PL223299B1

PL223299B1 - Kompozycja i preparat zawierające tioprolinę i sylimarynę, zastosowanie kosmetyczne kompozycji tioproliny i sylimaryny oraz sposób kosmetycznej ochrony skóry przed procesem starzenia zewnątrzpochodnego

Info

Publication number: PL223299B1
Application number: PL393398A
Authority: PL
Inventors: Irena Szołomicka-Orfinger; Katarzyna Rogiewicz; Karolina Bazela; Renata Dębowska
Original assignee: Laboratorium Kosmetyczne Dr Irena Eris Spółka Akcyjna
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2010-12-22
Publication date: 2016-10-31
Also published as: PL393398A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja i preparat zawierające tioprolinę i sylimarynę, zastosowanie kosmetyczne kompozycji tioproliny i sylimaryny oraz sposób kosmetycznej ochrony skóry przed procesem starzenia zewnątrzpochodnego.

Starzenie się skóry spowodowane jest działaniem czynników zewnątrzpochodnych (środowiskowych) i wewnątrzpochodnych, np. genetycznych. Wpływ uszkadzających czynników środowiska wyraża się przede wszystkim przedwczesnym starzeniem się skóry, najbardziej widocznym w miejscach eksponowanych na działanie promieniowania ultrafioletowego - na skórze twarzy i rąk. Szacuje się, że w skórze niechronionej 80% wszystkich zmian obserwowanych podczas procesu starzenia się jest indukowane promieniowaniem ultrafioletowym.

Zarówno bezpośrednie działanie UV, jak i generowane przez nie wolne rodniki uszkadzają elementy bariery naskórkowej. Degradacji ulegają składniki cementu międzykomórkowego warstwy rogowej (nienasycone lipidy) oraz zmniejsza się aktywność gruczołów łojowych. W przypadku cer suchych powoduje to pogorszenie bilansu wodnego skóry.

UVA generuje będący wolnym rodnikiem tlen singletowy, który pobudza działanie metaloproteinaz (MMP-1) degradujących kolagen - M. Winschek i wsp.: „Singlet oxygen may mediate the ultraviolet: A-induced synthesis of interstitial collegenase”, J. Invest. Dermatol. 104: 194-198 (1995).

UVB generuje wolny rodnik o nazwie anion ponadtlenkowy (O ^-). Ponadto uszkadza DNA, przyspiesza śmierć komórek, pobudza reakcję zapalną w skórze - H. Masaki i wsp.: „Increased generation of hydrogen peroxide possibly from mitochondrial respiratory chain after UVB irradiation of mutine fibroblasts”, J. Dermatol. Sci., 14: 207-216 (1997).

Głównymi uszkodzeniami DNA pojawiającymi się w wyniku działania promieniowania ultrafioletowego są uszkodzenia oksydacyjne oraz tzw. fotouszkodzenia - Gajewski W.: „Mutageneza, reperacja i rekombinacja DNA”. Genetyka Molekularna. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2000, 248-279.

Uszkodzenia oksydacyjne polegają na reakcji aktywnych form tlenu z resztami cukrowymi lub zasadami nukleinowymi. W wyniku tego procesu powstają 5-hydroksymetylouracyl (addukt) oraz utlenione formy pirymidyn i puryn (glikol tyminy, 8-oksoguanina, jako uszkodzenie o charakterze mutagennym). Oddziaływania aktywnych form tlenu z resztami cukrowymi mogą powodować powstawanie wiązań między nićmi DNA i w efekcie końcowym doprowadzać do ich pęknięcia. Dla komórki jest to letalne - Gros L. i wsp.: „Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage”. Oncogene, 2002, 21:8905-8925.

Poza bezpośrednim i pośrednim działaniem promieni UV bardzo duży wpływ na procesy starzenia się skóry mają, uwalniane w atmosferze i powstające wewnątrz organizmu wolne rodniki. Cząstki te działają na ogół jak bardzo agresywne utleniacze niszczące różne struktury skóry właściwej i naskórka. Paradoksalnie, wraz z wiekiem maleje sprawność własnych systemów przeciwutleniających organizmu (np. enzymów katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej SOD) i skóra traci zdolność do samoregeneracji uszkodzeń - Ichihashi M. i wsp.: „UV-induced skin damage”. Toxicology, 2003, 189:21-39.

Mitochondria są strukturami subkomórkowymi, które biorą udział w wielu procesach komórk owych. Ich działanie jest niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania skóry. W trakcie upływu czasu w mitochondriach następuje akumulacja mutacji i uszkodzeń. W tym właśnie upatrywana jest główna przyczyna starzenia się organizmu, w myśl tzw. hipotezy wolnorodnikowej lub mitochondrialnej.

W komórce to właśnie głównie w mitochondriach generowane są reaktywne formy tlenu. Te ni ezwykle reaktywne związki chemiczne (w tym: anionorodnik ponadtlenkowy czy H₂O₂) doprowadzają do modyfikacji i zmiany funkcjonalności licznych składników komórki (białek, lipidów i kwasów nukleinowych). Jedna z podstawowych hipotez upatruje, jako główną przyczynę procesu starzenia długotrwałe działanie reaktywnych form tlenu i towarzyszącą temu akumulację defektów elementów komórki.

Mitochondrialna teoria starzenia się opiera się na sprawności reakcji łańcucha oddechowego.

Z wiekiem jego sprawność jest coraz niższa, czego skutkiem jest wzmożona produkcja anionorodników

2ponadtlenkowych O ^-, które same inicjują łańcuch reakcji wolnorodnikowych lub, z których to powstają rodniki hydroksylowe. Rodnik hydroksylowy jest najbardziej niebezpieczny dla ludzkiego organizmu.

