PL229478B1 - Kompozycja podłoża biologicznego do prowadzenia hodowli komórkowych oraz sposób przygotowania podłoża biologicznego do prowadzenia hodowli komórkowych - Google Patents

Abstract

Kompozycja podłoża biologicznego do prowadzenia hodowli komórkowych, zawierająca stabilizowaną postać mieszanin roztworów wodnych wytworzonych na bazie aminokwasów, witamin z grupy B, roztworów o odczynie kwaśnym i glukozy, charakteryzuje się tym, że zawiera mieszaninę roztworów wodnych wytworzonych na bazie aminokwasu L-Argininy, L-Histydyny, L-Lizyny, L-Tryptofanu, L-Fenyloalaniny, L-Treoniny, L-Leucyny, L-Waliny, L-Izoleucyny, L-Metioniny w ilości 40,0 - 45% wagowych, kwaśnego roztworu L-Tyrozyny, L-Cystyny w ilości 44,5 - 49,5% wagowych oraz zawiera mieszaninę wodnych roztworów witamin, zasadowy roztwór kwasu foliowego w ilości 1,7 - 2,8% wagowych, a ponadto zawiera wodny roztwór aminokwasu L-Seryny i Glicyny w ilości 1,7 - 2,8% wagowych oraz wodny roztwór pirogronianu sodu w ilości 1,7 - 2,8% wagowych i wodny roztwór kwaśny azotanu żelazowego w ilości 1,7 - 2,8% wagowych, przy czym mieszanina ta jest rozcieńczona wodnym roztworem L-Glutaminy, wodowęglanu sodu, siarczanu miedzi oraz selenianu sodu. Przedmiotem zgłoszenia jest też sposób przygotowania podłoża biologicznego do prowadzenia hodowli komórkowych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja podłoża biologicznego do prowadzenia hodowli komórkowych, zwłaszcza ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych oraz sposób przygotowania podłoża biologicznego do prowadzenia hodowli komórkowych, zwłaszcza ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych.

Najnowsze osiągnięcia w badaniach nad komórkami macierzystymi ukazują wiele możliwości ich potencjalnego zastosowania w medycynie regeneracyjnej oraz w leczeniu nowotworów. Terapie oparte na komórkach macierzystych oferują możliwość wymiany starych i „zepsutych” komórek na nowe a także regenerację tkanek i organów. Komórki macierzyste to komórki, które niosą ze sobą ogromny potencjał terapeutyczny do leczenia chorób genetycznych i zwyrodnieniowych, które do tej pory nie poddawały się żadnej z metod terapeutycznych. Mogą być także stosowane, po uprzedniej modyfikacji genetycznej, jako cząsteczki dostarczające lecznicze jednostki do uszkodzonych tkanek lub organów.

Z opisu wynalazku nr PL. 167 291 znane jest nowe podłoże biologiczne dla hodowli komórkowych zwłaszcza ludzkich keratocytów. Podłoże biologiczne zawiera mieszaninę koncentratu białek osocza, które mogą być wykrzepione przez trombinę, otrzymanych w znany sposób przez kolejne dwukrotne strącanie świeżego osocza 10% roztworem etanolu w temperaturze 4°C i zawierających co najmniej 90% fibrynogenu, co najmniej 0,1 IU czynnika krzepnięcia XIII na jeden gram białka oraz 0,03-0,11 g fibrynoektyny, przy czym koncentrat białek osocza jest liofilizowany i zawieszony w wodnym roztworze ewentualnie zawierającym aprotyninę w stężeniu 3000 KIU/ml oraz równą objętość wzbogaconej jonami wapnia trombiny w stężeniu 10 lU/ml.

Z opisu wynalazku nr PL 215 234 znane są wolne od białka zwierzęcego i wolne od surowicy podłoże do hodowania komórek ssaka, zastosowanie podłoża, sposób hodowania komórek, sposób wytwarzania rekombinowanego czynnika krwi, kompozycja hodowli komórkowej i sposób wytwarzania podłoża. Podłoże zawiera od 10% wagowych ultrafiltrowanego hydrolizatu soi w stosunku do całkowitej suchej masy podłoża, gdzie hydrolizat soi ma zawartość endotoksyny < 500 U/g oraz zawiera również aminokwas. Aminokwas jest wybrany z grupy składającej się z L-asparaginy, L-cysteiny, L-cystyny, L-proliny, L-tryptofanu, L-glutaminy lub ich mieszaniny i zawiera również substancje pomocnicze wybrane z grupy składającej się z substancji buforujących, stabilizatorów utleniania, stabilizatorów przeciwdziałających bodźcom mechanicznym i inhibitorów proteazy.

