PL216216B1 - Urządzenie jednorazowego użytku, przeznaczone do wykrywania antygenu docelowego w płynnej próbce i sposób wyznaczania ilości antygenu docelowego w płynnej próbce - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest urządzenie jednorazowego użytku, przeznaczone do wykrywania antygenu docelowego w płynnej próbce i sposób wyznaczania ilości antygenu docelowego w płynnej próbce.

Sensory biomedyczne wykorzystywane są do wykrywania obecności i/lub stężenia szerokiego spektrum analitów. Gdy analitem jest białko, wówczas stosowanym elementem wykrywającym jest zwykle przeciwciało, ze względu na to, że interakcja przeciwciała z białkiem (antygenem) jest bardzo specyficzna. Tego rodzaju próby immunologiczne dzielą się zwykle na dwie kategorie: odpowiedź „tak/nie”, otrzymywaną na przykład w wyniku prostej detekcji wizualnej lub też wykrywanie stężenia antygenu metodą ilościową. Większość metod ilościowych wymaga kosztownej aparatury, takiej jak liczniki scyntylacyjne (do monitorowania radioaktywności), spektrofotometry, spektrofIuorymetry (patrz na przykład dokument US nr 5 156 972), instrumenty wykorzystujące powierzchniowy rezonans plazmonowy (patrz na przykład US nr 5 965 456) i tym podobne. Korzystne byłoby zatem opracowanie ilościowej próby immunologicznej, która jest zarówno niedroga, jak i wystarczająco prosta, aby nadawała się do zastosowania w warunkach domowych, czy polowych. Tego rodzaju immunosensor nie wymaga etapów odwirowywania, rozcieńczania, odmierzania pipetą, płukania, czy też odmierzania czasu i wytwarza minimalną ilość odpadów.

Konwencjonalne próby immunologiczne sklasyfikowane są w dwóch kategoriach: metoda kompetycyjna i metoda kanapkowa. W próbie metodą kompetycyjną, antygen podczas testu mieszany jest z kompleksem antygen-sonda (określanym powszechnie jako kompleks reporterowy), po czym mieszanina ta współzawodniczy w celu związania się z przeciwciałem. Sondą może być radioizotop, enzym, fluorofor lub też chromofor. W metodzie kanapkowej, antygen w próbce testowej wiąże się z przeciwciałem, a następnie drugi kompleks przeciwciało-sonda wiąże się z antygenem. W przypadku takich metod oznaczania ze stanu techniki, wymagany jest zwykle jeden lub większa liczba etapów płukania. Etapy komplikują procedurę testu i mogą powodować powstawanie niebezpiecznych odpadów ciekłych. Korzystne byłoby zatem opracowanie urządzenia, przeznaczonego do wykonywania próby immunologicznej, która nie wymaga jakichkolwiek etapów płukania i nadaje się do jednokrotnego użycia w postaci jednorazowego urządzenia.

Urządzenie jednorazowego użytku, przeznaczone do wykrywania antygenu docelowego w płynnej próbce, zawierające komorę reakcyjną, która jest połączona płynowo z komorą detekcji, przy czym ta komora reakcyjna posiada wlot płynnej próbki, zaś pomiędzy komorą reakcyjną a komorą detekcji znajduje się kanał przepustowy płynnej próbki, umożliwiający przemieszczanie płynnej próbki z komory reakcyjnej do komory detekcji poprzez oddziaływanie kapilarne, przy czym w komorze reakcyjnej znajduje się immobilizowane przeciwciało, przytwierdzone wewnątrz tej komory reakcyjnej, a ponadto w komorze reakcyjnej znajduje się kompleks reporterowy zawierający sondę związaną z antygenem kompleksu reporterowego, według wynalazku charakteryzuje się tym, że znajdujący się w komorze reakcyjnej antygen kompleksu reporterowego wybrany z grupy zawierającej antygen docelowy, pseudoantygen i zmodyfikowany antygen, a zwłaszcza wybrany z grupy zawierającej monomerowe białko C-reaktywne, białko C-reaktywne otrzymane od osobników innych niż człowiek, a także białko C-reaktywne modyfikowane chemicznie, gdzie powinowactwo białka C-reaktywnego modyfikowanego chemicznie z przeciwciałem jest mniejsze niż powinowactwo ludzkiego białka C-reaktywnego z tym przeciwciałem, jest związany z immobilizowanym przeciwciałem, przy czym zastosowany antygen kompleksu reporterowego stanowi antygen, który słabiej wiąże się z immobilizowanym przeciwciałem niż antygen docelowy.

Sonda zawiera radioizotop, chromofor, fluorofor oraz enzym.

Enzym zawiera dehydrogenazę glukozową.

Urządzenie według wynalazku zawiera ponadto substrat enzymu.

Substrat enzymu stanowi substrat utlenialny.

Substrat enzymu zawiera glukozę.

Urządzenie według wynalazku zawiera ponadto mediator.

Mediator jest wybrany z grupy, składającej się z dichlorofenolindofenolu, kompleksu między metalem przejściowym a heteroatomową cząstką zawierającą azot, a także cyjanożelaziany.

Urządzenie zawiera ponadto bufor regulujący wartość pH płynnej próbki.

Bufor zawiera fosforan lub melitan.

PL 216 216 B1

Sonda zawiera stabilizator, który stabilizuje przynajmniej jeden składnik, wybrany z grupy składającej się z antygenu docelowego, antygenu kompleksu reporterowego, enzymu oraz immobilizowanego przeciwciała.

Substrat enzymu znajduje się na wewnętrznej powierzchni komory detekcji.

Immobilizowane przeciwciało znajduje się na wewnętrznej powierzchni komory reakcyjnej.

Urządzenie według wynalazku zawiera ponadto środek pomocniczy.

Środek pomocniczy znajduje się wewnątrz komory detekcji, zaś na środku pomocniczym lub wewnątrz niego znajduje się pierwsza substancja, wybrana z grupy składającej się z substratu enzymu, mediatora oraz bufora.

Środek pomocniczy znajduje się wewnątrz komory reakcyjnej, zaś na środku pomocniczym lub wewnątrz niego znajduje się druga substancja, wybrana z grupy składającej się z immobilizowanego przeciwciała, kompleksu reporterowego oraz czynnika, który zapobiega powstawaniu niespecyficznego wiązania białek z wewnętrzną powierzchnią komory reakcyjnej.

Środek pomocniczy zawiera materiał wybrany z grupy, składającej się z materiału usieciowanego, włóknistego materiału wypełniającego, materiału porowatego, spiekanego proszku, membrany makroporowatej oraz materiału perlistego.

Komora detekcji zawiera pierwszą elektrodę i drugą elektrodę.

Przynajmniej jedna z elektrod zawiera materiał wybrany z grupy, składającej się z aluminium, miedzi, niklu, chromu, stali, stali nierdzewnej, palladu, platyny, złota, irydu, węgla, węgla zmieszanego ze spoiwem, tlenku indu, tlenku cyny, polimeru przewodzącego oraz ich mieszaniny.

Ściana komory detekcji jest przeźroczysta względem promieniowania emitowanego lub absorbowanego przez sondę, traktowanego jako wskaźnik obecności lub nieobecności kompleksu reporterowego w komorze detekcji.

Komora reakcyjna zawiera detektor, który wykrywa stan, w którym ta komora reakcyjna jest zasadniczo wypełniona.

Antygen docelowy zawiera ludzkie białko C-reaktywne.

Ściana komory detekcji lub ściana komory reakcyjnej zawiera dodatkowo wypełniacz.

Materiał wypełniacza jest wybrany z grupy, składającej się z dwutlenku tytanu, węgla, krzemionki, szkła oraz mieszaniny dwóch lub więcej tych substancji z grupy.

Sonda zawiera kofaktor enzymu.

Kofaktor enzymu jest wybrany z grupy, składającej się z mononukleotydu flawinowego, dwunukleotydu flawinoadeninowego, dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego oraz pirolochinolinochinonu.

Kofaktor enzymu jest związany z antygenem kompleksu reporterowego za pośrednictwem elastycznego dystansownika.

Urządzenie według wynalazku zawiera ponadto substrat enzymu.

Sonda zawiera apoenzym.

Sonda zawiera regulator aktywności enzymu.

Regulator aktywności enzymu zawiera kinazę lub fosforylazę.

Urządzenie zawiera dodatkowo substrat enzymu.

Urządzenie zawiera dodatkowo enzym.

Sonda zawiera podjednostkę proteinową enzymu o wielu podjednostkach.

Sposób wyznaczania ilości antygenu docelowego w płynnej próbce, polegający na umieszczaniu płynnej próbki w komorze reakcyjnej, w której znajduje się immobilizowane przeciwciało, przytwierdzone wewnątrz tej komory reakcyjnej oraz kompleks reporterowy, zawierający sondę oraz antygen kompleksu reporterowego, przy czym sonda jest związana z antygenem kompleksu reporterowego, poddawaniu części antygenu kompleksu reporterowego z immobilizowanego przeciwciała dysocjacji do płynnej próbki, wiązaniu części antygenu docelowego z immobilizowanym przeciwciałem, a następnie na kapilarnym przemieszczaniu płynnej próbki z komory reakcyjnej do komory detekcji i wreszcie na wyznaczaniu ilości kompleksu reporterowego zawartego w płynnej próbce, którą traktuje się jako wskaźnik ilości antygenu docelowego, obecnego początkowo w płynnej próbce, według wynalazku charakteryzuje się tym, że przed umieszczeniem płynnej próbki w komorze reakcyjnej powoduje się związanie zawartego w komorze reakcyjnej antygenu kompleksu reporterowego z immobilizowanym przeciwciałem, przy czym stosuje się antygen kompleksu reporterowego, który słabiej wiąże się z immobilizowanym przeciwciałem niż antygen docelowy.

Etap kapilarnego przemieszczania płynnej próbki z komory reakcyjnej do komory detekcji zawiera etap przemieszczania płynnej próbki do ogniwa elektrochemicznego, które zawiera pierwszą

PL 216 216 B1 elektrodę i drugą elektrodę, zaś etap wyznaczania ilości kompleksu reporterowego w płynnej próbce obejmuje przykładanie różnicy potencjałów między pierwszą elektrodą a drugą elektrodą oraz pomiar natężenia prądu, które jest wskaźnikiem ilości kompleksu reporterowego obecnego w płynnej próbce.

Etap przemieszczania płynnej próbki z komory reakcyjnej do komory detekcji obejmuje stosowanie komory detekcji, zawierającej część przepuszczalną dla promieniowania elektromagnetycznego.

W przypadku stosowania komory detekcji zawierającej część przepuszczalną dla promieniowania elektromagnetycznego, etap wyznaczania ilości kompleksu reporterowego w płynnej próbce zawiera etap wystawienia części przepuszczalnej dla promieniowania elektromagnetycznego na oddziaływanie promieniowania elektromagnetycznego, które przechodzi przez płynną próbkę lub odbija się od niej, a także etap monitorowania własności promieniowania elektromagnetycznego po jego przejściu przez płynną próbkę lub odbiciu się od niej, traktowanej jako wskaźnik ilości kompleksu reporterowego obecnego w płynnej próbce, którą z kolei traktuje się jako wskaźnik ilości antygenu docelowego obecnego początkowo w płynnej próbce.

Wynalazek pozwala na otrzymanie niedrogiego immunosensora ilościowego jednorazowego użytku, który nie wymaga etapów płukania i nie powoduje powstawania ciekłych odpadów. W pewnych przykładach wykonania immunosensorów, nie są wymagane żadne etapy odmierzania czasu przez użytkownika, zaś sensor może być z łatwością przystosowany do interakcji antygenu-przeciwciała w szerokim zakresie kinetycznym. Sensory z korzystnych przykładów wykonania posiadają liczne potencjalne zalety. Sensory takie mogą być prostsze do wytworzenia i mogą być osadzane w charakterze reagentów w pojedynczym etapie i/lub tylko w jednej części komory reakcyjnej lub na znajdującym się w niej podłożu.

Sensory te mogą wykorzystywać kompleks pseudo-antygenu-sondy. Stosowane w niniejszym określenie „pseudo-antygen” ma szerokie znaczenie i stosowane jest w swym zwykłym sensie, włączając w to, ale bez ograniczenia, antygeny inne niż antygen, będący przedmiotem analizy, które wiążą się z immobilizowanym przeciwciałem, ale nie tak silnie jak dany antygen. Stosowane w niniejszym określenie „antygen modyfikowany” ma szerokie znaczenie i stosowane jest w swym zwykłym sensie, włączając w to, ale nie ograniczając, antygeny, które zostały zmodyfikowane chemicznie lub w inny sposób tak, iż modyfikowany antygen wiąże się z immobilizowanym przeciwciałem, ale nie tak silnie jak rozważany antygen. Antygen z kompleksu antygen-sonda, który może być taki sam lub inny niż rozważany antygen, dzięki temu, iż jest związany z sondą, wiązał się będzie z unieruchomionym przeciwciałem, ale nie tak silnie jak rozważany antygen, który znajduje się w stanie niezwiązanym. Podczas gdy korzystne przykłady wykonania omawiane są głównie w odniesieniu do pseudo-antygenu, należy rozumieć, że kompleks antygen-sonda lub modyfikowany antygen może zostać podstawiony za pseudo-antygen.