Uszkodzenia mitochondriów prowadzą do stresu mitochondrialnego, którego efektem może być programowana śmierć komórki - apoptoza - Bednarczyk P. i wsp.: „New properties of mitochondria

PL 223 299 B1

ATP-regulated potassium channel”. J. Bioenerg Biomembr, 2008, 40:325-335; Szewczyk A. i wsp.: „Mitochondrial Potassium Channels, Critical Review”, Life 2009, 61(2):134-143.

Także dym tytoniowy, zawierający między innymi aktywne formy tlenu, czyli wolne rodniki, jest ich największym egzogennym źródłem. Wywołany w komórkach stres oksydacyjny prowadzi do uszkodzeń błon biologicznych (peroksydacja lipidów) i związany z tym rozpad komórek naskórka, a w konsekwencji przyspieszenie elastozy skóry; uszkodzeń DNA; hamowania rozwoju/różnicowania keratynocytów; indukcji procesów nowotworzenia oraz przyspieszenia zaprogramowanej śmierci skóry (apoptozy), a tym samym starzenia się skóry.

Efektem stresu oksydacyjnego jest zaburzenie prawidłowego funkcjonowania układu immunologicznego skóry; zmiany w aktywności istotnych dla prawidłowego funkcjonowania komórki enzymów, receptorów błonowych i białek transportowych oraz degradacja kolagenu, poprzez aktywację MMP-1, stanowiącego główny budulec zdrowej skóry, swoiste rusztowanie, które niszczone i nie zdolne do regeneracji prowadzi do starzenia się skóry.

Ponadto stres oksydacyjny prowadzi do skurczu naczyń krwionośnych w skórze; zmniejszenia transportu tlenu i substancji odżywczych; zaburzenia mikrokrążenia; spowolnienia procesu gojenia się ran; wzrostu częstości występowania i zaostrzenia objawów łuszczycy; nasilenia objawów trądziku; przyspieszenia wypadania włosów; zwiększenia utraty wody (TEWL) i suchości skóry; podatności skóry na podrażnienia i wrażliwości na czynniki środowiskowe (ciepło, zimno, słońce, substancje chemiczne); przyspieszenia tworzenia się zmarszczek (liczne, głębokie i wyraźnie zaznaczone); zmniejszenia syntezy kolagenu i postępującej elastozy skóry. Opisane zaburzenia powodują, że osoby poddane stresowi oksydacyjnemu wywołanym paleniem tytoniu wyglądają na starsze niż są w rzeczyw istości. Badania dowiodły, iż palenie średnio 20 papierosów dziennie przyspiesza fizjologiczny proces starzenia się skóry o 10 lat - Rosińska A. i wsp.: „Dermatologia dla kosmetologów”. red. A. Kaszuba, Wyd. Naukowe Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu, 2008, 234-238.

Wolne rodniki są także jedną z przyczyn powstania cery naczyniowej i trądzika różowatego.

Cera naczyniowa to potoczne określenie skóry twarzy, którą cechują skłonność do przejściowego, a po pewnym czasie utrwalonego zaczerwienienia skóry, widoczne rozszerzone naczynia krwionośne (tzw. teleangiektazje), duża wrażliwość skóry na czynniki środowiskowe (promienie UV, wolne rodniki, wiatr, wysoką temperaturę, niewłaściwą dietę), problemy pielęgnacyjne (trudności w doborze kosmetyków).

Etiopatogeneza trądziku różowatego nie została dostatecznie wyjaśniona i przez ostatnie lata była przedmiotem wielu badań i publikacji. Wszystkie doniesienia wskazują udział czynników środow iskowych, zarówno w powstawaniu jak i zaostrzaniu się objawów trądziku różowatego. Do czynników zewnętrznych wpływających na objawy rosacea należą; omawiane powyżej promieniowanie UV, działanie wolnych rodników, gwałtowne zmiany temperatury, silny wiatr, ostre i gorące potrawy, czynniki emocjonalne, czynniki związane ze stylem życia i aktywnością fizyczną, zaburzenia hormonalne i stosowane leki, a także niewłaściwy sposób pielęgnacji skóry.

Jakkolwiek obserwowane zaostrzanie się objawów rosacea pod wpływem UV sugeruje taką hipotezę, rola reaktywnych form tlenu (ROS) w patogenezie rosacea rozważana jest głównie w kontekście aktywności leków stosowanych w terapii tej choroby, tj. tetracykliny, metronidazol, retinoidy, kwas azelainowy. Wykazano bowiem, że większość leków stosowanych z powodzeniem w leczeniu trądziku różowatego posiada aktywność antyoksydacyjną - Górkiewicz-Petkow A. „Trądzik różowaty - etiopatogeneza i leczenie”; Przegl. Dermatol. 2007, 94(3):373-383; Yamasaki K., Gallo RL. „The molecular pathology of rosacea”. J. Dermatol Sci 2009, doi: 10.1016/j.derrmsci, 2009, 04.007; Geria AN, Culp B, Scheinfeld NS. „Rosacea: a review. Kosmetische Medizin” 2008, 6:303-308; Bakar O. i wsp.: „The effect of azithromycin on reactive oxygen species in rosacea”. Clin Exp Dermatol, marzec 2007, 32(2):197-200.

Tioprolina (tymonacyk), czyli kwas tiazolidyno-4-karboksylowy jest metabolizowana do cysteiny, która wchodzi w skład białek włosów, naskórka, paznokci (białko keratyna) i glutationu. Glutation umożliwia detoksykację. Jest także źródłem licznych istotnych w funkcjonowaniu organ izmu metabolitów.

