PL237648B1 - Sposób wytwarzania szerokoporowatej biodegradowalnej membrany polimerowej - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szerokoporowatej (zawierającej pory o średnicy powyżej 30 ąm) biodegradowalnej polimerowej membrany metodą elektroprzędzenia. Membrany takie mogą zostać przykładowo zastosowane jako rusztowania komórkowe do trójwymiarowych hodowli komórkowych lub w procesach filtracyjnych.

Obecnie szerokoporowate membrany są stosowane zarówno w skali laboratoryjnej, jak i przemysłowej do takich celów, jak na przykład: filtracja, uzdatnianie wody (US 9,457,325), podłoża do hodowli komórkowych (PL 223271, PL 229497) oraz separatory półogniw baterii. Do ich wytwarzania używane są najczęściej polimery syntetyczne m. in.: polilaktyd (PLA), poliglikolid (PGA), polikaprolakton (PCL), polisulfon (PSU), polieterosulfon (PES), poliwinylopirolidon (PVP) oraz ich kopolimery. Są one biozgodne, biokompatybilne i biodegradowalne, a produkty ich rozpadu (monomery, CO2 i H2O) nie są toksyczne.

Szczególnie istotnym parametrem opisującym właściwości membran jest ich porowatość i wielkość porów. W przypadku zastosowania membran jako rusztowania do hodowli komórkowych odpowiednia wielkość i układ porów zapewniają właściwą migrację komórek, ich namnażanie oraz transport substancji odżywczych i metabolitów. W przypadku procesów filtracyjnych parametry te określają przepuszczalność membran, wyznaczając graniczną wielkość możliwych do odseparowania cząstek. Dobór odpowiedniego polimeru membranotwórczego (lub mieszaniny polimerów) może mieć wpływ na charakter polarny membrany, a także jej hydrofilowość/hydrofobowość, polepszając jej selektywne właściwości separacyjne. Przykładowo, opracowano polisulfonowe membrany z domieszką kopolimeru styrenu i winylopirolidonu o poprawionej hydrofilowości w stosunku do czystego polisulfonu, przeznaczone do ultrafiltracji roztworów wodnych (J Membrane Sci 216 (2003) 95-106).

Polimerowe membrany można przykładowo otrzymać w procesie inwersji faz (metoda sucha i mokra) oraz w procesie elektroprzędzenia. W procesach inwersji faz stosuje się układ trójskładnikowy: polimer membranotwórczy oraz jego rozpuszczalnik i nierozpuszczalnik, przy czym rozpuszczalnik i nierozpuszczalnik dobrze mieszają się ze sobą.

Sucha metoda inwersji faz polega na rozpuszczeniu polimeru w rozpuszczalniku w podwyższonej temperaturze, dodaniu nierozpuszczalnika, a następnie odparowaniu z takiego trójskładnikowego układu w temperaturze otoczenia rozpuszczalnika i nierozpuszczalnika z warstwy roztworu umieszczonego na szklanej płytce (Electron J Biotechnol (2000) 3-23).

W metodzie mokrej inwersji faz szklana płytka z wylanym na nią roztworem membranotwórczym (polimerem rozpuszczonym w rozpuszczalniku) umieszczana jest w kąpieli żelującej (nierozpuszczalniku). Metodę modyfikuje się przez dodanie substancji porotwórczej do roztworu polimeru membranotwórczego. Rolę porofora przykładowo, mogą pełnić kryształki soli (US 551478 A) lub polimerowe włókniny. Po uformowaniu membrany porofor zostaje usunięty poprzez rozpuszczenie w jego rozpuszczalniku będącym jednocześnie nierozpuszczalnikiem polimeru membranotwórczego. Polimerowe porofory (włókniny) tego typu można wytwarzać metodą elektroprzędzenia z takich polimerów jak: PEG i PVP (CN 102886068 A). Znane jest także zastosowanie włókniny celulozowej jako porofora (PL 223271, PL 211793). Zastosowanie poroforów pozwala na kontrolowanie porowatości membran oraz wielkości ich porów.