Może być łatwiejsze uzyskanie prawidłowego stosunku przeciwciała do antygenu-sondy, modyfikowanego antygenu-sondy lub pseudo-antygenu-sondy w komorze reakcyjnej, gdyż następuje to zasadniczo automatycznie, kiedy antygen-sonda, modyfikowany antygen-sonda lub pseudo-antygen-sonda jest wiązany z przeciwciałem podczas wytwarzania sensora, w przeciwieństwie do sposobów ze stanu techniki, gdzie poprawny stosunek osiągany jest zwykle poprzez kontrolę szybkości osadzania reagentów i gęstości powierzchniowych. Sensor według korzystnych przykładów wykonania może także nadawać się szczególnie dobrze do wolniejszych kinetyk immunoreakcji, gdzie szybkości procesów wiązania mogą być powolne. Zastosowanie nie-ludzkiego pseudo-antygenu przy wytwarzaniu sensora może zredukować prawdopodobieństwo przenoszenia chorób zakaźnych, gdy sensor wchodzi w styczność z kroplą krwi na palcu pacjenta.

W pierwszym przykładzie wykonania opracowano jednorazowe urządzenie, przeznaczone do zastosowania przy detekcji antygenu docelowego w płynnej próbce, przy czym urządzenie to zawiera komorę reakcyjną, immobilizowane przeciwciało wewnątrz komory reakcyjnej, kompleks reporterowy, zawierający sondę oraz antygen kompleksu reporterowego, przy czym sonda jest połączona z antygenem kompleksu reporterowego, zaś antygen kompleksu reporterowego jest związany z immobilizowanym przeciwciałem, zaś antygen kompleksu reporterowego wiąże się słabiej z immobilizowanym przeciwciałem niż antygen docelowy, komorę detekcji, wejście do komory reakcyjnej, a także kanał pomiędzy komorą reakcyjną a komorą detekcji.

Zgodnie z pierwszym przykładem wykonania, antygen kompleksu reporterowego może być antygenem docelowym, pseudo-antygenem lub modyfikowanym antygenem. Sonda może zawierać radioizotopy, chromofory lub fluorofory.

PL 216 216 B1

Sonda może zawierać enzym, taki jak dehydrogenaza glukozowa. Gdy sonda jest enzymem, wówczas komora detekcji może dodatkowo zawierać substrat enzymu, na przykład substrat utlenialny, taki jak glukoza. Komora detekcji może zawierać dodatkowo mediator, taki jak dichlorofenolindefenol lub kompleksy między metalami przejściowymi a zawierającymi azot cząstkami heteroatomowymi lub też cyjanożelaziany. Urządzenie może dodatkowo zawierać bufor, który dopasowuje wartość współczynnika pH sondy, taki jak na przykład fosforan lub melitan (mellitate). Urządzenie to może zawierać także stabilizator, który stabilizuje jeden lub większą liczbę antygenów docelowych, antygen kompleksu reporterowego, enzym, a także immobilizowane przeciwciało. Substrat enzymu może być położony na wewnętrznej powierzchni komory detekcji.

W pewnej postaci pierwszego przykładu wykonania, immobilizowane przeciwciało może być oparte na wewnętrznej powierzchni komory reakcyjnej.

W innej postaci pierwszego przykładu wykonania, urządzenie zawiera także środek pomocniczy. Ten środek pomocniczy może znajdować się wewnątrz komory detekcji i może zawierać pierwszą substancję, taką jak substrat enzymu, mediator lub bufor, który może być położony na lub zawarty w środku pomocniczym. Środek pomocniczy może też znajdować się wewnątrz komory reakcyjnej i może zawierać drugą substancję, taką jak immobilizowane przeciwciało, kompleks reporterowy lub środek, zapobiegający nie specyficznemu związaniu białek do wewnętrznej powierzchni komory reakcyjnej, który może być unoszony na lub zawarty w środku pomocniczym. Środek pomocniczy może zawierać materiał usieciowany, na przykład zawierający polimer, taki jak poliolefina, poliester, nylon, celuloza, polistyren, poliwęglan, polisulfon lub ich mieszanki. Środek pomocniczy może zawierać włóknisty materiał wypełniający, zawierający na przykład polimer, taki jak poliolefina, poliester, nylon, celuloza, polistyren, poliwęglan, polisulfon lub ich mieszanki. Środek pomocniczy może zawierać materiał porowaty, taki jak proszek spiekany lub makroporowata membrana, na przykład makroporowata membrana zawierająca materiał polimerowy, taki jak polisulfon, dwufluorek poliwinylidenu, nylon, octan celulozy, polimetakrylan, poliakrylan lub ich mieszanki. Środek pomocniczy może też zawierać materiał perlisty.

W innej postaci pierwszego przykładu wykonania, komora detekcji zawiera pierwszą elektrodę i drugą elektrodę. Przynajmniej jedna z tych elektrod zawiera materiał, taki jak aluminium, miedź, nikiel, chrom, stal, stal nierdzewna, pallad, platynę, złoto, iryd, węgiel wymieszany ze spoiwem, tlenek indu, tlenek cyny, polimer przewodzący lub ich mieszaniny.

Ściana komory detekcji może być przezroczysta dla promieniowania emitowanego lub pochłanianego przez sondę, a promieniowanie to wskazuje na obecność lub nieobecność kompleksu reporterowego w komorze detekcji.

W innej postaci pierwszego przykładu wykonania, urządzenie zawiera detektor, który wykrywa moment, kiedy komora reakcyjna jest zasadniczo wypełniona.

W innej postaci pierwszego przykładu wykonania, urządzenie zawiera środki przebijające, które tworzą otwór wentylacyjny komory detekcji w dalszym końcu komory detekcji. Urządzenie może także zawierać otwór wentylacyjny komory reakcyjnej w dalszym końcu komory reakcyjnej.

W innej postaci pierwszego przykładu wykonania, antygen docelowy zawiera ludzkie białko C-reaktywne. Antygen kompleksu reporterowego może zawierać monomerowe białko C-reaktywne, otrzymane z gatunków innych niż człowiek lub też chemicznie modyfikowane białko C-reaktywne, gdzie powinowactwo chemicznie modyfikowanego białka C-reaktywnego do przeciwciała jest mniejsze niż powinowactwo ludzkiego białka C-reaktywnego do tegoż przeciwciała.

W innej postaci pierwszego przykładu wykonania, ściana komory detekcji lub ściana komory reakcyjnej zawiera materiał, taki jak poliester, polistyren, poliwęglan, poliolefina, politereftalan etylenowy lub ich mieszaniny. Ściana komory detekcji lub ściana komory reakcyjnej może zawierać także wypełniacz, jak dwutlenek tytanu, węgiel, krzemionkę, szkło i ich mieszaniny.

W innej postaci pierwszego przykładu wykonania, sonda zawiera kofaktor enzymu, taki jak mononukleotyd flawinowy, dwunukleotyd fIawinoadeninowy, dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy lub pirolochinolinochinon. Kofaktor enzymu może być związany z antygenem kompleksu reporterowego poprzez elastyczny dystansownik. Komora detekcji także może zawierać substrat enzymu lub apoenzym.

W innej postaci pierwszego przykładu wykonania, sonda zawiera regulator aktywności enzymu, taki jak kinaza czy fosforylaza. Komora detekcji może również zawierać substrat enzymu lub enzym.

W innej postaci pierwszego przykładu wykonania, sonda zawiera podjednostkę białka, która jest częścią enzymu o wielu podjednostkach.

PL 216 216 B1

Drugi przykład wykonania wynalazku dotyczy sposobu wyznaczania ilości antygenu docelowego w płynnej próbce, który zawiera etapy umieszczania płynnej próbki w komorze reakcyjnej, zawierającej immobilizowane przeciwciało oraz kompleks reporterowy, zawierający sondę związaną z antygenem kompleksu reporterowego, przy czym przeciwciało jest mocowane w komorze reakcyjnej, zaś antygen kompleksu reporterowego jest wiązany do immobilizowanego przeciwciała, a antygen kompleksu reporterowego wiąże się z mniejszą siłą niż antygen docelowy z immobilizowanym przeciwciałem, etap oddzielania części antygenu kompleksu reporterowego od immobilizowanego przeciwciała do płynnej próbki, etap wiązania części antygenu docelowego z immobilizowanym przeciwciałem, etap przenoszenia płynnej próbki do komory detekcji, a także etap wyznaczania pewnej ilości kompleksu reporterowego w płynnej próbce, przy czym ilość kompleksu reporterowego wskazuje na ilość antygenu docelowego, znajdującą się początkowo w płynnej próbce.

Etap przenoszenia płynnej próbki do komory detekcji zawiera etap przenoszenia płynnej próbki do ogniwa elektrochemicznego, zawierającego pierwszą elektrodę i drugą elektrodę. Etap wyznaczania ilości kompleksu reporterowego w płynnej próbce może zawierać również etap przykładania potencjału pomiędzy pierwszą elektrodę a drugą elektrodę w ogniwie elektrochemicznym, a także etap pomiaru prądu, gdzie natężenie prądu jest wskaźnikiem ilości kompleksu reporterowego, obecnego w płynnej próbce, zaś ilość kompleksu reporterowego jest wskaźnikiem ilości antygenu docelowego.

W innej postaci drugiego przykładu wykonania wynalazku, etap przenoszenia płynnej próbki do komory detekcji zawiera etap przenoszenia płynnej próbki do komory detekcji, zawierającej element przepuszczalny dla promieniowania elektromagnetycznego. Etap określania ilości kompleksu reporterowego w płynnej próbce może także zawierać etap wystawiania elementu przepuszczalnego dla promieniowania elektromagnetycznego na oddziaływanie promieniowania elektromagnetycznego, w wyniku czego promieniowanie elektromagnetyczne przenika przez płynną próbkę lub odbija się od niej, a także etap monitorowania właściwości promieniowania elektromagnetycznego po jego przejściu przez płynną próbkę lub odbiciu się od tej próbki, przy czym właściwości te są wskaźnikiem ilości kompleksu reporterowego, obecnego w płynnej próbce, zaś ilość kompleksu reporterowego jest wskaźnikiem ilości antygenu docelowego.

Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładach wykonania na załączonym rysunku, na którym: fig. 1 przedstawia widok z góry (bez zachowania skali) immunosensora według pierwszego korzystnego przykładu wykonania wynalazku, który zawiera ogniwo elektrochemiczne, fig. 2 - widok w przekroju poprzecznym (bez zachowania skali) wzdłuż linii A-A' według przykładu wykonania immunosensora z fig. 1, fig. 3 - widok z góry (bez zachowania skali) immunosensora według korzystnego przykładu wykonania, który zawiera ogniwo elektrochemiczne, a fig. 4 - widok w przekroju poprzecznym (bez zachowania skali) wzdłuż linii B-B' przykładu wykonania immunosensora z fig. 3.

Następujący dalej opis i przykłady ilustrują szczegółowo korzystny przykład wykonania niniejszego wynalazku. Znawcy tej dziedziny techniki zauważą, iż istnieją liczne odmiany i modyfikacje, które leżą w zakresie tego wynalazku. Zgodnie z tym, opis korzystnego przykładu wykonania nie powinien zostać uznany za ograniczenie zakresu niniejszego wynalazku.

Dostarczono pas sensorowy, który zawiera dwie komory: komorę reakcyjną oraz komorę detekcji. Płynna próbka umieszczana jest w komorze reakcyjnej, gdzie składniki próbki przechodzą proces immunoreakcji. Wykrywa się jeden lub większą liczbę produktów immunoreakcji w celu określenia ilości antygenu, obecnego w próbce. Komora reakcyjna i komora detekcji są tak rozmieszczone, że próbki mogą przepływać z komory reakcyjnej do komory detekcji.

Po zajściu immunoreakcji w komorze reakcyjnej, przynajmniej pewna część przereagowanej próbki jest przenoszona do komory detekcji, gdzie wykrywana jest i analizowana obecność sondy w celu otrzymania wyniku. Korzystne jest, aby przeniesiona została wystarczająca ilość próbki tak, aby komora detekcji została wypełniona w wystarczającym stopniu, mianowicie tak, aby przy zastosowanej metodzie detekcji, mogła zostać wykryta i zanalizowana obecność sondy.