Tioprolina pełni liczne funkcje w organizmie, między innymi działa przeciwmiażdżycowo, obniża stężenie lipidów we krwi, chroni wątrobę, nerki i serce przed stłuszczeniem; działa żółciopędnie, rozkurczowo; ochronnie na miąższ wątroby; poprawia strukturę i pobudza wzrost oraz regenerację naskórka, włosów i paznokci; posiada właściwości przeciwtrądzikowe i przeciwłuszczycowe; a także wraz z N-acetylocysteiną stanowią antyoksydanty, które znalazły zastosowanie w suplementacji

PL 223 299 B1 anti-aging - Miguel J. Menopause: „A review on the role of oxygen stress and favorable effects of dietary antioxidants” (2006) Arch Gerontol Geriatr; Guayerbas N.„ Thiolic antioxidant supplementation of the diet reverses age-related behavioural dysfunction in prematurely ageing mice” (2005) Pharmacol Biochem Behav 80:45-51; Miguel J. „Can antioxidant diet supplementation protect against agerelated mitochondrial damage?” (2002) 959:508-16,

W US 5047409 opisano sole tioproliny z 3-tlenkiem 6-piperydyno-2,4-diaminopirymidyny oraz ich miejscowe stosowanie, a także ich kosmetyczne i medyczne zastosowanie do leczenia utraty włosów lub stanów patologicznych takich jak między innymi łysienie, zapalenie skóry.

W US 6150405 ujawniono zastosowanie związków sulfhydrylowych, w tym tioproliny, do leczenia utraty włosów.

US 20040028787 wymieniono tioprolinę do aromatyzowania żywności i napojów, a także do stosowania w kosmetyce.

Sylimaryna stanowi kompleks flawonolignanów pochodzenia roślinnego, który pozyskiwany jest z łupin nasiennych ostropestu plamistego.

Sylimaryna obejmuje przede wszystkim sylibinę, izosylibinę, sylikrystynę oraz sylidianinę.

Sylimaryna wykazuje działanie przeciwzapalne, rozkurczowe, detoksykujące, żółciotwórcze i żółciopędne, stabilizuje strukturę błon komórkowych, obniża stężenie cholesterolu we krwi i hamuje wytrącanie się blaszek miażdżycowych, chroni wątrobę przed szkodliwym działaniem trucizn, hamuje podziały komórek nowotworowych, zapobiega marskości wątroby, zapobiega wytrącaniu się złogów i kamieni żółciowych.

W EP 1576961 B1 opisano nowy związek zawierający silimarynę do leczenia cukrzycy. Związek ten regeneruje morfologiczne i strukturalne uszkodzenia, które powstają w tkance trzustki cukrzycowej i regeneruje komórki trzustkowe wydzielające insulinę.

Jakkolwiek znanych jest szereg preparatów przeznaczonych do profilaktyki i leczenia starzenia się skóry, to nadal istnieje potrzeba opracowania skutecznych środków do ochrony skóry przed procesem starzenia zewnątrzpochodnego.

Wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej tioprolinę i sylimarynę w synergicznie skutecznej ilości.

Korzystnie, kompozycja zawiera tioprolinę i sylimarynę w proporcji od 0,001:1 do 1:0,001, k orzystnie od 0,01:1 do 1:0,01, korzystniej od 0,1:1 do 1:0,1, a zwłaszcza 1:1.

Wynalazek dotyczy także preparatu zawierającego substancję czynną oraz kosmetycznie dopuszczalne zaróbki, nośniki i substancje dodatkowe, który jako substancję czynną zawiera tioprolinę i sylimarynę w synergicznie skutecznej ilości.

Korzystnie, preparat zawiera tioprolinę i sylimarynę w proporcji od 0,001:1 do 1:0,001, korzystnie od 0,01:1 do 1:0,01, korzystniej od 0,1:1 do 1:0,1, a zwłaszcza 1:1.

Korzystnie, preparat zawiera tioprolinę w ilości od 0,001% do 3% wagowych, w przeliczeniu na całość preparatu i sylimarynę w ilości od 0,001% do 3% wagowych, w przeliczeniu na całość preparatu.

Korzystnie, preparat jest w postaci kremu, balsamu, lotionu, żelu, fluidu, korektora, emulsji O/W i W/O, toniku, żelu myjącego lub pianki.

Korzystnie, preparat stanowi preparat kosmetyczny.

Wynalazek dotyczy również zastosowania kosmetycznego kompozycji zawierającej tioprolinę i sylimarynę zdefiniowanej powyżej do spowalniania, przeciwdziałania, zapobiegania procesowi starzenia zewnątrzpochodnego.

Korzystne jest zastosowanie do ochrony skóry przed promieniowaniem UV, substancjami chemicznymi, wolnymi rodnikami i czynnikami środowiskowymi.

Korzystne jest zastosowanie do pielęgnacji skóry po naświetlaniu promieniowaniem UVA i/lub UVB.

Korzystne jest zastosowanie do ochrony skóry osób nałogowo palących i/lub biernych palaczy.

Korzystne jest zastosowanie do ochrony skóry przed wolnymi rodnikami generowanymi w komórkach i/lub uwalnianymi w atmosferze.

Korzystne jest zastosowanie do ochrony skóry osób z cerą naczyniową i /lub trądzikiem różowatym.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu kosmetycznego spowalniania, przeciwdziałania, zapobiegania procesowi starzenia zewnątrzpochodnego skóry polegającego na tym, że skórę traktuje się skuteczną ilością kompozycji zdefiniowanej powyżej i/lub preparatu zdefiniowanego powyżej.

