PL237710B1

PL237710B1 - 3β-Hydroxy-5α-chloro-6,19-oxidoandrostan-17-one and method of preparation of 3β-hydroxy-5α-chloro-6,19-oxidoandrostan-17-one

Info

Publication number: PL237710B1
Application number: PL426025A
Authority: PL
Inventors: Ewa Kozłowska; Agata Matera; Edyta Kostrzewa-Susłow; Tomasz Janeczko
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2018-06-22
Filing date: 2018-06-22
Publication date: 2021-05-17
Also published as: PL426025A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest 3β-hydroksy-5α-chloro-6,19-oksidoandrostan-17-onu i sposób wytwarzania 3β-hydroksy-5α-chloro-6,19-oksidoandrostan-17-onu o wzorze 2. Zgodnie z rozwiązaniem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Fusarium acuminatum KCh S1, następuje hydroliza grupy acetylowej przy C-3. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (chloroform).The subject of the application is 3β-hydroxy-5α-chloro-6,19-oxidoandrostan-17-one and a method for preparing 3β-hydroxy-5α-chloro-6,19-oxidoandrostan-17-one of formula 2. According to the solution, as a result operation of the enzymatic system contained in the cells of the Fusarium acuminatum KCh S1 strain, the hydrolysis of the acetyl group at C-3 occurs. The product obtained in this way is isolated from the aqueous culture of the microorganism in a known method, by extraction with an organic solvent immiscible with water (chloroform).

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 3β-hydroksy-5α-chloro-6,19-oksidoandrostan-17-onu.The present invention relates to a process for the preparation of 3β-hydroxy-5α-chloro-6,19-oxidoandrostane-17-one.

Metoda, według wynalazku może znaleźć zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym jako prekursor leków antykoncepcyjnych.The method according to the invention may find application in the pharmaceutical industry as a precursor to contraceptive drugs.

Wprowadzenie mostka 6,19-oksiranowego w strukturze związków steroidowych powoduje ugięcie szkieletu pomiędzy pierścieniami A i B. (G. Burton, M. Galigniana, S. de Lavallaz, A. L. BrachetCota, E. M. Sproviero, A. A. Ghini, C. P. Lantos and M. C. Damasco, Mol. Pharmacol., 1995, 47, 535543). Wykazano, że niektóre związki posiadające takie ugrupowanie mają interesujące aktywności biologiczne. Analog 21- hydroksyprogesteronu jest selektywnym antyglukokortykoidem pozbawionym mineralokortykoidowych i progestagenowych aktywności (G. P. Vicent, M. C. Monteserin, A. S. Veleiro, G. Burton, C. P. Lantos and M. D. Galigniana, Mol. Pharmacol., 1997, 52, 749-753), a analog 2 pregnanolonu jest silnym środkiem przeciwdrgawkowym (A. S. Veleiro, R. Rosenstein, M. L. Grilli, C. Jaliffa, F. Speroni and G. Burton, Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 343-346; M. Joselevich, A.A. Ghini, G. Burton 6,19- Carbon-bridged steroids. Synthesis of 6,19-methanoprogesterone. Org. Biomol. Chem. 2003, 1,939-943). Istnieją również doniesienia dotyczące działania zapobiegającego migotaniu komór serca C-19 steroidów posiadających mostek 6,19-oksiranowy. Z opisu patentowego US3001989 znane są właściwości przeciwbólowe i są bakteriostatyczne wobec bakterii Gram-dodatnich. Związki steroidowe posiadające mostek 6,19-oksiranowy są prekursorami posiadających właściwości antykoncepcyjne 19-norsteroidów (B. Berkoz, E. Denot, A. Bowers. Steroids CCXXX. Conversion of 6β,19-oxides and lactones into 19-nor steroids. Steroids. 1, 1963, 251-270).The introduction of a 6,19-oxirane bridge in the structure of steroid compounds causes a deflection of the skeleton between the A and B rings (G. Burton, M. Galigniana, S. de Lavallaz, AL BrachetCota, EM Sproviero, AA Ghini, CP Lantos and MC Damasco, Mol Pharmacol., 1995, 47, 535543). Some compounds having such a moiety have been shown to have interesting biological activities. The 21-hydroxyprogesterone analog is a selective antiglucocorticoid devoid of mineralocorticoid and progestagenic activities (GP Vicent, MC Monteserin, AS Veleiro, G. Burton, CP Lantos and MD Galigniana, Mol. Pharmacol., 1997, 52, 749-753), and pregnanolone analog 2 is a potent anticonvulsant (AS Veleiro, R. Rosenstein, ML Grilli, C. Jaliffa, F. Speroni and G. Burton, Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 343-346; M. Joselevich, AA Ghini , G. Burton 6.19-Carbon-bridged steroids. Synthesis of 6.19-methanoprogesterone. Org. Biomol. Chem. 2003, 1.939-943). There are also reports of C-19 steroids with a 6,19-oxirane bridge in preventing ventricular fibrillation. From the patent description US3001989 analgesic properties are known and are bacteriostatic against gram-positive bacteria. Steroid compounds having a 6,19-oxirane bridge are the precursors of the contraceptive properties of 19-norsteroids (B. Berkoz, E. Denot, A. Bowers. Steroids CCXXX. Conversion of 6β, 19-oxides and lactones into 19-nor steroids. Steroids. 1, 1963, 251-270).

