PL223271B1

PL223271B1 - Szerokoporowaty podkład do hodowli komórkowych, sposób jego wytwarzania i zastosowanie

Info

Publication number: PL223271B1
Application number: PL400288A
Authority: PL
Inventors: Andrzej Chwojnowski; Konrad Dudziński; Ewa Łukowska; Cezary Wojciechowski
Original assignee: Inst Biocybernetyki I Inżynierii Biomedycznej Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2012-08-07
Publication date: 2016-10-31
Also published as: PL400288A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest szerokoporowaty podkład wykonany z polimerów syntetycznych i przeznaczony zwłaszcza do hodowli 3D, ze zmodyfikowaną warstwą naskórkową, sposób modyfikacji warstwy naskórkowej szerokoporowatego podkładu i zastosowanie podkładu. Podkład jest przeznaczony zwłaszcza do hodowli komórek przeznaczonych do wszczepu i/lub do otrzymywania biosztucznych narządów zastępujących utracone funkcje organizmu.

Znanych jest wiele typów podłoży, na których prowadzi się hodowle komórkowe i tkankowe. Najczęściej są to hodowle „płaskie”, czyli typu 2D. W chwili obecnej coraz powszechniej przyznaje się, że nie jest to naturalna metoda hodowli i powinno się je prowadzić na podłożach przestrzennych, czyli typu 3D. Jest to bardzo wyraźnie akcentowane w hodowli hepatocytów [J. Hepatology 26(1997)1379-1392, J. Bioc. Bioeng. 99(2005)311-319]. Przykładem takiej membrany przeznaczonej do hodowli 3D jest membrana opisana w polskim patencie PL 211793. Na membranie tej z pełnym powodzeniem prowadzono hodowle hepatocytów [Transplant. Proc. 39(9)(2007) 2914-6, Artificial Organs 32/9(2008)747-752].

Membrana znana z opisu patentowego PL 211793 jest szerokoporowata, półprzepuszczalna, i jest wykonana z polimeru lub mieszaniny polimerów syntetycznych, dających się formować metodą inwersji faz, o porach niezapadających się podczas wielokrotnego suszenia, korzystnie wybranych z grupy obejmującej polieterosulfony, polisulfony, poliamidy lub poliimidy, z dodatkiem poroforów w ybranych z grupy obejmującej celulozę naturalną i przetworzoną oraz jej pochodne, ewentualnie z dodatkiem poroforów wybranych z grupy obejmującej niskocząsteczkowe alkohole poliwinylowe, poliglikole etylenowe i propylenowe oraz poliwinylopirolidony. Membranę wytwarza się nasycając w znany sposób matrycę celulozową z celulozy naturalnej, celulozy regenerowanej, korzystnie wiskozy, celulozy mikrokrystalicznej lub podkład wykonany z mieszaniny powyższych wersji celulozy, korzystnie z bibuły jakości chromatograficznej, roztworem polimeru membranotwórczego w rozpuszczalniku polimeru, korzystnie wybranym z grupy obejmującej DMF (N,N-dimetyloformamid) DMA (N,N-dimetyloacetamid), NMP (N-metylopirolidon), ewentualnie z dodatkiem poroforu, i następnie formowanie metodą inwersji faz, przez suszenie naniesionej cienkiej warstwy membranotwórczej, lub korzystnie przez wytrącanie nierozpuszczalnikiem. Po wypłukaniu z powstałej membrany poroforu, lub poroforów pol imerowych, wypłukuje się celulozę za pomocą kompleksu tetraamonowego miedzi, a po całkowitym usunięciu celulozy usuwa się osadzone na powierzchni membrany nierozpuszczalne związki miedzi i doprowadza się odczyn membrany do pH 7.

Jednakże membrana otrzymana według PL 211793 posiada pewne istotne wady zmniejszające jej użyteczność. Jak każda membrana otrzymywana za pomocą mokrej inwersji faz, membrana ta na powierzchni pokryta jest warstwą naskórkową o bardzo zwartej strukturze i porach o co najmniej rząd wielkości mniejszych niż rozmiary komórek zwierzęcych czy bakterii. Z tego względu wprowadzenie komórek do wnętrza takich membran może być przeprowadzane jedynie metodą iniekcji lub migracji naturalnej wyłącznie przez pozbawione naskórka krawędzie boczne membrany.