Komora reakcyjna zawiera przeciwciała na badany antygen, immobilizowane wewnątrz tej komory. Przeciwciała mogą zostać immobilizowane na ścianie samej komory. Ewentualnie, przeciwciała mogą zostać immobilizowane na substracie, znajdującym się wewnątrz komory reakcyjnej. Do odpowiednich substratów należą, ale bez ograniczenia do nich, materiały włókniste, materiały makroporowate, materiały w postaci proszku lub, w szczególnie korzystnych przykładach wykonania, perły, takie jak powszechnie znane w dziedzinie substratów przeciwciał.

W korzystnym przykładzie wykonania, immobilizowane przeciwciała wiązane są z tak zwanym „pseudo-antygenem”, związanym z sondą. Kompleks pseudo-antygen-sonda wiąże się z immobilizoPL 216 216 B1 wanym przeciwciałem, ale nie tak silnie, jak rozważany antygen. Jeżeli, przykładowo, wykrywany antygen jest białkiem ludzkim, to odpowiednim kompleksem pseudo-antygenu-sondy może być zwierzęca odmiana tego samego białka, na przykład białko psa lub świni, związana z sondą. W tym przykładzie, antyciała dla ludzkiej wersji tego białka są immobilizowane w komorze reakcyjnej, zaś zwierzęca odmiana białka, związana z odpowiednią sondą, wiąże się z immobilizowanym przeciwciałem w celu utworzenia kompleksu przeciwciało-pseudo-antygen-sonda.

Gdy płynna próbka wypełnia komorę reakcyjną, wówczas niewielka część kompleksu pseudoantygen-sonda dysocjuje w roztworze, gdyż jest stosunkowo słabo związana z przeciwciałem. Występować będzie wtedy równowaga dynamiczna pomiędzy ilością związanego pseudo-antygenu-sondy a ilością swobodnego pseudo-antygenu-sondy, pozostawiając pewne wolne miejsca wiązania przeciwciała. Jeśli w roztworze występuje antygen, wówczas będzie on silniej wiązał się z wolnymi miejscami wiązania przeciwciała niż pseudo-antygen-sonda, pozostawiając w ten sposób kompleks pseudo-antygen-sonda w roztworze. Proces ten będzie trwał, aż zasadniczo całość antygenu w płynnej próbce ulegnie związaniu z przeciwciałami i występować będzie stała ilość kompleksu pseudoantygen-sonda w roztworze. Każdy antygen, który zwiąże się z immobilizowanym przeciwciałem, spowoduje przemieszczenie jednego kompleksu pseudo-antygen-sonda do roztworu.

Gdy całość lub określona część antygenu w płynnej próbce ulegnie związaniu z immobilizowanymi przeciwciałami, to stężenie pseudo-antygenu-sondy w roztworze odzwierciedli początkową koncentrację antygenu w próbce. W korzystnych przykładach wykonania, równowaga między swobodnym a związanym pseudo-antygenem-sondą zależy od pewności, że antygen w roztworze wiąże się chętniej z przeciwciałem niż kompleks pseudo-antygenu-sondy. Stąd, wykorzystuje się taki kompleks pseudo-antygenu-sondy, który słabiej wiąże się z przeciwciałem niż antygen docelowy, ale nie ma potrzeby fizycznego usuwania kompleksu pseudo-antygenu-sondy z przeciwciała przed wprowadzeniem płynnej próbki, jak miało to miejsce w niektórych sposobach ze stanu techniki.

Po wystąpieniu takich immunoreakcji, płynna próbka zawierająca kompleks pseudo-antygenusondy, uwolniona z przeciwciał, przenoszona jest do komory detekcji. W komorze detekcji jest mierzone stężenie obecnego w próbce kompleksu pseudo-antygen-sonda i otrzymywany jest wynik.

Niewielka ilość kompleksu pseudo-antygen-sonda może dysocjować w roztworze, nawet przy nieobecności antygenu w próbce, w wyniku osiągnięcia w roztworze równowagi związanego i swobodnego kompleksu pseudo-antygenu-sondy. Jeżeli ma to miejsce, wówczas sygnał generowany w komorze detekcji w wyniku obecności tego swobodnego kompleksu pseudo-antygenu-sondy traktowany jest jako sygnał tła, który odejmowany jest od wyniku stężenia antygenu, stanowiąc część procedury analizy.

W toczącym się zgłoszeniu nr 09/616 433, złożonym 14 lipca 2000 i załączonym niniejszym w całości przez odniesienie, opisywany jest pas sensorowy do próby immunologicznej z wiązaną immunoreakcją i komorą detekcji. W przeciwieństwie do opisywanego tu sensora, który wykorzystuje kompleks pseudo-antygenu-sondy, związany wstępnie z immobilizowanym przeciwciałem na powierzchni wewnątrz komory reakcyjnej, w sensorze ze zgłoszenia 09/616 433, przed wprowadzeniem próbki do komory reakcyjnej, przeciwciała są immobilizowane na powierzchni, a antygen-sonda jest immobilizowany na innej powierzchni komory reakcyjnej. Gdy próbka jest wprowadzana do komory reakcyjnej, wówczas kompleks antygen-sonda rozpuszcza się W roztworze i współzawodniczy z antygenem w próbce o miejsca wiązania przeciwciała.

Sposób użycia sensora ze zgłoszenia nr 09/616 433 opiera się głównie na czynnikach kinetycznych, wykorzystując fakt, że antygen zwiąże się z przeciwciałem (dzięki temu, że dostanie się tam jako pierwszy) W obecności kompleksu antygen-sonda. Stąd też istnieje potrzeba przestrzennego usunięcia kompleksu antygen-sonda z przeciwciała w komorze reakcyjnej, a sensor może działać, gdy antygen i antygen-sonda wiążą się z przeciwciałem z taką samą siłą.

W korzystnym przykładzie wykonania, sensor jest jednoetapowym sensorem, nie wymagającym płukania. Sensor ten jest urządzeniem jednorazowego użytku, które wykorzystuje komorę reakcyjną oraz komorę detekcji. Zastosowany może być dowolny, dogodny sposób detekcji. Do odpowiednich sposobów detekcji należą na przykład detekcja wizualna, w której obserwowana jest zmiana barwy lub detekcja spektroskopowa, w której do pomiaru zmian absorpcji światła wykorzystywane jest światło odbite lub przenoszone.

W korzystnym przykładzie wykonania stosowany jest elektrochemiczny sposób detekcji, w którym mierzony jest prąd elektryczny lub potencjał, związane z produktami immunoreakcji.

PL 216 216 B1

Sposoby i urządzenia, służące do otrzymania pomiarów elektrochemicznych płynnych próbek, omawiane są ponadto we współbieżącym zgłoszeniu patentowym USA nr 09/616 556, złożonym 14 lipca 2000, które załączono w niniejszym w całości.

Pomiar czasu różnych etapów testu, to jest etapów reakcji i detekcji, może zostać wykonany manualnie. Ewentualnie, pomiar czasu może być wykonany automatycznie w odpowiedzi na sygnał wyzwalający, generowany w momencie, gdy komora reakcyjna i/lub komora detekcji zostaje napełniona.

Na fig. 1 i 2 oraz 3 i 4 przedstawiono przykłady wykonania sensorów, odpowiednich do zastosowania w detekcji elektrochemicznej. Na fig. 1 przedstawiono widok z góry przykładu wykonania pasa sensorowego, a na fig. 2 - widok w przekroju poprzecznym, ukazujący szczegóły budowy komory reakcyjnej I komory detekcji. Na fig. 3 przedstawiono widok z góry drugiego przykładu wykonania pasa sensorowego, a na fig. 4 - widok w przekroju poprzecznym, ukazujący szczegóły budowy komory reakcyjnej I komory detekcji.

Sensor

Immunosensory według wynalazku mogą być przygotowane przy zastosowaniu dobrze znanych technik wytwarzania urządzeń cienkowarstwowych, takich jak stosowane przy wytwarzaniu elektrochemicznych urządzeń do wykrywania glukozy (patrz na przykład zgłoszenie US nr 5 942 102, załączone w niniejszym w całości przez odniesienie). Techniki tego rodzaju, z pewnymi modyfikacjami, mogą być także stosowane do wytwarzania immunosensorów, wykorzystujących nie elektrochemiczne metody detekcji.

W korzystnych przykładach wykonania immunosensorów, zilustrowanych na fig. 1 i 2 oraz na fig. 3 i 4, komora detekcji zawiera ogniwo elektrochemiczne. Immunosensory te mogą być przygotowane poprzez złożenie różnych cienkich warstw z odpowiednio ukształtowanych materiałów, zgodnie z metodami wytwarzania czujników cienkowarstwowych, które są dobrze znane w technice. Zazwyczaj proces wytwarzania polega na złożeniu jednej lub większej liczby warstw przekładających pomiędzy warstwą wierzchnią a warstwą spodnią.

W korzystnym przykładzie wykonania, sensor 20 jest ogniwem elektrochemicznym 28, wykorzystującym enzym, na przykład oksydazę glukozową lub dehydrogenazę glukozową, w charakterze sondy, jak zilustrowano na fig. 1 w widoku z góry sensora 20, a także fig. 2 w przekroju poprzecznym przez sensor wzdłuż linii A-A'. Komora reakcyjna 22 i komora detekcji 28 przygotowane są poprzez utworzenie otworu, biegnącego przez arkusz materiału rezystywnego elektrycznie 36. Otwór ten jest tak ukształtowany, że tworzy ścianę boczną zarówno komory reakcyjnej 22, jak i komory detekcji 28, jak również kanał 38 pomiędzy obydwiema komorami 22 i 28. Dzięki temu, że otwór ten rozciąga się od bliższego końca 24 komory reakcyjnej 22 do krawędzi arkusza 37, powstaje również wlot płynnej próbki 24.

W jednym przykładzie wykonania, grubość arkusza 36 określa całkowitą wysokość komory reakcyjnej 22 i komory detekcji 28, które są takie same. W innym przykładzie wykonania, wysokość komory reakcyjnej 22 jest większa niż wysokość komory detekcji 28. Komora reakcyjna 22 o wysokości większej niż komora detekcji 28 przygotowana jest poprzez uwarstwienie licznych arkuszy 32, 34 i 36. Środkowy arkusz 36 posiada otwór, tworzący ściany boczne 74 i 76 zarówno komory reakcyjnej 22, jak i komory detekcji 28, jak opisano powyżej. Ta środkowa warstwa 36 znajduje się między dwiema lub większą liczbą dodatkowych warstw 32 i 34, które to dodatkowe warstwy 32 i 34 mają otwór, tworzący tylko ścianę boczną 74 komory reakcyjnej 22, przez co warstwy 32 i 34 tworzą ściany czołowe 60 i 62 komory detekcji 28. W tym przykładzie wykonania, ściany czołowe 60 i 62 komory detekcji 28 zawierają elektrody 52 i 54, które mogą zostać przygotowane, zgodnie z tym jak opisano poniżej.

Jak pokazano na fig. 2, przeciwciała 44 są przywiązane do dna 40 komory reakcyjnej 22. Z przeciwciałami 44 połączony jest kompleks pseudo-antygenu-sondy 50. Przeciwciało może być przywiązane do dowolnej, odpowiedniej powierzchni wewnątrz komory reakcyjnej 22, na przykład przywiązane do ściany lub na powierzchni ewentualnego substratu, znajdującego się wewnątrz komory reakcyjnej 22.

Na jednej stronie 70 arkusza 36 materiału rezystywnego zamontowana jest pierwsza cienkowarstwowa elektroda 52, rozciągająca się nad otworem, tworzącym komorę detekcji 28 i tworzącym ścianę czołową 60. Warstwa elektrody 52 może przylegać do arkusza 36, na przykład za pośrednictwem spoiwa. Do odpowiednich spoiw należą na przykład spoiwa aktywowane cieplnie, spoiwa wrażliwe na ciśnienie, spoiwa utwardzane cieplnie lub chemicznie, spoiwa roztapiane, spoiwa rozpływane na gorąco i tym podobne.

PL 216 216 B1

Warstwa elektrody 52 może być wykonana poprzez powlekanie (na przykład w procesie powlekania napylanego, jak ujawniono w zgłoszeniu W097/18464, metodą sitodruku lub dowolną inną, odpowiednią metodą) arkusza 32 materiału rezystywnego odpowiednim materiałem, na przykład aluminium, miedzią, niklem, chromem, stalą nierdzewną, platyną, palladem, węglem, węglem wymieszanym ze spoiwem, tlenkiem indu, tlenkiem cyny, mieszanką tlenku indu i tlenku cyny, złotem, srebrem, irydem, ich mieszankami, polimerami przewodzącymi, takimi jak polipirol czy poliacetylen i tym podobnymi. Jeżeli elektroda 52 ma być wykorzystywana w ogniwie elektrochemicznym w charakterze katody, to do odpowiednich materiałów należą na przykład aluminium, miedź, nikiel, chrom, stal, stal nierdzewna, platyna, pallad, węgiel, węgiel wymieszany ze spoiwem, tlenek indu, tlenek cyny, mieszanina tlenku indu i tlenku cyny, złoto, srebro, iryd, ich mieszaniny, polimery przewodzące takie jak polipirol lub poliacetylen i tym podobne. Jeżeli elektroda 52 ma być wykorzystywana w ogniwie elektrochemicznym jako anoda lub ma mieć styczność z substancjami utleniającymi podczas wytwarzania lub przechowywania sensora, wtedy do odpowiednich materiałów należą na przykład platyna, pallad, węgiel, węgiel wymieszany ze spoiwem, tlenek indu, tlenek cyny, mieszanina tlenków indu i cyny, złoto, srebro, iryd, ich mieszaniny, polimery przewodzące, takie jak polipirol lub poliacetylen i tym podobne. Materiały nadające się do zastosowania w charakterze elektrod 52 i 54 są kompatybilne z reagentami, występującymi w sensorze 20, a mianowicie nie reagują z nimi chemicznie przy wybranym potencjale lub też podczas wytwarzania i składowania sensora.

