PL223232B1

PL223232B1 - Kompozycja i preparat zawierające tioprolinę i ergotioneinę, zastosowanie kosmetyczne kompozycji tioproliny i ergotioneiny oraz sposób kosmetycznej ochrony skóry przed procesem starzenia zewnątrzpochodnego

Info

Publication number: PL223232B1
Application number: PL397785A
Authority: PL
Inventors: Irena Szołomicka-Orfinger; Katarzyna Rogiewicz; Karolina Bazela; Renata Dębowska
Original assignee: Laboratorium Kosmetyczne Dr Irena Eris Spółka Z Ograniczoną
Priority date: 2012-01-12
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2016-10-31
Also published as: PL397785A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja i preparat zawierające tioprolinę i ergotioneinę, zastosowanie kosmetyczne kompozycji tioproliny i ergotioneiny oraz sposób kosmetycznej ochrony skóry przed procesem starzenia zewnątrzpochodnego.

Starzenie się skóry spowodowane jest działaniem czynników zewnątrzpochodnych (środowiskowych) i wewnątrzpochodnych, np. genetycznych. Wpływ uszkadzających czynników środowiska wyraża się przede wszystkim starzeniem przedwczesnym skóry, najbardziej widocznym w miejscach eksponowanych na przewlekłe działanie promieniowania ultrafioletowego - na skórze twarzy i rąk. Szacuje się, że 80% wszystkich zmian obserwowanych podczas procesu starzenia w skórze niechronionej jest indukowanych promieniowaniem ultrafioletowym.

Zmiany charakterystyczne dla procesu starzenia zewnątrzpochodnego w skórze wywołane są bezpośrednim działaniem promieni UVA i UVB oraz ich działaniem pośrednim związanym z wywołaniem reakcji zapalnej w komórkach skóry.

Promienie UVA nie powodują zaczerwienienia skóry, ale odgrywają rolę w powstawaniu słonecznych zmian degeneracyjnych tkanki łącznej, niszczą kolagen, sprzyjają powstawaniu dermatoz i nowotworów skóry. Mogą też, podobnie jak promienie podczerwone, doprowadzać do uszkodzenia naczyń włosowatych i zaburzeń ukrwienia skóry.

Promienie UVB są odpowiedzialne za rumień słoneczny, poparzenia skóry oraz odgrywają decydującą rolę w powstawaniu zmian przednowotworowych i nowotworów skóry (działanie mutagenne). Około 10% promieniowania UVB przenika do skóry właściwej, uszkadzając włókna podporowe. Promienie UVB stymulują w naskórku wydzielanie interleukiny 1 (IL-1) pośredniczącej w powstawaniu reakcji zapalnej. W skórze właściwej dochodzi do zwiększonej syntezy i wzrostu aktywności metaloproteinaz rozkładających włókna kolagenowe, co doprowadza do zmniejszenia gęstości i utraty właściwości tkanki podporowej skóry.

Zarówno bezpośrednie działanie promieniowania ultrafioletowego, jak i generowane przez nie wolne rodniki uszkadzają elementy bariery naskórkowej. Degradacji ulegają składniki cementu międzykomórkowego warstwy rogowej (nienasycone lipidy) oraz zmniejsza się aktywność gruczołów łojowych. W przypadku cer suchych powoduje to pogorszenie bilansu wodnego skóry.

Oksydacyjne uszkodzenia DNA

Materiał genetyczny wszystkich organizmów narażony jest na działanie czynników mających zdolność modyfikacji chemicznej struktury DNA. Należą do nich przede wszystkim promieniowanie ultrafioletowe, substancje chemiczne i wolne rodniki.

Głównymi uszkodzeniami DNA pojawiającymi w wyniku działania promieniowania ultrafioletowego są uszkodzenia oksydacyjne oraz tzw. fotouszkodzenia, czyli powstawanie dimerów pirymidynowych (dimery tymidynowe i dimery tyminy z cytozyną) oraz fotoproduktów 6-4 (wiązanie pomiędzy węglem 6 pierścienia pirymidyny w 5' nici DNA i węglem 4 pirymidyny w 3' nici DNA). Pary sąsiadujących w łańcuchu DNA pirymidyn, powiązane wiązaniami kowalencyjnymi, zatrzymują w procesie replikacji włączanie nukleotydów przez polimerazę DNA III do nowo tworzonej nici kwasu nukleinowego, co powoduje fragmentację DNA i efekt letalny (Wojtkowiak D. i in.: Efekty oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego - rola kosmetyków. Część I. Polish Journal of Cosmetology, 1999, 1: 10-33; Gajewski W.: Mutageneza, reperacja i rekombinacja DNA. Genetyka Molekularna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2000, 248-279).

Uszkodzenia oksydacyjne polegają na reakcji aktywnych form tlenu z resztami cukrowymi lub zasadami nukleinowymi. W wyniku tego procesu powstają 5-hydroksymetylouracyl (addukt) oraz utlenione formy pirymidyn i puryn (glikol tyminy, 8-oksoguanina jako uszkodzenie o charakterze mutagennym). Oddziaływania aktywnych form tlenu z resztami cukrowymi mogą powodować powstawanie wiązań między nićmi DNA i w efekcie końcowym doprowadzać do ich pęknięcia. Dla komórki jest to letalne (Gros L. i in.: Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene, 2002, 21: 8905-8925).

Niezależnie od źródła czynnika uszkadzającego, wszystkie uszkodzenia DNA zmieniają strukturę chromosomów i zaburzają procesy replikacji DNA (Widłak P.: Struktura chromatyny a powstawanie i naprawa uszkodzeń DNA. Kosmos, 2002, 1(254): 5-12).

