PL212433B1 - Sekwencje nukleotydowe starterów specyficznych dla krańcowych rejonów badanego fragmentu DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy PCR za pomocą starterów specyficznych dla fragmentu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania sekwencji nukleotydowej fragmentu DNA (54) sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania markera DNA typu SCAR dla identyfikacjiroślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura, sposób identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura i zestaw testowy do identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura - Google Patents
Sekwencje nukleotydowe starterów specyficznych dla krańcowych rejonów badanego fragmentu DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy PCR za pomocą starterów specyficznych dla fragmentu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania sekwencji nukleotydowej fragmentu DNA (54) sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania markera DNA typu SCAR dla identyfikacjiroślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura, sposób identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura i zestaw testowy do identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności oguraInfo
- Publication number
- PL212433B1 PL212433B1 PL380290A PL38029006A PL212433B1 PL 212433 B1 PL212433 B1 PL 212433B1 PL 380290 A PL380290 A PL 380290A PL 38029006 A PL38029006 A PL 38029006A PL 212433 B1 PL212433 B1 PL 212433B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- gene
- rfo
- ogura
- dna
- restorer gene
- Prior art date
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims description 125
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 123
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 65
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 64
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title claims description 60
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims description 55
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 title claims description 37
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims description 24
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 title claims description 19
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 title claims description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 12
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 title claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 77
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 60
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 46
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 25
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 20
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 19
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 18
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 claims description 17
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 11
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 10
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 10
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 9
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 4
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 7
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 6
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 5
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 5
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 4
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 4
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N Aspoxicillin Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3[C@H](C(C)(C)S[C@@H]32)C(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC(=O)NC)=CC=C(O)C=C1 BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N 0.000 description 2
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000220259 Raphanus Species 0.000 description 1
- 235000019057 Raphanus caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000011380 Raphanus sativus Nutrition 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Sekwencje nukleotydowe starterów specyficznych dla krańcowych rejonów badanego fragmentu DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy PCR za pomocą starterów specyficznych dla fragmentu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania sekwencji nukleotydowej fragmentu DNA (54) sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania markera DNA typu SCAR dla identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura, sposób identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura i zestaw testowy do identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura
| (73) Uprawniony z patentu: | |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: | INSTYTUT HODOWLI I AKLIMATYZACJI ROŚLIN ODDZIAŁ W POZNANIU, Radzików, PL |
| 04.02.2008 BUP 03/08 | (72) Twórca(y) wynalazku: KATARZYNA MIKOŁAJCZYK, Poznań, PL IWONA BARTKOWIAK-BRODA, Poznań, PL MIROSŁAWA DABERT, Poznań, PL |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.10.2012 WUP 10/12 | JAN PODKOWIŃSKI, Poznań, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Aleksandra Twardowska |
PL 212 433 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sekwencje nukleotydowe starterów specyficznych dla krańcowych rejonów badanego fragmentu DNA, sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy PCR za pomocą starterów specyficznych dla fragmentu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania sekwencji nukleotydowej fragmentu DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania markera DNA typu SCAR dla identyfikacji roś lin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura, sposób identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura i zestaw testowy do identyfikacji ro ś lin rzepaku posiadają cych gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura, przeznaczone do stosowania w badaniach identyfikacji genotypów posiadających gen restorer Rfo, w procesach selekcyjnych umożliwiających identyfikację genotypów DNA rzepaku we wczesnych etapach rozwoju - zanim ujawnią się cechy fenotypowe oraz niezależnie od zmieniających się warunków środowiska oraz w analizach rutynowych dla potrzeb hodowli odmian mieszańcowych o określonych charakterystykach jak również poprawa plenności takich odmian rzepaku.
Rzepak ozimy (Brassica napus L.) jest jedną z głównych roślin oleistych strefy klimatu umiarkowanego. W Polsce powierzchnia jego uprawy stanowi około 97% powierzchni przeznaczonej pod uprawę roślin oleistych.
Nasiona rzepaku stanowią cenne źródło oleju, wykorzystywanego zarówno do celów spożywczych jak i przemysłowych, oraz śruty białkowej - stanowiącej wysokobiałkową paszę dla zwierząt. W związku z perspektywą wykorzystania oleju do produkcji biokomponentów biopaliw konieczna będzie, między innymi, poprawa plenności rzepaku.
Jedną z metod zwiększenia plonu jest hodowla odmian mieszańcowych wykorzystująca efekt heterozji występujący w wyniku zapylenia krzyżowego.
W Polsce, hodowla tego typu odmian prowadzona jest w oparciu o system genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności CMS ogura, który całkowicie zapewnia zapylenie obcym pyłkiem [Bartkowiak-Broda i wsp., 1979].