Druga cienkowarstwowa elektroda 54 zamontowana jest po przeciwnej stronie 72 arkusza 36 materiału rezystywnego, również rozciągając się nad otworem, tworzącym komorę detekcji 28 tak, aby utworzyć drugą ścianę czołową 62. W tym przykładzie wykonania, obojętna, izolująca elektrycznie warstwa arkusza 36 rozdziela dźwigające elektrodę warstwy 32 i 34.

Korzystnie, izolująca warstwa 36 utrzymuje warstwy 32 i 34 w określonej odległości od siebie. Zakładając, że odległość ta jest wystarczająco mała, na przykład mniejsza lub równa około 500 mikrometrów, prąd, płynący pomiędzy elektrodami 52 i 54 będzie wprost proporcjonalny do stężenia zredukowanego mediatora po odpowiednio krótkim czasie względem zastosowanego czasu detekcji. W tym przykładzie wykonania, szybkość narastania natężenia prądu jest bezpośrednio związana z szybkością reakcji enzymu, a więc też z ilością obecnego enzymu.

W pewnych przykładach wykonania korzystna może być budowa elektrody inna niż konfiguracja przeciwległa, na przykład ułożenie bok w bok lub też ułożenie równoległe ale z przesunięciem. Elektrody mogą być identyczne lub zasadniczo podobne pod względem wymiarów lub też mogą mieć różne wymiary i/lub różne kształty. Elektrody mogą zawierać ten sam lub inny materiał przewodzący. Dla znawców oczywiste będą inne odmiany konfiguracji elektrod, rozmieszczenia, a także ich budowy lub wytwarzania.

W korzystnym przykładzie wykonania, warstwy elektrod 52 i 54 zamontowane są równolegle i przeciwległe w odległości mniejszej lub równej 500, 450, 400, 350, 300, 250 lub 200 mikrometrów, a korzystniej od około 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 lub 50 mikrometrów do około 75, 100, 125 lub 175 mikrometrów. W innych przykładach wykonania korzystne może być jednakże, aby rozstawienie elektrod było większe niż 500 mikrometrów, na przykład 600, 700, 800, 900 czy 1000 mikrometrów lub nawet większe niż 1, 2, 3, 4 lub 5 milimetrów.

Objętość komory detekcji 28 lub komory reakcyjnej 22 wynosi zwykle od około 0,3 mikrolitrów lub mniej do około 100 mikrolitrów, lub więcej, korzystnie od około 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 lub 0,9 mikrolitrów do około 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 lub 90 mikrolitrów, a najkorzystniej od około 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 lub 5 mikrolitrów do około 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16 lub 18 mikrolitrów. Jednakże, w niektórych przykładach wykonania, korzystne mogą być większe lub mniejsze objętości zarówno komory reakcyjnej 22, jak i komory detekcji 28.

Elektrody 54 i 52 w komorze detekcji 28 mogą być połączone elektrycznie z miernikiem (nie pokazanym) za pośrednictwem złącza 66. Łączniki te (nie pokazane) są połączone elektrycznie z elektrodami 54 i 56 w komorze detekcji 28 za pośrednictwem ścieżek przewodzących (nie pokazane). W korzystnym przykładzie wykonania, zilustrowanym na fig. 1, ścieżki przewodzące składają się z przedłużeń folii przewodnika 52 i 54, powleczonych na wewnętrznych powierzchniach 32 i 34. Miernik połączony z obszarem złącza 66 jest zdolny do przyłożenia potencjału między elektrodami 52 i 54 W komorze detekcji 28, analizy generowanych sygnałów elektrycznych, wyświetlenia odpowiedzi, ewentualnie przechowania tej odpowiedzi w pamięci i ewentualnie przekazania przechowywanych odpowiedzi do urządzenia zbierającego, takiego jak drukarka, czy komputer.

PL 216 216 B1

W innych przykładach wykonania, wykorzystujących detekcję elektrochemiczną, stosowane są zwykle paski materiału przewodzącego na jednej lub obydwu wewnętrznych powierzchniach komory detekcji 28, z przynajmniej dwiema elektrodami, a mianowicie elektrodą wykrywającą i przeciwelektrodą/elektrodą odniesienia. Ewentualnie, obecna może być trzecia elektroda, służąca jako niezależna elektroda odniesienia.

W przypadku wykorzystywania potencjometrycznych metod detekcji, miernik jest zdolny do pomiaru różnicy potencjału między elektrodą wykrywającą a elektrodą odniesienia, ale nie musi być zdolny do przykładania pomiędzy te elektrody żadnego napięcia.

W przykładach wykonania, w których wykorzystywana jest detekcja wizualna lub spektroskopia refIektancyjna, warstwy 32 i 46 i/lub warstwy 34 i 42 są przezroczyste dla długości fali obserwowanego promieniowania. W przypadku detekcji wizualnej, w komorze detekcji 28 obserwowana jest zwykła zmiana koloru. W przypadku spektroskopii refIektancyjnej, promieniowanie detekcyjne świeci poprzez warstwy 32 i 46 i/lub warstwy 34 i 42, zaś analizowane jest promieniowanie odbite od roztworu w komorze detekcji 28. W przypadku spektroskopii transmisyjnej, warstwy 32, 46, 34 i 42 są przezroczyste dla promieniowania o wybranej długości fali. Promieniowanie świeci poprzez próbkę w komorze detekcji 28, a mierzone jest tłumienie wiązki.

W korzystnym przykładzie wykonania, warstwa 36 zawiera podłoże z warstwą adhezyjną (nie pokazaną), naniesioną na jego górną powierzchnię 70 i dolną powierzchnię 72. Do przykładów materiałów, nadających się na podłoże warstwy 36 należą poliester, polistyren, poliwęglan, poliolefiny i, korzystnie, politereftalan etylenowy. Mogą to być materiały czyste lub też mogą być wypełnione odpowiednimi wypełniaczami, w celu uzyskania pożądanych właściwości optycznych lub mechanicznych. Do przykładów materiałów, nadających się na wypełniacze, należą, ale bez ograniczenia: dwutlenek tytanu, węgiel, krzemionka i szkło. Przykładami odpowiednich spoiw są spoiwa wrażliwe na ciśnienie, ciepło oraz spoiwa utwardzane chemicznie, a także spoiwa topione na gorąco i rozpływane na gorąco. Ewentualnie, warstwy dystansujące same mogą zawierać odpowiednie spoiwa.

Jeżeli otwór wlotowy 24 nie został wykonany wcześniej w procesie wytwarzania, to tworzy się go na przykład poprzez utworzenie wycięcia (nie zilustrowane) w krawędzi 37 urządzenia 20, która przecina komorę reakcyjną 22.

Zakreskowany okrąg na fig. 1 oznacza otwór 30, przebijający warstwy 32, 34, 36, ale nie warstwy 42 i 46, przy czym otwór w warstwie 34 otwiera się do wnętrza komory detekcji 28. Ze względu na to, że warstwy 42 i 46 nie są początkowo przebite, to jedynym wylotem do atmosfery z komory detekcji 28 jest kanał 38, otwierający się do wnętrza komory reakcyjnej 22. Kiedy więc komora reakcyjna 22 wypełnia się płynną próbką, wówczas kanał 38 prowadzący do komory detekcji 28 jest zablokowany. Powoduje to uwięzienie powietrza w komorze detekcji 28 i zasadniczo zapobiega przed wypełnieniem jej płynną próbką. Niewielka ilość płynnej próbki przedostanie się do komory detekcji 28 w czasie pomiędzy pierwszym kontaktem próbki z otworem 38, prowadzącym do komory detekcji a momentem, kiedy próbka styka się z dalszą stroną otworu 38. Jednakże, po tym jak płynna próbka całkowicie zwilży otwór 38, prowadzący do komory reakcyjnej 28, napełnianie komory detekcji 28 już nie następuje. Objętość komory reakcyjnej 22 jest zwykle tak dobrana, aby była przynajmniej równa, a korzystnie większa niż objętość komory detekcji 28. Poprzez otwarcie otworu wentylacyjnego 30 do atmosfery, płynna próbka przepływa do komory detekcji 28. Otwór wentylacyjny może zostać otwarty przy użyciu igły, połączonej z cewką w mierniku.

Immunosensor 100 według innego przykładu wykonania wynalazku, pokazanego na fig. 3 i 4, może zostać wykonany następująco. Na wierzchu spodniej warstwy 116 położone są pierwsza profilowana warstwa 112 i druga profilowana warstwa 114 o podobnej grubości. Pierwsza rozdzielająca warstwa 112 ma kształt prostokątny i położona jest przy bliższym końcu 118 spodniej warstwy 116. Druga rozdzielająca warstwa 114 ma również kształt prostokątny i położona jest na spodniej warstwie 116 w pewnej odległości od pierwszej rozdzielającej warstwy 112. Dalszy koniec 120 pierwszej warstwy 116 i bliższy koniec 122 drugiej rozdzielającej warstwy 114 tworzą części 120, 122 ścian bocznych komory reakcyjnej 124. Spodnia warstwa 116 tworzy ścianę spodnią 126 komory reakcyjnej 124. Przeciwciała 164 są przywiązane do dna 126 komory reakcyjnej 124. Kompleks antygensonda lub pseudo-antygen-sonda 162 jest związany z przywiązanymi przeciwciałami 164.

Na wierzchu pierwszej rozdzielającej warstwy 112 znajduje się trzecia rozdzielająca warstwa 128, podobna pod względem kształtu do pierwszej rozdzielającej warstwy 112. Czwarta rozdzielająca warstwa 130 posiada szczelinę 132, rozciągającą się poprzez bliższy koniec 134 rozdzielającej warstwy 130 w kierunku środka rozdzielającej warstwy 130. Czwarta rozdzielająca warstwa 130 znajPL 216 216 B1 duje się na wierzchu drugiej warstwy 114 z wyrównanymi bliższymi końcami 122, 134. Szczelina 132 w czwartej warstwie 130 tworzy ściany boczne (nie zilustrowane) komory detekcji 132. Część 138 drugiej rozdzielającej warstwy jest odsłonięta przez szczelinę 132 w czwartej rozdzielającej warstwie 130 i tworzy dno 138 komory detekcji 132. Bliższy koniec 140 szczeliny 132 tworzy kanał 140 między komorą reakcyjną 124 a komorą detekcji 132. Bliższy koniec 134 czwartej rozdzielającej warstwy 130 tworzy część 134 ściany bocznej komory reakcyjnej 124.

Na wierzchu trzeciej rozdzielającej warstwy 128 znajduje się piąty kształtowany dystansownik 142, o kształcie podobnym do pierwszej rozdzielającej warstwy 112 i trzeciej rozdzielającej warstwy 128. Na wierzchu czwartej rozdzielającej warstwy 130 znajduje się szósta rozdzielająca warstwa 144, o kształcie podobnym do drugiej rozdzielającej warstwy 114, z wyrównanymi bliższymi końcami 146, 122. Część 170 szóstej warstwy rozdzielającej, odsłonięta przez szczelinę 132 w czwartej rozdzielającej warstwie 130, tworzy wierzch 170 komory detekcji 132. Otwór 148 biegnie przez szóstą kształtowaną rozdzielającą warstwę 144. Dalszy koniec 150 otworu 148 i dalszy koniec 152 szczeliny 132 są wyrównane. Otwór 148 tworzy część 150 ściany bocznej otworu wentylacyjnego 154, pozwalając na przemieszczenie powietrza z komory detekcji 132, gdy wypełnia się ona próbką. Wierzchnia warstwa 156 umieszczona jest nad piątą rozdzielającą warstwą 142 i szóstą rozdzielającą warstwą 144. Wierzchnia warstwa 156 także zawiera otwór 158 o podobnej wielkości i kształcie oraz wyrównany z otworem 148 w szóstej rozdzielającej warstwie 144.