Wadą obu wyżej wymienionych metod wytwarzania szerokoporowatych membran jest stosowanie wielu toksycznych rozpuszczalników, które mogą ograniczać późniejsze zastosowania membran oraz wymuszają konieczność ich wielokrotnego płukania. Powszechnie stosowane rozpuszczalniki to znane ze stanu techniki: dimetyloformamid, dioksan, tetrahydrofuran lub dimetylosulfotlenek. Proces rozpuszczania roztworu membranotwórczego najczęściej trzeba prowadzić w podwyższonej temperaturze w celu poprawy rozpuszczalności polimerów.

Kolejną wadą metody inwersji faz jest długi czas wytwarzania membrany, wynoszący od 24 godzin (Ma P. X., Scaffolds for tissue fabrications; Materials Today; 2004; 30) do nawet kilku tygodni (PL 211793) i konieczność jej suszenia (często w suszarkach próżniowych). Ponadto, wielkość porów w otrzymywanych tym sposobem membranach nie przekracza 20-30 mikrometrów, co w przypadku hodowli komórek jest najczęściej niewystarczającą wielkością do ich prawidłowego wzrostu. Przykładowo chondrocyty wymagają porów o wielkości około 80-150 mikrometrów (optymalnie około 100 ąm).

Ostatnią z wymienionych metod otrzymywania membran jest proces elektroprzędzenia, w którym włókniny polimerowe otrzymuje się z włókien o różnej morfologii i średnicy z użyciem sił elektrostatycznych. W metodzie elektroprzędzenia włókna otrzymuje się ze stopionych polimerów lub ich roztworów,

PL 237 648 B1 z zastosowaniem wysokiego napięcia. Typowo, stosuje się stałe napięcie elektryczne wysokiej wartości, w zakresie od 2 do 30 kV. Aparatura do formowania włókien metodą elektroprzędzenia składa się ze źródła wysokiego napięcia, podajnika roztworu polimerowego, którym jest najczęściej strzykawka z igłą, pompy z kontrolowanym przepływem oraz kolektora. Aparaturę umieszcza się zwykle w komorach lub pomieszczeniach z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością powietrza. Roztwór polimeru membranotwórczego umieszcza się w podajniku roztworu polimerowego, a do dyszy (igły) przykłada się wysokie napięcie. Płyn pod wpływem przyłożonego napięcia ulega rozciągnięciu w cienką strugę. Tworzące się włókna są zbierane na kolektorze.

Przykładowo, membrana otrzymywana metodą elektrostatyczną z zastosowaniem napięcia stałego jest znana z opisu patentowego US 9,457,325 B2 i wykonana z polieterosulfonu rozpuszczonego w N-metylo-2-pirolidonie. Włókniny otrzymane z włókien o średnicy z zakresu 200-500 nm poddawane są płukaniu i utrwalaniu w wodzie destylowanej, a następnie suszeniu w powietrzu. Tak przygotowana włóknina może być zastosowana jako filtr do uzdatniania wody. Membrana wytworzona tą metodą charakteryzuje się małą porowatością i wielkością porów, co znacznie ogranicza jej potencjalne zastosowania, szczególnie w inżynierii biomedycznej. W opisie patentowym CN 102886068 opisano sposób otrzymywania porowatego rusztowania komórkowego metodą elektroprzędzenia z zastosowaniem napięcia stałego i roztworu kopolimeru polilaktyd-co-glikolid z domieszką PVP jako porofora. Po procesie przędzenia PVP usuwa się ze struktury membrany, płucząc ją w roztworze wodnym. Wadą tej metody jest dwuetapowa produkcja membran.

