PL223258B1 - Podłoże do hodowli komórek jego zastosowanie oraz sposób in vitro hodowli komórek ludzkich lub zwierzęcych - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nanostrukturalne trójwymiarowe podłoże do hodowli komórek ludzkich lub zwierzęcych oraz sposób hodowli komórek.

Hodowlę komórek ludzkich lub zwierzęcych w warunkach in vitro prowadzi się w celu ich namnożenia dla ich identyfikacji i badań.

Powszechnie stosowaną metodą in vitro jest hodowla na płytkach umożliwiająca wzrost komórek w dwóch kierunkach. Jako podłoże stosuje się płytki wykonane z tworzyw sztucznych, najczęściej polistyrenu. W przypadku hodowli niektórych typów komórek podłoże płytek modyfikuje się w ściśle określony sposób.

Hodowlę prowadzi się w środowisku odpowiedniej pożywki podtrzymującej procesy życiowe oraz umożliwiającej wzrost komórek. Metoda ta ma ograniczone zastosowanie, gdyż pozwala na hodowlę tylko jednej warstwy komórek. Hodowla w tych warunkach nie odpowiada panującym w żywym organizmie.

Druga metoda hodowli polega na wykorzystaniu struktur przestrzennych, takich jak struktury 3D, przykładowo skafoldy. Są to struktury przestrzenne o silnie rozbudowanej powierzchni umożliwiające między innymi lepszy wzrost komórek.

Jako podłoża stosuje się struktury przestrzenne umożliwiające rozwój komórek w trzech wymiarach, w postaci materiałów porowatych o różnej wielkości por lub materiały włókniste tworzące przestrzenne rusztowanie, na powierzchni których następuje wzrost komórek.

Znane są skafoldy wykonane z różnych materiałów, np.:

• ceramicznych - np. fosforan wapnia, hydroksyapatyt, wykorzystywane w szczególności do hodowli komórek kostnych.

• nanocząstki - posiadają rozbudowaną powierzchnię w stosunku do objętości, co czyni je podatnymi na oddziaływanie czynników wzrostu, dostępu leków, itp., co korzystnie wpływa na hodowlę komórek.

• mikro- i nanowłókna tworzące rozbudowaną strukturę przestrzenną, której można nadawać pożądane kształty.

Do tworzenia struktur włóknistych najczęściej wykorzystuje się znaną od początku XX wieku technikę elektroprzędzenia. Mikro- i nanowłókna wykonuje się w szczególności z różnych syntetycznych i naturalnych biomateriałów, jak np. poli(kwasu mlekowego-ko-glikolowego) (PLGA), poli(kwasu L-mlekowego) (PLLA), poli(kaprolaktonu) (PCL), poli(tlenku etylenu) (PEO), alkoholu poliwinylowego (PVA), żelatyny, kolagenu, włókien jedwabiu i fibrynogenu.

W celu prowadzenia wydajnych hodowli komórkowych i tkankowych konieczne jest zapewnienie warunków sterylnych. W trakcie zakładania hodowli pierwotnych, w których komórki izoluje się z materiału biologicznego, niekorzystnym zjawiskiem jest ich zakażenie drobnoustrojami. Hodowla komórkowa zanieczyszczona bakteriami nie nadaje się do prowadzenia hodowli i badań.

Dotychczas stosowane podłoża 3D nie posiadają właściwości bakteriostatycznych, bakteriobójczych i przeciwgrzybicznych, co wymaga stosowania sterylnych warunków nie tylko hodowli, ale również sterylnego materiału wyjściowego. Konieczność zachowania absolutnie sterylnych warunków ogranicza możliwości hodowli in vitro, a ich nieprzestrzeganie może prowadzić do nieudanych hodowli i konieczności ich powtarzania, co nie w każdym przypadku jest możliwe. W celu zapewnienia sterylnych warunków stosuje się dodatek substancji bakteriobójczych i grzybobójczych, co może mieć wpływ na wynik hodowli.

Celem wynalazku było opracowanie podłoża do hodowli komórek in vitro oraz sposobu prowadzenia takiej hodowli.

