtcaggaata taggcgcaca cttaagcggc 180
ccgggcgggt accgccgtcc cgccatggct ctgaggcgcg ccctgcccgc gctgcgcccc 240
tgcattcccc gcttcgtccc gctgtccacg gcgccggcct cccgcgagca gcccgcagcg 300
ggcccagcgg ccgtgccagg aggtgggtcg gccacggcag tgcggccgcc ggtgcccgcc 360
gtggacttcg gcaacgcgca ggaggcgtac cgcagccggc gaacctggga gctggcgcgg 420
PL 239 994 Β1 agcctgctgg tgctgcgctt gtgcgcctgg cccgcgctgc tggcgcgcca cgagcagctg 480 ctgtatgttt ccaggaaact tctaggacag aggctattca acaagctcat gaagatgacc 540 ttctatgggc attttgtagc cggggaggac caggagtcca tccagcccct gcttcggcac 600 tacagggcct tcggtgtcag cgccatcctg gactatggag tggaggagga cctgagcccc 660 gaggaggcag agcacaagga gatggagccc tgcacctcag ctgcggagag ggatggcagt 720 ggcacgaata agcgggacaa gcaataccag gcccaccggg ccttcgggga ccgcaggaat 780 ggtgtcatca gtgcccgcac ctacttctac gccaatgagg ccaagtgcga cagccacatg 840 gagacattct tgcgctgcat cgaagcctca ggtagagtca gcgatgacgg cttcatagcc 900 attaagctca cagcactggg gagaccccag tttctgctgc agttctcaga ggtgctggcc 960 aagtggaggt gcttctttca ccaaatggct gtggagcaag ggcaggcggg cctggctgcc 1020 atggacacca agctggaggt ggcggtgctg caggaaagtg tcgcaaagtt gggcatcgca 1080 tccagggctg agattgagga ctggttcacg gcagagaccc tgggagtgtc tggcaccatg 1140 gacctgctgg actggagcag cctcatcgac agcaggacca agctgtccaa gcacttggta 1200 gtccccaacg cacagacagg acagccggag cccctgctgt cccggtccac tgaggaggag 1260 gagctacaga tgaccaggat gctacagcgg atggatgtcc tggccaagaa agccacagag 1320 atgggcgtgc ggctgacggt ggatgccgag cagacctact tccagccggc catcagccgc 1380 ctgacgctgg agatgcagcg gaagttcaat gtggagaagc cgctcatctt caacacatac 1440 cagtgctacc tcaaggatgc ctatgacaat gtgaccctgg acgtggagct ggctcgccgt 1500 gagggctggt gttttggggc caagctggtg cggggcgcat acctggccca ggagcgagcc 1560 cgtgcggcag agatcggcta tgaggacccc atcaacccca cgtacgaggc caccaacgcc 1620 atgCaccaca ggtgcctgga ctacgtgttg gaggagctga agcacaacgc caaggccaag 1680
PL 239 994 Β1
gtgatggLgg cctcccacaa tgaggacaca gtgcgctttg cactgcgcag gatggaggag 1740
ctgggcctgc atcctgctga ccaccaggtg tactttggac agctgctagg catgtgtgac 1800
cagatcagct tcccgctggg ccaggccggc taccccgtgt acaagtacgt gccctatggc 1860
cccgtgatgg aggtgctgcc ctacttgtcc cgccgtgccc tggagaacag cagcctcatg 1920
aagggcaccc atcgggagcg gcagctgctg tggctggagc tcttgaggcg gctccgaact 1980
ggcaacctct tccatcgccc tgcctagcac ccgccagcac acccttagcc tccagcaccc 2040