Wpływ wolnych rodników na procesy starzenia się skóry

Poza bezpośrednim i pośrednim działaniem promieni UV bardzo duży wpływ na procesy starzenia się skóry mają wolne rodniki, zarówno uwalniane w atmosferze, jak i powstające wewnątrz

PL 223 232 B1 organizmu. Cząstki te działają zazwyczaj jako bardzo agresywne utleniacze, niszczące różne struktury skóry i naskórka. Wraz z wiekiem maleje sprawność własnych systemów antyutleniających organizmu (np. enzymów katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej SOD) i skóra traci zdolność do samoregeneracji uszkodzeń (Ichihashi M. i in.: UV-induced skin damage. Toxicology, 2003, 189: 21-39).

Największym egzogennym źródłem aktywnych form tlenu, czyli wolnych rodników jest dym tytoniowy i spaliny. Wywołany w komórkach stres oksydacyjny prowadzi do: uszkodzeń błon biologicznych (peroksydacja lipidów) i związany z tym rozpad komórek naskórka, a w konsekwencji przyspieszenie elastozy skóry, uszkodzeń DNA, hamowania rozwoju/ różnicowania keratynocytów, indukcji procesów nowotworzenia oraz przyspieszenia apoptozy komórek skóry, a tym samym starzenia się skóry.

Efektem stresu oksydacyjnego jest:

a. zaburzenie prawidłowego funkcjonowania układu immunologicznego skóry,

b. zmiany w aktywności istotnych dla prawidłowego funkcjonowania komórki enzymów, receptorów błonowych i białek transportowych (kanały jonowe),

c. degradacja kolagenu poprzez aktywację MMP-1, stanowiącego główny budulec zdrowej skóry, które niszczone i niezdolne do regeneracji prowadzą do starzenia się skóry, przy jednoczesnej nadmiernej produkcji włókien elastycznych - włókna kolagenowe i elastyczne ulegają zbijaniu się,

d. skurcz naczyń krwionośnych w skórze, zmniejszenie transportu tlenu i substancji odżywczych, zaburzenia mikrokrążenia,

e. spowolnienie procesu gojenia się ran,

f. zwiększenie częstości występowania łuszczycy, co sprzyja wystąpieniu pierwszych zmian lub zaostrza objawy istniejącej choroby,

g. nasilenie objawów trądziku,

h. przyspieszenie wypadania włosów.

W konsekwencji pojawia się zwiększona utrata wody (TEWL), suchość skóry, podatność na p odrażnienia i wrażliwość na czynniki środowiskowe (ciepło, zimno, słońce, substancje chemiczne), przyspieszone tworzenie się zmarszczek (liczne, głębokie i wyraźnie zaznaczone), upośledzenie zdolności regeneracyjnych, zmniejszenie syntezy kolagenu i postępująca elastoza skóry.

Opisane zaburzenia powodują, że osoby poddane stresowi oksydacyjnemu wyglądają na starsze niż są w rzeczywistości. Badania dowiodły, iż palenie średnio 20 papierosów dziennie przyspiesza fizjologiczny proces starzenia się skóry o 10 lat (Rosińska A. i in. Dermatologia dla kosmetologów. red. A. Kaszuba, Wyd. Naukowe UM w Poznaniu, 2008: 234-238).

Wpływ wolnych rodników na rozwój cery naczyniowej i trądziku różowatego

Przyczyny powstawania cery naczyniowej nie są do końca poznane. Uważa się, że w skórze właściwej niektórych okolic twarzy, a także szyi i dekoltu, dochodzi do zaburzeń krążenia, które mogą być spowodowane m.in. nadmierną ekspozycją skóry na działanie czynników środowiskowych, które wpływają na czynność naczyń krwionośnych skóry np. promieniowanie cieplne i UV oraz wolne rodniki.

W większości przypadków wiele czynników nakłada się na siebie i u jednej osoby można wykryć kilka różnych przyczyn wystąpienia cery naczyniowej.

Najnowsze doniesienia Yamasaki i Gallo sugerują, że u podstaw wszystkich mechanizmów biorących udział w patogenezie trądziku różowatego leżą zaburzenia odpowiedzi immunologicznej. Szeroko opisywane czynniki zewnętrzne, pełniące rolę mechanizmów spustowych, indukują zaburzenia immunologiczne, prowadzące do powstawania objawów klinicznych choroby. Autorzy ci wśród m echanizmów patogenetycznych w trądziku różowatym za najistotniejsze uznali m.in. działanie reaktywnych form tlenu (ROS) i działanie promieniowania UV (Górkiewicz-Petkow A. Trądzik różowaty - etiopatogeneza i leczenie. Przegl. Dermatol. 2007, 94(3): 373-383, Yamasaki K i in. The molecular pathology of rosacea. J. Dermatol Sci 2009, Geria AN i in. Rosacea: a review. Kosmetische Medizin 2008,6: 303-308).

Tioprolina (tymonacyk), czyli kwas tiazolidyno-4-karboksylowy jest metabolizowana do cysteiny, która wchodzi w skład białek włosów, naskórka, paznokci (białko keratyna) i glutationu. Glut ation umożliwia detoksykację. Jest także źródłem licznych istotnych w funkcjonowaniu organizmu metabolitów.

Tioprolina pełni liczne funkcje w organizmie, między innymi działa lipotropowo: przeciwmiażdżycowo, obniża stężenie lipidów we krwi, chroni wątrobę, nerki i serce przed stłuszczeniem; działa żółciopędnie, rozkurczowo; ma działanie ochronnie na miąższ wątroby, chroniąc przed szkodliwymi czynnikami wirusowymi, bakteryjnymi, metalami ciężkimi, węglowodorami i lekami; poprawia strukturę i pobudza wzrost oraz regenerację naskórka, włosów i paznokci, ma ponadto właściwości przeciwtrą4

PL 223 232 B1 dzikowe i przeciwłuszczycowe; a także, wraz z N-acetylocysteiną stanowią antyoksydanty, które znalazły zastosowanie w suplementacji anti-aging - Miguel J. Menopause: A review on the role of oxygen stress and favorable effects of dietary antioxidants. (2006) Arch Gerontol Geriatr; Guayerbas N. Thiolic antioxidant supplementation of the diet reverses age-related behavioural dysfunction in prematurely ageing mice. (2005) Pharmacol Biochem Behav 80: 45-51. W organizmie jest metabolizowana do cysteiny.