Przy przygotowaniu bio-sztucznych implantów dla małych zwierząt, jak np. króliki, zupełnie wystarczająca jest metoda naturalnej migracji. Została ona wypróbowana doświadczalnie na membranach o średnicy około 5 mm i zdała egzamin. Natomiast przy przygotowaniu większych implantów, docelowo dla ludzi, metoda naturalnej migracji jest zdecydowanie zbyt powolna i nie spełnia wymogu równomiernego wypełnienia membrany komórkami. Wprowadzanie posiewanych komórek do wnętrza membrany metodą iniekcji jest technicznie niezwykle trudne ze względu na rozmiary i budowę membrany. Wprowadzenie komórek jest punktowe i na pełne zasiedlenie wnętrza membrany, co jest celem w hodowli na podłożu 3D, należy długo czekać. Iniekcja może prowadzić do mechanicznego zniszczenia membrany. Ogólnie można powiedzieć, że naturalna migracja komórek do wnętrza membrany przez krawędzie jest tak powolnym procesem, że w przypadku użycia membran o najmniejszym wymiarze liniowym powyżej około 5 mm przestaje mieć zastosowanie praktyczne. Rozwiązaniem tego problemu mogłoby być otrzymanie membrany bez warstw naskórkowych. Ale wytrzymałość mechaniczna na rozciąganie takiej membrany drastycznie spada. Przykładowo, membrana po mechanic znym usunięciu warstw naskórkowych ma wytrzymałość na zrywanie rzędu 15-20% membrany z obydwiema warstwami naskórkowymi. Po usunięciu jednej warstwy naskórkowej wytrzymałość wynosiła odpowiednio około 60% membrany z obydwiema warstwami naskórkowymi. Tak drastyczne obniżenie wytrzymałości mechanicznej membrany zmniejsza jej użyteczność jako podłoża (ang. scaffold) do hodowli komórkowych, a szczególnie chondrocytów. Wytrzymałość mechaniczna membrany jest jedną

PL 223 271 B1 z kilku podstawowych zalet przy wykorzystaniu takich membran w medycynie regeneracyjnej do tworzenia bio-sztucznych implantów. Dzięki znaczącej wytrzymałości, zapewnianej przez warstwę n askórkową, możliwe jest mocowanie implantu z wyhodowanymi komórkami za pomocą szwów chirurgicznych, co w przypadku stosowanych obecnie podłoży kolagenowych jest praktycznie niemożliwe ze względu na właściwości kolagenu.

Obecność warstwy naskórkowej korzystna jest także dlatego, że zmniejsza ona punkt odcięcia membrany. Warstwa naskórkowa o punkcie odcięcia (ang. cut off), zwanego również graniczną masą molową, rzędu 20 kD potencjalnie chroni chondrocyty implantu przed enzymami lizującymi, które m ogą migrować z kości do implantu. Z tych względów obecność naskórka w takiej szerokoporowatej membranie jest bardzo korzystna. Dlatego niezbędnym stało się rozwiązanie problemu penetracji komórek do wnętrza membrany.

Nieoczekiwanie okazało się, że jeżeli na membranę przygotowaną w sposób opisany w wyn alazku 211793, w momencie formowania się warstwy naskórkowej w kontakcie z powietrzem, ale jeszcze przed inwersją faz, położy się warstwę materiału włóknistego w taki sposób, aby włókna przebiły tworzący się naskórek membrany nie niszcząc całego naskórka, a następnie przeprowadzi korzystnie mokrą inwersję faz, to otrzymuje się warstwę naskórkową z perforacją, co usuwa wadę poprzednio opracowanej membrany, i umożliwia swobodne wnikanie posiewanych komórek do wnętrza membrany przez powierzchnię warstwy naskórkowej membrany.