Podłożem do hodowli komórkowej, według wynalazku, są nanostrukturalne nano- i mikrowłókna w postaci nano- i mikrokapilar wykonane metodą elektroprzędzenia z nanokompozytu, w którego skład wchodzą co najmniej dwa polimery „klasyczne” oraz przewodzący polimer - polianilina.

Nanokompozyt zwiera polistyren oraz od 15 do 45% podtlenku etylenu, a ponadto od 0,5 do 4% polianiliny względem mieszaniny polistyrenu i politlenku etylenu.

Korzystnie, nanokompozyt zawiera od 20 do 30% politlenku etylenu i od 0,5 do 1,5% polianiliny względem mieszaniny polistyrenu i politlenku etylenu.

Skład nanokompozytu determinuje strukturę nano- i mikrokapilar, otrzymywanych w procesie elektroprzędzenia, nadając im nanoporowatość w formie nanootworów o przypadkowych lecz dość regularnych, elipsoidalnych kształtach. Nanootwory w nano- i mikrokapilarach stanowią istotną ich

PL 223 258 B1 cechę i korzystnie wpływając na przyczepność komórek i ich proliferację. Dodatkowo, nano- i mikrokapilary ułożone przypadkowo w przestrzeni, tworzą sieć o nieregularnych oczkach, w przewadze o mikrometrycznej wielkości. Ta cecha również sprzyja wzrostowi komórek.

W drugim aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nano- i mikrokapilar według wynalazku. Ich właściwości zależą w znacznym stopniu od procesu przygotowania mieszaniny polimerów. W zależności od czasu mieszania zmieniają się właściwości otrzymanych nano- i mikrokapilar. Im dłuższy jest czas mieszania, tym właściwości nano- i mikrokapilar zmieniają się w kierunku wzrostu ich hydrofilowości. Dobierając czas i parametry mieszania otrzymuje się nano- i mikrokapilary o różnej hydrofilowości lub hydrofobowości. Właściwości te zależą od stopnia rozproszenia makrocząsteczek politlenku etylenu w polistyrenie. Im rozproszenie jest większe, tym bardziej właściwości nanoi mirkokapilar zmieniają się w kierunku większej hydrofilowości.

Nanokompozyt według wynalazku otrzymuje się w wyniku mieszania roztworu polistyrenu z podtlenkiem etylenu w rozpuszczalniku organicznym o dobrej rozpuszczalności obu polimerów korzystnie wybranych z grupy: chlorowane węglowodory, ketony, estry, etery, a szczególnie w chloroformie, co najmniej do chwili całkowitego rozpuszczenia dodanego politlenku etylenu, a następnie dodaje się zawiesinę nanocząstek polianiliny w tym samym rozpuszczalniku organicznym lub innym, mieszającym się z użytym już rozpuszczalnikiem i dalej miesza do chwili uzyskania jednorodnego rozkładu polianiliny w mieszaninie polimerów, a następnie prowadzi się proces elektroprzędzenia w silnym, niejednorodnym polu elektrycznym.

Dodatek polianiliny do nano- i mikrokapilar nadaje im właściwości bakteriobójcze i umożliwia hodowlę komórek ludzkich i zwierzęcych bez zagrożeń związanych z jej zakażeniem.

Stosując długie czasy mieszania polistyrenu z podtlenkiem etylenu uzyskuje się nanoporowate nano- i mikrokapilary nanokompozytowe o właściwościach hydrofilowych, co skutkuje pęcznieniem i galaretowaceniem nano- i mikrokapilar podczas dłuższego kontaktu z wodą. Skracając czas mieszania polistyrenu i politlenku etylenu można otrzymać nano- i mikrokapliary o zmniejszającej się hydrofilowości i wzrastającej hydrofobowości. Różnice w hydrofilowości nano- i mikrokapilar umożliwiają odpowiedni ich dobór w zależności od celu zastosowania.