W US 5047409 opisano sole tioproliny z 3-tlenkiem 6-piperydyno-2,4-diaminopirymidyny oraz ich miejscowe stosowanie, a także ich kosmetyczne i medyczne zastosowanie do leczenia utraty wł osów lub stanów patologicznych takich jak między innymi łysienie, zapalenie skóry.

W US 6150405 ujawniono zastosowanie związków sulfhydrylowych, w tym tioproliny, do leczenia utraty włosów.

US 20040028787 wymieniono tioprolinę do aromatyzowania żywności i napojów, a także do stosowania w kosmetyce.

Ergotioneina (L-ergotioneina, tiotaina, nazwa handlowa Thiotaine) jest egzogennym aminokwasem. Jest ona skutecznym antyoksydantem, który reagując z różnorodnymi wolnymi rodnikami pom aga chronić struktury komórkowe przed uszkodzeniami. Pełni także funkcję podobną do karnityny transportuje substancje odżywcze do wnętrza mitochondriów. Dodatkowo, ergotioneina wpływa na zmniejszenie ilości MMP-1, jednej z metaloproteinaz, enzymów które rozkładają włókna kolagenowe odpowiedzialne za elastyczność skóry; obniża również poziom TNF-a

- substancji w dużej mierze odpowiedzialnej za stan zapalny wywołany promieniami UVB. Ergotioneina może również chronić przed powstawaniem przebarwień posłonecznych (Thiotaine, spec yfikacja produktu, Barnet Products Corporation, New Jersey i cytowane tam odnośniki literaturowe).

Ergotioneinę stosuje się w kosmetykach jako składnik o działaniu antyoksydacyjnym.

Ergotioneina występuje naturalnie między innymi w grzybach, np. grzybach shiitake (Lentinula edodes, twardziak japoński), w których stwierdzono także obecność tioproliny. W handlu dostępne są również ekstrakty z grzybów shiitake przeznaczone do stosowania w kosmetykach jako składniki ochronne i odżywcze, np. corthellus shiitake extract, lentinus edodes extract i lentinus edodes mycelium extract. Jako składniki czynne ekstraktów z grzybów shiitake wskazuje się witaminę C, jako składnik wyłapujący wolne rodniki; witaminy A i B oraz minerały, jako składniki ochronne dla skóry; oraz aminokwasy i lentinan (polisacharyd o właściwościach przeciwnowotworowych), jako składniki nawilżające i immunostymulujące.

Przykładowo, wyciąg z grzybów shiitake jest surowcem kosmetycznym stosowanym w preparacie Positively Ageless™ Sunscreen Lotion Face SPF 60.

Jednakże badania dostępnego w handlu, będącego surowcem kosmetycznym, ekstraktu z grzybów shitake wykazały, że nie zawiera on w ogóle tioproliny.

Jakkolwiek znanych jest szereg preparatów przeznaczonych do profilaktyki i leczenia starzenia się skóry, to nadal istnieje potrzeba opracowania skutecznych środków do ochrony skóry przed procesem starzenia zewnątrzpochodnego.

Wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej tioprolinę i ergotioneinę w synergicznie skutecznej ilości.

Korzystnie kompozycja zawiera tioprolinę i ergotioneinę w proporcji od 0,0001:1 do 1:0,0001, korzystnie od 0,001:1 do 1:0,001, korzystniej od 0,01:1 do 1:0,01, w szczególności od 0,1:1 do 1:0,1, a zwłaszcza 2:1.

Wynalazek dotyczy także preparatu zawierającego substancję czynną oraz kosmetycznie dopuszczalne zaróbki, nośniki i substancje dodatkowe, który jako substancję czynną zawiera tioprolinę i ergotioneinę w synergicznie skutecznej ilości.

Korzystnie preparat zawiera tioprolinę i ergotioneinę w proporcji od 0,0001:1 do 1:0,0001, k orzystnie od 0,001:1 do 1:0,001, korzystniej od 0,01:1 do 1:0,01, w szczególności od 0,1:1 do 1:0,1, a zwłaszcza 2:1.

Korzystnie preparat zawiera tioprolinę w ilości od 0,0001% do 3% wagowych, w przeliczeniu na całość preparatu i ergotioneinę w ilości od 0,0001% do 3% wagowych, w przeliczeniu na całość preparatu.

Korzystnie preparat jest w postaci kremu, balsamu, lotionu, żelu, fluidu, korektora, emulsji O/W i W/O, toniku, żelu myjącego lub pianki.

Korzystnie preparat stanowi preparat kosmetyczny.

PL 223 232 B1

Wynalazek dotyczy również zastosowania kosmetycznego kompozycji zawierającej tioprolinę i ergotioneinę zdefiniowanej powyżej do spowalniania, przeciwdziałania, zapobiegania procesowi starzenia zewnątrzpochodnego.

Korzystne jest zastosowanie do ochrony skóry przed promieniowaniem UV, substancjami chemicznymi, wolnymi rodnikami i czynnikami środowiskowymi.

Korzystne jest zastosowanie do pielęgnacji skóry po naświetlaniu promieniowaniem UVA i/lub

UVB.

Korzystne jest zastosowanie do ochrony skóry osób nałogowo palących i/lub biernych palaczy.

Korzystne jest zastosowanie do ochrony skóry przed wolnymi rodnikami generowanymi w komórkach i/lub uwalnianymi w atmosferze.