Szerokoporowaty podkład do hodowli komórkowych stanowi membrana półprzepuszczalna wykonana z membranotwórczego polimeru lub mieszaniny membranotwórczych polimerów syntetyc znych, dających się formować metodą inwersji faz, o porach niezapadających się podczas wielokrotnego suszenia, która posiada dwie warstwy naskórkowe, z których jedna lub obydwie są perforowane otworami o takiej wielkości, że przez tę perforację możliwe jest swobodne wnikanie posianych komórek do wnętrza membrany.

Sposób wytwarzania szerokoporowatego podkładu z perforowanymi warstwami naskórkowymi według wynalazku polega na tym, że nasyca się w znany sposób matrycę celulozową z celulozy nat uralnej, celulozy regenerowanej, celulozy mikrokrystalicznej lub matrycę wykonaną z mieszaniny powyższych wersji celulozy, roztworem polimeru membranotwórczego w rozpuszczalniku polimeru, z dodatkiem poroforu, i kolejno membranę poddaje się procesowi inwersji faz przez odparowanie lub zanurzenie w nierozpuszczalniku polimeru membranotwórczego, a po wypłukaniu z powstałej membrany poroforu lub poroforów polimerowych rozpuszczalnych w nierozpuszczalniku polimeru membranotwórczego usuwa się matrycę i doprowadza się odczyn membrany do pH obojętnego. Sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że na membranę przygotowaną do inwersji faz, z formującą się warstwą naskórkową, nanosi się z jednej lub obydwóch stron warstwę materiału włóknistego, nasyconego rozpuszczalnikiem polimeru membranotwórczego lub mieszaniną takich rozpuszczalników albo rozpuszczalnikiem lub mieszaniną rozpuszczalników polimeru membranotwórczego z dodatkiem nierozpuszczalnika lub nierozpuszczalników polimeru membranotwórczego albo nierozpuszczalnikiem polimeru membranotwórczego lub mieszaniną takich nierozpuszczalników, zaś warstwę materiału włóknistego usuwa się wraz z matrycą, za pomocą metody, która nie powoduje rozpuszczania polimeru membranotwórczego.

Jako polimer membranotwórczy stosuje się polimer lub mieszaninę polimerów wybranych z grupy zawierającej: polieterosulfony, polisulfony, poliamidy, poliimidy.

Jako materiał włóknisty w sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się materiał celulozowy lub materiał z włókniny syntetycznej z polimeru różnego od stosowanego polimeru membranotwórczego i nie rozpuszczający się w rozpuszczalniku polimeru membranotwórczego.

Materiał celulozowy jest wykonany z celulozy naturalnej, włókniny bawełnianej, celulozy regenerowanej lub z mieszaniny powyższych wersji celuloz. Jako materiał celulozowy korzystnie stosuje się bibułę filtracyjną, włókninę bawełnianą o zwartej strukturze, wiskozę. Najkorzystniej stosuje się bibułę filtracyjną jakości analitycznej lub chromatograficznej. Korzystnie materiał włóknisty celulozowy jest tym samym materiałem, z którego jest wykonana matryca.

Materiał włóknisty z włókniny syntetycznej stanowi włóknina poliamidowa lub poliimidowa nierozpuszczalna w rozpuszczalniku polimeru membranotwórczego.

Korzystnie rozpuszczalnik polimeru membranotwórczego jest wybrany z grupy obejmującej: DMF (N,N-dimetyloformamid), DMA (N,N-dimetyloacetamid), NMP (N-metylopirolidon).

PL 223 271 B1

Korzystnie nierozpuszczalnik polimeru membranotwórczego jest wybrany z grupy obejmującej: wodę, alkohole mono i wielohydroksylowe, węglowodory, węglowodory halogenowane, ciekłe kwasy karboksylowe.

Korzystnie dodatek nierozpuszczalnika polimeru do rozpuszczalnika polimeru zawiera się w objętościowo w zakresie od 1:100 do 1:10.