Z opisu wynalazku PL 215 347 znany jest sposób wytwarzania gotowych do transplantacji nabłonkowych komórek, pochodzących z przetworzonych „in vitro” komórek grasicy ludzkiej. Sposób, zgodnie z wynalazkiem umożliwia zastąpienie brakującego lub nieczynnego narządu preparatem wyhodowanym „in vitro” z komórek pozyskiwanych z fragmentów grasicy ludzkiej wieku rozwojowego, której program genetyczny nie został wyczerpany. Sposób polega na przekształceniu fragmentów grasicy ludzkiej po uprzednim, mechanicznym usunięciu maksymalnej ilości limfocytów korowych i rdzeniowych. Z pozostałości szkieletu nabłonkowego, umieszczonego w hodowli uzyskuje się wzrost jednolitych komórek nabłonkowych. Hodowlę prowadzi się w warunkach jałowych, w temperaturze +37°C, przy wilgotności 98% i stałym dopływie dwutlenku węgla, korzystnie 5%, w pożywce przypominającej składem surowicę ludzką z dodatkiem 10% surowicy płodowej. Wzrost odbywa się w odpowiednich cieplarkach. Różnicowanie i dojrzewanie komórek trwa, korzystnie 4-8 tygodni aż do uzyskania dostatecznej ilości komórek. Płyny odżywcze wymienia się korzystnie co 4-5 dni, korzystnie co 7 dni część hodowli poddaje się badaniom kontrolnym, polegającym na zastosowaniu znaczników pozwalających określić fenotyp komórek i ocenić ewentualność wystąpienia mutacji nowotworowych. Po upływie wskazanych 4-8 tygodni uzyskuje się dostateczną ilość komórek gotowych do transplantacji.

Z opisu wynalazku nr PL. 195 516 znany jest sposób otrzymywania ludzkich komórek macierzystych z krwi pępowinowej i sposób ich namnażania. Komórki hodowane są w warunkach typowych dla wzrostu komórek ssaczych (korzystnie w atmosferze 100% wilgotności, 5% CO2, 21% O2, 64% N2, w 37°C, w Dulbecco Modified Eagle Medium z 10% surowicą płodową bydlęcą, pod osłoną antybiotykową mieszaniny streptomycyny i penicyliny) w komercyjnie dostępnych plastykowych butelkach hodowlanych. Po osiągnięciu fazy zlewnej (monolayer) komórki odlepiane są od podłoża plastykowego enzymatycznie (korzystnie przy użyciu trypsyny), a następnie po zatrzymaniu procesu trypsynizacji (korzystnie przez surowicę płodową bydlęcą, lub pożywkę hodowlaną, w której FBS jest obecna) zawiesinę komórek wiruje się i umieszcza w pożywce stosowanej do hodowli komórek ludzkich z czynnikiem wzrostowym stymulującym komórki ssacze do podziałów (korzystnie DMEM suplementowany 10% FBS oraz czynnikiem wzrostu naskórka - EGF- w przedziale stężeń 10-20 ng/ml), po czym przenosi się

PL 229 478 Β1 komórki do plastykowych butelek hodowlanych (korzystnie w objętości 5 do 10 ml, w gęstości ok. 0,5x104 kom/cm²) i inkubuje się w warunkach korzystnych dla komórek ssaczych przez 5 do 7 dni, aż do osiągnięcia fazy zlewnej. Pożywkę można wymieniać co 3 dni.

Nieoczekiwanie okazało się, na podstawie przeprowadzonych badań, że kompozycja podłoża biologicznego zawierająca jony z grupy berylowców pozwala na precyzyjne określenie przewidywanej ilości komórek potomnych w kolejnych pasażach.