Korzystne jest zastosowanie do ochrony skóry osób z cerą naczyniową i/lub trądzikiem różowatym.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu kosmetycznego spowalniania, przeciwdziałania, zapobiegania procesowi starzenia zewnątrzpochodnego skóry polegającego na tym, że skórę traktuje się skuteczną ilością kompozycji zdefiniowanej powyżej i/lub preparatu zdefiniowanego powyżej.

Korzystny jest sposób, w którym skórę traktuje się przed, w trakcie i/lub po naświetlaniu promieniowaniem UV, traktowaniu substancjami chemicznymi, działaniu czynników środowiskowych i/lub wolnych rodników.

Kompozycja według wynalazku ma zastosowanie w preparatach pielęgnacyjnych stosowanych między innymi w zabiegach wykonywanych w salonach kosmetycznych.

Kompozycję stanowi kompleks antyoksydacyjny, który spowalnia procesy starzenia zewnątrzpochodnego, uwarunkowanego działaniem czynników zewnętrznych (zanieczyszczenia) oraz jego najbardziej znanej formy - fotostarzenia, związanego z nadmierną ekspozycją na promieniowanie UV. Kompozycja ta znajduje zastosowanie w pielęgnacji skóry starzejącej się, suchej, odwodnionej, przesuszonej, wrażliwej, skóry naczyniowej i z trądzikiem różowatym, skóry poddanej działaniu promieniowania słonecznego i promieniowania stosowanego np. w solariach.

Preparat według wynalazku zawiera tioprolinę w ilości od 0,0001% do 3% wagowych, w przeliczeniu na całość preparatu i ergotioneinę w ilości od 0,0001% do 3% wagowych, w przeliczeniu na całość preparatu.

Preparat według wynalazku zwiera tioprolinę w ilości od 0,0001% wag., tak jak 0,005% wag., 0,01% wag., 0,05% wag., 0,1% wag., 0,5% wag., 1% wag., 2% wag., 3% wag., w przeliczeniu na całość preparatu.

Preparat według wynalazku zawiera ergotioneinę w ilości od 0,0001% wag., tak jak 0,005% wag., 0,01% wag., 0,05% wag., 0,1% wag., 0,5% wag., 1% wag., 2% wag., 3% wag., w przeliczeniu na całość preparatu.

Najskuteczniejsze jest połączenie substancji w mieszaninie związków w proporcji tioprolina : ergotioneina wynoszącej 2:1.

Środek kosmetyczny według wynalazku wykazuje liczne zalety na tle znanych ze stanu techniki preparatów.

Z uwagi na synergiczne działanie składników możliwe jest użycie w preparacie mniejszej ilości tioproliny i ergotioneiny, a więc zmniejszenie prawdopodobieństwa wystąpienia niekorzystnych skutków ubocznych, takich jak reakcja podrażnienia czy alergia.

Tioprolinę i ergotioneinę można podawać w połączeniu z kosmetycznie dopuszczalnymi nośnikami lub rozcieńczalnikami w wielu różnych postaciach dawkowanych do stosowania miejscowo. Można je łączyć z wieloma różnymi kosmetycznie dopuszczalnymi, chemicznie obojętnymi nośnikami, w postać kremu, balsamu, lotionu, żelu, fluidu, korektora, emulsji O/W i W/O, toników, żeli myjących, pianek a także mleczek, balsamów, itp., zgodnie ze standardową praktyką kosmetyczną.

Kremy i żele można np. formułować z wodnym lub oleistym podłożem, z dodatkiem odpowiednich środków zagęszczających i/lub żelujących i/lub rozpuszczalników. Takie podłoża mogą zawierać np. wodę i/lub olej, taki jak ciekła parafina lub dowolny olej roślinny, albo rozpuszczalnik, taki jak glikol polietylenowy. Do środków zagęszczających i środków żelujących, które można stosować w zależności od charakteru podłoża, należą miękka parafina, stearynian glinu, alkohol cetostearylowy, glikole polietylenowe, tłuszcz z wełny, wosk pszczeli, karboksypolimetylen i pochodne celulozy i/lub monostearynian glicerylu i/lub niejonowe środki emulgujące.

Emulsje O/W i W/O zawierają fazę wodną, fazę tłuszczową i środek powierzchniowo czynny lub mieszaninę środków powierzchniowo czynnych (emulgatorów), które umożliwiają powstanie emulsji.

PL 223 232 B1

Stosunek ilościowy zależy od wymaganej konsystencji, od właściwości składników fazy tłuszczowej i właściwości emulgatora. Można je formułować poprzez połączenie fazy wodnej z fazą olejową z o dpowiednimi emulgatorami. Faza wodna może zawierać ekstrakty roślinne wodne lub/i alkoholowe, faza olejowa - oleje roślinne naturalne (oleinowy, linolowy, linolenowy), parafinowe (wazelinowe, białe, mineralne, płynne parafiny), masła, oleje syntetyczne.

Lotiony można formułować z użyciem wodnego lub olejowego podłoża np. etanolu lub alkoholu oleilowego.

W razie potrzeby środki kosmetyczne według wynalazku można buforować przez dodanie odpowiednich środków buforujących.

Zazwyczaj preparaty zawierają również jeden lub większą liczbę środków emulgujących, stabilizatorów, środków dyspergujących, środków zagęszczających, środków barwiących, substancji zapachowych, środków konserwujących środków nawilżających itp.

Nośniki odpowiednie do stosowania zgodnie z wynalazkiem obejmują stałe rozcieńczalniki lub wypełniacze, ośrodki wodne i różne nietoksyczne rozpuszczalniki organiczne i nieorganiczne.

Poniżej przedstawiono przykładowe ramowe receptury środków kosmetycznych oraz preparatów według wynalazku.

