PL238335B1

PL238335B1 - Szczepionka, sposób przygotowania szczepionki oraz sposób biotyzacji borówki amerykańskiej

Info

Publication number: PL238335B1
Application number: PL430205A
Authority: PL
Inventors: Katarzyna TURNAU; Katarzyna Turnau; Rafał WAŻNY; Rafał Ważny; Piotr ROZPĄDEK; Piotr Rozpądek
Original assignee: Univ Jagiellonski
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2021-08-09
Also published as: EP3982736A1; WO2020251379A1; EP3982736B1; PL430205A1

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy szczepionki do biotyzacji borówki amerykańskiej, zawierającej szczep Xylaria sp. nr KKP 2073p, sposobu przygotowania szczepionki do biotyzacji borówki amerykańskiej oraz sposobu biotyzacji borówki amerykańskiej. Przedmioty wynalazku znajdują zastosowanie w ekologicznej produkcji owoców jagodowych.

Biotyzacja jest nowym biotechnologicznym podejściem do uprawy roślin, które obejmuje inokulację rośliny pożytecznymi mikroorganizmami jak np. grzyby i bakterie w celu zwiększenia jej wzrostu i tolerancji na stres biotyczny i abiotyczny. Biotyzacja roślin pomaga przyczynić się do ograniczenia nawożenia mineralnego roślin oraz zwiększenia ilości i jakości plonu.

Z opisu CN106635821 znane jest zastosowanie grzybów mykoryzowych do promowania absorpcji nutrientów, takich jak azot i fosfor, przez borówkę amerykańską. Grzyby uzyskano poprzez izolację z korzeni borówki. Zastosowanie grzybów mykoryzowych polepszyło rozwój korzeni, promowało wzrost roślin i wchłanianie azotu, fosforu i potasu.

Z opisu CN102220246 znane jest zastosowanie grzybów mykoryzowych Coprinus micaceus, wyizolowanych z korzeni borówki amerykańskiej, do promowania wzrostu i poprawy wydajności hodowli borówki amerykańskiej. Zastosowanie grzybów Coprinus micaceus przyczynia się do poprawy systemu korzeniowego roślin i ochrony przed insektami.

Z opisu WO2010050808 znane jest zastosowanie grzybów erikoidalnych do poprawy jakości gleby. Szczepy grzybów erikoidalnych, należące do Hymenoscyphus ericae, Rhizoscyphus spp. i Oidiodendron spp. wprowadza się do gleby razem ze skałą krzemianową, która jest źródłem kationów magnezu, żelaza, sodu i innych. Sposób prowadzi do poprawy jakości gleb dla roślin uprawnych.

Celem niniejszego wynalazku było zapewnienie szczepionki do biotyzacji borówki amerykańskiej, która przyczynia się do ograniczenia nawożenia mineralnego roślin i przede wszystkim zwiększa jakość plonu borówki amerykańskiej.

Szczepionka do biotyzacji borówki amerykańskiej według wynalazku zawiera szczep rodzaju Xylaria sp. nr KKP 2073p, zdeponowany w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie pod numerem KKP 2073p. Szczep rodzaju Xylaria sp. nr KKP 2073p został wyizolowany z rośliny Verbascum lychnitis. Wyniki analizy genetycznej regionu ITS rDNA przedstawia SEQ. ID NO.1.

Szczepionka może zawierać co najmniej jeden szczep należący do grzybów erikoidalnych.

Korzystna jest obecność w szczepionce szczepu Oidiodendron maius UNIJAG.PL.368 i/albo Phialocephala fortinii UNIJAG.PL.382 i/albo Hymenoscyphus sp. UNIJAG.PL.391.

W szczególności, szczepionka może zawierać szczepy Xylaria sp. nr KKP 2073p, Oidiodendron maius UNIJAG.PL.368, Phialocephala fortinii UNIJAG.PL.382 oraz Hymenoscyphus sp. UNIJAG.PL.391 w stosunku ilościowym 1:1:1:1

Sposób przygotowania szczepionki do biotyzacji borówki amerykańskiej według wynalazku polega na tym, że szczep rodzaju Xylaria sp. nr KKP 2073p, zdeponowany w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie pod numerem KKP 2073p, namnaża się w płynnym nośniku, w szczególności w 2% pożywce maltozowej, przez okres co najmniej 5, po czym grzybnię oddziela się od nośnika. W szczególności, preferowany okres namnażania wynosi 7 dni.