cccgcecccg cccaggccat caccacagct gcagccaacc ccatcctcac acagattcac 2100
cttttttcac cccacacttg cagagctgct ggaggtgagg tcaggtgcct cccagccctg 2160
cccagagtat gggcactcag gtgtgggccg aacctgatac ctgcctggga cagccactgg 2220
aaacttttgg gaaccctcct cgaatgtgtg ggcccaaggc ccccacctct gtgaccccca 2280
tgtccttgga cctagaggat tgtccacctt ctgccaaggc cagcccacac agcccgagcc 2340
ccttggggag cagtggccgg gctggggagg cctgcctggt caataaacca ctgttcctgc 2400
agctgagaaa aaaaaaaaaa aaa 2423
<210* 18
<211> 2008
<212> DNA
<213> Ilomo sapiens
<400> 18
gctgaagtgc cagggtgctt gtgaagtcta agcccttgtc tggcatttgt caggaatata 60
ggctgctgta tgtttccagg aaacttctag gacagaggct attcaacaag ctcatgaaga 120
tgaccttcta tgggcatttt gtagccgggg aggaccagga gtccatccag cccctgcttc 180
PL 239 994 Β1 ggcactacag ggccttcggt gtcagcgcca tcctggacta tggagtggag gaggacctga 240 gccccgagga ggcagagcac aaggagatgg agtcctgcac ctcagctgcg gagagggatg 300 gcagcggcac gaataagcgg gacaagcaat accaggccca ccgggccttc ggggaccgca 360 ggaatggtgt catcagtgcc cgcacctact tctacgccaa tgaggccaag tgcgacagcc 420 acatggagac attcttgcgc tgcatcgaag cctcaggtag agtcagcgat gacggcttca 480 Cagccattaa gctcacagca ctggggagac cccagtttct gctgcagttc tcagaggtgc 540 tggccaagtg gaggtgcttc tttcaccaaa tggctgtgga gcaagggcag gcgggcctgg 600 ctgccatgga caccaagctg gaggtggcgg Cgctgcagga aagtgtcgca aagttgggca 660 tcgcatccag ggctgagatt gaggactggt tcacggcaga gaccctggga gtgtctggca 720 ccatggacct gctggactgg agcagcctca tcgacagcag gaccaagctg tccaagcact 780 tggtagtccc caacgcacag acaggacagc tggagcccct gcCgtcccgg ttcactgagg 840 aggaggagct acagatgacc aggatgctac agcggatgga tgtcctggcc aagaaagcca 900 cagagatggg cgtgcggctg atggtggatg ccgagcagac ctacttccag ccggccatca 960 gccgcctgac gctggagatg cagcggaagt tcaatgtgga gaagccgctc atcttcaaca 1020 cataccagtg ctacctcaag gatgcctatg acaatgtgac cctggacgtg gagctggctc 1080 gccgtgaggg ctggtgtttt ggggccaagc tggtgcgggg cgcatacctg gcccaggagc 1140 gagcccgtgc ggcagagatc ggctatgagg accccatcaa ccccacgtac gaggccacca 1200 acgccatgta ccacaggtgc ctggactacg tgLtggagga gctgaagcac aacgccaagg 1260 ccaaggtgat ggtggcctcc cacaatgagg acacagtgcg ctttgcactg cgcaggatgg 1320 aggagctggg cctgcatcct gcCgaccacc aggtgtactt tggacagctg ctaggcatgt L380 gtgaccagat cagcttcccg ctgggccagg ccggctaccc cgtgtacaag tacgtgccct 1440