Mleczko - receptura ramowa

nazwa składnika	% [m/m]
Alkohol tłuszczowy	1,50
Emulgator	3,00
Estry kwasu benzoesowego i alkoholi tłuszczowych	6,50
Glicerydy kwasów tłuszczowych	7,10
Gliceryna	3,00
Olej z masłosza	2,00
Polimer akrylowy w estrze kwasu tłuszczowego i sorbitolu	1,00
Polimer metakrylanu metylu	0,50
Wodny wyciąg roślinny	0,30
Tioprolina	0,20
Tiotaina	0,10
Kompozycja zapachowa	0,00-0,30
Układ konserwujący	0,6-1,0
Woda	Do 100

Mleczko do demakijażu

nazwa handlowa	procent
1	2
arlamol hd	10,000
euxyl pe 9010	0,800
gliceryna	3,000
kompozycja zapachowa	0,200
kwas stearynowy	0,100
lipex 203	0,200
lipex cocoasoft	0,200
montanov 1	3,000

PL 223 232 B1 cd. tabeli

1	2
nexbase 2008	1,000
simulgel eg	0,900
sj touch	0,600
tegosoft gc	0,100
tioprolina	0,200
tiotaina	0,100
woda	do 100,000

Balsam - receptura ramowa

nazwa składnika	% [m/m]
Bha	0,02
Alkohol cetylowy	1,20
Dimetikon	1,00
Emulgator	3,00
Gliceryna	3,00
Olej roślinny	4.50
Olej mineralny	8,00
Polimer akrylowy	0,25
Stearynian glicerolu	2,00
Tioprolina	0,10
Tiotaina	0,05
Kompozycja zapachowa	0,00-0,80
Układ konserwujący	0,60-1,30
Woda	Do 100

Balsam do ciała

nazwa handlowa	procent
1	2
abil 350	1,000
alkohol cetylowy	1,200
cosmedia sp	0,250
germall	0,100
gliceryna	3,000
methylparaben	0,200
olej migdałowy	3,000
olej wazelinowy	7,000
sepicide	0,300
masło shea	1,500
tegin m	2,000

PL 223 232 B1 cd. tabeli

1	2
tego care 450	3,000
tenox bha	0,020
wazelina	1,000
tioprolina	0,100
tiotaina	0,050
woda	do 100,000

Krem do twarzy - receptura ramowa

nazwa składnika	% [m/m]
emulgator	3,000
dimetikon	2,00
alkohol tłuszczowy	1,50
stearynian pentaerytrytylu lub stearynian glicerolu	2,50
gliceryna	3,00
masło kakaowe	0,50
lanolina	1,00
wosk roślinny	1,00
skwalan	3,00
izostearynian izopropylu	3,00
tetraizostearynian pentaizoerytrytylu	4,00
wodny wyciąg roślinny	1,00
polimer silikonowy modyfikowany alkilem	3,00
tioprolina	0,50
tiotaina	0,25
kompozycja zapachowa	0,00-0,80
układ konserwujący	0,60-1,50
woda	do 100

Krem do twarzy

nazwa handlowa	procent
1	2
abil 350	2,00000
alkohol cetylowy	1,50000
barwnik czerwony	0,00015
collaxyl is	0,90000
cutina pes	2,50000
euxyl k-702	0,30000
luteina	0,00100
gliceryna	3,00000

PL 223 232 B1 cd. tabeli

1	2
kompozycja zapachowa	0,30000
lipex cocoasoft	0,50000
medilan ultra	1,00000
paraben metylu	0,20000
nikkol	0,25000
phytowax oliwe	1,00000
pripure 3759	3,00000
prisorine 2021	3,00000
prisorine 3631	4,00000
Sensiline ekstrakt nasion lnu	1,00000
silsoft 034	3,00000
tego care 450	3,00000
witamina a-palmitat	0,05000
tioprolina	0,500
tiotaina	0,250
woda	do 100,000

Emulsja - receptura ramowa

nazwa składnika	max. % \|m/m\|
alkohole wielowodorotlenowe	10,00
emolienty	25,00
emulgatory	5,00
filtry UV	25,00
kompozycja zapachowa	1,00
substancje pomocnicze	3,00
tioprolina	3,00
tiotaina	3,00
układ konserwujący	2,00
wyciągi roślinne	5,00
zagęstniki	5,00
woda	do 100

Pianka do mycia twarzy - receptura ramowa

nazwa składnika	max. % [m/ml
1	2
alkohole wielowodorotlenowe	10,00
barwniki	1,00
emolienty	5,00
kompozycja zapachowa	2,00

PL 223 232 B1 cd. tabeli

1	2
składniki aktywne	5,00
stabilizatory barwy	2,00
substancje pomocnicze	3,00
środki powierzchniowo czynne	12,00
tioprolina	3,00
tiotaina	3,00
układ konserwujący	5,00
wyciągi roślinne	10,00
zagęstniki	5,00
woda	do 100

Pianka do mycia twarzy

nazwa handlowa	procent
allantoina	0,100
dowicil 200	0,120
d-panthenol	1,500
gliceryna	5,000
glucam e-20	2,500
natrosol 250 hr	0,400
natural extract ap	4,000
rewoderm s 1333	3,000
rewoteric amb 45	7,000
Sensiline ekstrakt nasion lnu	0,500
tegosoft gc	1,000
tioprolina	1,000
tiotaina	0,500
woda	do 100,000

Tonik - receptura ramowa

nazwa składnika	max. % [m/m]
1	2
alkohole wielowodorotlenowe	2,00
barwniki	1,00
kompozycja zapachowa	2,00
regulatory pH	1,00
stabilizatory barwy	3,00
substancje pomocnicze	2,00
środki powierzchniowo czynne	5,00

PL 223 232 B1 cd. tabeli

1	2
tioprolina	3,00
tiotaina	3,00
ukłuł konserwujący	5,00
wyciągi roślinne	7,00
woda	do 80,00