Elektroprzędzenie jest techniką używaną do wytwarzania ultracienkich nano- i mikrowłókien polimerowych. Włókniny otrzymane metodą elektroprzędzenia mają zazwyczaj zbyt małe pory, co eliminuje je z wielu zastosowań. Nieoczekiwanie okazało się, że użycie wysokiego napięcia podawanego w sposób impulsowy skutkuje wytworzeniem szerokoporowatych membran w miejsce standardowo otrzymywanych nano- i mikrowłóknin. Proces ten prowadzi się w temperaturze pokojowej, a otrzymany produkt powstaje w jednoetapowym procesie i nie wymaga układu polimerów (membranotwórczy i porofor), ani długotrwałej obróbki poprocesowej.

Sposób wytwarzania szeroko porowatej membrany z polimeru biodegradowalnego, według wynalazku charakteryzuje się tym, że polimer rozpuszcza się w rozpuszczalniku lub mieszaninie rozpuszczalników i z przygotowanego w ten sposób roztworu membranotwórczego wytwarza się włókna metodą elektroprzędzenia. Sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że w procesie elektroprzędzenia stosuje się napięcie stałe od 2 kV do 30 kV podawane impulsowo, przy częstotliwości impulsów od 1 Hz do 100 Hz, i czasie trwania impulsu od 1 ms do 10 ms. W sposobie według wynalazku stosuje się roztwór membranotwórczy o stężeniu polimeru w zakresie 10-20% i o lepkości w zakresie 400-2000 mPa-s.

Jako polimer membranotwórczy stosuje się polimer lub mieszaninę polimerów wybranych z grupy: polimery winylowe, poliestry, polieterosulfony, polisulfony, poliamidy, poliuretany.

Korzystnie jako polimer stosuje się: polilaktydy, poliwinylopirolidony, polikaprolaktony.

Korzystnie rozpuszczalnik polimeru membranotwórczego jest wybrany z grupy obejmującej: alkohole (C1-C10), DMF (N,N-dimetyloformamid), cykloheksanon, chloroform, aceton, N,N-dimetyloacetamid, m-metylopirolidon, halogenowane pochodne węglowodorów C1 do C5, ketony alifatyczno-aromatyczne C7 do C11.

Korzystnie gotową membranę suszy się w przepływie laminarnym powietrza przez 0,5-2 h, w celu odparowania pozostałości rozpuszczalnika.

Sposób według wynalazku realizuje się tak, że roztwór membranotwórczy umieszcza się w strzykawce, którą za pomocą drenu łączy się z metalową dyszą. Strzykawkę umieszcza się w pompie inf uzyjnej i włącza tłoczenie roztworu z założonym przepływem objętościowym. Do dyszy podłączony jest przewodem generator wysokiego napięcia impulsowego, w którym nastawia się parametry: napięcie elektryczne w zakresie 2-30 kV, częstotliwość wysyłania impulsów elektrycznych w zakresie 1-100 Hz oraz czas trwania pojedynczego impulsu w zakresie 1-10 ms. W odległości 4,5-35 cm od dyszy umieszczony jest uziemiony kolektor odbiorczy, na którym zbierana jest otrzymywana membrana. Całość umieszcza się w przezroczystej komorze wyposażonej w system kontroli i pomiaru wilgotności oraz temperatury otoczenia.

Korzystnie stosuje się dreny teflonowe. Korzystnie stosuje się dysze stalowe o średnicy wewnętrznej od 0,1 do 2,5 mm. Korzystnie roztwór tłoczy się z natężeniem przepływu objętościowego z zakresu 0,1-5 ml/h.

PL 237 648 B1

Korzystnie jako kolektor stosuje się obrotowy kolektor bębnowy o średnicy z zakresu 0,5-300 mm lub kolektor płaski o powierzchni czynnej z zakresu 1-100 cm², bądź też wcześniej przygotowane porowate podłoże polimerowe lub ceramiczne w formie płaskiej lub rurowej (także membrany kapilarnej) o małych porach lub włókninę o grubości z zakresu 20-400 μm wykonaną korzystnie na drodze procesu elektroprzędzenia.