Claims (31)

  1. PL 239 994 Β1 atggccccgt gatggaggtg ctgccctact tgtcccgccg tgccctggag aacagcagcc 1500 tcatgaaggg cacccatcgg gagcggcagc tgctgtggct ggagctcttg aggcggctcc 1560 gaactggcaa cctcttccat cgccctgcct agcacccgcc agcacaccct tagcctccag 1620 caccccccgc ccccgcccag gccatcacca cagctgcagc caaccccatc ctcacacaga 1680 ttcacctttt ttcaccccac acttgcagag ctgctggagg tgaggtcagg tgcctcccag 1740 ccctgcccag agtatgggca ctcaggtgtg ggccgaacct gatacctgcc tgggacagcc 1800 actggaaact tttgggaact ctcctcgaat gtgtgggccc aaggccccca cctctgtgac 1860 ccccatgtcc ttggacctag aggattgtcc accttctgcc aaggccagcc cacacagccc 1920 gagccccttg gggagcagtg gccgggctgg ggaggcctgc ctggtcaata aaccactgtt 1980 cctgcagctg agaaaaaaaa aaaaaaaa 2008
    Zastrzeżenia patentowe
    1. Dwuniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX w komórce, przy czym ten dwuniciowy kwas nukleinowy zawiera nić sensowną i nić antysensowną o długości co najmniej 19 nukleotydów każda, które są komplementarne do siebie, przy czym ten dwuniciowy kwas nukleinowy stanowi dwuniciowy kwas deoksynukleinowy (dsDNA), w którym nić sensowna zawiera pierwszą sekwencję: GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2), a nić antysensowna zawiera drugą sekwencję: AGCTGATCTGGTCACACATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5), komplementarną do mRNA kodującego białko PRODH/POX, i przy czym ten dwuniciowy kwas nukleinowy po wprowadzeniu do komórki wykazującej ekspresję genu kodującego białko PRODH/POX wycisza ekspresję tego genu.
  2. 2. Dwuniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX w komórce, przy czym ten dwuniciowy kwas nukleinowy zawiera nić sensowną i nić antysensowną o długości co najmniej 19 nukleotydów każda, które są komplementarne do siebie, przy czym ten dwuniciowy kwas nukleinowy stanowi dwuniciowy kwas rybonukleinowy (dsRNA), w którym nić sensowna zawiera pierwszą sekwencję zawierającą sekwencję GCAUGUGUGACCAGAUCAGCU (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8), a nić antysensowna zawiera drugą sekwencję AGCUGAUCUGGUCACACAUGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 11), komplementarną do mRNA kodującego białko PRODH/POX, i przy czym ten dwuniciowy kwas nukleinowy po wprowadzeniu do komórki wykazującej ekspresję genu kodującego białko PRODH/POX wycisza ekspresję tego genu.
  3. 3. Wektor ekspresyjny do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, znamienny tym, że zawiera dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrzeżeniu 1 albo 2.
  4. 4. Wektor ekspresyjny według zastrz. 3, znamienny tym, że wektor ten stanowi plazmid, transpozon lub wirus.
    PL 239 994 B1
  5. 5. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrzeżeniu 1 albo 2, lub wektor jak określono w zastrzeżeniu 3 albo 4, przy czym korzystnie wybrana jest ona spośród komórki prokariotycznej, takiej jak komórka bakteryjna, i komórki eukariotycznej, takiej jak komórka zwierzęca, zwłaszcza komórka ssacza, w szczególności komórka ludzka.
  6. 6. Klon komórkowy z wyciszoną ekspresją genu kodującego białko PRODH/POX, znamienny tym, że zawiera dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrzeżeniu 1 albo 2, lub wektor ekspresyjny jak określono w zastrzeżeniu 3 albo 4.
  7. 7. Klon komórkowy według zastrz. 6, znamienny tym, że klon ten stanowi klon komórek MCF-7 zawierający jako dwuniciowy kwas nukleinowy dsDNA, który zawiera sekwencję GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) i sekwencję AGCTGATCTGGTCACACATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5).
  8. 8. Kompozycja farmaceutyczna do wyciszania ekspresji genu kodującego PRODH/POX w organizmie, znamienna tym, że zawiera dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 1 albo 2, lub wektor ekspresyjny jak określono w zastrz. 3 albo 4, oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik lub rozcieńczalnik.
  9. 9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, że zawiera dsDNA, który zawiera pierwszą sekwencję: GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) oraz drugą sekwencję: AGCTGATCTGGTCACACATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5).
  10. 10. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, że zawiera dsRNA, który zawiera pierwszą sekwencję: GCAUGUGUGACCAGAUCAGCU (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8) oraz drugą sekwencję: AGCUGAUCUGGUCACACAUGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 11).
  11. 11. Sposób in vitro wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX w komórce, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których:
    (a) wprowadza się dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 1 albo 2, lub wektor jak określono w zastrz. 3 albo 4, do komórki; oraz (b) utrzymuje się komórkę z wprowadzonym dwuniciowym kwasem nukleinowym lub wektorem z etapu (a) w warunkach i przez czas wystarczający do osiągnięcia wyciszenia ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX w komórce.
  12. 12. Sposób in vitro wyciszania ekspresji według zastrz. 11, znamienny tym, że w etapie a) wprowadza się dsDNA zawierający sekwencję GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) i sekwencję: AGCTGATCTGGTCACACATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5).
  13. 13. Sposób in vitro wyciszania ekspresji według zastrz. 11, znamienny tym, że w etapie a) wprowadza się dsRNA, korzystnie zawierający sekwencję GCAUGUGUGACCAGAUCAGCU (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8) i sekwencję AGCUGAUCUGGUCACACAUGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 11).
  14. 14. Sposób według jednego z zastrz. 11 do 13, znamienny tym, że wyciszanie ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX uzyskuje się z zastosowaniem metody RNAi, korzystnie opartej na shRNA, miRNA, lub siRNA.