Tonik

nazwa handlowa	procent
cremophor rh 40	0,500
germall ii	0,300
ginkgo biloba	2,000
gliceryna	2,000
kompozycja zapachowa	0,100
paraben metylu	0,200
ekstrakt cytrynowy	0,450
neo pcl	2,000
trójetanoloamina	0,080
wersenian dwusodowy	0,050
tioprolina	0,500
tiotaina	0,250
woda	do 100,000

Żel pod prysznic - receptura ramowa

nazwa składnika	max. % \|m/m\|
alkohole wielowodorotlenowe	7,00
barwniki	2,00
kompozycja zapachowa	2,00
stabilizatory barwy	3,00
substancje pomocnicze	2,00
środki powierzchniowo czynne	20,00
tioprolina	3,00
tiotaina	3,00
układ konserwujący	5,00
emolienty	5,00
wyciągi roślinne	5,00
zagęstniki	5,00
woda	do 100,00

PL 223 232 B1

Żel pod prysznic

nazwa handlowa	procent
barwnik czerwony	0,001
barwnik żółty	0,001
ekstrakt z miodu	0,150
gliceryna	3,000
gluadin wq	1,500
kompozycja zapachowa	0,500
rewoteric amb 45	15,000
salicylan sodowy	0,500
sól	0,800
uvinul ms 40	0,500
zetesol 270/n	12,000
tioprolina	1,000
tiotaina	0,500
woda	do 100,000

Próby biologiczne

I. Test na zdolność zmiatania rodnika DPPH (właściwości przeciwutleniających) metodą elektronowego rezonansu paramagnetycznego EPR

Próbka	RPF (ilość rodników /1 g próbki)
TioP1	6,40 x 10¹⁹
TioP2	7,03 x 10¹⁹

TioP1 - tioprolina w postaci surowca kosmetycznego TioP2 - tioprolina w postaci odczynnika chemicznego

Próbka:	RPF (ilość rodników /1 ml roztworu próbki)
TioP1 c = 0,628 mg/ml	4,02 x 10¹⁶
TioP2 c = 0,920 mg/ml	6,47 x 10¹⁶
TioT c = 0,4586 mg/ml	2,11 x 10¹⁸
TioT + TioP2	1,94 x 10¹⁸

TioT - tiotaina, L - ergotioneina .Opis próby

Rodnik 1,1-difenylo-2-pikrylohydrazylowy DPPH okazał się bardzo dobrym testerem właściwości antyutleniających, zwłaszcza polifenoli. DPPH w wyniku reakcji ze związkami zawierającymi wiązania C-H, N-H, O-H, S-H występuje jako akceptor wodoru i przekształca się w difenylopikrylohydrazynę (Rys.1). Do tej pory ukazało się wiele prac opisujących zastosowanie tego rodnika, w tym np. Ratz-Lyko A. i in. „Methods for evaluation of cosmetics antioxidant capa city” „Skin Research nad technology” 2011, publ. 9 października 2011, Kusznierewicz B. i in. „Metody oznaczania in vitro właściwości przeciwutleniających próbek żywności” Cz. II Bromat. Chem. Toksykol 2006, 36:261-270 Vertuani S. i in., oraz „Determination of antioxidant efficacy of cosmetic formulations by non-invasive measurements” Skin Res. Technol. 2003, 9:245-253.

PL 223 232 B1

2. Wykonanie pomiarów

Technika pomiaru EPR

Pomiary wykonano na spektrometrze Magnettech Miniscope MS200, promieniowanie o częstości 9.3 GHz (pasmo X), cyfrowy sygnał z detektora mikrofal poddawany jest obróbce komputerowej.

Parametry pomiaru: czas pomiaru 20 s Bo = 333,34 mT AB = 7,5 mT temp. pokojowa 22°C

3. Preparatyka

Roztwór DPPH (Aldrich Chemie) w acetonie miał stężenie 0,506 mg/ml.

Do wyznaczenia współczynnika RPF przygotowano roztwory substancji TioP1 i TioP2 w mieszaninie aceton/woda (1:1). Próbki mieszano z DPPH w proporcji dobranej dla każdej próbki i zostawiano na 45 min chroniąc przed światłem i dostępem powietrza. Następnie przenoszono do kapilary i wykonano pomiary metodą EPR. Pomiary powtórzono 3-krotnie dla każdej z badanych próbek.

4. Wyniki

4.1. Metoda Kulla

Do oceny wyników pod względem występowania synergii zastosowano równanie Kulla, opracowane i opublikowane w roku 1961 przez F.C. Kulla i in. z Research Department CIBA Pharmaceutical Products (New Jersey). Zastosowanie równania Kulla do oceny synergii dwóch lub większej liczby surowców kosmetycznych w kompleksie patrz David C. Steinberg, Measuring Synergy, C&T 2000, tom 115, nr 11; Dębowska R. i in., Synergistic effect of three active cosmetic ingredients on human skin celi cultures. 14-th EADV Conference, Londyn 2005.

Równanie Kulla:

PlxE(l + 2) , P2 + E(1 + 2) Ε(ϊ) ⁺ E(2) gdzie:

P1 oznacza stężenie surowca 1 (ułamek wagowy) w stosunku do sumy stężeń wszystkich składników stosowanych w kompleksie

P2 oznacza stężenie surowca 2 (ułamek wagowy) w stosunku do sumy stężeń wszystkich składników stosowanych w kompleksie

E1 oznacza efekt działania surowca 1 przy stężeniu składnika 1, w naszym przypadku OD 595 nm po potraktowaniu hodowli surowcem 1

E2 oznacza efekt działania surowca 2 przy stężeniu składnika 2, w naszym przypadku OD 595 nm po potraktowaniu hodowli surowcem 2

E(1 +2) oznacza efekt działania kompleksu surowców 1 i 2, w naszym wypadku OD 595 nm po potraktowaniu hodowli kompleksem surowców 1 i 2

Wartość X większa od 1 wskazuje na działanie synergiczne, a mniejsza od 1 wskazuje na działanie antagonistyczne.