Szczep Fusarium acuminatum KCh S1 znany jest z opisu zgłoszenia wynalazku P.420192 ujawniony jest również w publikacji (Kozłowska E., Urbaniak M., Kancelista A., Dymarska M., KostrzewaSusłow E.; Stępień Ł., Janeczko T., (2017) Biotransformation of dehydroepiandrosterone (DHEA) by environmental strains of filamentous fungi. RSC Advances 2017, 7, 31493-31501).The Fusarium acuminatum KCh S1 strain is known from the description of the invention application P.420192 is also disclosed in the publication (Kozłowska E., Urbaniak M., Kancelista A., Dymarska M., KostrzewaSusłow E .; Stępień Ł., Janeczko T., (2017 ) Biotransformation of dehydroepiandrosterone (DHEA) by environmental strains of filamentous fungi. RSC Advances 2017, 7, 31493-31501).

3β-hydroksy-5α-chloro-6,19-oksidoandrostan-17-onu znany jest ze stanu techniki. W zgłoszeniu patentowym US3141016 opisano sposób otrzymywania tego związku na drodze syntezy chemicznej, analogiczny sposób otrzymywania opisano w zgłoszeniu patentowym US3205227. Zgłoszenie patentowe CN102443038 również opisuje sposób otrzymywania 3β-hydroksy-5α-chloro-6,19-oksidoandrostan-17-onu w procesie syntezy chemicznej. W literaturze nie ma doniesień dotyczących otrzymywania 3β-hydroksy-5α-chloro-6,19-oksidoandrostan-17-onu na drodze biotransformacji.3β-hydroxy-5α-chloro-6,19-oxidoandrostane-17-one is known in the art. The patent application US3141016 describes a method of obtaining this compound by chemical synthesis, an analogous method of preparation is described in the patent application US3205227. Patent application CN102443038 also describes a method of obtaining 3β-hydroxy-5α-chloro-6,19-oxidoandrostane-17-one in the process of chemical synthesis. There are no reports in the literature on the preparation of 3β-hydroxy-5α-chloro-6,19-oxidoandrostane-17-one by biotransformation.

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Fusarium acuminatum KCh S1. Po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 3β-acetyloksy-5α-chloro-6,19-oksidoandrostan-17-on o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 12 godzin. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.The essence of the invention consists in introducing the strain Fusarium acuminatum KCh S1 into a medium suitable for filamentous fungi. After at least 48 hours, the substrate is introduced into the culture, which is 3β-acetyloxy-5α-chloro-6,19-oxidoandrostane-17-one of the formula I, dissolved in a water-miscible organic solvent. The transformation is carried out at a temperature of 20 to 30 degrees Celsius with continuous shaking for at least 12 hours. Subsequently, the product is extracted with a water-immiscible organic solvent and purified by chromatography.