W innych przykładach wykonania, korzystne może być opóźnienie napełnienia komory detekcji 132 na pewien czas po wypełnieniu komory reakcyjnej 124 przez płynną próbkę, w celu pozostawienia czasu na zajście immunoreakcji w komorze reakcyjnej 124. W tych przykładach wykonania osiągane jest to poprzez utworzenie otworu wentylacyjnego 158 w warstwie 116 i/lub 156 po zakończeniu immunoreakcji. Gdy komora reakcyjna 124 wypełnia się płynną próbką, wówczas powietrze jest więzione w komorze detekcji 132, co zapobiega wypełnieniu jej przez próbkę. W dogodnym czasie po napełnieniu komory reakcyjnej 124 przez próbkę, przynajmniej jedna z wierzchniej warstwy 156 i spodniej warstwy 116 może zostać przebita powyżej otworu wentylacyjnego 148 lub poniżej otworu wentylacyjnego 154 przez odpowiednie urządzenie, takie jak igła lub ostrze. Gdy to następuje, wówczas powietrze w komorze detekcji 132 może przepłynąć poprzez otwór 148 lub otwór 154, utworzony w warstwie 116 i/lub w warstwie 156 poprzez otwór 148 lub 154, pozwalając tym samym na wciągnięcie płynnej próbki do komory detekcji 132 z komory reakcyjnej 124 przez efekt kapilarny i przemieszczane powietrze.

Wysokość komory detekcji 132 jest zwykle tak dobierana, aby była mniejsza niż wysokość komory reakcyjnej 124 tak, aby w połączeniu z energiami powierzchniowymi powierzchni komór 132 i 124, siła kapilarna w komorze detekcji 132 była większa niż w komorze reakcyjnej 124. Większa siła kapilarna w komorze detekcji 132 służy do wciągnięcia płynnej próbki do komory detekcji 132, opróżniając jednocześnie komorę reakcyjną 124. Taki sposób wykorzystywania różnic w sile kapilarnej w celu napełnienia komory opisany jest szczegółowo we współbieżącym zgłoszeniu nr 09/536 234, złożonym 27 marca 2000.

W korzystnych przykładach wykonania, wysokość komory reakcyjnej 124 jest zwykle większa niż wysokość komory detekcji 132. Wysokość komory detekcji 132 wynosi zwykle około 500 mikrometrów lub mniej, korzystnie około 450, 400, 350, 300, 250 mikrometrów lub mniej, a najkorzystniej około 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 łub 50 mikrometrów do około 75, 100, 125, 150, 175 lub 200 mikrometrów. Takie wysokości komory detekcji 132 są szczególnie odpowiednie do zastosowań, w których ściana wierzchnia i ściana spodnia komory detekcji 132 zawierają warstwy elektrod. Jednakże mogą być pewne przykłady wykonania, w których stosowana jest detekcja elektrochemiczna, gdzie korzystne mogą być wysokości ogniw większe niż około 500 mikrometrów. Takie wysokości komory detekcji 132 mogą być również dogodne, gdy stosowane są inne niż detekcja elektrochemiczna sposoby detekcji. Gdy wykorzystywana jest inna metoda detekcji, na przykład metoda optyczna, wówczas korzystne mogą być inne wysokości ogniw.

W takich przykładach wykonania korzystne mogą być wysokości ogniw od około 600, 700, 800, 900 mikrometrów lub więcej lub nawet około 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 i 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 lub 5 mm lub więcej. Wysokość komory reakcyjnej 124 jest zwykle większa niż wysokość komory detekcji 132. Jednakże w pewnych przykładach wykonania może być korzystne zastosowanie komory reakcyjnej, posiadającej taką samą lub podobną wysokość, co komora detekcji lub nawet mniejszą wysokość niż komora detekcji. Wysokość komory detekcji wynosi zwykle od około 5 mikrometrów lub mniej do około 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 lub 5 mm lub więcej, korzystnie około 900, 800, 700, 600

PL 216 216 B1 lub 500 mikrometrów lub mniej, korzystniej około 450, 400, 350, 300 lub 250 mikrometrów lub mniej, a najkorzystniej od około 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 lub 50 mikrometrów do około 75, 100, 125, 150, 175, 200 lub 250 mikrometrów.

Gdy immunosensor 100 jest sensorem elektrochemicznym, wówczas górna powierzchnia drugiej rozdzielającej warstwy 138 i dolna powierzchnia 160 szóstej rozdzielającej warstwy 144, które są odsłonięte przez szczelinę 132 w czwartej rozdzielającej warstwie 130, mogą być częściowo lub całkowicie pokryte materiałem przewodzącym. Ewentualnie, same warstwy 114 i 144 mogą być wykonane z materiałów przewodzących elektryczność. Połączenie elektryczne między obydwoma warstwami przewodzącymi (nie zilustrowane) i miernikiem (nie zilustrowany) umożliwia prowadzenie pomiarów elektrochemicznych wewnątrz komory detekcji.

Sposoby wytwarzania

Dla celów ilustracji zostaną teraz opisane szczegóły wytwarzania sensorów według korzystnych przykładów wykonania w odniesieniu do sensora, przedstawionego na fig. 3 i 4. Pas sensora 100 jest zwykle zbudowany z wzajemnie laminowanych warstw pewnego materiału.

W celu rozdzielenia warstw 112 i 114 od warstw 142 i 144 stosowane są jedna lub większa liczba rozdzielających warstw 128, 130. Warstwy rozdzielające mają powierzchnie adhezyjne, umożliwiające wzajemne połączenie warstw 112, 128 i 142 oraz warstw 114, 130 i 144. Ewentualnie, same warstwy rozdzielające mogą składać się ze spoiwa lub też mogą zawierać materiał, zdolny do przylegania do sąsiednich warstw w wyniku oddziaływania ciepła i/lub nacisku podczas laminowania.

Komora detekcji 132 stanowi przestrzeń kapilarną, gdzie warstwy 114 i 144 tworzą ściany czołowe, zaś grubość warstw 128, 130 określa wysokość. Warstwy 114 i 144 mogą służyć również jako podłoża dla powłok elektrod (nie zilustrowane), które tworzą elektrody ogniwa elektrochemicznego lub same mogą działać jako elektrody dzięki temu, że zbudowane są z materiałów przewodzących. Podczas budowy, komora detekcji 132 formowana jest zwykle poprzez wykrojenie lub w inny sposób usunięcie części warstwy 130. Ta wykrojona część warstwy 130 może także służyć do określenia obszaru elektrody ogniwa elektrochemicznego.

Komora reakcyjna 124 może być uformowana poprzez wykrojenie lub usunięcie w inny sposób części warstw rozdzielających, przy czym obszary są tak usunięte, że komora reakcyjna 124 nachodzi na komorę detekcji 132, powodując otwarcie komory detekcji 132 do wnętrza komory reakcyjnej 124. Następnie, na zewnętrzną powierzchnię warstw 112, 114 oraz warstw 142, 144 mogą zostać nalaminowane warstwy 116 i 156, w celu utworzenia ścian czołowych 126, 174 komory reakcyjnej 124. Na wewnętrzną powierzchnię 126 i/lub 174 warstw 116 i/lub 156, przed lub po laminacji warstw 116 i 156 na warstwy 112, 114 i warstwy 142, 144, mogą zostać naniesione immunologiczne chemikalia 164 i 162. Warstwy 116 i 156 mogą przylegać do warstw 112, 114 i warstw 142, 144, w wyniku obecności warstwy spoiwa na wewnętrznej powierzchni warstw 112, 114 i warstw 142, 144 lub też na wewnętrznej powierzchni warstw 116 i 156.

Otwór wentylacyjny 148 i/lub 154 może korzystnie zostać wykonany poprzez wykrojenie otworu przez warstwy 114, 130 i 144. Ze względu na uproszczenie procesu wytwarzania paska, szczególnie korzystne jest uformowanie otworu wentylacyjnego 148 i/lub 154 w tym samym czasie, w którym wycinane są części komory reakcyjnej 124 i/lub komory detekcji 132, gdyż ułatwia to osiągnięcie odtwarzalnego rozmieszczenia komór i otworów wentylacyjnych, a także redukuje liczbę etapów procesu.

W innym przykładzie wykonania, otwór wentylacyjny 148, 154, 158 może zostać wykonany przez wykrojenie poprzez warstwy 114 , 116, 130, 144 i 156 oraz dodatkowe warstwy taśmy (nie zilustrowane), laminowane na obydwu końcach powstałego tak otworu. Ma to tę zaletę, że pozwala na niezależną optymalizację właściwości warstw 116 i 155 oraz warstw taśmy, przykrywających otwór wentylacyjny (nie zilustrowane). Ewentualnie, otwór wentylacyjny 148, 154, 158 może zostać uformowany poprzez wykrojenie przez warstwy 114, 130, 144 i 116 lub 156 przed nalaminowaniem warstw 116 lub 156. Pozostawia to otwór 158 na tylko jednej powierzchni pasa 100 i wtedy stosowana jest tylko jedna taśma przykrywająca.

W innym przykładzie wykonania, warstwy 116 i 156 mogą zostać utworzone i nalaminowane na warstwy 114 i 144 tak, iż warstwy 116 i 156 nie rozciągają się celem przykrycia obszaru, w którym formowany jest otwór wentylacyjny 158. Konieczne jest wtedy tylko wykrojenie przez warstwy 114, 130 i 144 w celu uformowania otworu wentylacyjnego 148, 154, 158 i dodatkowe warstwy taśmowe (nie zilustrowane), nalaminowane na obydwa końce powstałego w ten sposób otworu.

Warstwy te mogą zostać przyklejone do siebie wzajemnie dowolnym sposobem, na przykład za pośrednictwem spoiwa wrażliwego na ciśnienie, spoiw utwardzalnych, spoiw roztapianych na

PL 216 216 B1 gorąco, w wyniku laminacji poprzez przyłożenie ciepła i/lub ciśnienia, łączników mechanicznych i tym podobnych.

Opisane wyżej konfiguracje sensora są jednak tyko dwiema z wielu możliwych konfiguracji, co będzie oczywiste dla znawcy. Przykładowo, otwór może zostać wykonany poprzez wierzch pasa, dno pasa, zarówno wierzch jak i dno pasa lub też jeden lub większą liczbę boków pasa. Otwór wentylacyjny może mieć dowolną odpowiednią konfigurację i może przechodzić do części komory detekcji bezpośrednio lub też po drodze okrężnej. Komora detekcji może mieć dowolny odpowiedni kształt, na przykład prostokątny, kwadratowy, okrągły lub nieregularny. Komora detekcji może opierać się o komorę reakcyjną lub też może być obecny odrębny kanał pomiędzy komorą reakcyjną a komorą detekcji. Próbka może być wprowadzana do komory reakcyjnej z dowolnej strony pasa, jak w sensorze z fig. 4 i 3 lub tylko przez jedną stronę pasa ze stroną przeciwną zablokowaną przez dystansownik, jak na fig. 1 i 2. Komora detekcji może mieć dowolny odpowiedni kształt, na przykład prostokątny, kwadratowy, okrągły lub nieregularny. Komora detekcji może być zawarta wewnątrz korpusu pasa, zaś dostęp do komory detekcji może następować poprzez jeden lub większą liczbę otworów wlotowych przez wierzch, dno lub boki pasa. Zazwyczaj, poszczególna konfiguracja jest tak dobierana, aby mógł ulec uproszczeniu sposób wytwarzania, na przykład dzięki wykonaniu mniejszej liczby operacji lub użycie mniejszej liczby i ilości składników.

Detekcja elektrochemiczna

Gdy sensor jest ogniwem elektrochemicznym, wówczas warstwy elektrod, na przykład warstwy 52 i 54 sensora z fig. 1 i 2, zaopatrzone są w łącznik elektryczny, pozwalający na umieszczenie sensora 20 w obwodzie pomiarowym. Przynajmniej jedna z elektrod 52 lub 54 w ogniwie 28 jest elektrodą odczytującą, to znaczy elektrodą wrażliwą na zmianę ilości utlenionej lub zredukowanej postaci analitu w próbce. W przypadku sensora potencjometrycznego, w którym potencjał elektrody czytającej 52 lub 54 jest wskaźnikiem poziomu analitu, obecna jest druga elektroda 54 lub 52, działająca jako elektroda odniesienia, która podaje potencjał odniesienia. W przypadku sensora amperometrycznego, w którym wskaźnikiem poziomu analitu w próbce jest natężenie prądu elektrody czytającej, występuje przynajmniej jedna inna elektroda 54 lub 52, która działa jako przeciwelektroda, służąca do zamknięcia obwodu elektrycznego. Ta druga elektroda 54 lub 52 może również działać jako elektroda odniesienia. Ewentualnie, funkcję elektrody odniesienia może spełniać odrębna elektroda (nie pokazana).