System przywracania męskiej płodności u roślin charakteryzujących się genowo-cytoplazmatyczną męską sterylnością CMS typu ogura wykryto u rzodkwi (Raphanus sativus L.) i przeniesiono do genotypu rzepaku na drodze krzyż owań mię dzygatunkowych [Heyn, 1976; Pelletier i wsp., 1987].
Cecha ta jest kodowana przez gen restorer (Rfo), który na drodze homeologicznej rekombinacji został włączony do genomu rzepaku [Delourme i wsp., 1998].
W procesie selekcyjnym korzystne jest stosowanie metod umoż liwiających identyfikację genotypów we wczesnych etapach rozwoju - zanim ujawnią się cechy fenotypowe oraz niezależnie od zmieniających się warunków środowiska.
Warunki te spełniają markery DNA, znacznie zwiększając efektywność selekcji w programach hodowlanych roślin uprawnych.
Do identyfikacji genotypów posiadających gen restorer stosowany jest od szeregu lat, między innymi w Instytucie Hodowli i Aklimatyzacji Roślin (IHAR) w Poznaniu, marker DNA OPC-021150, sprzężony całkowicie z genem Rfo [Delourme i wsp., 1994] i wykazujący na żelach agarozowych prążek polimorficzny o długości około 1150 par zasad (pz), specyficzny dla roślin posiadających gen restorer.
Został on wybrany spośród innych markerów DNA typu RAPD (ang. Randomly Amplified Polymorphic DNA) oraz wdrożony do analiz rutynowych dla potrzeb hodowli odmian mieszańcowych rzepaku w IHAR, Oddz. Poznań [Mikołajczyk i wsp., 1998].
W analizie metodą RAPD, wyizolowany z badanych roś lin genomowy DNA poddaje się łańcuchowej reakcji polimerazy reakcji PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) z zastosowaniem startera o dł ugoś ci 10 nukleotydów, o arbitralnie okreś lonej sekwencji.
Wymieniona łańcuchowa reakcja polimerazy PCR trwa 4,5 godziny, przy czym dla jej powtarzalnego przebiegu próba DNA jest wielokrotnie (od 10 do 200-krotnie i więcej) rozcieńczana.
W przeciwnym wypadku można nie uzyskać miarodajnych wyników, z powodu zahamowania aktywności enzymu katalizującego reakcję.
Produktami reakcji są, oprócz polimorficznego prążka sprzężonego z genem Rfo, również inne, niespecyficzne prążki.
PL 212 433 B1
Elektroforezę prowadzi się w 1,8% żelach agarozowych przez około 4 godz. aby umożliwić rozdzielenie blisko migrujących prążków, jak również rozróżnienie genotypów posiadających - lub nieposiadających genu Rfo.
Sekwencje nukleotydowe starterów specyficznych dla krańcowych rejonów badanego fragmentu DNA, sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, według wynalazku charakteryzuje się tym, że mają postać:
C-02_f1: 5' TGTAACATAAGAAACGCTTGGC 3'
C-02_rev1: 5' AAGGATCATTAAACGTCTTTAGGC 3'.
W sposobie amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla fragmentu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, według wynalazku, istota rozwią zania polega na tym, że stosuje się parę starterów posiadających następujące sekwencje nukleotydowe.
C-02 f1: 5' TGTAACATAAGAAACGCTTGGC 3'
C-02_rev1: 5' AAGGATCATTAAACGTCTTTAGGC 3' przy czym dla rozdziału produktów amplifikacji korzystnie stosuje się elektroforezę na żelu agarozowym.
Korzystnie rozdział fragmentu DNA podczas elektroforezy jak również podczas prób po reakcji PCR prowadzi się przy procentowości żelu agarozowego od 0,8-2,0%, przy czym elektroforezę korzystnie prowadzi się przez kilka godzin, przynajmniej przez 0,5 godziny.
Korzystnie jest także, gdy podczas reakcji PCR denaturację wstępną prowadzi się w temperaturze od 90 do 95°C w czasie od 1 min. do 5 min., denaturację właściwą w temperaturze od 90 do 95°C w czasie od 10 sek. do 30 sek. i więcej, przyłączanie startera w temp. od 50 do 65°C w czasie od 20 sek. do 1 min., elongację w temp. od 70 do 75°C w czasie od 1 min. do 3 min., elongację końcową w temp. od 70 do 75°C w czasie od 5 do 20 min., zaś po zakończeniu reakcji próby inkubuje się w temperaturze od 4 do 25°C do momentu wyjęcia ich z termocyklera, przy czym korzystnie wykonuje się do 45 cykli.