Korzystnie, każdy szczep wchodzący w skład szczepionki namnaża się osobno na odpowiednim nośniku, a następnie szczepy miesza się ze szczepem Xylaria sp. nr KKP 2073p w określonym stosunku ilościowym przed inokulacją borówki amerykańskiej.

W przypadku gdy szczepionka zawiera szczep Oidiodendron maius UNIJAG.PL.368 i/albo Phialocephala fortinii UNIJAG.PL.382 i/albo Hymenoscyphus sp. UNIJAG.PL.391, nośnikiem do namnażania szczepu są otręby pszenne z domieszką ziemi okrzemkowej, najlepiej w proporcji objętościowej 4:1.

Otręby pszenne z domieszką ziemi okrzemkowej mogą być są sterylne.

Korzystnie, szczep Oidiodendron maius UNIJAG.PL.368 i/albo Phialocephala fortinii UNIJAG.PL.382 i/albo Hymenoscyphus sp. UNIJAG.PL.391 namnaża się najlepiej w ciemności, w temperaturze między 20°C a 30°C, korzystnie w 24°C, przez okres co najmniej 1 miesiąca.

Hymenoscyphus sp. (szczep UNIJAG.PL.391) został wyizolowany z borówki odmiany Bluehaven, Oidiodendron maius (szczep UNIJAG.PL.368) - odmiany P/14, Phialocephala fortinii (szczep UNIJAG.PL.382) - odmiany Pliszka. Rośliny do izolacji symbiontów pochodziły z plantacji

PL 238 335 Β1 borówki amerykańskiej, charakteryzującymi się optymalnymi warunkami wzrostu (podłoże torfowe o odczynie kwaśnym). Z każdej rośliny losowo pobrano korzenie z otaczającym je podłożem. Następnie korzenie oczyszczono z substratu pod bieżącą wodą i umieszczono na szalkach. Wstępnej oceny kolonizacji mykoryzowej dokonano przy użyciu lupy binokularnej przy powiększeniu 10-40x. Wyselekcjonowane korzenie włosowate umieszczano na szkiełku podstawowym i przeznaczono do obserwacji mikroskopowych przy powiększeniu 100-400x. Fragmenty korzeni z widocznymi zwojami grzybni w komórkach przeznaczono do izolacji grzybów. Korzenie sterylizowano powierzchniowo przez 50 sekund w 75% etanolu, a następnie płukano 3x w sterylnej wodzie. Po osuszeniu na sterylnej bibule korzenie cięto na fragmenty ok. 3 mm długości i umieszczono na kroplach pożywki GelGro. Szalki umieszczono w ciemności w 27°C. Kultury grzybów sukcesywnie przenoszono na pożywkę PDA i hodowano w ciemności w 27°C.

Identyfikację gatunkową przeprowadzono w oparciu o obserwacje mikroskopowe oraz z wykorzystaniem technik biologii molekularnej (amplifikacja i sekwencjonowanie regionu ITS rDNA). Do ekstrakcji DNA pobrano i zhomogenizowano około 50 mg grzybni pochodzącej z czystych kultur. Izolację DNA przeprowadzono z wykorzystaniem zestawu odczynników EZ-10 Spin Column Fungal Genomie DNA Mini-Preps Kit (Bio Basic, Canada). Zawartość oraz czystość DNA została zweryfikowana metodą spektrofotometryczną. W przypadku niskiej wydajności izolacji DNA z wykorzystaniem w/w metody dokonano ponownej ekstrakcji DNA z wykorzystaniem odczynników DNAzy Plant Mini Kit (Qiagen) lub metodą tradycyjną z wykorzystaniem CTAB. Ekstrakty zanieczyszczone oczyszczono z wykorzystaniem 5 M NaCI oraz izopropanolu. Następnie zamplifikowano fragment ITS rDNA w reakcji POR z zastosowaniem primerów ITS1F [Gardes i Bruns 1993] oraz ITS4 [White i in. 1990] i użyciem odczynników Maxima Hot Start Green POR Master Mix (Thermo Scientific). Parametry POR były następujące: wstępna denaturacja w 95°C przez 3 minuty; 35 cykli obejmujących kolejno denaturację w 95°C przez 30 sekund, przyłączanie starterów w 55°C przez 30 sekund i elongację w 72°C przez 45 sekund oraz końcowa elongacja w 72°C przez 5 minut. Obecność produktów PCR zweryfikowano w elektroforezie agarozowej. Produkty PCR były sekwencjonowane przez Macrogen z użyciem starterów ITS4 oraz ITS1. Sekwencje nukleotydów analizowano za pomocą programu Chromas [www.technelysium.com.au] oraz BioEdit oraz porównano z sekwencjami w bazie danych NCBI [www.ncbi.nlm.nih.gov] przy zastosowaniu algorytmu BLASTn. Wyniki identyfikacji molekularnej zostały przedstawione w tabeli 1.