Jeżeli immunosensor 20 pracuje w charakterze ogniwa elektrochemicznego 28, wówczas arkusz 36, zawierający otwory, definiujące komorę reakcyjną 22 i/lub komorę detekcji 28, zawiera materiał rezystywny elektrycznie. W korzystnym przykładzie wykonania, arkusze 32 i 34 także zawierają materiał rezystywny. Do odpowiednich materiałów rezystywnych należą na przykład poliestry, polistyreny, poliwęglany, poliolefiny, ich mieszaniny i tym podobne. Korzystnym poliestrem jest politereftalan etylenowy. W sensorze przedstawionym na fig. 1 i 2, warstwy 32 i 34 są podłożami, pokrytymi materiałem przewodzącym 52 i 54. Materiał przewodzący 52 lub 54 naniesiony jest na powierzchnię 60 lub 62, skierowaną ku komorze detekcji 28, zaś na powierzchni 33 lub 35 skierowanej ku warstwie 42 lub 46 naniesiona jest warstwa spoiwa (nie pokazana).

W przykładzie wykonania przedstawionym na fig. 3 i 4, komora detekcji 132 posiada elektrycznie przewodzące powłoki (nie zilustrowane) na wewnętrznej powierzchni 138 i 170, które są odpowiednie do zastosowania w charakterze elektrod w ogniwie elektrochemicznym. W komorze detekcji 132 znajduje się również warstwa suchego reagenta 172, zawierająca substrat enzymu sondy oraz, jeśli jest to konieczne, cząstki redoks, zdolne do cyklicznego przeprowadzania enzymu pomiędzy jego postacią utlenioną a zredukowaną i zdolne do utlenienia lub zredukowania na elektrodach ogniwa. Celem kontroli współczynnika pH w komorze detekcji 132, można zastosować także pewien bufor. Gdy immunosensor jest użytkowany, to elektrody połączone są do zewnętrznego miernika elektronicznego (nie zilustrowanego) za pośrednictwem zewnętrznych łączników (nie zilustrowanych), na przykład wtyków znanych w stanie techniki. Odpowiednie łączniki ujawnione są we współbieżącym zgłoszeniu nr 09/399 512, złożonym 20 września 1999 oraz zgłoszeniu nr 60/345 743, złożonym 4 stycznia 2002.

Immunosensor 20, 100 działa przy zastosowaniu metody detekcji innej niż detekcja elektrochemiczna, wobec czego materiały, z których wykonany jest sensor, nie muszą być materiałami rezystywnymi. Jednakże, opisane wyżej materiały polimerowe są korzystne do zastosowania w immunosensorach z korzystnych przykładów wykonania, że względu na łatwość ich obróbki, niski koszt i brak reaktywności z reagentami i próbkami.

PL 216 216 B1

Detekcja optyczna

W alternatywnym przykładzie wykonania, wykorzystywany jest raczej optyczny niż elektrochemiczny system detekcji. Według tego alternatywnego przykładu wykonania, elektrody nie są konieczne, zaś do analizy światła, transmitowanego lub odbitego od roztworu w komorze detekcji, wykorzystywane są zewnętrzne źródło światła i fotokomórka. W jednym przykładzie wykonania korzystne jest przepuszczenie światła przez wierzchnią powierzchnię sensora, a następnie przez próbkę, gdzie jest ono odbijane od dolnej warstwy sensora, po czym jest przepuszczane z powrotem poprzez próbkę i warstwę wierzchnią, gdzie jest wykrywane. W innym przykładzie wykonania, światło naświetlane jest przez bok komory detekcji i jest odbijane w całkowitym wewnętrznym odbiciu pomiędzy powierzchniami czołowymi komory detekcji, aż przejdzie ono przez drugą stronę komory detekcji, gdzie jest wykrywane. W tych przykładach wykonania, warstwy powyżej, z boku i/lub poniżej komory detekcji są zasadniczo przezroczyste dla analizowanego światła, które przeszło przez tę warstwę lub warstwy. Do zastosowania z immunosensorami według korzystnych przykładów wykonania z wykorzystaniem systemów detekcji wizualnej wykorzystane mogą zostać techniki, opisane we współbieżącym zgłoszeniu nr 09/404 119, złożonym 23 września 1999. Ewentualnie, w pewnych przykładach wykonania korzystne może być zastosowanie kombinacji detekcji elektrochemicznej i optycznej, co również opisane jest w zgłoszeniu nr 09/404 119.

Reagenty i inne materiały obecne w immunosensorze

Reagenty, przeznaczone do zastosowania w komorze reakcyjnej, na przykład immobilizowane przeciwciało, kompleks pseudo-antygenu-sondy, bufor, mediator i tym podobne, mogą być naniesione na ścianach komory reakcyjnej lub na ścianach komory detekcji, na niezależnym substracie, znajdującym się wewnątrz komór, w matrycy lub też mogą one być samonośne. Jeśli reagenty te mają spoczywać na ścianach komory lub elektrodach, chemikalia te zastosowane mogą zostać za pośrednictwem użycia dobrze znanych w technice technologii nadrukowywania, na przykład drukowania strumieniowego, sitodruku, pokrywania szczelinowego, litografii i tym podobnych. W korzystnym przykładzie wykonania, roztwór, zawierający reagent nanoszony jest na powierzchnię wewnątrz komory i pozostawiany do wyschnięcia.

Zamiast immobilizowania lub suszenia reagentów lub innych środków chemicznych na powierzchniach komory reakcyjnej lub komory detekcji, korzystne może być osadzenie ich lub umieszczenie wewnątrz jednego lub większej liczby niezależnych substratów, które są następnie umieszczane w komorze. Do odpowiednich niezależnych substratów należą, ale bez ograniczenia, materiały usieciowane, materiały włókniste, makroporowate membrany, spiekane proszki, żele lub perły. Do zalet niezależnych podłoża należą większe pole powierzchni, pozwalające, jeśli to konieczne, na umieszczenie w komorze reakcyjnej większej ilości przeciwciała i kompleksu pseudo-antygenu-sondy. W takim przykładzie wykonania, przeciwciało związane z kompleksem pseudo-antygenu-sondy jest suszone na kawałku materiału porowatego, który jest następnie umieszczany w komorze reakcyjnej. Łatwiejsze jest również podczas fabrykacji wymycie niezwiązanego białka z niezależnych substratów, takich jak perły, w porównaniu z wypłukiwaniem niezwiązanych białek z powierzchni komory reakcyjnej.

W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania, przeciwciało związane z kompleksem pseudo-antygenu-sondy, osadzone jest na perłach. Perły takie mogą zawierać materiał polimerowy, na przykład lateks lub agarozę, ewentualnie otaczając materiał magnetyczny (taki jak gamma Fe2O3 i Fe3O4). Materiał perły jest tak dobrany, że powstaje odpowiedni substrat dla przeciwciała. Do odpo_® wiednich pereł należeć mogą perły sprzedawane pod nazwą DYNABEADS^® przez Dynal Biotech z Oslo, Norwegia. Ewentualnie, w mierniku może być obecny magnes, służący do utrzymywania pereł magnetycznych w komorze reakcyjnej i do powstrzymania ich ruchu do komory detekcji.

W jeszcze innym przykładzie wykonania, ściany komory reakcyjnej są porowate, z antyciałem związanym z kompleksem pseudo-antygenu-sondy, obecnym w porach. W tym przykładzie wykonania, płynna próbka ma zdolność wsączania się do wnętrza porowatej ściany, ale nie wyciekania z określonego obszaru. Osiągane jest to poprzez użycie makroporowatej membrany w celu utworzenia ściany komory reakcyjnej i ściśnięcia tej membrany wokół komory reakcyjnej w celu zapobieżenia wyciekowi płynnej próbki poza pożądany obszar, jak opisano w zgłoszeniu US nr 5 980 709 na rzecz Hodges i inni.

Do odpowiednich niezależnych substratów, takich jak perełki, materiały usieciowane, arkusze włókniny oraz materiały włókniste, należą poliolefiny, poliestry, nylony, celulozy, polistyreny, poliwęglany, polisulfony, ich mieszaniny i tym podobne. Odpowiednie membrany makroporowate mogą być

PL 216 216 B1 przygotowane z materiałów polimerowych, obejmujących polisulfony, dwufluorki poliwinylidenu, nylony, octany celulozy, polimetakrylany, poliakrylany, ich mieszaniny i tym podobne.

Przeciwciało związane z kompleksem pseudo-antygenu-sondy może znajdować się wewnątrz matrycy, na przykład polioctanu winylu. Poprzez zmianę rozpuszczalności matrycy w próbce może zostać osiągnięte kontrolowane uwalnianie białka lub przeciwciała do próbki.

Jak zilustrowano na fig. 2, w komorze detekcji 28 mogą być opcjonalnie umieszczone suszone reagenty 64. Reagenty te mogą zawierać substrat enzymu (wykorzystywany jako sonda) oraz mediator, zdolny do reagowania z enzymatyczną częścią sondy pseudo-antygenu-enzymu 50 w celu wytworzenia wykrywalnego sygnału. Substrat enzymu i mediator, jeżeli są obecne, muszą występować w ilości wystarczającej, aby szybkość reakcji każdego enzymu, występującego w substracie enzymu 64 określana była przez ilość obecnego enzymu. Przykładowo, jeżeli enzymem jest oksydaza glukozowa lub dehydrogenaza glukozowa, to w komorze detekcji 28 umieszczony jest odpowiedni mediator enzymu 64 oraz glukoza (jeżeli jeszcze nie znajduje się w próbce).

W przykładzie wykonania, w którym wykorzystywany jest system detekcji elektrochemicznej, odpowiednim mediatorem jest cyjanożelazian. Do innych odpowiednich mediatorów należą dichlorofenolindefenole i kompleksy między metalami przejściowymi a cząstkami heteroatomowymi zawierającymi azot. Jeżeli jest to niezbędne, może być również obecny bufor, służący do dopasowania wartości współczynnika pH próbki w komorze detekcji 28. Reagenty 64 w postaci glukozy, mediatora i bufora występują w ilościach wystarczających, aby szybkość reakcji enzymu z substratem enzymu 64 ograniczona była tylko przez stężenie obecnego enzymu.

Wewnętrzna powierzchnia 40 substratu 42, która tworzy podstawę komory reakcyjnej 22, pokryta jest kompleksem pseudo-antygenu-sondy 50, związanym z przeciwciałami 44 wykrywanymi w próbce antygenu. Przeciwciała 44 są absorbowane lub w inny sposób immobilizowane na powierzchni 40 substratu 42 tak, iż podczas testu nie są one usuwane z substratu 42. Ewentualnie, w trakcie nanoszenia lub po naniesieniu przeciwciał 44 na wewnętrzną powierzchnię 40 substratu 42, naniesiony może zostać pewien środek (nie pokazany), służący do zapobieżenia nie-specyficznemu wiązaniu białek do tej powierzchni. Dobrze znanym przykładem takiego środka jest albumina surowicy wołu (BSA). W charakterze takiego środka zastosowany może być również niejonowy środek po_® wierzchniowo czynny, na przykład TRITON^® X100, wytwarzany przez Rohm & Haas z Filadelfii, stan _®

Pensylwania lub TWEEN^® produkcji ICI Americas z Wilmington, Delaware. Wybrany środek powierzchniowo czynny nie powoduje denaturacji białka. W momencie gotowości do zastosowania w teście, powłoka 44 na wewnętrznej powierzchni 40 substratu 42 jest w stanie suchym.

W korzystnych przykładach wykonania, w których wykorzystywana jest detekcja elektrochemiczna, w charakterze sondy stosowane mogą być enzymy. Do przykładów odpowiednich enzymów należą, ale bez ograniczania, peroksydaza chrzanowa, oksydaza glukozowa oraz dehydrogenaza glukozowa, na przykład PQQ dehydrogenaza glukozowa zależna od NAD (dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy) lub PQQ (pirolochinolinochinon).

Sondą może być również kofaktor enzymu. Do przykładów odpowiednich kofaktorów należą, ale bez ograniczenia, mononukleotyd flawinowy, dwunukleotyd fIawinoadeninowy, dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy lub pirolochinolinochinon. Kofaktor jest korzystnie związany z antygenem za pośrednictwem elastycznego dystansownika w celu umożliwienia kofaktorowi związanie z apoenzymem. Gdy sondą jest kofaktor, wówczas apoenzym może być opcjonalnie suszony razem z substratem enzymu i mediatorem w komorze reakcyjnej.

Sondą może być również regulator aktywności enzymu. Do przykładów odpowiednich regulatorów enzymów należą, ale bez ograniczenia, kinazy lub fosforylazy. Regulatory enzymów mogą zmieniać aktywność enzymu poprzez zmianę stanu fosforylacji, metylacji, adenylacji, urydylacji lub adenosynodwufosforanorybozylacji enzymu. Regulatory enzymu mogą zmieniać aktywność enzymu poprzez oderwanie peptydu od enzymu. Gdy sondą jest regulator enzymu, wówczas enzym suszony jest razem z substratem enzymu i mediatorem w komorze reakcyjnej.

