PL236111B1 - Sposób wytwarzania dynamicznego substytutu kości gąbczastej - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania dynamicznego substytutu kości gąbczastej.

Biodegradowalne, dynamiczne substytuty kości gąbczastej mają za zadanie naśladować ludzką zewnątrzkomórkową macierz i wspierać wzrost żyjących komórek lub stymulować endogenne komórki w celu wspomagania tworzenia i regeneracji tkanek, z pomocą zewnętrznych czynników biologicznych. Wydajna regeneracja kości gąbczastej po przebytych urazach bądź resekcjach jest możliwa przy zastosowaniu odpowiedniego materiału (HY. Mi, X. Jing, LS. Turng, J Cell Plast 2015, 51(2), 165-196; M. Grolik, Zeszyty Naukowe Towarzystwa Doktorantów UJ. Nauki Ścisłe 2011,3, 33-41).

Substytut kości gąbczastej przeznaczony do stosowania do regeneracji tej tkanki musi spełniać określone wymogi. Musi być nietoksyczny wobec komórek kostnych i szpiku kostnego oraz musi mieć odpowiednią wielkość porów dopasowaną do rozmiaru komórek regenerowanej tkanki. W przypadku tkanki kostnej rozmiar porów powinien zawierać się w przedziale 30-300 pm. Ponadto substytut taki musi mieć odpowiednią dla tkanki kostnej wytrzymałość mechaniczną, określaną za pomocą modułu Younga. W przypadku kości jest to wartość 50-100 MPa. Dodatkowo substytut kości powinien zapewniać dostęp substancji odżywczych i czynników wzrostu. Znane substytuty kości charakteryzują się porowatością otwartą <80%, nasiąkliwością masową względem izopropanolu powyżej 100-500% i modułem Younga odpowiadającym kości gąbczastej około 50-100 MPa (M. Dziadek, K. Cholewa-Kowalska, Acta Bio-Optica et Informatica Medica, Inżynieria Biomedyczna 2014, 20(4), 193-203).

Sam materiał nie jest jednak w stanie dostarczyć odpowiednich składników nowotworzącej się tkance. Brakujące składniki odżywcze mogą być dostarczane z osocza bogatopłytkowego, otrzymanego z krwi biorcy implantu. Jednak umieszczenie osocza wewnątrz silnie porowatego implantu nie jest łatwe (Y. Ikada, Tissue engineering: fundamentals and applications, Academic Press/Elsevier, Amsterdam, Boston 2006). Dodatkowym problemem jest to, że implanty wykonane z poliestrów alifatycznych np. z polilaktydu lub polikaprolaktonu, są hydrofobowe, co utrudnia umieszczanie w nich czynników biologicznych, takich jak osocze.

Z polskiego zgłoszenia patentowego P.415317 znany jest sposób wytwarzania polilaktydowych rusztowań gąbczastych do hodowli komórek nabłonka walcowatego, zgodnie z którym w reaktorze szklanym umieszcza się roztwór polilaktydu w dioksanie, dichlorometanie lub chloroformie o stężeniu 1,5-6% wag., roztwór miesza się przez 20-28 h z szybkością 550-700 obr/min., w temperaturze 20-30°C, do całkowitego rozpuszczenia polimeru, następnie do roztworu dodaje się nierozpuszczalnik polilaktydu, którym jest woda w takiej ilości, aby stężenie nierozpuszczalnika wynosiło od 0--5% wag. w stosunku do masy polimeru. Po uzyskaniu jednorodnego roztworu polimeru, roztwór zamraża się przez 20-28 h w temperaturze -10 do -20°C, i uzyskane zamrożone rusztowanie poddaje się żelowaniu w wodzie z metanolem i/albo etanolem w temperaturze od -10°C do -20°C przez 30-48 h, a następnie otrzymane rusztowanie oczyszcza się w wodzie i suszy się z pozostałości wody i rozpuszczalników.

Sposób według zgłoszenia P.415435 prowadzi do otrzymania rusztowania polilaktydowego o wewnętrznej gąbczastej strukturze i regularnym rozmieszczeniu porów, z funkcją dostarczania substancji odżywczych. Rusztowanie ma pory o dużej średnicy, powyżej 40 pm, przy czym pory mają kształt cylindryczny o znacznej długości, powyżej 200 pm. Taki rozmiar i kształt porów jest pożądany przy namnażaniu komórek nabłonka walcowatego, ale nie jest odpowiedni dla komórek regenerowanej tkanki kostnej. Ponadto rusztowanie opisane w P.415317 nie posiada wytrzymałości mechanicznej koniecznej w przypadku substytutu kości.