PL 223 299 B1

Korzystny jest sposób, w którym skórę traktuje się przed, w trakcie i/lub po naświetlaniu promieniowaniem UV, traktowaniu substancjami chemicznymi, działaniu czynników środowiskowych i/lub wolnych rodników.

Powyżej opisana kompozycja ma zastosowanie w preparatach pielęgnacyjnych stosowanych między innymi w zabiegach wykonywanych w salonach kosmetycznych.

Kompozycje stanowi kompleks antyoksydacyjny, który spowalnia procesy starzenia zewnątrzpochodnego, uwarunkowanego działaniem czynników zewnętrznych (zanieczyszczenia, dym papierosowy i tzw. skóra palacza) oraz jego najbardziej znanej formy fotostarzenia, związanego z nadmierną ekspozycją na promieniowanie UV. Ma zastosowanie w pielęgnacji skóry np. osób nałogowo palących i biernych palaczy, skóry naczyniowej i z trądzikiem różowatym, skóry poddanej działaniu promieniowania słonecznego i stosowanego w solariach, skóry starzejącej się, suchej, odwo dnionej, wrażliwej.

Preparat według wynalazku zawiera tioprolinę w ilości od 0,001% do 3% wag, i sylimarynę w ilości od 0,001% do 3% wag,, w przeliczeniu na całość preparatu. W korzystnych wykonaniach preparat może zwierać 0,001% do 2% wag., 0,001% do 1% wag., 0,001% do 0,1% wag., 0,001% do 0,01% wag. tioproliny i 0,001% do 2% wag., 0,001% do 1% wag., 0,001% do 0,1% wag., 0,001% do 0,01% wag. sylimaryny, w przeliczeniu na całość preparatu. Preparat może więc zawierać 0,001% wag., 0,005% wag., 0,01% wag., 0,05% wag., 0,1% wag., 0,5% wag., 1% wag., 2% wag., 3% wag. tioproliny i 0,001% wag., 0,005% wag., 0,01% wag., 0,05% wag., 0,1% wag., 0,5% wag., 1% wag., 2% wag., 3% wag. sylimaryny, w przeliczeniu na całość preparatu.

Opis figur

Na Fig. 1 przedstawiono zdolność zmiatania DPPH [mg DPPH/ml substancji].

Na Fig. 2 przedstawiono ilość przereagowanego DPPH w próbce.

Niniejszy środek kosmetyczny według wynalazku wykazuje liczne zalety na tle znanych ze stanu techniki preparatów.

Z uwagi na synergiczne działanie składników możliwe jest użycie w preparacie mniejszej ilości tioproliny i sylimaryny, a więc zmniejszenie prawdopodobieństwa wystąpienia niekorzystnych skutków ubocznych.

Tioprolinę i sylimarynę można podawać połączeniu z kosmetycznie dopuszczalnymi nośnikami lub rozcieńczalnikami w wielu różnych postaciach dawkowanych do stosowania miejscowo. Można je łączyć z wieloma różnymi kosmetycznie dopuszczalnymi, chemicznie obojętnymi nośnikami, w postać kremu, balsamu, lotionu, żelu, fluidu, korektora, emulsji O/W i W/O, toników, żeli myjących, pianek a także mleczek, proszków, sprejów, aerozoli, galaretek, past, płynów, płynów do przem ywania, maści, zawiesin wodnych, plastrów transdermalnych itp., zgodnie ze standardową praktyką kosmetyczną.

Maści, kremy i żele można np. formułować z wodnym lub oleistym podłożem, z dodatkiem odpowiednich środków zagęszczających i/lub żelujących i/lub rozpuszczalników. Takie podłoża mogą zawierać np. wodę i/lub olej, taki jak ciekła parafina lub dowolny olej roślinny, albo rozpuszczalnik, taki jak glikol polietylenowy. Do środków zagęszczających i środków żelujących, które można stosować w zależności od charakteru podłoża, należą miękka parafina, stearynian glinu, alkohol cetostearylowy, glikole polietylenowe, tłuszcz z wełny, wosk pszczeli, karboksypolimetylen i pochodne celulozy i/lub monostearynian glicerylu i/lub niejonowe środki emulgujące.

Lotiony można formułować z użyciem wodnego lub olejowego podłoża np. etanolu lub alkoholu oleilowego.

Proszki do stosowania zewnętrznego można formułować z użyciem odpowiedniego podłoża proszkowego, np. talku, laktozy łub skrobi.

W razie potrzeby środki kosmetyczne według wynalazku, można buforować przez dodanie odpowiednich środków buforujących.

Zazwyczaj preparaty zawierają również jeden lub większą liczbę środków emulgujących, stabilizatorów, środków dyspergujących, środków zagęszczających, środków barwiących, substancji zapachowych, środków konserwujących środków nawilżających itp.

Nośniki odpowiednie do stosowania, zgodnie z wynalazkiem obejmują stałe rozcieńczalniki lub wypełniacze, ośrodki wodne i różne nietoksyczne rozpuszczalniki organiczne i nieorganiczne.

Przykłady środków kosmetycznych według wynalazku podano poniżej.