Sposobem według wynalazku uzyskuje się trójwymiarową membranę szerokoporowatą w całej objętości, o średnicy porów większej niż 20 μm, korzystnie 30-350 μm i budowie podobnej do charakterystycznej budowy membran otrzymywanych za pomocą mokrej inwersji faz. Pory membrany są ze sobą połączone, stanowiąc istotną dla prowadzenia hodowli komórkowych cechę, która umożliwia transport substancji odżywczych, metabolitów i produktów degradacji polimeru membrano twórczego.

Sposobem według wynalazku można wytworzyć także szerokoporowatą warstwę membranową naniesioną na inny nośnik polimerowy, ceramiczny, spiek metaliczny, szklany lub kwarcowy w formie płaskiej lub rurowatej, korzystnie kapilarnej o średnicy wewnętrznej w zakresie 0,1-5,0 mm dla kapilarnych i do 56 mm dla rurowych.

Sposób według wynalazku pozwala na otrzymanie membran w jednoetapowym procesie i nie wymaga używania poroforów, dodatkowych rozpuszczalników ani kąpieli płuczących.

W zależności od rodzaju polimeru membranotwórczego, membrany otrzymane zgodnie ze sposobem według wynalazku mogą zostać zastosowane do prowadzenia trójwymiarowych hodowli komórkowych przykładowo hepatocytów, chondrocytów, komórek przytarczyc, macierzystych, genetycznie modyfikowanych lub patologicznie zmienionych. Wielkość porów pozytywnie wpływa na kształt i właściwości biologiczne komórek, zapobiegając ich odróżnicowaniu i utrzymując ich funkcje fizjologiczne. Ponadto, pokrycie powierzchni wąskoporowatej włókniny polimerowej, osadzonej uprzednio na kolektorze odbiorczym, warstwą szerokoporowatej membrany według wynalazku, pozwala na uzyskanie dwuwarstwowego rusztowania komórkowego, mogącego służyć do hodowli ekwiwalentów skóry, podobnego do zawartego w opisie patentowym PL 229497. Membrany wytworzone z odpowiednich roztworów membranotwórczych mogą zostać również zastosowane w procesach filtracyjnych lub jako separatory półogniw galwanicznych ze względu na silny polarny charakter i hydrofilowość polepszającą selektywne właściwości separacyjne membran.

Membrana otrzymana według wynalazku została pokazana na zdjęciach wykonanych skaningowym mikroskopem elektronowym Hitachi P-1000. Próbki przed badaniem zostały napylone złotem celem zwiększenia ich przewodności. Fig. 1 przedstawia membranę szeroko porowatą wykonaną z PVP. Fig. 2 przedstawia membranę szeroko porowatą wykonaną z PLA.

Sposób według wynalazku został opisany w przykładach.

P r z y k ł a d 1

Przygotowano roztwór membranotwórczy o stężeniu 17% w/w w kolbie stożkowej o objętości 100 ml rozpuszczając 8,5 g poliwinylopirolidonu (PVP; Mcz = 1300 kDa) w 41,5 g etanolu (96%), w temperaturze 25°C. Roztwór mieszano przy użyciu mieszadła magnetycznego i elementu mieszającego o trójkątnym kształcie, aż do całkowitego rozpuszczenia polimeru. Uzyskany roztwór miał lepkość 579 mPa-s. Następnie pobrano roztwór do strzykawki typu luer-lock o pojemności 10 ml, połączono z drenem teflonowym o pojemności 5 ml i umieszczono w pompie infuzyjnej. Na drugim końcu drenu (umieszczonego w uchwycie w komorze do elektroprzędzenia) zamocowano dyszę o średnicy wewnętrznej 0,9 mm. W odległości 15 cm od końcówki dyszy umiejscowiono płaski, okrągły, aluminiowy kolektor o średnicy 5 cm. Następnie dren i dyszę wypełniono roztworem membranotwórczym, a w generatorze impulsów elektrycznych ustawiono parametry elektryczne procesu elektroprzędzenia: napięcie elektryczne 8 kV, częstotliwość impulsów elektrycznych 50 Hz oraz czas trwania pojedynczego impulsu 7 ms. Generator połączono z dyszą za pomocą przewodu. Po ustawieniu w pompie infuzyjnej natężenia przepływu roztworu polimeru na wartość 0,9 ml/h i uruchomieniu generatora wysokiego napięcia rozpoczęto proces elektroprzędzenia, który trwał do czasu uzyskania warstwy produktu na kolektorze grubości 0,2-0,5 mm. Gotową membranę suszono dodatkowo w przepływie laminarnym powietrza przez 1 godzinę, w temperaturze 25°C, w celu odparowania pozostałości rozpuszczalnika. Otrzymano porowatą membranę o średnicach porów wynoszących od 40 do 140 μm. Jej powierzchnię zaprezentowano na obrazie spod skaningowego mikroskopu elektronowego - SEM (Fig. 1). Przedstawiono również przykładową analizę wielkości porów (Fig. 2).