Również korzystnie jest, gdy, podczas reakcji PCR stosuje się zakresy stężeń i ilości poszczególnych składników, jak również objętość końcową reakcji jak poniżej.
Mg2+ w zakresie stężeń od 1,25 do 2,5 mM i wyższych, dNTPs - od 0,1 do 0,2 mM, startery w ilości od 1 pmola do 4 pmoli oraz polimerazę od 0,5 do 5 jednostek enzymatycznych (u) - na 25 μΐ objętości reakcji, przy czym objętość końcowa reakcji może wynosić od 10 do 100 pi.
Korzystnie także można również stosować dodatkowo w mieszaninie reakcyjnej związki chemiczne oraz białka podnoszące specyficzność reakcji oraz zwiększające specyficzność enzymu, takie jak: detergenty niejonowe, BSA, glicerol, DMSO i inne.
Według wynalazku identyfikację specyficznego produktu reakcji PCR dokonuje się korzystnie poprzez rozdział w żelu agarozowym oraz wizualizację poprzez barwienie bromkiem etydyny.
Zgodnie z istotą wynalazku przed analizą PCR stosuje się korzystnie co najwyżej kilkunastokrotne rozcieńczenie próbek DNA, jak również korzystnie stosuje się czas reakcji PCR poniżej 3 godzin, zaś czas elektroforezy znacznie poniżej 2 godzin.
W sposobie uzyskania sekwencji nukleotydowej fragmentu DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, według wynalazku istota rozwiązania polega na tym, fragment DNA zawarty w polimorficznym prążku znanego markera DNA typu RAPD OPC-021150, sprzężonego z genem restorerem Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności typu ogura, przygotowuje się do sekwencjonowania korzystnie poprzez wycięcie fragmentu żelu zawierającego ten polimorficzny prążek, odzyskuje się DNA poprzez elucję DNA oraz jego ponowną amplifikację w reakcji PCR z zastosowaniem startera RAPD OPC-02 o następującej sekwencji nukleotydowej: 5'GTGAGGCGTC 3', przy podwyższonej temperaturze przyłączania startera, przy czym dla uzyskania
PL 212 433 B1 jednorodnego produktu reakcji czynności te powtarza się kilkukrotnie, po czym tak otrzymany fragment DNA wklonowuje się do plazmidu, a następnie plazmidowy DNA zawierający insert pC-02 sekwencjonuje się, po czym odczytuje się wyniki sekwencjonowania uzyskując sekwencję nukleotydową rejonu genomowego DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, przedstawioną na Fig. 3.
W sposobie uzyskania markera DNA typu SCAR dla identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura, według wynalazku istota rozwiązania polega na tym, że marker DNA typu RAPD OPC-021150, sprzężony z genem restorerem Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności typu ogura przekształca się w odpowiadający mu marker typu SCAR w ten sposób, że na podstawie odczytanej uzyskanej sekwencji nukleotydowej rejonu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo przedstawionej na Fig. 3, projektuje się startery specyficzne dla krańcowych regionów sekwencji badanego fragmentu DNA, mające postać
C-02_f1: 5' TGTAACATAAGAAACGCTTGGC 3'
C-02_rev1: 5' AAGGATCATTAAACGTCTTTAGGC 3' i wraz sekwencją nukleotydową rejonu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo stanowią ce marker SCAR odpowiadający markerowi RAPD OPC-02.
W sposobie identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowocytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura, na podstawie polimorfizmu fragmentu DNA badanej próbki, który to fragment powiela się w reakcji łańcuchowej polimerazy PCR z wykorzystaniem pary odpowiednich oligonukleotydowych starterów zdolnej do wykrycia tego polimorfizmu, znamienny tym, że jako startery wykrywające ten polimorfizm stosuje się parę oligonukleotydowych starterów o sekwencjach
C-02_f1: 5' TGTAACATAAGAAACGCTTGGC 3'
C-02_rev1: 5' AAGGATCATTAAACGTCTTTAGGC 3' stanowiących, wraz sekwencją nukleotydową rejonu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo, marker SCAR odpowiadający markerowi RAPD OPC-021150, przy czym wymieniony fragment DNA wykazujący polimorfizm powiela się przy użyciu tych starterów prowadząc amplifikację fragmentu genomowego DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo, przy odpowiednim składzie mieszaniny reakcyjnej i zdefiniowanych warunkach reakcji, zaś produkty reakcji analizuje się dostępnymi sposobami, korzystnie stosując elektroforezę w żelach agarozowych, zaś uzyskiwane po wizualizacji charakteryzujące te produkty prążki archiwizuje się i poddaje się analizie, uzyskując specyficzny produkt stanowiący marker SCAR dla genu restorera Rfo dla fragmentu DNA rośliny posiadającej gen restorer Rfo, oraz brak takiego produktu dla fragmentu DNA rośliny nie posiadającej genu restorera Rfo.