Tabela 1

Wyniki identyfikacji molekularnej grzybów erikoidalnych

Szczep	Identyfikacja	Sekwencja referencyjna (NCBI)	Podobieństwo
UNIJAG.PL.368	Oidiodendron maius	Oidiodendron maius KF359579.1	552/557 (99%)
UNIJAG.PL.382	Phialocephala fortinii	Phialocephala fortinii AY394921.1	551/553(99%)
UNIJAG.PL.391	Hymenoscyphus sp.	Hymenoscyphus sp. EU700265.1	449/460 (98%)

Wyniki analizy genetycznej odcinka ITS rDNA przedstawia SEQ ID NO.2 (szczep UNIJAG.PL.368), SEQ ID NO.3 (szczep UNIJAG.PL.382), SEQ ID NO.4 (szczep UNIJAG.PL.391).

Sposób biotyzacji borówki amerykańskiej według wynalazku polega na tym, że borówkę amerykańską inokuluje się szczepionką zawierającą szczep rodzaju Xylaria sp. nr KKP 2073p, zdeponowany w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie pod numerem KKP 2073p.

Korzystnie, borówkę amerykańską inokuluje się podczas hodowli in vitro.

Korzystnie, borówkę amerykańską inokuluje się podczas przenoszenia z hodowli in vitro do multidoniczek.

Borówkę amerykańską najefektywniej inokuluje się szczepionką podczas przenoszenia roślin z multidoniczek do większych doniczek.

Najefektywniej inokuluje się rośliny nie starsze niż jednoroczne.

PL 238 335 B1

Szczepionkę można dodawać do podłoża sterylnego albo niesterylnego. W korzeniach roślin nieinokulowanych rosnących na podłożu niesterylnym mogą pojawić się struktury mykoryzowe, których źródłem są grzybnia i zarodniki grzybów erikoidalnych występujące naturalnie w takim podłożu.

Podłoże może stanowić torf kwaśny o pH od 3.5 do 4.5, wymieszany z perlitem.

Najefektywniejszym podłożem jest torf kwaśny o pH od 3.5 do 4.5, wymieszany z perlitem w stosunku objętościowym 5:1.

Szczepionka i sposób przygotowania szczepionki oraz sposób biotyzacji borówki amerykańskiej według wynalazku mają duże możliwości komercyjnego zastosowania w produkcji materiału sadzeniowego, przyczyniając się do ograniczenia nawożenia mineralnego roślin i przede wszystkim zwiększenia jakości plonu.

Zaletą wynalazku jest fakt, że każdy szczep wchodzący w skład szczepionki jest hodowany osobno w warunkach in vitro na specjalnie opracowanym nośniku. Łączenie wszystkich składników szczepionki następuje tuż przed inokulacją roślin. Dzięki temu, że wszystkie organizmy wzrastają osobno, wzrasta pewność obecności żywej grzybni każdego ze szczepów szczepionki, co jest przewagą nad istniejącymi dotychczas na rynku rozwiązaniami, w których nie ma pewności, co do żywotności wszystkich komponentów szczepionki.

Szczepionka według wynalazku jest proponowana do stosowania w uprawie borówki amerykańskiej, w szczególności dla odmian: Bluecrop, Duke, Dorrow i Patriot.

P r z y k ł a d I

Skład szczepionki stanowiły następujące szczepy grzybów: Hymenoscyphus sp. (szczep UNIJAG.PL.391), Oidiodendron maius (szczep UNIJAG.PL.368), Phialocephala fortinii (szczep UNIJAG.PL.382) oraz szczep rodzaju Xylaria sp. nr KKP 2073p w stosunku ilościowym 1:1:1:1.