W trzecim aspekcie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie struktur przestrzennych utworzonych z nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar według wynalazku do hodowli komórek ludzkich lub zwierzęcych. Z nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar według wynalazku można tworzyć dowolne struktury przestrzenne, na których prowadzi się hodowle komórek ludzkich lub zwierzęcych począwszy od spłaszczonych nieregularnych siateczek, poprzez siatki o uporządkowanym układzie nanoi mikrokapilar, aż po struktury rozbudowane przestrzennie uformowanych w pożądane kształty. Zastosowanie polistyrenu charakteryzującego się dużą sztywnością umożliwia uzyskiwanie sztywnych i trwałych struktur przestrzennych.

W czwartym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób hodowli komórek ludzkich lub zwierzęcych na strukturze przestrzennej utworzonej z nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar według wynalazku.

Sposób według wynalazku polega na nanoszeniu zawiesiny komórek przeznaczonych do hodowli na siatki utworzone z przypadkowo rozmieszczonych lub uporządkowanych w różnym stopniu nano- i mikrokapilar według wynalazku, a następnie na hodowli znanymi metodami. Siatki z naniesionymi komórkami umieszcza się w płynie hodowlanym. Siatka z naniesionymi komórkami stanowi integralną całość, dlatego można w jednym płynie hodowlanym umieścić kilka równoległych prób, co umożliwia hodowle w ściśle identycznych warunkach. Eliminuje to wpływ nawet niewielkich różnic w warunkach hodowli kilku równoległych próbek.

Komórki hodowane na podłożu według wynalazku tworzą struktury przestrzenne.

Na fotografiach przedstawiona jest przykładowa struktura nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar oraz zdjęcie z poszczególnych etapów przykładowej hodowli komórek in vitro. Fot. 1 i 2 wykonane mikroskopem Philips SEM 515 przedstawiają strukturę nano- i mikrokapilar według wynalazku, Fot. 3-5, wykonane mikroskopem Nicon Diaphot Eclipse TE 200, przedstawiają poszczególne etapy hodowli komórek z wykorzystaniem nano- i mikrokapliar według wynalazku.

Na fot. 6-8 przedstawiono obraz z mikroskopu skaningowego Philips SEM 515, kolonii komórek wyhodowanych sposobem według wynalazku.

Fot. 1 przedstawia strukturę pojedynczej nanostrukturalnej nano- i mikrokapilary. Widoczne są nanootwory w ściankach nano- i mikrokapilary, a fot. 2 przedstawia strukturę zespołu nano- i mikrokapilar.

PL 223 258 B1

Hodowle komórek in vitro przedstawiono na fot. 3-5. Do badania wykorzystano komórki linii Hela wywodzące się z raka szyjki macicy.

Hodowlę prowadzono według następującej procedury.

1. Przygotowanie środowiska hodowli komórek zwierzęcych

Podłoże hodowlane do trójwymiarowego wzrostu komórek przygotowywano z nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar według wynalazku w postaci siatek umieszczonych w naczyniach hodowlanych (płytki Petriego).

2. Proces osadzania komórek na nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar w postaci siatek

Komórki nanoszono na wcześniej przygotowane podłoże hodowlane w postaci zawiesiny k omórkowej we właściwym dla ich hodowli medium hodowlanym. Podłoże hodowlane przenoszono do inkubatora na czas od 0.5 do 1 godziny. Po tym czasie naczynia hodowlane napełniano stosowanym medium i inkubowano dalsze 24 godziny. Następnie, nanostrukturalne nano- i mikrokapilary wraz z hodowlą przenoszono do nowych naczyń hodowlanych zawierających świeże medium hodowlane właściwe dla komórek i hodowano dalsze 24 i 48 godzin.

Na fot. 3, 4 i 5 przedstawiono kolejne fazy wzrostu po 24, 48 i 72 godzinach. Na zdjęciach w ykorzystano standardowe barwienie jąder komórek mieszaniną odczynników: Hoechst 33342 oraz jodek propidyny, wywołując zabarwienie jąder komórkowych w komórkach żywych na niebiesko a martwych na czerwono. Na zdjęciach są widoczne komórki żywe, nie zaobserwowano komórek martwych.