Korzystnie elektroforezę dla rozdziału fragmentu DNA jak również podczas prób po reakcji PCR prowadzi się przy procentowości żelu agarozowego od 0,8-2,0%, przy czym elektroforezę korzystnie prowadzi się przez kilka godzin, przynajmniej przez 0,5 godziny.
Korzystnie jest także, gdy podczas reakcji PCR denaturację wstępną prowadzi się w temperaturze od 90 do 95°C w czasie od 1 min. do 5 min., denaturację właściwą w temperaturze od 90 do 95°C w czasie od 10 sek. do 30 sek. i wię cej, przyłączanie startera w temp. od 50 do 65°C w czasie od 20 sek. do 1 min., elongację w temp. od 70 do 75°C w czasie od 1 min. do 3 min., elongację końcową w temp. od 70 do 75°C w czasie od 5 do 20 min., zaś po zakoń czeniu reakcji próby inkubuje się w temperaturze od 4 do 25°C do momentu wyjęcia ich z termocyklera, przy czym korzystnie wykonuje się do 45 cykli.
Również korzystnie jest, gdy, podczas reakcji PCR stosuje się zakresy stężeń i ilości poszczególnych składników, jak również objętość końcową reakcji jak poniżej:
Mg2+ w zakresie stężeń od 1,25 do 2,5 mM i wyższych, dNTPs - od 0,1 do 0,2 mM, startery w ilości od 1 pmola do 4 pmoli oraz
PL 212 433 B1 polimerazę od 0,5 do 5 jednostek enzymatycznych (u) - na 25 μΐ objętości reakcji, przy czym objętość końcowa reakcji może wynosić od 10 do 100 pi.
Korzystnie także można również stosować dodatkowo w mieszaninie reakcyjnej związki chemiczne oraz białka podnoszące specyficzność reakcji oraz zwiększające specyficzność enzymu, takie jak detergenty niejonowe, BSA, glicerol, DMSO i inne.
Zgodnie z istotą wynalazku przed analizą PCR stosuje się korzystnie co najwyżej kilkunastokrotne rozcieńczenie próbek DNA, jak również korzystnie stosuje się czas reakcji PCR poniżej 3 godzin, zaś czas elektroforezy znacznie poniżej 2 godzin.
Zestaw testowy do identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura, zawierający nośnik, startery o określonych sekwencjach nukleotydowych, enzym polimerazę oraz odczynniki do amplifikacji fragmentów DNA poprzez prowadzenie reakcji PCR, kontrolne próbki DNA z roślin rzepaku posiadających gen Rfo oraz nie posiadających tego genu, oraz ewentualnie instrukcję, według wynalazku charakteryzuje się tym, że jako startery zawiera startery, których sekwencje nukleotydowe mają postać:
C-02_f1: 5' TGTAACATAAGAAACGCTTGGC 3'
C-02_rev1: 5' AAGGATCATTAAACGTCTTTAGGC 3' umieszczone w odrębnych pojemniczkach, korzystnie w postaci liofilizowanej, a nadto standardowy osprzęt do przeprowadzenia testu.
W rozwiązaniach według wynalazków wykorzystano znany dotychczas marker RAPD OPC021150, sprzężony z genem restorerem Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności typu ogura - przekształcając go w bardziej efektywny, odpowiadający mu marker typu SCAR.
Uzyskiwane z użyciem markera SCAR wyniki są jednoznaczne: analiza DNA roślin posiadających gen Rfo wykazuje produkt specyficzny dla tej cechy, natomiast dla roślin nieposiadających tego genu wynik jest negatywny - brak produktu.
Analiza przeprowadzana zgodnie z wynalazkiem jest bardziej korzystna niż analiza RAPD. Przede wszystkim nie wymaga wielokrotnego, jak w przypadku analizy RAPD, rozcieńczania próbek DNA.
Dla analizy SCAR według wynalazku wystarczające jest co najwyżej kilkunastokrotne rozcieńczenie, zaś podczas analizy RAPD często konieczne jest dalsze rozcieńczanie, ponieważ w mało specyficznych warunkach reakcji zanieczyszczenia mogą hamować aktywność enzymu polimerazy Taq.
Kolejnym elementem decydującym o większej efektywności markera SCAR jest czas łańcuchowej reakcji polimerazy PCR w termocyklerze.
Dla reakcji łańcuchowej reakcji polimerazy PCR z RAPD jest on znacznie dłuższy, natomiast reakcji łańcuchowej reakcji polimerazy PCR dla opracowanego markera SCAR może być ograniczony prawie do połowy.