  15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że do wyciszania ekspresji tego genu stosuje się metodę RNAi opartą shRNA, który to shRNA zawiera korzystnie parę sekwencji: GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) i AGCTGATCTGGTCACACATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5) połączonych ze sobą w orientacji 5’-3’ łącznikiem nukleotydowym o długości 5 do 15 nukleotydów oraz sekwencji GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) i AGCTGATCTGGTCACACATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5) połączonych ze sobą w orientacji 3’-5’ łącznikiem nukleotydowym o długości 5 do 15 nukleotydów.
  16. 16. Dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 1 albo 2 do zastosowania w terapii.
  17. 17. Dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 1 albo 2 do zastosowania w leczeniu i/lub profilaktyce zaburzenia lub choroby charakteryzującej się zaburzonym metabolizmem proliny, korzystnie choroby nowotworowej, zwłaszcza raka sutka.
  18. 18. Dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 1 albo 2 do zastosowania do hamowania wzrostu i/lub proliferacji komórki nowotworowej.
    PL 239 994 B1
  19. 19. Dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono w jednym z zastrz. 1 albo 2 do zastosowania do indukcji apoptozy i/lub autofagii w komórce, w szczególności w komórce nowotworowej.
  20. 20. Dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 1 albo 2 do zastosowania do regulacji metabolizmu proliny w organizmie.
  21. 21. Dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 1 albo 2 do zastosowania w diagnostyce.
  22. 22. Dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 1 albo 2 do zastosowania w diagnostyce chorób charakteryzujących się zaburzonym metabolizmem proliny, korzystnie choroby nowotworowej, zwłaszcza raka sutka.
  23. 23. Dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 1 albo 2 do zastosowania do wytwarzania linii komórkowej wykazującej wyciszoną ekspresję genu kodującego PRODH/POX.
  24. 24. Dwuniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 1 albo 2 do zastosowania do wytwarzania klonu komórek wykazującego wyciszoną ekspresję genu kodującego białko PRODH/POX, korzystnie klonu komórek MCF-7 z wyciszoną ekspresją genu kodującego białko PRODH/POX.
  25. 25. Jednoniciowy kwas nukleinowy do oznaczania ekspresji transkryptu genu kodującego białko PRODH/POX w komórce, przy czym ten jednoniciowy kwas nukleinowy zawiera sekwencję o długości co najmniej 19 nukleotydów, która jest komplementarna do mRNA kodującego białko PRODH/POX, przy czym ten jednoniciowy kwas nukleinowy stanowi jednoniciowy kwas deoksynukleinowy, przy czym ten jednoniciowy kwas deoksynukleinowy stanowi sekwencja zawierająca nić sensowną zawierającą sekwencję: GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2) albo sekwencja zawierająca nić antysensowną zawierającą sekwencję: AGCTGATCTGGTCACACATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5).
  26. 26. Jednoniciowy kwas nukleinowy do oznaczania ekspresji transkryptu genu kodującego białko PRODH/POX w komórce, przy czym ten jednoniciowy kwas nukleinowy zawiera sekwencję o długości co najmniej 19 nukleotydów, która jest komplementarna do mRNA kodującego białko PRODH/POX, przy czym ten jednoniciowy kwas nukleinowy stanowi jednoniciowy kwas rybonukleinowy, przy czym ten jednoniciowy kwas rybonukleinowy stanowi sekwencja zawierająca nić sensowną zawierającą sekwencję GCAUGUGUGACCAGAUCAGCU (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8), albo sekwencja zawierająca nić antysensowną zawierającą sekwencję AGCUGAuCuGGUCACACAUGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 11).
  27. 27. Jednoniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 25 albo 26 do zastosowania do wytwarzania mikromacierzy do identyfikacji ekspresji transkryptu genu kodującego białko PRODH/POX.
  28. 28. Jednoniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 25 albo 26 do zastosowania do uzyskania sekwencji co najmniej części długości cDNA lub mRNA genu kodującego białko PRODH/POX w komórce.
  29. 29. Jednoniciowy kwas nukleinowy według zastrz. 28, znamienny tym, że stanowi go jednoniciowy kwas deoksynukleinowy, który stanowi sekwencja zawierająca nić sensowną: GCATGTGTGACCAGATCAGCT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2), albo sekwencja zawierająca nić antysensowną: AGCTGATCTGGTCACACATGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5).
  30. 30. Jednoniciowy kwas nukleinowy według zastrz. 28, znamienny tym, że stanowi go jednoniciowy kwas rybonukleinowy, który stanowi sekwencja zawierająca nić sensowną GCAUGUGU GACCAGAUCAGCU (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 8), albo sekwencja zawierająca nić antysensowną AGCUGAuCuGGUCACACAUGC (sekwencja o tym numerze identyfikacyjnym 11).
  31. 31. Jednoniciowy kwas nukleinowy jak określono w zastrz. 25 albo 26 do zastosowania do diagnostyki chorób charakteryzujących się zaburzonym metabolizmem proliny, korzystnie choroby nowotworowej, zwłaszcza raka sutka.
PL421954A 2017-06-20 2017-06-20 Dwuniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, klon komórkowy, kompozycja farmaceutyczna, sposób in vitro wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, jednoniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania PL239994B1 (pl)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL421954A PL239994B1 (pl) 2017-06-20 2017-06-20 Dwuniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, klon komórkowy, kompozycja farmaceutyczna, sposób in vitro wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, jednoniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania
PCT/PL2018/000061 WO2018236232A1 (en) 2017-06-20 2018-06-19 NUCLEIC ACIDS FOR SILENCING THE EXPRESSION OF A GENE ENCODING A PRODH / POX PROTEIN AND USES THEREOF