W ciągu 24 h od momentu osadzania komórek komórki przyczepione do nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar tworzą przestrzenne struktury, widoczne na fot. 3, które w ciągu następnej doby ulegają intensywnemu wzrostowi. Na fot. 4 pokazana jest ta sama hodowla po 48 godzinach, a na fot. 5 po 72 godzinach. Po 72 h od momentu osadzenia komórki tworzą struktury wielowarstwowe.

Na fot. 6 przedstawiono pojedynczą komórkę osadzoną na siatce według wynalazku.

Grupy komórek wyhodowanych sposobem według wynalazku przedstawiono na fot. 7, gdzie wyraźnie uwidoczniona jest przestrzenna struktura rozrastających się komórek.

Fot. 8 obrazuje rozbudowaną strukturę grupy komórek tworzących przestrzenną formę utworzoną na szkielecie z nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar. Komórki na siatkach przyjmują formy kuliste. Ich rozmiary wahają się w przedziale 6-7 mikrometrów. Komórki w trakcie podziałów oraz przez okres 48h tworzą regularne struktury kuliste, które w ciągu następnych 24 godzin tworzą zwartą stru kturę wielowarstwową.

Dobierając odpowiednie struktury nano- i mikrokapilarne można optymalizować wzrost hodowli w zależności od rodzaju komórek. Przykładowo, izolowane z materiału biologicznego fibroblasty ludzkie rosną przestrzennie na nanostrukturalnych nano- i mikrokapilarach hydrofilowych.

Nanostrukturalne nano- i mikrokapilary według wynalazku posiadają właściwości bakteriostatyczne, co może dodatkowo znaleźć zastosowanie przy tworzeniu procedur hodowlanych komórek izolowanych z materiału biologicznego, z konieczności pobranego w warunkach nie w pełni sterylnych lub narażonych na zakażenia na skutek niesprzyjających i nieprzewidywalnych okoliczności.

Sposób otrzymywania nanostrukturowanych nano- i mikrokapliar przedstawiono w przykładach, które obrazują, ale nie wyczerpują zakresu stosowania wynalazku. Użyte w przykładach określenia „typu I” oraz „typu II” odnoszą się do nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar według wynalazku charakteryzujących się niemalże skrajnymi właściwościami. W rzeczywistości można otrzymywać nanostrukturalne nano- i mikrokapilary o pośrednich właściwościach „hydrofilowo-hydrofobowych”.

P r z y k ł a d 1

Synteza polianiliny

6,9 g chlorowodorku aniliny rozpuszczono w 300 ml 1M HCl. Roztwór chlorowodorku aniliny zmieszano z roztworem 11,4 g nadsiarczanu amonu w 200 ml 1M HCl. Całość pozostawiono w temperaturze pokojowej (20°C) przez 12 godzin stale mieszając mieszadłem magnetycznym. Produkt odsączono na sączku piankowym i przepłukano kolejno wodą, metanolem i chloroformem.

Unikając wysuszenia preparatu, polianilinę (PANI) przeniesiono do 200 ml chloroformu (stosowano również mniejszą objętość chloroformu, np. 50 ml) i zdyspergowano przy użyciu ultradźwięków, otrzymując jej zawiesinę.

P r z y k ł a d 2

Mikrokapilary typu I („hydrofilowe”)

150 mg polistyrenu rozpuszczono w 2 ml chloroformu, następnie powoli dodawano 50 mg politlenku etylenu porcjami po około 10 mg stale mieszając mieszadłem magnetycznym. Następnie, rozPL 223 258 B1 twór polistyrenu i politlenku etylenu mieszano przez 24 godziny, po czym dodano 8 ml zawiesiny polianiliny (17,6 mg PANI) otrzymanej według przykładu 1, ciągle mieszając do uzyskania jednorodnego rozproszenia polianiliny w roztworze polimerów, co trwało ok. 0,5 godziny. Następnie, przeprowadzono proces elektroprzędzenia w niejednorodnym polu elektrycznym z metalowymi elektrodami pod napięciem 4,5 kV przy odległości elektrod 15 cm i prędkości wypływu roztworu polimerów 0,2 mL/min. Otrzymane nano- i mikrokapilary przeniesiono na plastikowe ramki nośne.