Porofor jest korzystnie wybrany z grupy zawierającej: celulozę naturalną i przetworzoną oraz jej pochodne, niskocząsteczkowe alkohole poliwinylowe, poliglikole etylenowe i propylenowe, poliwinylopirolidony. Porofory są usuwane w trakcie otrzymywania membrany, generując pory o wielkości odpowiadającej wielkościom zastosowanego porofora.

Celulozę z membrany usuwa się za pomocą związków kompleksowych miedzi, a następnie usuwa się osadzone na powierzchni membrany nierozpuszczalne związki miedzi przez płukanie wodą. Poliamidy lub poliimidy usuwa się za pomocą roztworu kwasów, ewentualnie z dodatkiem soli.

Dzięki rozpuszczeniu w powierzchni naskórka dodatkowej warstwy włókniny celulozowej lub polimerowej z polimeru różnego od polimeru membranotwórczego, w warstwie naskórka tworzy się perforacja umożliwiająca wnikanie komórek do wnętrza membrany i kolonizowanie wnętrza membrany przez te komórki. Ponadto, możliwość uzyskania membrany z dwustronnie perforowanymi warstwami naskórkowymi pozwala na przygotowanie implantów o grubości wielokrotnie większej od grubości samej membrany przez proste złożenie i sklejenie klejem tkankowym kilku membran z wyhodowanymi w nich chondrocytami. Takie postępowanie umożliwia uzyskanie implantu o grubości odpowiadającej rzeczywistej grubości chrząstki w stawie, do którego wprowadza się implant.

Obniżenie wytrzymałości membrany z perforowaną warstwą naskórka jest nie większe niż 30% wytrzymałości membrany z normalną zwartą warstwą naskórkową, co ma istotne znaczenie w praktycznym stosowaniu.

Otrzymany w ten sposób podkład może być sterylizowany znanymi ze stanu techniki metodami odpowiednimi do użytego materiału membranotwórczego. Może on służyć do hodowli komórek zwierzęcych i/lub ludzkich, w tym również komórek organizujących się w tkanki. Przykładami komórek które mogą być hodowane na takich membranach są: hepatocyty, chondrocyty, komórki przytarczyc, komórki macierzyste. Mogą to być również komórki genetycznie modyfikowane (GMO) lub komórki patologicznie zmienione. Hodowle prowadzi się w typowych używanych powszechnie pożywkach w naczyniach o powierzchniach odpowiednich do zamierzonej wielkości podkładu, w warunkach jałowych. Podkład szerokoporowaty może służyć również jako podłoże do hodowli mikroorganizmów, w tym GMO, komórek i tkanek roślinnych.

Membrana według wynalazku została przedstawiona na figurach rysunku, przedstawiających zdjęcia wykonane za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego:

Fig. 1 przedstawia perforowaną warstwę naskórkową membrany szerokoporowatej w powiększeniu 100x.

Fig. 2 przedstawia fragment naskórka z perforacją, w powiększeniu 1000x. Przez perforację naskórka widać gąbczaste wnętrze membrany. Widać także, że poza perforacją naskórek jest bardzo zwarty.

Fig. 3 przedstawia chondrocyty wnikające do wnętrza membrany przez perforację warstwy naskórkowej, w powiększeniu 1000x.

Fig. 4 przedstawia formujący się materiał chrząstki wewnątrz membrany, do której chondrocyty wniknęły przez perforację membrany, w szóstym tygodniu hodowli, w powiększeniu 1500x.

Fig. 5 przedstawia kolonię komórek na krawędzi membrany.

Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w poniższych przykładach.

P r z y k ł a d 1

Bibułę chromatograficzną Whatman nr 3 nasyca się roztworem polimerów o składzie:

100 g dimetyloformamid 18 g polisulfonu Udel 1700 g poliwinylopirolidon K30 i natychmiast po przygotowaniu jednostronnie nakrywa się bibułą filtracyjną Whatman nr 1 nasyconą N-metylopirolidonem, po czym natychmiast zanurza się w wodzie demineralizowanej na około 12 godzin. Po tym czasie, płucze się jeszcze raz w wodzie demineralizowanej i zanurza w kąpieli zawierającej nasycony roztwór wodorotlenku tetraaminomiedziowego na co najmniej 72 godziny, delikatnie mieszając roztwór co 4 godziny. Po tym czasie płucze się otrzymaną membranę wodą destyl oPL 223 271 B1 waną, aż do zaniku niebieskiego zabarwienia i następnie zanurza na 15 minut w 0,5% roztworze kwasu azotowego V, aby usunąć ewentualne nierozpuszczalne związki miedzi. Po kąpieli kwasowej membranę płucze się wodą demineralizowaną lub destylowaną, aż odciek będzie miał odczyn obojętny. Membrana po wysuszeniu w temperaturze 100°C przez 30 minut jest gotowa do sterylizacji za pomocą dowolnie wybranej typowej metody np. termicznie, parą, chemicznie, tlenkiem etylenu, alk oholami.

P r z y k ł a d 2

Membranę przygotowaną jak w przykładzie 1 natychmiast po przygotowaniu nakrywa się z obydwóch stron bibułą filtracyjną Whatman nr 1 nasyconą mieszaniną N,N-dimetyloformamidu i N,N-dimetyloacetamidu i następnie postępuje się jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 3

Membranę przygotowaną jak w przykładzie 1 natychmiast po przygotowaniu nakrywa się bibułą filtracyjną Whatman nr 2 nasyconą mieszaniną N,N-dimetyloformamidu i N-metylopirolidonu w stosunku 1:1 v/v i następnie postępuje się jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 4

Membranę przygotowaną jak w przykładzie 1 natychmiast po przygotowaniu nakrywa się z obydwóch stron bibułą filtracyjną Whatman nr 1 nasyconą mieszaniną N,N-dimetyloformamidu i N,N-dimetyloacetamidu w stosunku molowym 1:2 z dodatkiem 5% wagowych wody demineralizowanej lub destylowanej i następnie postępuje się jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 5

Membranę przygotowaną jak w przykładzie 1 natychmiast po przygotowaniu nakrywa się bibułą filtracyjną jakościową Schleicher & Schuell nasyconą N-metylopirolidonem z dodatkiem 7% objętościowych etanolu i następnie postępujemy jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 6

Membranę przygotowaną jak w przykładzie 1 natychmiast po przygotowaniu jednostronnie nakrywa się włókniną poliamidową nasyconą N-metylopirolidonem i natychmiast zanurza się w wodzie demineralizowanej na około 12 godzin. Po tym czasie, płucze się jeszcze raz w wodzie demineralizowanej w celu usunięcia poliamidu delikatnie mieszając zanurza na co najmniej 12 godzin w kąpieli o składzie:

Kwas mrówkowy 55%

Kwas octowy 15%

Chlorek wapnia 5%

Woda do 100%

Następnie membranę starannie płucze się aż do uzyskania pH 7 wodą dejonizowaną lub demineralizowaną i kolejno zanurza do nasyconego roztworu wodorotlenku tetraaminomiedziowego na co najmniej 72 godziny, delikatnie mieszając roztwór, co 4 godziny. Po tym czasie płucze się otrzymaną membranę wodą destylowaną, aż do zaniku niebieskiego zabarwienia i następnie zanurza na 15 minut w 0,5% roztworze kwasu azotowego V. Po kąpieli kwasowej membranę płucze się wodą demineralizowaną lub destylowaną, aż odciek będzie miał odczyn obojętny. Membrana po wysuszeniu w temperaturze 100°C przez 30 minut jest gotowa do sterylizacji za pomocą dowolnie wybranej typowej metody np. termicznie, parą, chemicznie, tlenkiem etylenu, alkoholami.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Szerokoporowaty podkład do hodowli komórkowych w postaci membrany półprzepuszczalnej wykonanej z membranotwórczego polimeru lub mieszaniny membranotwórczych polimerów syntetycznych, dających się formować metodą inwersji faz, o porach niezapadających się podczas wielokrotnego suszenia, znamienny tym, że posiada dwie warstwy naskórkowe, z których jedna lub obydwie są perforowane otworami o takiej wielkości, że przez tę perforację możliwe jest swobodne wn ikanie posianych komórek do wnętrza membrany.
2. Podkład według zastrz. 1, znamienny tym, że polimer membranotwórczy jest wybrany z grupy zawierającej polieterosulfony, polisulfony, poliamidy, poliimidy.
3. Sposób wytwarzania szerokoporowatego podkładu do hodowli komórkowych, w którym nasyca się matrycę celulozową z celulozy naturalnej, celulozy regenerowanej, celulozy mikrokrystalicznej lub podkład wykonany z mieszaniny powyższych wersji celulozy, roztworem polimeru membran o6