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL421954A PL239994B1 (pl) 2017-06-20 2017-06-20 Dwuniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, klon komórkowy, kompozycja farmaceutyczna, sposób in vitro wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, jednoniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL421954A1 PL421954A1 (pl) 2019-01-02
PL239994B1 true PL239994B1 (pl) 2022-02-07

Family

ID=63244932

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL421954A PL239994B1 (pl) 2017-06-20 2017-06-20 Dwuniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, klon komórkowy, kompozycja farmaceutyczna, sposób in vitro wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, jednoniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania

Country Status (2)

Country Link
PL (1) PL239994B1 (pl)
WO (1) WO2018236232A1 (pl)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7385106B2 (en) * 2000-01-24 2008-06-10 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Plants tolerant of environmental stress conditions, methods of generating same and novel polynucleotide sequence utilized thereby
US10517844B2 (en) * 2014-11-13 2019-12-31 Buck Institute For Research On Aging Inhibition of proline catabolism for the treatment of cancer and other therapeutic applications

Also Published As

Publication number Publication date
PL421954A1 (pl) 2019-01-02
WO2018236232A1 (en) 2018-12-27
WO2018236232A4 (en) 2019-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Goodarzi et al. Endogenous tRNA-derived fragments suppress breast cancer progression via YBX1 displacement
Abdolvahabi et al. MicroRNA‐590‐3P suppresses cell survival and triggers breast cancer cell apoptosis via targeting sirtuin‐1 and deacetylation of p53
Trakooljul et al. Identification of target genes and pathways associated with chicken microRNA miR‐143
D’Adamo et al. MicroRNAs and autophagy: fine players in the control of chondrocyte homeostatic activities in osteoarthritis
Belter et al. Inhibition of miR-21 in glioma cells using catalytic nucleic acids
Chen et al. MiR-34s negatively regulate homologous recombination through targeting RAD51
WO2005113770A1 (en) Anti-rhoa and -rhoc sirnas and therapeutic compositions comprising them.
Wang et al. Inhibition of miR‐24 suppresses malignancy of human non‐small cell lung cancer cells by targeting WWOX in vitro and in vivo
Mackedenski et al. Characterizing the interaction between insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1 (IMP1) and KRAS expression
JP4467559B2 (ja) 細胞増殖を阻害する組成物および方法
JP7406278B2 (ja) 腫瘍マーカー及び治療ターゲットとしての長鎖ノンコーディングｒｎａ ｌｅｔｎ
CN109706152B (zh) 一种抑制circ_0001017表达的siRNA及其应用
Shervington et al. Silencing DNA methyltransferase (DNMT) enhances glioma chemosensitivity
CN106350519A (zh) 一种调节鹿茸软骨快速生长的microRNA及其应用
PL239994B1 (pl) Dwuniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, klon komórkowy, kompozycja farmaceutyczna, sposób in vitro wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, jednoniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania
CN109825504A (zh) 一种抑制circ_0001016表达的siRNA及其应用
US20220298512A1 (en) Sirna sequences targeting the expression of human genes jak1 or jak3 for a therapeutic use
PL240375B1 (pl) Dwuniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, klon komórkowy, kompozycja farmaceutyczna, sposób in vitro wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, jednoniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania
PL240376B1 (pl) Dwuniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, klon komórkowy, kompozycja farmaceutyczna, sposób in vitro wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX, jednoniciowy kwas nukleinowy do wyciszania ekspresji genu kodującego białko PRODH/POX i jego zastosowania
US11319541B2 (en) Anticancer therapeutic intervention
US20180066251A1 (en) Rna products and uses thereof
KR101480523B1 (ko) 세포 내 rpS3 발현 억제를 위한 siRNA
CN116286828B (zh) 一种寡聚核酸siRNA及其在制备用于预防和治疗肝癌的药物中的应用
CN116769828B (zh) 调控nrf2转录因子活性的方法
WO2024065900A1 (zh) 用于抑制肿瘤生长的sirna及其应用