PL 223 299 B1

Receptura ramowa kremów, balsamów, lotionów i żeli

Składniki	Maksymalne stężenie [% wag.]
Oleje (roślinne i mineralne np. parafina ciekła), woski i alkohole tłuszczowe, włączając lanolinę i jej związki	95
Składniki nawilżające (np. gliceryna, glikol propylenowy, PEG)	25
Składniki emulgujące (np. stearynian glicerylu)	25
Silikony (np. dimetikon, cyklometikon)	20
Anionowe/amfoteryczne/niejonowe związki powierzchniowo czynne (np. sól sodowa oksyetylenowanego siarczanu larylowego)	20
Składniki zagęszczające (np. karbomer, eter celulozy, guma ksantanowa, mech islandzki)	12
Emolienty (np. mirystynian izopropylu, alkohole tłuszczowe)	10
Składniki dodatkowe (np. witaminy, antyoksydanty, ekstrakty roślinne)	10
Kationowe związki powierzchniowo czynne (>/= C12) i polimery (np. chlorek distearylodometyloamoniowy, polyquaterium-7)	5
Kompozycja zapachowa	5
Tlenek cynku	3
Konserwanty	2
Barwniki lub pigmenty	1
Sylimaryna	3
Tioprolina	3
Woda	do 100

Receptura ramowa fluidu

Składniki	Maksymalne stężenie [% wag.]
Oleje (roślinne i mineralne np. parafina ciekła	30
Emolienty (np. glikol propylenowy, lanolina)	30
Silikony i lotne silikony	30
Wypełniacze (np. talk, kaolin, krzemionka, skrobia)	30
Składniki nawilżające (np. gliceryna, PEG)	25
Składniki emulgujące (np. stearynian glicerylu)	20
Pigmenty	20
Anionowe/amfoteryczne/niejonowe związki powierzchniowo czynne (np. sól sodowa oksyetylenowanego siarczanu krylowego)	5
Składniki dodatkowe (np. witaminy, antyoksydanty, ekstrakty roślinne)	5
Filtry UV	5
Kompozycja zapachowa	1
Konserwanty	1
Sylimaryna	3
Tioprolina	3
Woda	do 100

PL 223 299 B1

Krem nawilżający

Lp.	Nazwa składnika	Zawartość [% wag.]
1	Alkohol tłuszczowy	3,00
2	Emulgator	2,00
3	Olej silikonowy	3,00
4	Filtry UV	7,80
5	Przeciwutleniacz	0,05
6	Gliceryna	3,00
7	Mech islandzki	0,10
8	Polimery akrylowe	0,35
9	Alantoina	0,20
10	Regulator pH	0,35
11	Kompozycja zapachowa	0,30
12	Mieszanina estrów alkoholi tłuszczowych	3,00
13	Olej roślinny	1,00
14	Olej mineralny	3,00
15	Układ konserwujący	0,40
16	Hialuronian sodu	2,00
17	Roztwór mleczanu sodu	0,50
18	Witaminy	2,00
19	Sylimaryna	2
20	Tioprolina	2
21	Woda	do 100

Krem pod oczy

Lp.	Nazwa składnika	Zawartość [% wag.]
1	2	3
1	Alkohol tłuszczowy	2,00
2	Emulgator	2,00
3	Wosk roślinny	2,00
4	Olej silikonowy	4,00
5	Filtry UV	8,00
6	Przeciwutleniacz	0,02
7	Gliceryna	3,00
8	Polimery akrylowe	0,30
9	Poliakrylamid	1,00
10	Regulator pH	0,30
11	Mieszanina estrów alkoholi tłuszczowych	5,00
12	Estry kwasu kaprylowego lub kaprynowego	3,00
13	Olej roślinny	1,00

PL 223 299 B1 cd. tabeli

1	2	3
14	Układ konserwujący	1,15
15	Wodny ekstrakt z alg	0,50
16	Witaminy	0,50
17	Sylimaryna	1
18	Tioprolina	1
19	Woda	do 100

Korektor zmarszczek

Lp.	Nazwa składnika	Zawartość [% wag.]
1	Glikol butylenowy	2,00
2	Emulgator	3,00
3	Olej silikonowy	22,00
4	Wosk	0,40
5	Stabilizatory emulsji	0,75
6	Gliceryna	3,00
7	Wodny roztwór ergotioneiny	0,10
8	Kompozycja zapachowa	0,30
9	Układ konserwujący	0,40
10	Hialuronian sodu	10,00
11	Sylimaryna	3
12	Tioprolina	3
13	Woda	do 100

Fluid

Lp.	Nazwa składnika	Zawartość [% wag.]
1	2	3
1	Mieszanina glikoli	6,00
2	Emulgator	3,00
3	Olej silikonowy	19,00
4	Wosk	0,30
5	Mieszanina estrów alkoholi tłuszczowych	8,00
6	Filtry UV	14,00
7	Pigmenty	11,00
8	Stabilizatory emulsji	1,00
9	Polimer silikonowy	3,30
10	Gliceryna	5,00
11	Wodny ekstrakt roślinny	0,10
12	Kompozycja zapachowa	0,30
13	Układ konserwujący	0,40

PL 223 299 B1 cd. tabeli

1	2	3
14	Hialuronian sodu	2,00
15	Witamina B3	0,50
16	Sylimaryna	1
17	Tioprolina	1
18	Woda	do 100

Badania biologiczne

Test MTT (test redukcji pobranej przez komórki soli tetrazolowej MTT) - test kolorymetryczny służący do ilościowej oceny proliferacji komórek w odpowiedzi na różnorodne czynniki oraz potencj onalnego efektu cytotoksycznego i cytostatycznego tychże czynników. Test MTT jest metodą powszechnie stosowaną np. przy ocenie cytotoksyczności substancji aktywnych o potencjalnym zastosowaniu w kosmetyce.

Zasada oznaczenia

MTT jest pobierana przez komórki i redukowana przez obecną w mitochondriach dehydrog enazę bursztynianową - jeden z enzymów łańcucha oddechowego aktywny tylko w żywych komórkach. MTT ulega redukcji do nierozpuszczalnego w wodzie formazanu, który gromadzi się we wnętrzu komórek.