Poszczególne szczepy grzybów przygotowano osobno na opracowanych nośnikach. Dla Hymenoscyphus sp., O. maius oraz P. fortinii nośnikiem grzybni były otręby pszenne z domieszką ziemi okrzemkowej w proporcji objętościowej 4:1. Nośnik o objętości 50 ml umieszczono w słoiku do hodowli in vitro o poj. 200 ml i poddano sterylizacji w 121°C przez 30 min. Następnie w warunkach sterylnych dodano sterylną wodę i umieszczono na nośniku 3 krążki grzybni z kilkudniowej hodowli na stałym podłożu PDA.

Inokulum namnażano w ciemności w 24°C przez okres co najmniej 1 miesiąca. Przed użyciem inokulum dodano do słoika 20-30 ml sterylnej wody i wytrząsano w celu ograniczenia ekspozycji na zarodniki grzybów podczas szczepienia roślin.

Szczep rodzaju Xylaria sp. nr KKP 2073p namnażano w płynnych kulturach w 2% pożywce maltozowej przez okres ok. 7 dni. Następnie grzybnię filtrowano, opłukiwano sterylną wodą, rozdrobniono i zawieszono w sterylnej wodzie. Szczepionkę płynną zawierającą nowy szczep rodzaju Xylaria sp. nr KKP 2073p aplikowano po dodaniu szczepionki zawierającej Hymenoscyphus sp. (szczep UNIJAG.PL.391), Oidiodendron maius (szczep UNIJAG.PL.368), Phialocephala fortinii (szczep UNIJAG.PL.382).

Rośliny borówki 'Bluecrop' inokulowano na etapie przenoszenia z hodowli in vitro do multidoniczek z torfem. Dawka inokulum stałego w przeliczeniu na jedną roślinę wyniosła 1-2 ml inokulum umieszczonego w dołku sadzeniowym lub wymieszanego z podłożem. Po posadzeniu roślin, podlano je. Szczepionkę dodano do podłoża, które stanowił niesterylny torf kwaśny pH 3.5-4.5 wymieszany z perlitem w stosunku objętościowych 5:1.

U borówki 'Bluecrop' inokulowanej podczas przenoszenia z hodowli in vitro do podłoża torfowego w multidoniczkach stwierdzono istotnie pozytywny wpływ szczepionki na świeżą masę roślin (wzrost o 60%), sucha masę (wzrost o 64%), powierzchnię liści (wzrost o 100%). Ponadto witalność roślin określona na podstawie analizy fluorescencji chlorofilu a u tych roślin była lepsza od roślin kontrolnych (wzrost Performance Index Abs o 27%).

P r z y k ł a d II

Poszczególne szczepy grzybów przygotowano osobno na opracowanych nośnikach. Dla Hymenoscyphus sp. O. maius oraz P. fortinii nośnikiem grzybni były otręby pszenne z domieszką ziemi okrzemkowej w proporcji objętościowej 4:1. Nośnik o objętości 50 ml umieszczono w słoiku do hodowli in vitro o poj. 200 ml i poddano sterylizacji w 121°C przez 30 min. Następnie w warunkach

PL 238 335 B1 sterylnych dodano sterylną wodę i umieszczono na nośniku 3 krążki grzybni z kilkudniowej hodowli na stałym podłożu PDA.

Rośliny borówki 'Duke' inokulowano na etapie przenoszenia z multidoniczek do większych doniczek przez umieszczenie inokulum w podłożu przed przesadzeniem roślin. Dawka inokulum stałego w przeliczeniu na jedną roślinę przesadzaną do doniczki o pojemności 0.5-1 L wyniosła 5 ml inokulum wymieszanego w podłożem.

Po posadzeniu roślin, podlano je. Szczepionkę dodano do podłoża, które stanowił sterylny torf kwaśny pH 3.5-4.5 wymieszany z perlitem w stosunku objętościowych 5:1. Zastosowanie podłoża sterylnego (121°C, 30 min) wymagało wysuszenia go w temperaturze 100°C (1 h przez 3 dni) oraz zraszania na bibule przez okres 2 tygodni.