Celem wynalazku rozwiązanie wyżej zdefiniowanych problemów.

Sposób wytwarzania dynamicznego substytutu kości gąbczastej według wynalazku charakteryzuje się tym, że sporządza się roztwór polilaktydu w dioksanie, o stężeniu 1-12% wag. Roztwór miesza się przez 3-24 h, w temperaturze 20-60°C, z szybkością 160-300 rpm. Następnie dodaje się wodę demineralizowaną w ilości 8-20% wag. w stosunku do polimeru, po czym, po uzyskaniu klarownego roztworu polimeru, roztwór umieszcza się w formie teflonowej i zamraża się w temperaturze od -30 do -10°C, przez 12-36 h. Następnie zamrożony produkt umieszcza się w metanolu lub bezwodnym etanolu o temperaturze od -50 do -10°C na 3-5 dni. Uformowany substytut oczyszcza się w wodzie, a następnie suszy.

Korzystnie stosuje się polilaktyd o ciężarze cząsteczkowym M n 50 000-150 000 g/mol, o polidyspersyjności PDI 1,2-2,1, zawartości Sn <20 ppm.

Korzystnie stosuje się poli-L-laktyd o 0-1% zawartości centrów D.

Korzystnie stosuje się dioksan o czystości co najmniej 99,5%.

PL 236 111 B1

Korzystnie wodę demineralizowaną dodaje się za pomocą pompy strzykawkowej, przez 5-20 min.

Dozowanie roztworu do formy korzystnie prowadzi się przez co najmniej 30 min.

Korzystnie suszenie prowadzi się przez 8-20 h, w temperaturze 30-45°C, przy wilgotności względnej 30-40% oraz pod próżnią.

W wyniku procesu przeprowadzonego zgodnie z wynalazkiem uzyskuje się trójwymiarowy substytut kości gąbczastej, o wielkości porów w przedziale 30-150 μm, którego struktura wewnętrzna (mikrostruktura) oprócz sieci połączonych porów zawiera także makrostrukturę. Pory we wnętrzu rusztowania mogą być zasiedlane przez namnażające się komórki, a przez makropory na powierzchni komórki kostne wnikają do wnętrza substytutu oraz zachodzi transport metabolitów i substancji odżywczych. W rezultacie komórkom są dostarczane niezbędne do wzrostu substancje odżywcze poprzez kontrolowane i stopniowe ich uwalnianie ze struktury skafoldu wraz z postępującą hodowlą. Otrzymany substytut charakteryzuje się porowatością otwartą 90-95%, nasiąkliwością względem izopropanolu 200-1600% oraz modułem Younga 85-150 MPa.

W porównaniu ze sposobem znanym ze zgłoszenia P.415317 zastosowano początkowe mieszanie roztworu ze znacznie niższą szybkością oraz zastosowano zdecydowanie większą masę porofora (wody) w stosunku do masy polimeru. Ponadto kąpiel żelującą realizuje się w alkoholu, podczas gdy w wynalazku według P.415317 stosuje się wodę z alkoholem. Istotne jest także prowadzenie procesu w formie teflonowej, dzięki czemu uzyskuje się odpowiednią morfologię powierzchni. Te zmiany pozwoliły na uzyskanie innej struktury porów, odpowiedniej dla substytutu kości gąbczastej, z zachowaniem funkcji dostarczania substancji odżywczych do wnętrza rusztowania.

Sposób według wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach.

Na rysunku przedstawiono:

Fig. 1 - obrazy SEM substytutów otrzymanych wg wynalazku, 1 - spód, 2 - bok, 3 - przekrój poziomy, 4 - przekrój pionowy (według przykładu 1),

Fig. 2 - obrazy SEM substytutów otrzymanych według przykładu porównawczego 2, Fig. 3 - obrazy SEM substytutów otrzymanych według przykładu porównawczego 3.