Efekt synergii równy 20,306 wyliczono przy zastosowaniu równania Kulla, dla poniższych wartości: P1 - stężenie surowca 1 (TioT) w stosunku do sumy stężeń wszystkich składników stosowanych w kompleksie (TioT-0,4586 mg/ml, TioP 0,92 mg/ml, suma stężeń=1,3786 mg/ml) = 0,3327 Masa molowa TioT 229,3 g/mol mmol - 229,3 mg mmole - 458,6 mg - 1000 ml, co daje 0,4586 mg/ml

P2 - stężenie surowca 2 (TioP 0,92 mg/ml) w stosunku do sumy stężeń wszystkich składników stosowanych w kompleksie 1,3786 mg/ml, = 0,667

E1 - efekt działania surowca 1 (TioT), =2,11 x 10¹⁸E2 - efekt działania surowca 2 (TioP), =6,47 x 10¹⁶E (1 +2) - efekt działania kompleksu surowców 1 i 2, =1,94 x 10¹⁸

4.2. Metoda Hidalgo

Niezależnie, do oceny wyników pod względem występowania synergii zastosowano równanie Hidalgo,

PL 223 232 B1

Efekt% =

200xRPF_T+P2RTF_t + RTF_P2 opracowane dla oceny właściwości antyoksydacyjnych substancji i opublikowane w roku 2010 przez Hidalgo M. i in. w Food Chemistry 121 (2010) 691-696.

Wartości współczynnika RPF (Radical Protection Factor) obliczono w przeliczeniu na 1 gram próbki i wyznaczono wartość średnią dla każdego preparatu. Współczynnik RPF określa, jaka ilość rodnika testowego (w tym przypadku DPPH) przereagowała z 1 gramem substancji (lub 1 ml roztworu). Większa wartość RPF oznacza większą zdolność zmiatania rodnika.

Z dwóch substancji TioP1 i TioP2 większą zdolność zmiatania rodnika DPPH wykazała druga. TioP2 wykorzystano do zbadania zdolności zmiatania połączenia TioT i TioP2.

Mieszanina roztworów wykazuje silny efekt synergiczny wynoszący +78%, zgodnie z równ aniem Hidalgo.

II. Badanie proliferacji keratynocytów

Komórki hodowano w obecności testowanych substancji przez 24 godz. (bez naświetlania UVB) w standardowym podłożu RPMI z antybiotykami i glutaminą, uzupełnionym 10% surowicą FCS. Żywotność komórek oceniono spektrofotometrycznie, testem MTT.

W warunkach z naświetlaniem komórek, (24 godz. hodowla od momentu wysiania komórek na płytkę 96-dołkową, naświetlanie UVB=0,030 J/m , t=60 sek., a następnie stymulacja badanymi substancjami w różnych stężeniach przez 24 godz.), usuwano pożywkę znad komórek i dodawano roztwór MTT (100 μl/studzienkę) sporządzony w płynie hodowlanym DMEM w stężeniu 0,5 mg/ml. Następnie komórki umieszczano na 2 godziny w 37°C, 5% CO₂. Po tym czasie usuwano roztwór MTT znad komórek i dodawano do studzienki po 100 μl izopropanolu zakwaszonego 5 mM HCl w celu upłynnienia błon komórkowych oraz kryształków formazanu. Intensywność pojawiającego się fioletowego zabarwienia jest wprost proporcjonalna do ilości wytworzonego formazanu, która koreluje z ilością metabolicznie aktywnych komórek w hodowli. Pomiaru ilości formazanu dokonuje się spektrofotometrycznie w czytniku do mikropłytek przy długości fali świetlnej 595 nm względem ślepej próby (izopropanol zakwaszony 5 mM HCl). Test MTT z ww. surowcami wykonano trzykrotnie (po 3 powtórzenia każdej kombinacji).

III. Badanie proliferacji komórek skóry właściwej (fibroblastów)

Komórki skóry właściwej (hodowla pierwotna) hodowano przez 7 dni w podłożu zawierającym ₂

10% surowicę (FCS), następnie naświetlano promieniowaniem UVB 250 J/m , t=3 min., po czym żywotność komórek oceniono spektrofotometrycznie, testem MTT po 48 i 72 godzinach od naświetlania (w tym czasie hodowle prowadzono w podłożu nie zawierającym - kontrola i zawierającym testowane substancje). Prowadzono również hodowle pierwotne fibroblastów przez 21 dni w obecności testowanych substancji, zarówno w podłożu zawierającym, jak i pozbawionym surowicy, bez naświetlania komórek promieniowaniem UVB. Podłoże hodowlane wymieniano co 7 dni, żywotność komórek po odpowiednio 7, 14 i 21 dniach oceniano testem MTT.

IV. Test MTT

Test MTT (test redukcji pobranej przez komórki soli tetrazolowej MTT) - test kolorymetryczny służący do ilościowej oceny proliferacji komórek w odpowiedzi na różnorodne czynniki oraz potencjonalnego efektu cytotoksycznego i cytostatycznego tychże czynników. Test MTT jest metodą powszechnie stosowaną np. przy ocenie cytotoksyczności substancji aktywnych o potencjalnym zastosowaniu w kosmetyce.

Zasada oznaczenia

MTT jest solą diazolową pobieraną przez komórki i redukowaną przez obecną w mitochondriach dehydrogenazę bursztynianową - jeden z enzymów łańcucha oddechowego aktywny tylko w żywych komórkach. MTT ulega redukcji do nierozpuszczalnego w wodzie formazanu, który grom adzi się we wnętrzu komórek.

V. Wyniki badań biologicznych

a. Efekt na komórki naskórka

Tiotaina działa stymulująco na komórki naskórka w szerokim zakresie stężeń.