Borówki 'Duke' inokulowane szczepionką charakteryzowały się statystycznie większą wysokością części nadziemnej (wzrost o 13%), biomasą części nadziemnej (wzrost o 21%) oraz wielkością liści (wzrost o 62%).

PL 238 335 Β1

LISTA SEKWENCJI < 110> Uniwersytet Jagielloński < 120> Szczepionka, sposób przygotowania szczepionki oraz sposób biotyzacji borówki amerykańskiej.

< 130> 7Θ5682 < 160> 4 < 170> Patentln version 3.5 < 210> 1 < 211> 564 < 212> DNA < 213> Xylaria sp. KKP2073p < 400> 1 gaagtaaaag tcgtaacaag gtttccgttg gtgaaccagc ggagggatca ttaaagagtt 60 ctataactcc caaacccatg tgaacatacc ttacgttgcc tcggcaggtc gtgcctaccc 120 cgtagcgtcc taccctgtag gacctacccg gtagacgcgg gtaagcctgc cggcggccca 180 cgaaactctg tttagtattg aattctgaac ctataactaa ataagttaaa actttcaaca 240 acggatctct tggttctggc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa 300 ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat tgcgcccatt agtattctag 360 tgggcatgcc tgttcgagcg tcatttccaa cccttaagcc cctgttgctt agtgttggga 420 gcctacggta atagtagctc ctgaaagtta gtggcggagt cggttcacac tctagacgta 480 gtagatttta tctcgcctat cagttggacc ggtcccttgc cgtaaaacca cctaattcta 540 aaggtgacct cgatcagaag aacc 564 < 210> 2 < 211> 552 < 212> DNA < 213> Oidiodendron maius UNIJAG.PL.368 <400> 2 tgatccgagg tcaaccacag agttgggggg ttctggcagg ctgccgccgg accctggagc60 gagagctgta ctacgctgag ggccaggcgg cgccgccact atctttaggg ccggccgcgg120 cgggcagggc ccaacaccaa gcgaggcttg agggttgaaa tgacgctcga acaggcatgc180 cctgcggaat accacagggc gcaatgtgcg ttcaaagatt cgatgactca ctgaattctg240 caattcgcat tacttatcgc atttcgctgc gttcttcatc gatgccagaa ccaagagatc3Θ0

PL 238 335 Β1

cgttgttgaa	agttttaacg	attatatagt	tactcggacg	acactaacat	tcagagtctg	360
tgaggtctct	ggcgggcacg	cgccagccgg	ggccggcggc	cgggcagggc	ccagcggccc	420
gccaaagcaa	cgagagtagt	gataacagtg	ggtgggagat	ctacccggag	ggcatgaact	480
ctgtaatgat	ccctccgcag	gttcacctac	ggagaccttg	ttacgacttt	tacttcctct	540
aaatgaccaa	ga					552

<210> 3 <211> 562 <212> DNA <213> Phialocephala fortinii UNIJAG.PL.382 <400> 3 cctgatccga ggtcaacctg taaaaattgg gggttctggc gagccaccgg gggaactcta60 tagcgggagt atgtactacg cttagagccc accggcgccg ccactaattt tgagggccgc120 ggagacccgc gtgccccaat accacgctag gcgtgagtgg ttaaatgacg ctcgaacagg180 catgccctgc ggaataccac agggcgcaat gtgcgttcaa agattcgatg attcactgaa240 ttctgcaatt cacattactt atcgcatttc gctgcgttct tcatcgatgc cagaaccaag390 agatccgttg ttgaaagttt taactattat atagtactca gacatcacta acattcagag360 tttggttctc tggcgggcac acacgagcag agcccgcagt ggaggccacg gcccgccaaa420 gcaacaatag tatgtaaaca cgggtgggtg taagctccta accgctgttt ccaacgttcg480 gtagcctcac ttgtaatgat ccttccgcag gttcacctac ggaaaccttg ttacgacttt540 tacttcctct aaatgaccaa ga562 <210> 4 <211> 540 <212> DNA <213> Hymenoscyphus sp. UNI3AG.PL.391 <400> 4

atccgaggtc aaccgtgaga	ttgggggttg	atggcaagca	t ccaccggga	accctatagc	60
gaggagtatt actacgctta	gagccagatg	gcgccgccac	tgattttaag	ggccgcggga	120
ccgcggaccc caacaccaag	ccgggcttga	gtggtcataa	tgacgctcga	acaggcatgc	180
ccctcggaat accaaggggc	gcaatgtgcg	ttcaaagatt	cgatgattca	ctgaattctg	240