Opis próby

Po okresie stymulacji usuwano pożywkę znad komórek i dodawano roztwór MTT (100 ąl/studzienkę) sporządzony w płynie hodowlanym DMEM w stężeniu 0,5 mg/ml. Następnie komórki umieszczano na 2 godziny w 37°C, 5% CO₂. Po tym czasie usuwano roztwór MTT znad komórek i dodawano do studzienki po 100 ąl izopropanolu zakwaszonego 5 mM HCl w celu upłynnienia błon komórkowych oraz kryształków formazanu. Intensywność pojawiającego się fioletowego zabarwienia jest wprost proporcjonalna do ilości wytworzonego formazanu, która koreluje z ilością metabolicznie aktywnych komórek w hodowli. Pomiaru ilości formazanu dokonuje się spektrofotom etrycznie w czytniku do mikropłytek przy długości fali świetlnej 595 nm względem ślepej próby (izopropanol zakwaszony 5 mM HCl). Test MTT z ww. surowcami wykonano trzykrotnie (po 3 powtórzenia każdej kombinacji).

Do oceny wyników pod względem występowania synergii zastosowano równanie Kulla, opracowane i opublikowane w roku 1961 przez F.C. Kulla i wsp. z Research Department CIBA Pharmaceutical Products (New Jersey). Zastosowanie równania Kulla do oceny synergii dwóch lub więcej surowców kosmetycznych w kompleksie (patrz David C. Steinberg, Measuring Synergy, C&T 2000, tom 115, nr 11; Dębowska R, Bazela K., Rogiewicz K., Eris I. „Synergistic effect of three active cosmetic ingredients on human skin celi cultures”. 14-th EADV Conference, Londyn 2005.

Równanie Kulla:

P1xE(1 + 2) P2xE(1 + 2) _ _χE(1) + E(2) gdzie:

P1 oznacza stężenie surowca 1 (ułamek wagowy) w stosunku do sumy stężeń wszystkich składników stosowanych w kompleksie;

P2 oznacza stężenie surowca 2 (ułamek wagowy) w stosunku do sumy stężeń wszystkich składników stosowanych w kompleksie;

E1 oznacza efekt działania surowca 1 przy stężeniu składnika 1, w naszym przypadku OD 595 nm po potraktowaniu hodowli surowcem 1;

E2 oznacza efekt działania surowca 2 przy stężeniu składnika 2, w naszym przypadku OD 595 nm po potraktowaniu hodowli surowcem 2;

E(1 +2) oznacza efekt działania kompleksu surowców 1 i 2, w naszym wypadku OD 595 nm po potraktowaniu hodowli kompleksem surowców 1 i 2;

Wartość X większa od 1 wskazuje na działanie synergiczne, a mniejsza od 1 wskazuje na działanie antagonistyczne.

PL 223 299 B1

Przy wykonaniu kilku powtórzeń stosowano program komputerowy - kalkulator do obliczania przedziału ufności dla wartości średniej oraz testu t-Studenta dla porównania z wartością 1, oznaczającą addytywny wkład składników.

W następujących badaniach kompleksu (połączenia) tioprolina + sylimaryna, sylimarynę stosowano, jako ekstrakt glikolowo-glicerynowy (proporcja 65:35), zawartość flawonoligonów w przeliczeniu na silibinę 100 mg/kg.

I. Badanie zdolności zmiatania rodnika DPPH (właściwości przeciwutleniających)

Charakterystyka pomiaru: pomiary wykonano na spektrometrze Radiopan SE/X 2542, parametry pomiaru:

wzmocnienie - dobierane do próbki, średnio 10⁴ czas pomiaru 1 min

B_o = 333,34 mT

AB = 10 mT stała czasowa 1 sek temperatura: 22°C

Preparatyka: roztwory wyjściowe dla sylimaryny (S), roztwór DPPH 1 mg/ml (50 mg/50 ml alk oholu) i tioproliny (TP) 6 mg/ml (150 mg/25 ml aceton/woda)

Przygotowane próbki:

1. tioprolina + DPPH

2. sylimaryna + DPPH

3. sylimaryna + tioprolina + DPPH

Wyniki:

Z substancji dodawanych pojedynczo najsilniej rodnik DPPH zmiatała sylimaryna. Po dodaniu tioproliny do sylimaryny następował duży wzrost reaktywności z DPPH. Najsilniejsze właściwości w ykazywała mieszanina tioprolina + sylimaryna.

Nr próbki	Nazwa	Stopień przereag.	Mg dodanego DPPH	Mg przereagowanego DPPH/cała próbka	Sumaryczna ilość dodanej substancji	Mg przereagowanego DPPH/ml mieszaniny
1	TP	0,504	0,15	0,076	0,15	0,504
2	S	0,526	0,3	0,158	0,15	1,053
3	TP+S	0,633	0,6	0,38	0,3	1,266

Synergia związana ze zmiataniem rodnika DPPH w przeliczeniu na ml mieszaniny = 1,21 (na podstawie równania Kulla).

Wyniki przedstawiono na Fig. 1 i 2.

II. Badanie przeżywalności komórek naskórka po napromieniowaniu UVB dla połączenia sylimaryna (S) i tioprolina (TP)

Żywotność komórek oceniono spektrofotometrycznie, testem MTT.

Zarówno pojedynczo stosowane substancje, jak i w połączeniu wykazują korzystny efekt na k eratynocyty - komórki wykazywały wyższy stopień przeżywalności po naświetlaniu UVB, a następnie po potraktowaniu testowanymi substancjami przez 24 godz., niż komórki kontrolne naświetlone w tych samych warunkach i nie poddane działaniu substancji po naświetleniu.