Ponadto, krótszy jest też dla markera SCAR czas elektroforezy, który dla markera dla RAPD jest kilkukrotnie większy.
Wiąże się z tym również efektywność wykorzystania żelu agarozowego - w tej samej objętości przygotowanego żelu można przeanalizować przynajmniej dwukrotnie więcej próbek DNA.
Wpływa to na, przynajmniej ośmiokrotne skrócenie czasu analizy i wynikającą z tego oszczędność energii, jak również, co najmniej dwukrotnie mniejsze zużycie odczynnika - agarozy.
Biorąc pod uwagę wszystkie te elementy w powiązaniu ze znaczną ilością roślin analizowanych w każdym sezonie w procesie selekcyjnym - w rozwiązaniach według wynalazku uzyskuje się zwiększenie efektywności prowadzonych analiz, a przez to - większą skuteczność i obniżenie kosztów.
Przedmiot wynalazku został przedstawiony na poniżej opisanych przykładach realizacji objaśnionych rysunkiem, na którym:
- na Fig. 1 pokazany jest elektroforetyczny rozdział, w 1,8% żelach agarozowych, produktów reakcji PCR z zastosowaniem startera RAPD OPC-02;
- na Fig. 2 pokazano elektroforetyczny rozdział, w 1,8% żelu agarozowym fragmentu C-02 genomowego DNA o długości około 1500 par zasad, sprzężonego z genem Rfo, uzyskanego w wyniku reakcji reII-PCR;
PL 212 433 B1
- na Fig. 3 pokazano sekwencję nukleotydową fragmentu DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura, zawierającą sekwencje nukleotydowe zaprojektowanych starterów specyficznych dla krańcowych rejonów badanego fragmentu DNA, sprzężonego z genem restorerem Rfo.
- na Fig. 4 pokazano ilustrację obrazującą elektroforetyczny rozdział w 1,8% żelu agarozowym produktów reakcji PCR z zastosowaniem starterów specyficznych dla opracowanego markera SCAR C-02 dla genu Rfo.
- na Fig. 5 pokazano ilustrację obrazują c ą elektroforetyczny rozdział w 1,8% ż elu agarozowym, produktów reakcji PCR z zastosowaniem startera RAPD OPC-02.
- na Fig. 6 pokazano ilustrację obrazują c ą elektroforetyczny rozdział w 1,8% ż elu agarozowym, produktów reakcji PCR z zastosowaniem starterów specyficznych dla opracowanego markera SCAR C-02 dla genu Rfo.
Przykłady realizacji.
Sposób uzyskania sekwencji nukleotydowej fragmentu DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura.
a) otrzymanie polimorficznego prążka na żelu agarozowym, zawierającego fragment DNA sprzężony z genem restorerem Rfo.
Uzyskanie polimorficznego fragmentu DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo polegało na uzyskaniu polimorficznego prążka na żelu agarozowym, odzyskanie DNA przez elucję i zastosowanie jako matrycę w kolejnej reakcji PCR, czyli tzw. re-PCR.
W tym celu wyizolowano genomowy DNA z roś lin posiadają cych gen restorer stosują c metodę według Doyle'a [1990].
Jakość prób DNA oceniano stosując elektroforezę w 0,8% żelu agarozowym.
Próby DNA rozcieńczano, a następnie prowadzono reakcję PCR z zastosowaniem startera RAPD OPC-02, firmy Operon Technologies, o następującej sekwencji nukleotydowej:
5'GTGAGGCGTC3'.
Skład mieszaniny w 12,5 μΐ reakcji PCR z zastosowaniem startera RAPD OPC-02, sprzężonego z genem restorerem Rfo zastosowane w przykładzie, zostały przedstawione w poniższej tabeli 1 i są zgodne z opisanymi przez Delourme i wsp. [1994].
| objętość [pl] | Stężenie końcowe/ilość* | |
| H2O | 7,35 | do 10 pl |
| 10 x stężony bufor PCR | 1,25 | 1 x |
| MgCl2 25 mM | 0,95 | 1,9 mM |
| dNTPs 10 mM | 0,13 | 0,1 mM |
| Starter OPC-02 10 μM | 0,25 | 2,5 pmola* |
| Polimeraza Taq 5 u^l | 0,08 | 0.4 u * |
Reakcję prowadzono w termocyklerach Biometra UNO-thermoblock lub Eppendorf Mastercycler gradient, w następujących warunkach według Delourme i wsp. (1994):
denaturacja wstępna w 95°C przez 30 sek., a następnie 45 kolejnych cykli - denaturacja w 95°C przez 30 sek., przyłączanie startera w 35°C przez 1 minutę. Reakcję zatrzymano przez schłodzenie prób do 4°C. Czas reakcji w termocyklerze wynosił 4,5 godziny.