P r z y k ł a d 1

W kolbie stożkowej 250 mL rozpuszczano 10,34 g poli-L-laktydu (o M n 86 000 g/mol, PDI 1,8, zawartość Sn 10 ppm) w 200 mL dioksanu o czystości 99,5% przez 3 h, w 60°C. Następnie roztwór PLA/dioksan ochładzano do 30°C i mieszano przez 21 h przy użyciu mieszadła magnetycznego oraz elementu mieszającego, z szybkością mieszania 200 min^-1. Stosuje się mieszadło magnetyczne z elementem baryłkowym, którego objętość wynosi min. 50% objętości roztworu polimeru. Następnie, za pomocą pompy strzykawkowej, wkroplono porcjami 1 mL (2 razy po 0,5 mL) wody demineralizowanej, o czystości miliq. Czynność powtórzono po około 13 minutach, upewniając się, że roztwór jest klarowny. Sumarycznie dodano 2 mL wody do 200 mL roztworu polimeru (w którym było 10,34 g PLA, stężenie porofor: polimer = 19,3%). Po wkropleniu ostatniej porcji porofora odczekano 30 minut. Po upływie tego czasu, roztwór ochłodzono do 37°C i wylano do odpowiednio przygotowanych teflonowych form z odkręcanym dnem o pojemności 50 mL. Natychmiast po wylaniu roztworów formy umieszczono w zamrażarce, w temperaturze -18°C, na 24 h. Po upływie tego czasu powstałe substytuty wyjęto z form i umieszczono w 300 mL metanolu schłodzonego do -10°C). Czas kąpieli w metanolu: 5 dni. Następnie substytuty umieszczono w 400 mL wody deminarelizowanej na 2,5 h, w temperaturze pokojowej. Substytuty suszono przez 20 h w temp 30°C pod próżnią 10 mbar. Otrzymano substytut posiadający mikro i makroporowatość (Fig. 1), spełniający wymagania implantu do regeneracji kości z wykorzystaniem osocza bogatopłytkowego. Otrzymuje się rusztowanie o nasiąkliwości ok. 1200%, porowatości 94,6% (średni rozmiar porów 150 μm), a moduł Younga wynosi 136 MPa.

P r z y k ł a d 2

Przeprowadzono proces jak w Przykładzie 1, z tą różnicą, że zastosowano 0,5% roztwór poli-L-laktydu o M_n 86 000 g/mol, PDI 1,7. Nie stosowano dodatku ciekłego porofora, a forma była wykonana ze szkła. Otrzymano substytut zawierający w swojej strukturze jedynie nieliczne zaklejone pory o rozmiarze <10 μm (Fig. 2). Nasiąkliwości masowej i porowatości nie udało się oznaczyć bo rusztowanie pływało po powierzchni izopropanolu. Moduł Younga wynosił ok. 35 MPa. Rusztowanie to nie spełnia wymagań stawianych implantom kostnym.

P r z y k ł a d 3

Przeprowadzono proces jak w Przykładzie 1, z tą różnicą, że zastosowano 0,1% roztwór poli-L-laktydu o M n 86 000 g/mol, PDI 1,7. Zastosowano dodatek ciekłego porofora (wody) w ilości 10% wag

PL 236 111 B1 w stosunku do polimeru. Forma była wykonana ze szkła. Otrzymano substytut kości zawierający w swojej strukturze nieliczne pory o rozmiarze <10 μm (Fig. 3) oraz grubą warstwę podstawą ok. 50 μm uniemożliwiającą przedostanie się osocza do jego wnętrza. Nasiąkliwości masowej i porowatości nie udało się oznaczyć, bo rusztowanie pływało po powierzchni izopropanolu. Moduł Younga wynosił ok. 20 MPa. Rusztowanie to nie spełnia wymagań stawianych implantom kostnym.

Claims (7)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania dynamicznego substytutu kości gąbczastej, w którym do roztworu polilaktydu w dioksanie dodaje się wodę, po czym roztwór zamraża się i zamrożony roztwór umieszcza się w kąpieli żelującej, znamienny tym, że sporządza się roztwór polilaktydu w dioksanie o stężeniu 1-12% wag., roztwór miesza się przez 3-4 h, w temperaturze 20-60°C, z szybkością 160-300 rpm, następnie dodaje się wodę demineralizowaną w ilości 8-20% wag. w stosunku do polimeru, po czym, po uzyskaniu klarownego roztworu polimeru, roztwór umieszcza się w formie teflonowej i zamraża się w temperaturze od -30 do -10°C, przez 12-36 h, a następnie zamrożony produkt umieszcza się w metanolu lub bezwodnym etanolu o temperaturze od -50 do - 10°C na 3-5 dni, po czym uformowany substytut oczyszcza się w wodzie, a następnie suszy.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się polilaktyd o ciężarze cząsteczkowym M n 50 000-150 000 g/mol, o polidyspersyjności PDI 1,2-2,1, zawartości Sn <20 ppm.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się poli-L-laktyd o 0-1% zawartości centrów D.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się dioksan o czystości co najmniej 99,5%.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wodę demineralizowaną dodaje się za pomocą pompy strzykawkowej, przez 5-20 min.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór dozuje się do formy teflonowej w czasie co najmniej 30 min.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że suszenie prowadzi się przez 8-20 h, w temperaturze 30-45°C, przy wilgotności względnej 30-40% oraz pod próżnią.