W wyniku hydrolizy grupy acetylowej przy C-3 otrzymuje się 3β- hydroksy-5a-chloro-6,19-oksidoandrostan-17-on, a reakcję prowadzi się w wodnej kulturze szczepu Fusarium acuminatum KCh S1.Hydrolysis of the acetyl group at C-3 gives 3β-hydroxy-5a-chloro-6,19-oxidoandrostane-17-one, and the reaction is carried out in an aqueous culture of the Fusarium acuminatum KCh S1 strain.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 g : 1 L. Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.It is preferable that the ratio of the mass of the added substrate to the culture volume is 0.2 g: 1 L. It is also preferred that the process is carried out at a temperature of 25 degrees Celsius.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 3 dni.Additionally, it is preferred that the transformation is carried out for 3 days.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Fusarium acuminatum KCh S1, następuje hydroliza grupy acetylowej przy C-3. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (chloroform).By following the invention, the acetyl group at C-3 is hydrolyzed by the enzyme system contained in the cells of the Fusarium acuminatum KCh S1 strain. The product obtained in this way is separated from the aqueous culture of the microorganism by a known method by extraction with a water-immiscible organic solvent (chloroform).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 3β-hydroksy-5α-chloro-6,19-oksidoandrostan-17-onu, z wydajnością izolowaną na poziomie 50% (konwersja według GC=90%), w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu.The main advantage of the invention is the preparation of 3β-hydroxy-5α-chloro-6,19-oxidoandrostane-17-one with an isolated yield of 50% (GC conversion = 90%), at room temperature and pH natural for the strain.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.The invention is explained in more detail using an exemplary embodiment.

P r z y k ł a dP r z k ł a d

Do kolby Erlenmajera o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 5 g aminobaku i 15 g glukozy, wprowadza się szczep Fusarium acuminatum KCh S1. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 100 mg 3β-acetyloksy-5α-chloro-6,19-oksidoandrostan-17-onuTo the Erlenmeyer flask with a capacity of 2,000 cm ^3, which is 500 cm ^{3 of} a sterile medium containing 5 g aminobaku and 15 g of glucose, is introduced into a strain of Fusarium acuminatum SDS S1. After 72 hours of its growth, 100 mg of 3β-acetyloxy-5α-chloro-6,19-oxidoandrostane-17-one are added

PL 237 710 B1 o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ DMSO. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 3 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie chloroformem, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny heksan i aceton 2:1.Of formula 1, dissolved in 1 cm ^{3 of} DMSO. The transformation is carried out at 25 degrees Celsius with continuous shaking for 3 days. The reaction mixture was then extracted three times with chloroform, dried with anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated. The extract obtained is purified by chromatography using a 2: 1 mixture of hexane and acetone as the eluent.

Na tej drodze otrzymuje się 50 mg 3β-hydroksy-5α-chloro-6,19-oksidoandrostan-17-onu (konwersja według GC=90%).In this way, 50 mg of 3β-hydroxy-5α-chloro-6,19-oxidoandrostane-17-one are obtained (GC conversion = 90%).

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi:The obtained product is characterized by the following spectral data:

¹H NMR (600 MHz) (ppm) (CDCI3) δ: 1.06 (qd, 1 H, J = 13.0, 3.5 Hz, 11 -Κβ); 1.34 (s, 3H, 18-H); 1.43 (qd, 1H, J = 11.3, 5.8 Hz, 8-H); 1.45-1.49 (m, 2H, 1 -Ha, 7-Ha); 1.54 (tt, 1H, J = 13.2, 8.6 Hz, 15-Κβ); 1.60-1.68 (m, 1H, 1 -Κβ, 11-Ha, 14-H); 1.72 (dd, 1H, J = 12.6, 3.5 Hz, 12-Ha); 1.75 (ddd, 1H, J = 13.3, 5.6, 5.1 Hz, 2-Ha); 1.82-1.92 (m, 3H, 2-Κβ, 9-H, 15-Ha); 1.96 (ddd, 1H, J = 10.0, 5.0, 2.4 Hz, 7-Κβ); 2.01 (dt, 1 H, J = 12.3, 3.2 Hz, 12-Κβ); 2.03 (dd, 1 H, J = 13.6, 11.3 Hz, 4-Ha); 2.21 (ddd, 1H, J = 13.7, 4.3, 2.3 Hz, 4- Hβ); 2.57 (ddd, 1H, J = 19.0, 9.1,8.4 Hz, 16-Ha); 2.68 (ddd, 1H, J = 19.0, 8.6, 2.4 Hz, 16Hβ); 3.72 (d, 1 H, J = 8.7 Hz, one of 19-H); 3.92 (dd, 1 H, J = 8.7, 0.9 Hz, one of 19-H); 4.04 (d, 1H, J = 4.8 Hz, 6-Ha); 4.07 (tt, 1H, J = 11.1, ,4.6 Hz, 3-Ha). ¹³C NMR (151 MHz) (ppm) (CDCI3) δ: 23,40 (C-1); 30,97 (C-2); 66,34 (C-3); 43,72 (C-4); 75,61 (C-5); 81,76 (C-6); 30,70 (C-7); 35,73 (C-8); 45,64 (C-9); 45,71 (C-10); 23,34 (C-11); 39,32 (C-12); 83,08 (C-13); 44,84 (C-14); 19,55 (C-15); 28,63 (C-16); 171,39 (C-17); 20,47 (C-18); 68,30 (C-19). ¹ H NMR (600 MHz) (ppm) (CDCl 3) δ: 1.06 (qd, 1H, J = 13.0, 3.5 Hz, 11-β); 1.34 (s, 3H, 18-H); 1.43 (qd, 1H, J = 11.3, 5.8 Hz, 8-H); 1.45-1.49 (m, 2H, 1-Ha, 7-Ha); 1.54 (mp, 1H, J = 13.2, 8.6 Hz, 15-Κβ); 1.60-1.68 (m, 1H, 1-β, 11-Ha, 14-H); 1.72 (dd, 1H, J = 12.6, 3.5 Hz, 12-Ha); 1.75 (ddd, 1H, J = 13.3, 5.6, 5.1 Hz, 2-Ha); 1.82-1.92 (m, 3H, 2-Κβ, 9-H, 15-Ha); 1.96 (ddd, 1H, J = 10.0, 5.0, 2.4 Hz, 7-Κβ); 2.01 (dt, 1H, J = 12.3, 3.2 Hz, 12-Κβ); 2.03 (dd, 1H, J = 13.6, 11.3Hz, 4-Ha); 2.21 (ddd, 1H, J = 13.7, 4.3, 2.3 Hz, 4-Hβ); 2.57 (ddd, 1H, J = 19.0, 9.1, 8.4 Hz, 16-Ha); 2.68 (ddd, 1H, J = 19.0, 8.6, 2.4 Hz, 16Hβ); 3.72 (d, 1H, J = 8.7Hz, one of 19-H); 3.92 (dd, 1H, J = 8.7,0.9 Hz, one of 19-H); 4.04 (d, 1H, J = 4.8Hz, 6-Ha); 4.07 (mp, 1H, J = 11.1, 4.6 Hz, 3-Ha). ¹³ C NMR (151 MHz) (ppm) (CDCl 3) δ: 23.40 (C-1); 30.97 (C-2); 66.34 (C-3); 43.72 (C-4); 75.61 (C-5); 81.76 (C-6); 30.70 (C-7); 35.73 (C-8); 45.64 (C-9); 45.71 (C-10); 23.34 (C-11); 39.32 (C-12); 83.08 (C-13); 44.84 (C-14); 19.55 (C-15); 28.63 (C-16); 171.39 (C-17); 20.47 (C-18); 68.30 (C-19).

Claims

1. The method for the production of 3β-hydroxy-5α-chloro-6,19-oxidoandrostane-17-one, characterized in that the Fusarium acuminatum KCh S1 strain is introduced into a medium suitable for filamentous fungi, then, after at least 48 hours, the culture is introduced is the substrate, which is 3β-acetyloxy-5α-chloro-6,19-oxidoandrostane-17-one of the formula 1, dissolved in an organic solvent miscible with water, the transformation is carried out at a temperature of 20 to 30 degrees Celsius, with continuous shaking for a maximum of 12 hours, then the product is extracted with a water-immiscible organic solvent and purified by chromatography.

2. The method according to p. The method of claim 1, wherein the ratio of the weight of the added substrate to the volume of the culture is 0.2 g: 1 L.

3. The method according to p. The process of claim 1, wherein the temperature is 25 degrees Celsius.

4. The method according to p. The method of claim 1, wherein the transformation is carried out for 3 days.