Produkty reakcji rozdzielano elektroforetycznie na 1,8% żelach agarozowych, przy napięciu prądu 100 V przez 4 godziny.
Wizualizacji prążków dokonywano poprzez barwienie w roztworze bromku etydyny o stężeniu 5 μg/ml przez kilkadziesiąt minut (około 0,5 godziny), a następnie odbarwiano w wodzie przez 0,5 godziny i analizowano w świetle UV na transiluminatorze UV firmy Biometra Tl 1.
PL 212 433 B1
Obrazy żeli archiwizowano z zastosowaniem systemu cyfrowego Kodak Digital Science™ DC40 camera.
W wyniku reakcji uzyskiwano amplifikowane fragmenty DNA jako prążki w żelu i wś ród nich prążek polimorficzny o długości około 1150 par zasad (pz), sprzężony z genem restorerem Rfo pokazany na Fig. 5 i stanowiący marker DNA typu RAPD dla tego genu [Delourme i wsp., 1994] - występujący u roślin posiadających gen restorer Rfo (R+).
Natomiast w przypadku analizy DNA z roślin rzepaku nie posiadających tego genu (R-) - produkt ten nie powstawał, z powodu braku fragmentu DNA sprzężonego z tą cechą, natomiast występowały inne, niespecyficzne prążki.
Na wymienionej wyżej Fig. 5 pokazany jest elektroforetyczny rozdział, w 1,8% żelach agarozowych, produktów reakcji PCR z zastosowaniem startera RAPD OPC-02;
R+ - oznacza DNA z roślin posiadających gen restorer (Rfo),
R- - DNA z roślin nie posiadających genu Rfo;
M - marker wielkoś ci - DNA faga λ hydrolizowany enzymami restrykcyjnymi Eco RI oraz Hind III;
Strzałką =>
oznaczono specyficzny prążek polimorficzny, sprzężony z genem Rfo.
b) przygotowanie fragmentu DNA zawartego w polimorficznym prążku, otrzymanym w doświadczeniu (a) do sekwencjonowania
DNA do sekwencjonowania uzyskano korzystnie poprzez wycięcie fragmentu żelu zawierającego polimorficzny prążek, elucję DNA oraz jego ponowną amplifikację w reakcji RAPD z zastosowaniem startera OPC-02, przy podwyższonej temperaturze przyłączania startera.
Dla uzyskania jednorodnego produktu czynności te powtórzono trzykrotnie.
Następnie, otrzymany fragment DNA wklonowano do plazmidu.
Na Fig. 2 pokazano elektroforetyczny rozdział, w 1,8% żelu agarozowym fragmentu C-02 genomowego DNA o długości około 1500 par zasad, sprzężonego z genem Rfo, uzyskanego w wyniku reakcji reII-PCR, w temperaturze przyłączania startera RAPD OPC-02 wynoszącej 63°C;
M - marker wielkości - DNA faga λ hydrolizowany enzymami restrykcyjnymi Eco RI oraz Hind ///; Strzałką oznaczono prążek DNA sprzężony z genem Rfo.
c) odczytanie sekwencji nukleotydowej fragmentu DNA sprzężonego z genem restorerem
Rfo i uzyskanego w reakcji RAPD z zastosowaniem startera OPC-02
Sekwencjonowanie badanego fragmentu DNA umożliwiło odczytanie jego sekwencji nukleotydowej pokazanej na Fig. 3 zawierającej sekwencję nukleotydową fragmentu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo.
Zaprojektowanie sekwencji nukleotydowej starterów specyficznych dla krańcowych rejonów badanego fragmentu DNA, sprzężonego z genem restorerem Rfo.
Na podstawie odczytanej sekwencji nukleotydowej badanego fragmentu DNA z Fig. 3 zaprojektowano startery specyficzne dla jego krańcowych rejonów i umożliwiające jego amplifikację w reakcji PCR.
Postać sekwencji nukleotydowych starterów specyficznych dla krańcowych rejonów fragmentu DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo zobrazowana jest poniżej:
C-02_f1: 5' TGTAACATAAGAAACGCTTGGC 3'
C-02_rev1: 5' AAGGATCATTAAACGTCTTTAGGC 3'
3. Sposób identyfikacji cechy występowania genu restorera Rfo
a) skład mieszaniny reakcyjnej
W tabeli 1 poniżej podany jest opracowany skład mieszaniny reakcyjnej do łańcuchowej reakcji polimerazy PCR z zastosowaniem zaprojektowanych starterów C-02_f1 i C-02_rev1, specyficznych dla opracowanego markera SCAR sprzężonego z genem Rfo.