Istotą kompozycji podłoża biologicznego do prowadzenia hodowli komórkowych , według wynalazku jest to, że zawiera mieszaninę roztworów wodnych wytworzonych na bazie aminokwasu L-Argininy , L-Histydyny, L-Lizyny, L-Tryptofanu, L-Fenyloalaniny, L-Treoniny, L-Leucyny, L-Waliny, L-Izoleucyny, L-Metioniny w ilości 40,0-45% wagowych, kwaśnego roztworu L-Tyrozyny, L-Cystyny w ilości 44,5-49,5% wagowych oraz zawiera mieszaninę wodnych roztworów witamin w ilości 1,7-2,8% wagowych, które stanowią Amid kwasu nikotynowego, Pirydoksal HCL, Tiamina, Pantotenian wapnia, chlorek Choliny, I-1nozytol i Ryboflawiny, zasadowy roztwór kwasu foliowego w ilości 1,7-2,8% wagowych, a ponadto zawiera wodny roztwór aminokwasu L-Seryny i Glicyny w ilości 1,7-2,8% wagowych oraz wodny roztwór Pirogronianu sodu w ilości 1,7-2,8% wagowych i wodny roztwór kwaśny azotanu żelazowego w ilości 1,7-2,8% wagowych, przy czym mieszanina ta jest rozcieńczona 10-krotnie roztworem L-Glutaminy, wodowęglanu sodu, siarczanu miedzi oraz selenianu sodu.

Istotą sposobu przygotowania podłoża biologicznego do prowadzenia hodowli komórkowych, według wynalazku jest to, że przygotowuje się oddzielnie roztwór wodny na bazie aminokwasu L-Argininy, L-Histydyny, L-Lizyny, L-Tryptofanu, L-Fenyloalaniny, L-Treoniny, L-Leucyny, L-Waliny, L-Izoleucyny, L-Metioniny w ilości 40,0-45,0% wagowych roztwór wodny na bazie L-Tyrozyny, L-Cystyny w ilości 44,5-49,5% wagowych o odczynie kwaśnym, roztwór wodny witamin na bazie Amidu kwasu nikotynowego, Pirydoksalu, Tiaminy, Pantotenianu wapnia, chlorku Choliny, l-lnozytolu i Ryboflawiny w ilości 1,7-2,8% wagowych, roztwór wodny o odczynie zasadowym kwasu foliowego w ilości 1,7-2,8% wagowych, roztwór wodny na bazie aminokwasu L-Seryny i Glicyny w ilości 1,7-2,8% wagowych roztwór wodny o odczynie kwaśnym na bazie Pirogronianu sodu w ilości 1,7-2,8% wagowych oraz roztwór wodny o odczynie kwaśnym na bazie azotanu żelazowego w ilości 1,7-2,8% wagowych. Otrzymane rozwory wodne miesza się i rozcieńcza 10-krotnie roztworem L-Glutaminy, wodowęglanu sodu, siarczanu miedzi oraz selenianu sodu, a następnie po wymieszaniu poddaje się procesowi filtracji oraz sterylizacji.

Korzystną cechą kompozycji podłoża biologicznego do prowadzenia hodowli komórkowych jest otrzymanie podłoża o optymalnych parametrach, które pozwala na precyzyjne określenie przewidywanej ilości komórek potomnych w kolejnych pasażach, umożliwiających zmaksymalizowanie wydajności wzrostowej komórek macierzystych, uzyskania jednorodności namnażanych komórek.

Przedmiot wynalazku objaśnia bliżej poniższy przykład.

Przykład

Z wodnym roztworem chlorku sodu zmieszano najpierw roztwór wodny na bazie L-Tyrozyny, L-Cystyny w ilości 46,5% wagowych, a następnie dodano kolejno wodny roztwór witamin na bazie Amidu kwasu nikotynowego, Pirydoksalu, Tiaminy, Pantotenianu wapnia, chlorku Choliny, l-lnozytolu i Ryboflawiny, Pirydoksalu, Tiaminy, Pantotenianu wapnia, chlorku Choliny, l-lnozytolu i Ryboflawiny w ilości 2,3% wagowych. Do otrzymanej mieszaniny dodano roztwór wodny o odczynie zasadowym kwasu foliowego w ilości 2,3% wagowych oraz roztwór wodny na bazie aminokwasu L-Seryny i Glicyny w ilości 2,3% wagowych ciągle mieszając. Następnie do otrzymanej mieszaniny dodano roztwór wodny o odczynie kwaśnym na bazie Pirogronianu sodu w ilości 2,3% wagowych oraz roztwór wodny o odczynie kwaśnym na bazie azotanu żelazowego w ilości 2,3% wagowych. W ostatniej kolejności dodano roztwór wodny na bazie aminokwasu L-Argininy, L-Histydyny , L-Lizyny, L-Tryptofanu, L-Fenyloalaniny, L-Treoniny, L-Leucyny, L-Waliny, L-Izoleucyny, L-Metioniny w ilości 42,0% wagowych. Otrzymaną mieszaninę roztworów rozcieńczono 10-krotnie roztworem L-Glutaminy, wodowęglanu sodu, siarczanu miedzi oraz selenianu sodu. Następnie skorygowano pH do wartości 7,2 i ciśnienie osmotyczne do wartości 270-300 mOsmol/l, a po dokładnym wymieszaniu przeprowadzono proces filtracji i sterylizacji otrzymanego podłoża biologicznego.