Sondą może być również podjednostka białka, która stanowi część kompleksu wielu podjednostek. Przykładem takiej podjednostki białka jest jedna z podjednostek enzymu oksydazy cytochromowej.

Przeciwciało i kompleks pseudo-antygenu-sondy mogą zostać złożone razem przed wysuszeniem w komorze reakcyjnej. Warunki kompleksacji są tak dobrane, aby zminimalizować ilość swobodnego (niezłożonego) kompleksu pseudo-antygenu-sondy, gdyż cząstki te będą zwiększać sygnał tła w próbce. Ilość swobodnego przeciwciała również jest minimalizowana, gdyż będzie ono wiązało antygen i powstrzymywało go przed przemieszczeniem kompleksu pseudo-antygenu-sondy, zmniejsza16

PL 216 216 B1 jąc tym samym czułość testu. Przykładowo, możliwe jest zoptymalizowanie kompleksacji pseudoantygenu-sondy z przeciwciałami poprzez „zagęszczenie” roztworów obojętnymi makromolekułami, takimi jak glikol polietylenowy, który wyklucza objętość białek i zwiększa tym samym ich aktywność termodynamiczną oraz zwiększa powinowactwo ich wzajemnego wiązania, patrz na przykład Minton, Biopolymers, vol. 20, pp. 2093-2120 (1981).

Korzystne jest, aby przeciwciało było immobilizowane na perle, zanim zostanie skompleksowane z kompleksem pseudo-antygenu-sondą. Umożliwia to zajęcie wszystkich lokalizacji przeciwciał poprzez odsłonięcie ich na oddziaływanie wysokiego stężenia kompleksu pseudo-antygenu-sondy. Nadmiarowy kompleks pseudo-antygenu-sondy jest wtedy łatwo usuwany poprzez odwirowanie i przemycie pereł.

Taki immunosensor jest najbardziej czuły na stężenia antygenu od około 1 nM do około 10 μΜ (mikromoli). Dla antygenu o względnej masie molowej 100000 odpowiada to około 0,1 μg/mL (mikrogramów na mililitr) do około 1000 μg/ml. Jednakże, taki sensor może zostać zmodyfikowany (na przykład poprzez zmianę odległości między elektrodami lub poprzez zastosowanie innego kształtu impulsów napięcia) w celu wykrywania stężeń w zakresie 0,1 nM lub mniej do 0,1 mM lub więcej.

Granica wykrywalności próby określona jest przez stężenie kompleksu pseudo-antygenu-sondy/przeciwciała w komorze reakcyjnej. Wobec tego to stężenie molowe jest tak ustalane, aby odpowiadało oczekiwanemu zakresowi stężeń molowych antygenu, jakie spotykane są zwykle w danych próbkach. Przykładowo, stężenie białka C-reaktywnego, spotykanego zwykle w laboratorium, wynosi od około 10 nM do około 10 μΜ.

Do przykładów antygenów, które mogą być oznaczane, należą, ale bez ograniczenia, Alfafetoproteina, antygen carcinoembrionalny, białko C-reaktywne, troponina I (cardiac Troponin I), troponina T, naparstnica (Digoxin), ferrytyna, gamma-glutamylo-transferaza, glikowana hemoglobina, glikowana proteina, wirusowe zapalenie wątroby A, B i C, ludzka gonadotropina kosmówkowa, ludzki wirus upośledzenia odporności, insulina, białko amyloidowe surowicy A, tromboblastina, antygen gruczołu krokowego, protrombina, tyroksyna, antygen nowotworowy CA125, antygen nowotworowy CA15-3, antygen nowotworowy CA27/29, antygen nowotworowy CA19-9, a także antygen nowotworowy NMP22.

Sensory według korzystnych przykładów wykonania nie są ograniczone do oznaczania antygenów ludzkich, ale nadają się także do zastosowań weterynaryjnych lub rolniczych. Ponadto, jeżeli antygen jest zbyt mały, aby mógł być immunogeniczny, wówczas może zostać przyłączony do nośnika, takiego jak hapten, jak również w ten sposób mogą zostać uniesione do niego przeciwciała. Dlatego też wynalazek nie jest ograniczony do oznaczania antygenów białek lub dużych molekuł, ale może być stosowany również w przypadku niewielkich antygenów.

Do przeciwciał, nadających się do wykorzystania w korzystnym przykładzie wykonania należą, ale bez ograniczenia, przeciwciała naturalne, jak IgG, IgM i IgA. Odpowiednie przeciwciała mogą być również wykonane z fragmentów przeciwciał naturalnych, takich jak F(ab)2 lub Fab. Przeciwciało może składać się z genetycznie modyfikowanych lub syntetycznych fragmentów przeciwciał naturalnych, takich jak cząstki scFv (single chain Fragment variable).

Przeciwciała mogą być kompleksowane do sond antygenu rodzimego lub do sond „pseudoantygenu”. Do przykładów pseudo-antygenów należą antygeny, pochodzące od innych gatunków. Przykładowo, jeśli oznaczane ma być ludzkie białko C-reaktywne, wówczas pseudo-antygenem może być białko C-reaktywne psie, kocie, końskie, bydlęce, owcze, świńskie lub ptasie. Pseudo-antygeny mogą być również wykonane poprzez modyfikację antygenu rodzimego. Przykładowo, jeśli oznaczane ma być ludzkie białko C-reaktywne, wówczas pseudo-antygenem może być monomerowa postać rodzimego pentameru lub białko C-reaktywne, którego grupy aminowe, karboksylowe, hydroksylowe, tiolowe czy dwusiarczkowe zostały zmodyfikowane chemicznie. Zastosowanie sensora do wykrywania obecności lub nieobecności antygenu

Sensor może być zastosowany do wykrywania obecności lub nieobecności antygenu w płynnej próbce w następujący sposób. Odwołując się do fig. 3 i 4, pas sensora 100 zawiera komorę reakcyjną 124 oraz komorę detekcji 132. Próbka wprowadzana jest do komory reakcyjnej 124 przez otwór 166 lub 168. Odległość między warstwami 116 i 156 oraz energia powierzchniowa ich wewnętrznych powierzchni jest taka, że płynna próbka zostanie wciągnięta do komory reakcyjnej 124 przez siły kapilarne. Komora reakcyjna 124 zawiera przeciwciała 164, immobilizowane na wewnętrznej powierzchni 126 komory reakcyjnej 124. Z przeciwciałami 164 związane są kompleksy pseudo-antygenu-sondy 162 tak, iż zasadniczo wszystkie lokalizacje rozpoznania przeciwciał dla antygenu są

PL 216 216 B1 zablokowane przez kompleks pseudo-antygenu-sondy 162. W tym przykładzie wykonania sondą jest enzym.

Na figurze 4 przedstawione przeciwciało jest położone tylko na jednej powierzchni 126 komory reakcyjnej 124, ale może ono być powleczone na więcej niż tylko jednej powierzchni 126 komory reakcyjnej 124 lub też może być położone na niezależnym podłożu (nie pokazanym), które znajduje się w komorze reakcyjnej 124. Jednakże, dla większej łatwości wytwarzania, korzystne jest, aby przeciwciała 164 położone były na jednej części komory reakcyjnej 124 lub na jednym materiale podłoża. Gdy W celu immobilizowania przeciwciał 164 stosowane jest podłoże niezależne, to podłoże jest tego rodzaju, że w trakcie testu nie wchodzi ono do komory reakcyjnej 132. Może to zostać osiągnięte na przykład poprzez przyklejenie podłoża do przynajmniej jednej powierzchni 126 komory reakcyjnej 124 lub poprzez dobór wielkości lub kształtu podłoża tak, aby nie mogło ono przejść przez kanał próbki 134 do komory detekcji 132 lub też poprzez dobór podłoża o gęstości wystarczającej, aby pozostało ono na dolnej powierzchni 126 komory reakcyjnej 124, gdy płynna próbka jest przenoszona do komory detekcji 132.

Gdy płynna próbka wypełnia komorę reakcyjną 124, wówczas sonda pseudo-antygenowo-enzymowa 162, związana z przeciwciałem 164 wchodzi w styczność z próbką i niewielka część kompleksu pseudo-antygenu-sondy dysocjuje od przeciwciała 164 do próbki. Następnie, pozostawia się wystarczającą ilość czasu na ustalenie równowagi między związaną i niezwiązaną sondą pseudo-antygenowo-enzymową 162. Jeśli antygen jest obecny w próbce, wówczas antygen, który wiąże się z przeciwciałem 164 silniej niż sonda pseudo-antygenowo-enzymowa 162, w końcu wypiera sondę pseudo-antygenowo-enzymową 162. Każdy antygen, który zwiąże się z immobilizowanym przeciwciałem 164 spowoduje wyparcie jednej sondy pseudo-antygenowo-enzymowej 162 do roztworu.

Koniec etapu reakcji stanowi określony okres czasu po wprowadzeniu próbki do komory reakcyjnej 124. Ów określony okres czasu jest tak ustalony, że jest wystarczający, aby całość antygenu, zawartego w płynnej próbce, wyparła sondę pseudo-antygenowo-enzymową 162 w celu związania się z przeciwciałem 164. Ewentualnie, może zostać określony czas, po jakim znana część antygenu spowoduje wyparcie sondy pseudo-antygenowo-enzymowej 162 w celu związania się z przeciwciałem 164.

Moment, w którym płynna próbka wprowadzana jest do komory reakcyjnej 124 może być wskazany przez użytkownika, na przykład poprzez wciśnięcie przycisku na mierniku (nie pokazany), połączonym z sensorem 100. Czynność ta jest wykorzystywana do uruchomienia urządzenia odmierzającego czas (nie zilustrowane). W przypadku detekcji wizualnej nie jest potrzebny żaden miernik. W takim przykładzie wykonania użytkownik dokonuje pomiaru czasu reakcji ręcznie.

W przypadku stosowania detekcji elektrochemicznej w celu wykrycia wyniku immunoreakcji, może zostać zautomatyzowane wskazanie faktu wprowadzenia płynnej próbki do komory reakcyjnej 124. Jak opisano powyżej, gdy próbka wypełnia komorę reakcyjną 124, to tylko niewielka część komory detekcji 132 przy otworze 140, prowadzącym do komory reakcyjnej 124, zostanie zwilżona przez próbkę. W przypadku stosowania detekcji elektrochemicznej, w komorze detekcji 132 obecne będą przynajmniej dwie elektrody (nie zilustrowane). Jeśli elektrody te (nie zilustrowane) umieszczone są w komorze detekcji 134 tak, iż przynajmniej część każdej z elektrod (nie zilustrowana) ma styczność z próbką podczas napełniania komory reakcyjnej 124. Obecność próbki powoduje zmostkowanie elektrod (nie zilustrowanych) i powstanie sygnału elektrycznego, który może być wykorzystany do włączenia urządzenia mierzącego czas.

Po upływie określonego okresu czasu od momentu włączenia urządzenia mierzącego czas, albo przez użytkownika albo automatycznie, faza immunoreakcji w teście zostaje uznana za zakończoną. Po zakończeniu fazy immunoreakcji, otwierany jest otwór wentylacyjny 158 prowadzący do atmosfery. Przykładowo, w celu przebicia warstwy 156 i/lub warstwy 116 lub też dodatkowo warstw 114 i 44, otwierając w ten sposób dalszy koniec 152 komory detekcji 132 do atmosfery, zastosowana może być igła aktywowana przez cewkę. Przebicie to może być wykonywane automatycznie przez miernik, jak w przykładzie powyżej lub manualnie przez użytkownika w przypadku detekcji wizualnej, gdzie może nie być używany żaden miernik, na przykład użytkownik umieszcza igłę wskroś warstw 156, 116, 114 i/lub 144 do komory detekcji 132, tworząc tym samym otwór wentylacyjny 158.

Otwarcie otworu wentylacyjnego 158 do atmosfery pozwala na ucieczkę powietrza uwięzionego w komorze detekcji 132, co umożliwia wypełnienie komory detekcji 132 przereagowaną próbką z komory reakcyjnej 124. Przereagowana próbka zostanie wciągnięta do komory detekcji 132 w wyniku zwiększonej siły kapilarnej w komorze detekcji 132 w porównaniu z komorą reakcyjną 124. W korzystnym przykładzie wykonania, zwiększona siła kapilarna uzyskiwana jest poprzez odpowiednie pokrycie

PL 216 216 B1 powierzchni 138 i 160 komory detekcji 132 lub jeszcze korzystniej, poprzez wybór mniejszej odległości kapilarnej dla komory detekcji 132 niż dla komory reakcyjnej 124. W tym przykładzie wykonania odległość kapilarna zdefiniowana jest jako najmniejszy wymiar komory.