PL 223 232 B1

T a b e l a 1

Zawartość Tiotainy	% stymulacji proliferacji komórek naskórka w stosunku do kontroli (OD=595 nm, przyjętej jako 100%)
0,00004586 pg/ml	103
0,0004586 pg/ml	103,3
0,004586 pg/ml	104
0,04586 pg/ml	107,1
0,004586 mg/ml	113
0,04586 mg/ml	112
0,4586 mg/ml	109

Tioprolina działa stymulująco na komórki naskórka w szerokim zakresie stężeń.

T a b e l a 2

Zawartość Tioproliny (%)	% stymulacji proliferacji komórek naskórka w stosunku do kontroli (OD=595 nm, przyjętej jako 100%)
(10^-3%)	99,3
(10^-4%)	98,5
(10^-5%)	108,4
(10^-6%)	112
(10^-7%)	113
(10^-8%)	117,4

b. Efekt na komórki skóry właściwej

Tiotaina działa stymulująco na komórki skóry właściwej

Stwierdzono wzrost (o 3,14%) proliferacji fibroblastów linii R9 po 14 dniach hodowli w podłożu zawierającym (10%) lub nie zawierającym surowicę i 0,004586 mg/ml (10^- % roztworu 2 MM) tiotainy.

Tioprolina działa stymulująco na komórki skóry właściwej

Stwierdzono wzrost (o odpowiednio 9% i 10%) proliferacji fibroblastów linii R10 już po 7 dniach hodowli w podłożu zawierającym (10%) lub nie zawierającym surowicę i 10^-6% tioproliny. Po 14 dniach hodowli stwierdzono dalszy wzrost stymulacji podziałów komórek do +20%.

c. Efekt po UV

W obecności tiotainy nie stwierdzono efektu dla komórek naświetlanych UVB, zarówno fibroblastów, jak i keratynocytów

- żywotność komórek była zbliżona do żywotności komórek kontrolnych, nie traktowanych b adaną substancją.

W obecności tioproliny wykazano efekt ochronny zarówno dla keratynocytów, jak i fibroblastów.

Dla keratynocytów zaobserwowano wzrost przeżywalności komórek o +14,71 po naświetlaniu UVB UVB=0,030 J/m², t=60 sek. i stymulacji Tioproliną w stężeniu 10^-5% przez 24 godz.

Dla fibroblastów (linia B3 i A8) zaobserwowano wzrost przeżywalności komórek po 48 godz. i 72 godz. od naświetlania w podłożu zawierającym 10^-6% Tioproliny, odpowiednio o 4% i 16% (linia B3) oraz odpowiednio o 4,8% i 20,6% (linia A8).

Wniosek ogólny:

Zarówno pojedynczo stosowane substancje, jak i w połączeniu wykazują pozytywny efekt na komórki - komórki wykazują wyższy stopień przeżywalności po potraktowaniu substancjami niż k omórki kontrolne w tych samych warunkach i nie poddane działaniu substancji.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera tioprolinę i ergotioneinę w synergicznie skutecznej ilości.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera tioprolinę i ergotioneinę w proporcji od 0,0001:1 do 1:0,0001, korzystnie od 0,001:1 do 1:0,001, korzystniej od 0,01:1 do 1:0,01, w szczególności od 0,1:1 do 1:0,1, a zwłaszcza 2:1.
3. Preparat zawierający substancję czynną oraz kosmetycznie dopuszczalne zaróbki, nośniki i substancje dodatkowe, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera tioprolinę i ergotioneinę w synergicznie skutecznej ilości.
4. Preparat według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera tioprolinę i ergotioneinę w proporcji od 0,0001:1 do 1:0,0001, korzystnie od 0,001:1 do 1:0,001, korzystniej od 0,01:1 do 1:0,01, w szczególności od 0,1:1 do 1:0,1, a zwłaszcza 2:1.
5. Preparat według któregokolwiek z zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że zawiera tioprolinę w ilości od 0,0001% do 3% wagowych, w przeliczeniu na całość preparatu i ergotioneinę w ilości od 0,0001% do 3% wagowych, w przeliczeniu na całość preparatu.
6. Preparat według któregokolwiek z zastrz. 3 do 5, znamienny tym, że jest w postaci kremu, balsamu, lotionu, żelu, fluidu, korektora, emulsji O/W i W/O, toniku, żelu myjącego lub pianki.
7. Preparat według któregokolwiek z zastrz. 3 do 6, znamienny tym, że stanowi preparat kosmetyczny.
8. Zastosowanie kosmetyczne kompozycji zawierającej tioprolinę i ergotioneinę zdefiniowanej w zastrz. 1 do spowalniania, przeciwdziałania, zapobiegania procesowi starzenia zewnątrzpochodnego.
9. Zastosowanie według zastrz. 8 do ochrony skóry przed promieniowaniem UV, substancjami chemicznymi, wolnymi rodnikami i czynnikami środowiskowymi.
10. Zastosowanie według zastrz. 8 do pielęgnacji skóry po naświetlaniu promieniowaniem UVA i/lub UVB.
11. Zastosowanie według zastrz. 8 do ochrony skóry osób nałogowo palących i/lub biernych palaczy.
12. Zastosowanie według zastrz. 8 do ochrony skóry przed wolnymi rodnikami generowanymi w komórkach i/lub uwalnianymi w atmosferze.
13. Zastosowanie według zastrz. 8 do ochrony skóry osób z cerą naczyniową i /lub trądzikiem różowatym.
14. Sposób kosmetycznego spowalniania, przeciwdziałania, zapobiegania procesowi starzenia zewnątrzpochodnego skóry, znamienny tym, że skórę traktuje się skuteczną ilością kompozycji zdefiniowanej w zastrz. 1 i/lub preparatu zdefiniowanego w zastrz. 3.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że skórę traktuje się przed, w trakcie i/lub po naświetlaniu promieniowaniem UV, traktowaniu substancjami chemicznymi, działaniu czynników środowiskowych i/lub wolnych rodników.