Claims (3)

1. Kompozycja podłoża biologicznego do prowadzenia hodowli komórkowych, zawierająca stabilizowaną postać mieszanin roztworów wodnych wytworzonych na bazie aminokwasów, witamin z grupy B, roztworów o odczynie kwaśnym i glukozy, znamienna tym, że zawiera mieszaninę roztworów wodnych wytworzonych na bazie aminokwasu L-Argininy, L-Histydyny, L-Lizyny, L-Tryptofanu, L-Fenyloalaniny, L-Treoniny, L-Leucyny, L-Waliny, L-Izoleucyny, L-Metioniny w ilości 40,0-45% wagowych kwaśnego roztworu L-Tyrozyny, L-Cystyny w ilości 44,5-49,5% wagowych oraz zawiera mieszaninę wodnych roztworów witamin w ilości 1,7-2,8% wagowych, które stanowią Amid kwasu nikotynowego, Pirydoksal HCL, Tiamina, Pantotenian wapnia, chlorek Choliny, I-Inozytol i Ryboflawiny, zasadowy roztwór kwasu foliowego w ilości 1,7-2,8% wagowych, a ponadto zawiera wodny roztwór aminokwasu L-Seryny i Glicyny w ilości 1,7-2,8% wagowych oraz wodny roztwór Pirogronianu sodu w ilości 1,7-2,8% wagowych i wodny roztwór kwaśny azotanu żelazowego w ilości 1,7-2,8% wagowych, przy czym mieszanina ta jest rozcieńczona wodnym roztworem L-Glutaminy, wodowęglanu sodu, siarczanu miedzi oraz selenianu sodu.

2. Kompozycja, według zastrz. 1, znamienna tym, że mieszanina jest rozcieńczona 10-krotnie.

3. Sposób przygotowania podłoża biologicznego do prowadzenia hodowli komórkowych, znamienny tym, że przygotowuje się oddzielnie roztwór wodny na bazie aminokwasu L-Argininy, L-Histydyny, L-Lizyny, L-Tryptofanu, L-Fenyloalaniny, L-Treoniny, L-Leucyny, L-Waliny, L-Izoleucyny, L-Metioniny w ilości 40,0-45,0% wagowych roztwór wodny na bazie L-Tyrozyny, L-Cystyny w ilości 44,5-49,5% wagowych o odczynie kwaśnym, roztwór wodny witamin na bazie Amidu kwasu nikotynowego, Pirydoksalu, Tiaminy, Pantotenianu wapnia, chlorku Choliny, l-lnozytolu i Ryboflawiny w ilości 1,7-2,8% wagowych, roztwór wodny o odczynie zasadowym kwasu foliowego w ilości 1,7-2,8% wagowych, roztwór wodny na bazie aminokwasu L-Seryny i Glicyny w ilości 1,7-2,8% wagowych roztwór wodny o odczynie kwaśnym na bazie Pirogronianu sodu w ilości 1,7-2,8 % wagowych oraz roztwór wodny o odczynie kwaśnym na bazie azotanu żelazowego w ilości 1,7-2,8% wagowych, po czym otrzymane rozwory wodne miesza się i rozcieńcza się 10-krotnie wodnym roztworem L-Glutaminy, wodowęglanu sodu, siarczanu miedzi oraz selenianu sodu, a ponadto koryguje się pH otrzymanej mieszaniny do wartości 7,2 oraz koryguje się ciśnienie osmotyczne do wartości 270-300 mOsmol/l, po czym poddaje się procesowi filtracji oraz procesowi sterylizacji.