PL 237 648 B1

P r z y k ł a d 2

Przygotowano roztwór membranotwórczy tak jak w przykładzie 1, z tą różnicą, że jego stężenie wynosiło 10% w/w, a do jego wykonania użyto 5 g polilaktydu (PLLA; Mcz = 200 kDa) rozpuszczonego w 45 g mieszaniny rozpuszczalników: chloroform i dimetyloformamid (stosunek objętościowy 9:1). Uzyskany roztwór miał lepkość 1020 mPa s. Proces elektroprzędzenia przeprowadzono podobnie jak w przykładzie 1, z tą różnicą, że zmieniono wartości poniższych parametrów procesowych: odległość dyszy od kolektora: 5 cm; parametry elektryczne: napięcie elektryczne 15 kV, częstotliwość impulsów elektrycznych 30 Hz oraz czas trwania pojedynczego impulsu 5 ms.

Otrzymano porowatą membranę o średnicach porów wynoszących do 40 pm. Jej powierzchnię przedstawiono na obrazie SEM (Fig. 3). Przedstawiono również przykładową analizę wielkości porów (Fig. 4).

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania szerokoporowatej membrany z polimeru biodegradowalnego, w którym polimer membranotwórczy rozpuszcza się w rozpuszczalniku lub mieszaninie rozpuszczalników i z przygotowanego w ten sposób roztworu membranotwórczego wytwarza się membranę metodą elektroprzędzenia, znamienny tym, że w procesie elektroprzędzenia stosuje się napięcie stałe od 2 kV do 30 kV podawane impulsowo, przy częstotliwości impulsów od 1 Hz do 100 Hz, i czasie trwania impulsu od 1 ms do 10 ms, przy czym stosuje się roztwór membranotwórczy o stężeniu polimeru w zakresie 10-20% i o lepkości w zakresie 400-2000 mPa-s.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako polimer membranotwórczy stosuje się polimer lub mieszaninę polimerów wybranych z grupy: polimery winylowe, poliestry, polieterosulfony, polisulfony, poliamidy, poliuretany.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako polimer stosuje się: polilaktydy, poliwinylopirolidony, polikaprolaktony.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczalnik polimeru membranotwórczego jest wybrany z grupy obejmującej: alkohole (C1-C10), DMF (N,N-dimetyloformamid), cykloheksanon, chloroform, aceton, N,N-dimetyloacetamid, m-metylopirolidon, halogenowane pochodne węglowodorów Ci do C5, ketony alifatyczno-aromatyczne C7 do C11.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór membranotwórczy tłoczy się z podajnika z dyszą połączoną z generatorem wysokiego napięcia impulsowego, z prędkością przepływu objętościowego w zakresie 0,1-5 ml/h, w kierunku kolektora odbiorczego, który umieszcza się w odległości 4,5-35 cm od dyszy.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się dyszę o średnicy wewnętrznej od 0,1 do 2,5 mm.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że gotową membranę suszy się w przepływie laminarnym powietrza przez 05-2 h.