₂

Żywotność komórek jest wyższa o 12,34% w komórkach naświetlonych UVB (UVB = 0,030 J/m , t = 60 sek.), a następnie poddanych działaniu tioproliny w stężeniu 10^-6% przez 24 godz., niż komórek kontrolnych naświetlonych UVB i nie potraktowanych substancją po naświetleniu.

PL 223 299 B1 . 2

Żywotność komórek jest wyższa o 3,22% w komórkach naświetlonych UVB (UVB = 0,030 J/m , t = 60 sek.), a następnie poddanych działaniu sylimaryny w stężeniu 10^-6% przez 24 godz., niż komórek kontrolnych naświetlonych UVB i nie potraktowanych substancją po naświetleniu.

Połączenie sylimaryna + tioprolina wykazuje efekt synergiczny - przeżywalność keratynocytów po naświetlaniu w warunkach j.w., a następnie poddanych działaniu kompleksu tioprolina + sylimaryna (każde w stężeniu 10^-6%) jest wyższa o 15,21% niż komórek kontrolnych (naświetlanych i nie poddanych działaniu substancji) oraz komórek naświetlanych i poddanych działaniu substancji stosowanych pojedynczo.

Efekt synergii równy 1,071 wyliczono przy zastosowaniu równania Kulla.

Keratynocyty, linia KB	Żywotność komórek (test MTT), wartość OD (opitcal density) przy długości fali 595 nm	% zwiększenia przeżywalności w stosunku do kontroli
Komórki kontrolne naświetlone UVB 0,030 J/m², t=60 sek	0,559	100%
Komórki poddane działaniu sylimaryny 10⁶% po naświetlaniu UVB, przez 24 godz.	0,577	103,22%
Komórki poddane działaniu tioproliny 10⁶% po naświetlaniu UVB, przez 24 godz.	0,628	112,34%
Komórki poddane działaniu tioprolina + sylimaryna (10^-6% każde) po naświetlaniu UVB, przez 24 godz.	0,644	115,21%

III. Badanie efektu ochronnego na komórki skóry właściwej naświetlone promieniowaniem UVB

Zarówno pojedynczo stosowane substancje (sylimaryna (S), tioprolina (TP)), jak i w połączeniu wykazują efekt ochronny na fibroblasty - komórki wykazują wyższy stopień przeżywalności po potraktowaniu substancjami przez 7 dni, a następnie naświetleniu UVB, niż komórki kontrolne naświetlone w tych samych warunkach i nie poddane działaniu substancji.

Komórki skóry właściwej (hodowla pierwotna) hodowano przez 7 dni w podłożu zawierającym ₂

10% surowicę (FCS), następnie naświetlano promieniowaniem UVB 250 J/m , t = 3 min, po czym żywotność komórek oceniono spektrofotometrycznie, testem MTT, po 72 godzinach od naświetlania (w tym czasie hodowle prowadzono w podłożu nie zawierającym - kontrola i zawierającym testowane substancje).

Żywotność komórek jest wyższa o 2,26% w komórkach traktowanych przez 7 dni tioproliną w stężeniu 10^-6%, a następnie naświetlonych UVB (UVB = 250 J/m², t = 3 min.), niż komórek kontrolnych naświetlonych UVB i nie potraktowanych przed naświetleniem. Żywotność komórek jest wyższa o 9,21% w komórkach traktowanych przez 7 dni sylimaryną stężeniu 10^-6%, a następnie naświetlo₂ nych UVB (UVB = 250 J/m , t = 3 min.), niż komórek kontrolnych naświetlonych UVB i nie potraktowanych przed naświetleniem. Połączenie tioprolina + sylimaryna wykazuje efekt synergiczny - żywotność fibroblastów traktowanych przez 7 dni kompleksem tioprolina + sylimaryna (każde w stężeniu 10^-6%), a następnie naświetlonych w warunkach j.w. jest wyższa o 15,23% niż komórek kontrolnych (naświetlanych i nie poddanych działaniu substancji przed naświetleniem) oraz komórek naświetlanych i nie poddanych przed naświetlaniem działaniu substancji stosowanych pojedynczo.

Efekt synergii równy 1,1 wyliczono przy zastosowaniu równania Kulla.

Fibroblasty, hodowla pierwotna	Żywotność komórek (test MTT), wartość OD (opitcal density) przy długości fali 595 nm, po 72 godz. od naświetlenia	% zwiększenia przeżywalności w stosunku do kontroli
1	2	3
Komórki kontrolne nie traktowane przez 7 dni żadną substancją, a następnie naświetlone UVB 250 J/m², t = 3 min.	0,532	100%

PL 223 299 B1 cd. tabeli

1	2	3
Komórki poddane działaniu sylimaryny 10^-6% przez 7 dni i naświetlone UVB	0,581	109,21%
Komórki poddane działaniu tioproliny 10^-6% przez 7 dni i naświetlone UVB	0,544	102,26%
Komórki poddane działaniu tioproliny + sylimaryny (10^-6% każdej) przez 7 dni i naświetlone UVB	0,613	115,23%

IV. Badanie połączenia tioproliny + sylimaryny do poprawy syntezy glutationu

Poziom glutationu (GSH, kluczowego antyoksydantu chroniącego komórki przed wolnymi rodnikami) oznaczano w komórkach naskórka linii KB według metody Tietze F (Analytical Chemistry 27, 205-520,1969), w warunkach bez naświetlania i po naświetleniu UVB = 300 J/cm , t = 10 sek.