PL 238 335 Β1

caattcacat	tacttatcgc	atttcgctgc gttcttcatc	gatgccagaa	ccaagagatc	300
cgttgttgaa	agttttaact	attatatagt	actcagacat	cactaaacaa	aagagtttgg	360
gtcctctggc	gggcacagcc	agccgaagcc	gacacgcgaa	cgtggcccgc	caaagcaaca	420
aaggtaaggt	attcaagggt	gggagatcta	cccgtgaggg	catgaactct	gtaatgatcc	480
ttccgcaggt	tcacctacgg	aaaccttgtt	acgactttta	cttcctctaa	atgaccaaga	540

Zastrzeżenia patentowe

Claims

1. Szczepionka do biotyzacji borówki amerykańskiej, zawierająca szczep rodzaju Xylaria sp. nr KKP 2073p, zdeponowany w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2073p.

2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera co najmniej jeden szczep należący do grzybów erikoidalnych.

3. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera grzyby szczepu Oidiodendron maius UNIJAG.PL.368 i/albo Phialocephala fortinii UNIJAG.PL.382 i/albo Hymenoscyphus sp. UNIJAG.PL.391.

4. Szczepionka według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera szczepy Xylaria sp. nr KKP 2073p, Oidiodendron maius UNIJAG.PL.368, Phialocephala fortinii UNIJAG.PL.382, Hymenoscyphus sp. UNIJAG.PL.391 w stosunku ilościowym 1:1:1:1.

5. Sposób przygotowania szczepionki do biotyzacji borówki amerykańskiej, znamienna tym, że szczep rodzaju Xylaria sp. nr KKP 2073p, zdeponowany w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2073p namnaża się w płynnym nośniku, korzystnie w 2% pożywce maltozowej, przez okres co najmniej 5 dni, a korzystnie 7 dni, po czym grzybnię oddziela się od nośnika.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że każdy szczep wchodzący w skład szczepionki namnaża się osobno na odpowiednim nośniku, a następnie szczepy miesza się ze szczepem rodzaju Xylaria sp. nr KKP 2073p w określonym stosunku ilościowym przed inokulacją borówki amerykańskiej.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że w przypadku gdy szczepionka zawiera szczep Oidiodendron maius UNIJAG.PL.368 i/albo Phialocephala fortinii UNIJAG.PL.382 i/albo Hymenoscyphus sp. UNIJAG.PL.391, nośnikiem do namnażania są otręby pszenne z domieszką ziemi okrzemkowej, korzystnie w proporcji objętościowej 4:1

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że otręby pszenne z domieszką ziemi okrzemkowej są sterylne.

9. Sposób według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że szczep Oidiodendron maius UNIJAG.PL.368 i/albo Phialocephala fortinii UNIJAG.PL.382 i/albo Hymenoscyphus sp. UNIJAG.PL.391 namnaża się w ciemności, w temperaturze między 20°C a 30°C, korzystnie 24°C, przez okres co najmniej 1 miesiąca.

10. Sposób biotyzacji borówki amerykańskiej, znamienny tym, że borówkę amerykańską inokuluje się szczepionką określoną w którymkolwiek z zastrz. od 1 do 4.

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że borówkę amerykańską inokuluje się podczas hodowli in vitro.

12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że borówkę amerykańską inokuluje się podczas przenoszenia z hodowli in vitro do multidoniczek.

13. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że borówkę amerykańską inokuluje się podczas przenoszenia z multidoniczek do większych doniczek

PL 238 335 B1

14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że inokuluje się rośliny nie starsze niż jedno- roczne.

15. Sposób według zastrz. 11 albo 12 albo 13 albo 14, znamienny tym, że szczepionkę dodaje się do podłoża sterylnego albo niesterylnego.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że podłożem jest torf kwaśny o pH od 3.5 do

4.5 wymieszany z perlitem.

17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że torf kwaśny o pH od 3.5 do 4.5 jest wymieszany z perlitem w stosunku objętościowym 5:1.