P r z y k ł a d 3

Mikrokapilary typu II („hydrofobowe”)

150 mg polistyrenu rozpuszczono w 2 ml chloroformu, następnie powoli dodawano 50 mg politlenku etylenu porcjami po około 10 mg stale mieszając mieszadłem magnetycznym. Następnie, roztwór polistyrenu i politlenku etylenu mieszano do całkowitego rozpuszczenia, co trwało ok. 1 godziny, po czym dodano 8 ml zawiesiny polianiliny (17,6 mg PANI) otrzymanej według przykładu 1, ciągle mieszając do uzyskania jednorodnego rozproszenia polianiliny w roztworze polimerów, co trwało ok. 0,5 godziny. Następnie przeprowadzono proces elektroprzędzenia w niejednorodnym polu elektrycznym z metalowymi elektrodami pod napięciem 4,5 kV przy odległości elektrod 15 cm i prędkości wypływu roztworu polimerów 0,2 mL/min. Otrzymane nano- i mikrokapilary przeniesiono na plastikowe ramki nośne.

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Podłoże do hodowli komórkowej w postaci nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar wykonanych metodą elektroprzędzenia z nanokompozytu, w którego skład wchodzą co najmniej dwa polimery oraz polianilina.
2. 2. Podłoże według zastrz. 1, znamienne tym, że nanokompozyt zawiera polistyren oraz od 15 do 45% politlenku etylenu oraz od 0,5 do 4% polianiliny względem mieszaniny polistyrenu i politlenku etylenu.
3. 3. Podłoże według zastrz. 2, znamienne tym, że nanokompozyt zawiera polistyren oraz od 20 do 30% politlenku etylenu oraz od 0,5 do 1,5% polianiliny względem mieszaniny polistyrenu i politlenku etylenu.
4. 4. Sposób wytwarzania nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar, znamienny tym, że 55-85% polistyrenu w postaci roztworu w rozpuszczalniku organicznym miesza się z 15-45% politlenku etylenu w rozpuszczalniku organicznym, a następnie po wymieszaniu dodaje się 0,5-4% polianiliny, względem mieszaniny polistyrenu i politlenku etylenu i po ujednorodnieniu uzyskaną mieszaninę polimerów podaje się procesowi elektroprzędzenia.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik stosuje się rozpuszczalnik wybrany z grupy: chlorowane węglowodory, ketony, estry, etery.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik stosuje się chloroform.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że po zmieszaniu polistyrenu z politlenkiem etylenu mieszaninę poddaje się dodatkowemu mieszaniu przez okres od 1 do kilkudziesięciu godzin, a następnie dodaje się polianilinę.
8. 8. Zastosowanie nanostrukturyzowanych nano- i mikrokapilar do hodowli komórek ludzkich lub zwierzęcych.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że do hodowli komórek stosuje się nanostrukturalne nano- i mikrokapilary wykonane z nanokompozytu zawierającego polistyren i od 15 do 45% politlenku etylenu oraz od 0,5 do 4% polianiliny względem mieszaniny polistyrenu i politlenku etylenu.
10. 10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że do hodowli komórek stosuje się nanostrukturalne nano- i mikrokapilary wykonane z nanokompozytu zawierającego polistyren i od 20 do 30% politlenku etylenu oraz od 0,5 do 1,5% polianiliny względem mieszaniny polistyrenu i politlenku etylenu.
11. 11. Sposób hodowli komórek ludzkich lub zwierzęcych w środowisku medium hodowlanego, znamienny tym, że prowadzi się hodowle komórek na strukturze przestrzennej utworzonej z nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się na siatkach z nanostrukturalnych nano- i mikrokapilar wykonanych z nanokompozytu zawierającego polistyren i od 15 do

    PL 223 258 B1

    45% politlenku etylenu oraz od 0,5 do 4% polianiliny względem mieszaniny polistyrenu i politlenku etylenu.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się na siatkach z nanokompozytu zawierającego polistyren i od 20 do 30% politlenku etylenu oraz od 0,5 do 1,5% polianiliny względem mieszaniny polistyrenu i politlenku etylenu.