PL 223 271 B1 twórczego w rozpuszczalniku polimeru, z dodatkiem poroforu i następnie membranę poddaje się procesowi inwersji faz przez odparowanie lub zanurzenie w nierozpuszczalniku polimeru membranotwórczego, a po wypłukaniu z powstałej membrany poroforu lub poroforów polimerowych rozpuszczalnych w nierozpuszczalniku polimeru membranotwórczego usuwa się celulozę i doprowadza się odczyn podkładu do odczynu obojętnego, znamienny tym, że na membranę przygotowaną do inwersji faz, z formującą się warstwą naskórkową, nanosi się z jednej lub obydwóch stron warstwę materiału włóknistego nasyconego rozpuszczalnikiem polimeru membranotwórczego lub mieszaniną takich ro zpuszczalników albo rozpuszczalnikiem lub mieszaniną rozpuszczalników polimeru membranotwórczego z dodatkiem nierozpuszczalnika lub nierozpuszczalników polimeru membranotwórczego albo nierozpuszczalnikiem polimeru membranotwórczego lub mieszaniną takich nierozpuszczalników, zaś warstwę materiału włóknistego usuwa się wraz z matrycą celulozową lub przed usunięciem matrycy celulozowej, za pomocą metody, która nie powoduje rozpuszczania polimeru membranotwórczego.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako polimer membranotwórczy stosuje się polimer lub mieszaninę polimerów wybranych z grupy zawierającej: polieterosulfony, polisulfony, poliamidy, poliimidy.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako materiał włóknisty stosuje się materiał celulozowy lub materiał z włókniny syntetycznej z polimeru różnego od stosowanego polimeru membranotwórczego i nie rozpuszczającego się w rozpuszczalniku materiału membranotwórczego.
6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako materiał celulozowy stosuje się materiał wykonany z celulozy naturalnej, włókniny bawełnianej, celulozy regenerowanej lub z mieszaniny powyższych wersji celuloz.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako materiał celulozowy stosuje się bibułę filtracyjną, włókninę bawełnianą o zwartej strukturze, wiskozę.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się bibułę filtracyjną jakości analitycznej lub chromatograficznej.
9. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako materiał włóknisty z włókniny syntetycznej stosuje się włókninę poliamidową lub poliamidową, nierozpuszczalną w rozpuszczalniku polimeru membranotwórczego.
10. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że rozpuszczalnik polimeru membranotwórczego jest wybrany z grupy obejmującej: DMF (N,N-dimetyloformamid), DMA (N,N-dimetyloacetamid), NMP (N-metylopirolidon).
11. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że nierozpuszczalnik polimeru membranotwórczego jest wybrany z grupy obejmującej: wodę, alkohole mono i wielohydroksylowe, węglowodory, węglowodory halogenowane, ciekłe kwasy karboksylowe.
12. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosunek objętościowy nierozpuszczalnika polimeru membranotwórczego do rozpuszczalnika tego polimeru wynosi od 1:100 do 1:10.
13. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że porofor jest wybrany z grupy zawierającej: celulozę naturalną i przetworzoną oraz jej pochodne, niskocząsteczkowe alkohole poliwinylowe, poliglikole etylenowe i propylenowe, poliwinylopirolidony.
14. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że celulozę usuwa się za pomocą roztworu kompleksu tetraamonomiedzi (II).
15. Zastosowanie szerokoporowatego podkładu określonego w zastrzeżeniu 1 do hodowli k omórkowych 3D.