Po napełnieniu komory detekcji 132, reagenty 172 ulegają rozpuszczeniu w płynnej próbce. Enzymatyczny składnik warstwy reagentowej 172 reaguje z substratam enzymu i mediatorem w celu wytworzenia zredukowanego mediatora. Ten zredukowany mediator jest utleniany elektrochemicznie na elektrodzie (nie pokazanej), działającej w charakterze anody w komorze detekcji 134 w celu wytworzenia prądu elektrycznego. W jednym przykładzie wykonania szybkość zmiany natężenia tego prądu w czasie wykorzystywana jest jako wskaźnik obecności i ilości enzymu, który jest obecny w przereagowanej próbce. Jeżeli szybkość zmian prądu jest mniejsza od pewnej wartości progowej (biorąc pod uwagę, że część sondy pseudo-antygenowo-enzymowej 162 jest uwalniana do roztworu w stanie równowagi dynamicznej, ustalonej pomiędzy swobodną a związaną sondą pseudo-antygenowo-enzymową 162). Oznacza to, że w przereagowanej próbce nie występuje znacząca ilość sondy pseudo-antygenowo-enzymowej 162, co wskazuje na nieobecność antygenu w próbce oryginalnej. Jeżeli szybkość zmian natężenia prądu jest większa niż szybkość progowa, stanowi to wskazanie, że w przereagowanej próbce obecna jest sonda pseudo-antygenowo-enzymowa 162 w ilości większej niż wartość progowa, a więc że w oryginalnej próbce obecny był także antygen. W jednym przykładzie wykonania, szybkość zmian natężenia prądu wykorzystywana jest do uzyskania miary względnej ilości antygenu obecnego początkowo w próbce.

Powyższy opis ujawnia kilka sposobów i urządzeń według niniejszego wynalazku. Wynalazek obejmuje rozmaite modyfikacje sposobów i materiałów, jak też zmiany sposobów wytwarzania i wyposażenia. Modyfikacje takie staną się oczywiste dla znawcy tej dziedziny techniki na podstawie rozważań nad zawartością niniejszego ujawnienia lub praktycznego stosowania ujawnionego wynalazku. W konsekwencji, wynalazek nie ma być w zamierzeniu ograniczony do szczególnych, ujawnionych tutaj przykładów wykonania, ale ma obejmować także wszystkie modyfikacje i odmiany, leżące w zakresie i w ramach idei wynalazku, zgodnie z załączonymi zastrzeżeniami. Wszystkie patenty, zgłoszenia i inne cytowane tutaj przypisy są tym samym włączone w całość poprzez odniesienie.

Claims (38)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Urządzenie jednorazowego użytku, przeznaczone do wykrywania antygenu docelowego w płynnej próbce, zawierające komorę reakcyjną, która jest połączona płynowo z komorą detekcji, przy czym ta komora reakcyjna posiada wlot płynnej próbki, zaś pomiędzy komorą reakcyjną a komorą detekcji znajduje się kanał przepustowy płynnej próbki, umożliwiający przemieszczanie płynnej próbki z komory reakcyjnej do komory detekcji poprzez oddziaływanie kapilarne, przy czym w komorze reakcyjnej znajduje się immobilizowane przeciwciało, przytwierdzone wewnątrz tej komory reakcyjnej, a ponadto w komorze reakcyjnej znajduje się kompleks reporterowy zawierający sondę związaną z antygenem kompleksu reporterowego, znamienne tym, że znajdujący się w komorze reakcyjnej (22, 124) antygen kompleksu reporterowego (50, 162) wybrany z grupy zawierającej antygen docelowy, pseudoantygen i zmodyfikowany antygen, a zwłaszcza wybrany z grupy zawierającej monomerowe białko C-reaktywne, białko C-reaktywne otrzymane od osobników innych niż człowiek, a także białko C-reaktywne modyfikowane chemicznie, gdzie powinowactwo białka C-reaktywnego modyfikowanego chemicznie z przeciwciałem jest mniejsze niż powinowactwo ludzkiego białka C-reaktywnego z tym przeciwciałem, jest związany z immobilizowanym przeciwciałem (44, 164), przy czym zastosowany antygen kompleksu reporterowego (50, 162) stanowi antygen, który słabiej wiąże się z immobilizowanym przeciwciałem (44, 164) niż antygen docelowy.
2. 2. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że sonda zawiera radioizotop, chromofor, fluorofor oraz enzym.
3. 3. Urządzenie według zastrz. 2, znamienne tym, że enzym zawiera dehydrogenazę glukozową.
4. 4. Urządzenie według zastrz. 2, znamienne tym, że zawiera ponadto substrat enzymu.
5. 5. Urządzenie według zastrz. 4, znamienne tym, że substrat enzymu stanowi substrat utlenialny.
6. 6. Urządzenie według zastrz. 4, znamienne tym, że substrat enzymu zawiera glukozę.
7. 7. Urządzenie według zastrz. 4, znamienne tym, że zawiera ponadto mediator.

   PL 216 216 B1
8. 8. Urządzenie według zastrz. 7, znamienne tym, że mediator jest wybrany z grupy, składającej się z dichlorofenolindofenolu, kompleksu między metalem przejściowym a heteroatomową cząstką zawierającą azot, a także cyjanożelaziany.
9. 9. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera ponadto bufor regulujący wartość pH płynnej próbki.
10. 10. Urządzenie według zastrz. 9, znamienne tym, że bufor zawiera fosforan lub melitan.
11. 11. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że sonda zawiera ponadto stabilizator, który stabilizuje przynajmniej jeden składnik, wybrany z grupy, składającej się z antygenu docelowego, antygenu kompleksu reporterowego, enzymu oraz immobilizowanego przeciwciała.
12. 12. Urządzenie według zastrz. 4, znamienne tym, że substrat enzymu znajduje się na wewnętrznej powierzchni komory detekcji (28, 132).
13. 13. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że immobilizowane przeciwciało (44, 164) znajduje się na wewnętrznej powierzchni komory reakcyjnej (22, 124).
14. 14. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera ponadto środek pomocniczy.
15. 15. Urządzenie według zastrz. 14, znamienne tym, że środek pomocniczy znajduje się wewnątrz komory detekcji (28, 132), zaś na środku pomocniczym lub wewnątrz niego znajduje się pierwsza substancja, wybrana z grupy, składającej się z substratu enzymu, mediatora oraz bufora.
16. 16. Urządzenie według zastrz. 14, znamienne tym, że środek pomocniczy znajduje się wewnątrz komory reakcyjnej (22, 124), zaś na środku pomocniczym lub wewnątrz niego znajduje się druga substancja, wybrana z grupy składającej się z immobilizowanego przeciwciała (44, 164), kompleksu reporterowego (50, 162) oraz czynnika, który zapobiega powstawaniu niespecyficznego wiązania białek z wewnętrzną powierzchnią komory reakcyjnej (22, 124).
17. 17. Urządzenie według zastrz. 15 albo 16, znamienne tym, że środek pomocniczy zawiera materiał wybrany z grupy, składającej się z materiału usieciowanego, włóknistego materiału wypełniającego, materiału porowatego, spiekanego proszku, membrany makroporowatej oraz materiału perlistego.
18. 18. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że komora detekcji (28, 132) zawiera pierwszą elektrodę (52) i drugą elektrodę (54).
19. 19. Urządzenie według zastrz. 18, znamienne tym, że przynajmniej jedna z elektrod (52, 54) zawiera materiał wybrany z grupy składającej się z aluminium, miedzi, niklu, chromu, stali, stali nierdzewnej, palladu, platyny, złota, irydu, węgla, węgla zmieszanego ze spoiwem, tlenku indu, tlenku cyny, polimeru przewodzącego oraz ich mieszaniny.
20. 20. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że ściana komory detekcji (28, 132) jest przezroczysta względem promieniowania emitowanego lub absorbowanego przez sondę, traktowanego jako wskaźnik obecności lub nieobecności kompleksu reporterowego (50, 162) w komorze detekcji (28, 132).
21. 21. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że komora reakcyjna (22, 124) zawiera detektor, który wykrywa stan, w którym ta komora reakcyjna (22, 124) jest zasadniczo wypełniona.
22. 22. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że antygen docelowy zawiera ludzkie białko C-reaktywne.
23. 23. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że ściana komory detekcji (28, 132) lub ściana komory reakcyjnej (22, 124) zawiera dodatkowo wypełniacz.
24. 24. Urządzenie według zastrz. 23, znamienne tym, że materiał wypełniacza jest wybrany z grupy składającej się z dwutlenku tytanu, węgla, krzemionki, szkła oraz mieszaniny dwóch lub więcej tych substancji z grupy.
25. 25. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że sonda zawiera kofaktor enzymu.
26. 26. Urządzenie według zastrz. 25, znamienne tym, że kofaktor enzymu jest wybrany z grupy składającej się z mononukleotydu flawinowego, dwunukleotydu flawinoadeninowego, dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego oraz pirolochinolinochinonu.
27. 27. Urządzenie według zastrz. 25, znamienne tym, że kofaktor enzymu jest związany z antygenem kompleksu reporterowego za pośrednictwem elastycznego dystansownika.
28. 28. Urządzenie według zastrz. 25, znamienne tym, że zawiera ponadto substrat enzymu.
29. 29. Urządzenie według zastrz. 25, znamienne tym, że sonda zawiera apoenzym.
30. 30. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że sonda zawiera regulator aktywności enzymu.
31. 31. Urządzenie według zastrz. 30, znamienne tym, że regulator aktywności enzymu zawiera kinazę lub fosforylazę.

    PL 216 216 B1
32. 32. Urządzenie według zastrz. 30, znamienne tym, że zawiera dodatkowo substrat enzymu.
33. 33. Urządzenie według zastrz. 30, znamienne tym, że zawiera dodatkowo enzym.
34. 34. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że sonda zawiera podjednostkę proteinową enzymu o wielu podjednostkach.
35. 35. Sposób wyznaczania ilości antygenu docelowego w płynnej próbce, polegający na umieszczaniu płynnej próbki w komorze reakcyjnej, w której znajduje się immobilizowane antyciało, przytwierdzone wewnątrz tej komory reakcyjnej oraz kompleks reporterowy, zawierający sondę oraz antygen kompleksu reporterowego, przy czym sonda jest związana z antygenem kompleksu reporterowego, poddawaniu części antygenu kompleksu reporterowego z immobilizowanego przeciwciała dysocjacji do płynnej próbki, wiązaniu części antygenu docelowego z immobilizowanym przeciwciałem, a następnie na kapilarnym przemieszczaniu płynnej próbki z komory reakcyjnej do komory detekcji i wreszcie na wyznaczaniu ilości kompleksu reporterowego zawartego w płynnej próbce, którą traktuje się jako wskaźnik ilości antygenu docelowego, obecnego początkowo w płynnej próbce, znamienny tym, że przed umieszczeniem płynnej próbki w komorze reakcyjnej powoduje się związanie zawartego w komorze reakcyjnej (22, 124) antygenu kompleksu reporterowego z immobilizowanym przeciwciałem (44, 164), przy czym stosuje się antygen kompleksu reporterowego, który słabiej wiąże się z immobilizowanym przeciwciałem (44, 164) niż antygen docelowy.
36. 36. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że etap kapilarnego przemieszczania płynnej próbki z komory reakcyjnej (22, 124) do komory detekcji (28, 32) zawiera etap przemieszczania płynnej próbki do ogniwa elektrochemicznego, które zawiera pierwszą elektrodę (52) i drugą elektrodę (54), zaś etap wyznaczania ilości kompleksu reporterowego (50, 162) w płynnej próbce obejmuje przykładanie różnicy potencjałów między pierwszą elektrodą (52) a drugą elektrodą (54) oraz pomiar natężenia prądu, który jest wskaźnikiem ilości kompleksu reporterowego (50, 162) obecnego w płynnej próbce.
37. 37. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że etap przemieszczania płynnej próbki z komory reakcyjnej (22, 124) do komory detekcji (28, 132) obejmuje stosowanie komory detekcji (28, 132), zawierającej część przepuszczalną dla promieniowania elektromagnetycznego.
38. 38. Sposób według zastrz. 37, znamienny tym, że w przypadku stosowania komory detekcji (28, 132) zawierającej część przepuszczalną dla promieniowania elektromagnetycznego, etap wyznaczania ilości kompleksu reporterowego (50, 162) w płynnej próbce zawiera etap wystawienia części przepuszczalnej dla promieniowania elektromagnetycznego na oddziaływanie promieniowania elektromagnetycznego, które przechodzi przez płynną próbkę lub odbija się od niej, a także etap monitorowania własności promieniowania elektromagnetycznego po jego przejściu przez płynną próbkę lub odbiciu się od niej, traktowanej jako wskaźnik ilości kompleksu reporterowego (50, 162) obecnego w płynnej próbce, którą z kolei traktuje się jako wskaźnik ilości antygenu docelowego obecnego początkowo w płynnej próbce.