PL 212 433 B1
T a b e l a. 1
Skład mieszaniny w 25 μΐ PCR z zastosowaniem zaprojektowanych starterów C-02_f1 i C-02 rev1, specyficznych dla opracowanego markera SCAR sprzężonego z genem Rfo.
| Składnik | Ilość [μΐ] użyta do reakcji | Stężenie końcowe [mM]/ilość* w objętości reakcji wynoszącej 25,0 μΐ |
| H2O | 10,03 | - |
| Bufor 10 x stężony | 2,5 | 1 x |
| Mg2+ 25 mM | 2 | 2 |
| dNTPs 10 mM | 0,38 | 0,15 |
| Starter C-02_f1 1 μΜ | 2,5 | 2.5 pmola* |
| Starter C-02_rev1 1 μΜ | 2,5 | 2.5 pmola* |
| polimeraza Taq 5 u/μΐ | 0,1 | 0,5 u* |
Warunki reakcji w termocyklerze dla uzyskania specyficznej amplifikacji fragmentu DNA, stanowiącego marker SCAR sprzężony z genem Rfo - z zastosowaniem zaprojektowanych starterów:
C-02_f1: 5' TGTAACATAAGAAACGCTTGGC 3'
C-02_rev1: 5' AAGGATCATTAAACGTCTTTAGGC 3' przedstawione zostały w poniższej tabeli 2.
Tab. 2 Warunki reakcji PCR prowadzonej w termocyklerze z zastosowaniem starterów C-02 f1 oraz C-02 rev1, w celu otrzymania markera SCAR dla genu Rfo rzepaku.
| Etap reakcji | Temperatura | Czas | |
| a) | denaturacja wstępna | 95°C | 2 min. 30 sek. |
| b) | 35 cykli: | ||
| denaturacja | 95°C | 30 sek. | |
| przyłączanie startera | 62°C | 30 sek. | |
| elongacja | 72°C | 1 min. 20 sek. | |
| c) | elongacja końcowa | 72°C | 7 min. |
| d) | zakończenie reakcji | 4°C |
Czas reakcji w termocyklerze wynosił 2 godz. 20 min. Produkty reakcji analizowano stosując elektroforezę w 1,8% żelach agarozowych, prowadząc rozdział przy napięciu prądu 100 V przez 1 godz.
Wizualizacji prążków dokonywano poprzez barwienie w roztworze bromku etydyny o stężeniu μg/ml przez kilkadziesiąt minut, a następnie odbarwiano w wodzie. Prążki analizowano w świetle UV.
W wyniku reakcji uzyskano specyficzny produkt - prążek w żelu agarozowym stanowiący marker SCAR dla genu restorera Rfo - w przypadku analizy DNA uzyskanego z roślin posiadających gen restorer, natomiast brak prążka - dla DNA roślin nie posiadających tego genu.
Efekt opisanego elektroforetycznego rozdziału pokazano na Fig. 4.
Ten rozdział nastąpił wskutek elektroforezy w 1,8% żelu agarozowym produktów reakcji PCR z zastosowaniem starterów specyficznych dla markera SCAR C-02 dla genu Rfo.
M - marker wielkości - DNA faga λ hydrolizowany enzymami restrykcyjnymi Eco RI oraz Hind III;
K1, k2 - reakcje kontrolne PCR RAPD OPC-02 z wykorzystaniem jako matryc DNA roślin, odpowiednio: nie posiadającej oraz posiadającej gen Rfo;
R-, R+ - reakcje PCR z zastosowaniem starterów specyficznych dla opracowanego markera SCAR przeprowadzone na matrycowym DNA z roślin, odpowiednio: nie posiadających oraz posiadających gen Rfo;
PL 212 433 B1
Strzałką oznaczono fragment genomowego DNA sprzężony z genem Rfo.
Przykłady zastosowania opracowanego markera SCAR dla genu restorera Rfo.
Dla przetestowania opracowanego marker SCAR według wynalazku wykonano analizy DNA roślin rzepaku równolegle dwoma markerami: RAPD OPC-02 oraz nowym markerem SCAR.
Łącznie zbadano 103 linie hodowlane rzepaku o różnym podłożu genetycznym, z których 96 posiadało gen Rfo, natomiast 7 - nie posiadało tego genu.
Jeśli badana linia posiadała gen Rfo - obie metody dawały wynik pozytywny. Jeśli nie - wtedy uzyskany obiema metodami wynik był negatywny.
Oznacza to, że marker SCAR jest ekwiwalentny w stosunku do markera RAPD OPC-02, można więc stosować je zamiennie.
Zilustrowano to na kolejnych Fig. 5 i Fig. 6 rysunku.