Poziom glutationu oznaczono w komórkach poddanych działaniu tioproliny w stężeniu 10^-6%, sylimaryny w stężeniu 10^-6% oraz kompleksu tioprolina + sylimaryna (10^-6% każdej), po 6 godzinach stymulacji testowanymi substancjami.

Średnie stężenie/poziom GSH w komórkach

GSH gM /mg białka	6 godz.
Kontrola	0,767
Sylimaryna	0,876
Tioprolina	0,808
Tioprolina + sylimaryna	0,867
Kontrola po UY	0,723
Sylimaryna +UV	0,712
Tioprolina +UV	0,884
Tioprolina + sylimaryna +UV	0,837

Efekt synergii, bez działania promieniowania UV, równy 1,031 wyliczono przy zastosowaniu równania Kulla.

Efekt synergii równy 1,061, po działaniu promieniowania UV, wyliczono przy zastosowaniu równania Kulla.

Zakresy stężeń

Przebadano w warunkach in vitro, na hodowli pierwotnych fibroblastów i linii komórkowej naskórka KB stężenia 10^-5%, 10^-6%, 10^-7%, 10^-8% zarówno pojedynczych substancji, jak i ich kompleksów (połączeń).

Najskuteczniejsze połączenie wykazujące efekt synergii, uzyskano w stężeniu 10^-6% każdej z testowanych substancji. Nie mniej jednak wszelkie kombinacje w/w stężeń wywołują efekt synergii, w zależności od linii komórek pobranych od pacjentów w różnym wieku.

Ocena zdolności proliferacyjnych komórek naskórka poddanych działaniu substancji

Substancje aktywne i stężenie	MTT
1	2	3
Kontrola		0,4743
Tioprolina	10'⁵	0,6596
Tioprolina	10'⁶	0,498
Tioprolina	10'⁷	0,6385
Tioprolina	10·⁸	0,5567
Sylimaryna	10·⁵	0,6757

PL 223 299 B1 cd. tabeli

1	2	3
Sylimaryna	10'⁶	0,5617
Sylimaryna	10'⁷	0,6945
Sylimaryna	10'⁸	0,5795
Tioprolina + sylimaryna	10'⁵	0,667
Tioprolina + sylimaryna	10'⁶	0,5837
Tioprolina + sylimaryna	10'⁷	0,6342
Tioprolina + sylimaryna	10'⁸	0,5777

W preparatach kosmetycznych, zgodnie z zaleceniami producenta poszczególnych składników, minimalne stężenie pojedynczego składnika wynosiło 1%, a maksymalne 3%.

Najskuteczniejsze połączenie substancji uzyskano w mieszaninie związków w proporcji 1:1 (zakres od 0,001% do 3% wagowych).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera tioprolinę i sylimarynę w synergicznie skutecznej ilości.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera tioprolinę i sylimarynę w proporcji od 0,001:1 do 1:0,001, korzystnie od 0,01:1 do 1:0,01, korzystniej od 0,1:1 do 1:0,1, a zwłaszcza 1:1.
3. Preparat zawierający substancję czynną oraz kosmetycznie dopuszczalne zaróbki, nośniki i substancje dodatkowe, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera tioprolinę i sylimarynę w synergicznie skutecznej ilości.
4. Preparat według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera tioprolinę i sylimarynę w proporcji od 0,001:1 do 1:0,001, korzystnie od 0,01:1 do 1:0,01, korzystniej od 0,1:1 do 1:0,1, a zwłaszcza 1:1.
5. Preparat według któregokolwiek z zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że zawiera tioprolinę w ilości od 0,001% do 3% wagowych, w przeliczeniu na całość preparatu i sylimarynę w il ości od 0,001% do 3% wagowych, w przeliczeniu na całość preparatu.
6. Preparat według któregokolwiek z zastrz. 3 do 5, znamienny tym, że jest w postaci kremu, balsamu, lotionu, żelu, fluidu, korektora, emulsji O/W i W/O, toniku, żelu myjącego lub pianki.
7. Preparat według któregokolwiek z zastrz. 3 do 6, znamienny tym, że stanowi preparat kosmetyczny.
8. Zastosowanie kosmetyczne kompozycji zawierającej tioprolinę i sylimarynę zdefiniowanej w zastrz. 1 do spowalniania, przeciwdziałania, zapobiegania procesowi starzenia zewnątrzpochodnego.
9. Zastosowanie według zastrz. 8 do ochrony skóry przed promieniowaniem UV, substancjami chemicznymi, wolnymi rodnikami i czynnikami środowiskowymi.
10. Zastosowanie według zastrz. 8 do pielęgnacji skóry po naświetlaniu promieniowaniem UVA i/lub UVB.
11. Zastosowanie według zastrz. 8 do ochrony skóry osób nałogowo palących i/lub biernych palaczy.
12. Zastosowanie według zastrz. 8 do ochrony skóry przed wolnymi rodnikami generowanymi w komórkach i/lub uwalnianymi w atmosferze.
13. Zastosowanie według zastrz. 8 do ochrony skóry osób z cerą naczyniową i/lub trądzikiem różowatym.
14. Sposób kosmetycznego spowalniania, przeciwdziałania, zapobiegania procesowi starzenia zewnątrzpochodnego skóry, znamienny tym, że skórę traktuje się skuteczną ilością kompozycji zdefiniowanej w zastrz. 1 i/lub preparatu zdefiniowanego w zastrz. 3.

PL 223 299 B1
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że skórę traktuje się przed, w trakcie i/lub po naświetlaniu promieniowaniem UV, traktowaniu substancjami chemicznymi, działaniu czynników środowiskowych i/lub wolnych rodników.