Elektroforetyczny rozdział, w 1,8% żelu agarozowym, produktów reakcji PCR z zastosowaniem odpowiednich starterów:
na Fig. 5 z zastosowaniem startera RAPD OPC-02 dla genu Rfo, na Fig. 6 z zastosowaniem starterów specyficznych dla opracowanego markera SCAR dla genu Rfo.
Na tych figurach poszczególne oznaczenia to:
M - marker wielkości - DNA faga λ hydrolizowany enzymami restrykcyjnymi Eco RI oraz Hind III; k1, k2 - reakcje kontrolne PCR RAPD OPC-02 z wykorzystaniem jako matryc DNA roślin, odpowiednio: nie posiadającej oraz posiadającej gen Rfo; kolejnymi numerami od 1 do 9 oznaczono preparaty genomowego DNA roślin rzepaku;
R-, R+ - rośliny nie posiadające lub posiadające gen Rfo;
Strzałką oznaczono fragment genomowego DNA sprzężony z genem Rfo.
Przykład zestawu testowego do identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura.
Zestaw testowy zawierał:
- noś nik, jakim jest korzystnie standardowy 10 x stężony bufor do reakcji PCR
- startery o sekwencjach:
C-02_f1: 5' TGTAACATAAGAAACGCTTGGC 3'
C-02_rev1: 5' AAGGATCATTAAACGTCTTTAGGC 3' umieszczone w osobnych pojemniczkach w postaci liofilizowanej,
- enzym polimeraza oraz odczynniki do amplifikacji fragmentów DNA, czyli prowadzenia reakcji PCR
- próbki DNA do reakcji kontrolnych z roś lin rzepaku posiadają cych gen Rfo oraz nie posiadają cych tego genu
- standardowy osprz ę t do przeprowadzenia amplifikacji DNA w reakcji ł a ńcuchowej polimerazy PCR oraz identyfikacji produktu specyficznego poprzez elektroforezę w żelu agarozowym
- instrukcję
Zalety nowo opracowanego markera SCAR dla genu Rfo w porównaniu ze stosowanym dotąd markerem RAPD OPC-02.
Uzyskany z użyciem starterów specyficznych dla opracowanego markera SCAR dla genu Rfo wynik jest jednoznaczny: analiza DNA roślin posiadających gen Rfo wykazuje produkt specyficzny dla tej cechy, natomiast dla roślin nieposiadających tego genu wynik jest negatywny - brak produktu.
Tego typu analiza jest bardziej korzystna niż analiza RAPD. Przede wszystkim nie wymaga wielokrotnego, jak w przypadku analizy RAPD, rozcieńczania próbek DNA.
Wystarczające jest dla analizy SCAR standardowe 10-krotne rozcieńczenie.
Natomiast podczas analizy RAPD często konieczne jest dalsze rozcieńczanie, ponieważ w mało specyficznych warunkach reakcji zanieczyszczenia mogą hamować aktywność enzymu - polimerazy Taq.
Drugim elementem decydującym o większej efektywności markera SCAR jest czas reakcji PCR w termocyklerze.
PL 212 433 B1
Dla reakcji RAPD wynosi on 4,5 godz., natomiast dla opracowanego markera SCAR - 2 godz. 20 min. Ponadto, krótszy jest czas elektroforezy - dla RAPD - około 4 godz., dla SCAR - wystarczy 1 godz.
Wiąże się z tym również efektywność wykorzystania żelu agarozowego - w tej samej objętości przygotowanego żelu można przeanalizować przynajmniej dwukrotnie więcej próbek DNA.
Wpływa to na, przynajmniej ośmiokrotne skrócenie czasu analizy i wynikającą z tego oszczędność energii, jak również, co najmniej dwukrotnie mniejsze zużycie odczynnika - agarozy.
Biorąc pod uwagę wszystkie te elementy w powiązaniu ze znaczną ilością roślin analizowanych w każdym sezonie w procesie selekcyjnym - uzyskuje się zwiększenie efektywności prowadzonych analiz, a przez to - większą skuteczność i obniżenie kosztów.
W celu izolacji genomowego DNA można zastosować inne metody, poza podaną wyżej metodą opracowaną przez Doyle'a (1990).
Do elektroforetycznego rozdziału preparatów DNA, jak również prób po reakcji PCR można stosować inną niż podana w pkt. 1 procentowość żelu agarozowego: od 0,8 do 2%. Można stosować również różne parametry elektroforezy, jak czas oraz napięcie prądu. Do identyfikacji markera SCAR można stosować również inne dostępne metody analityczne, np. wykorzystujące techniki hybrydyzacyjne, jak również sekwencjonowanie.
Barwienia rozdzielanych na żelu próbek DNA można dokonać również innymi metodami, np. dodając bromek etydyny do buforu elektroforetycznego lub do żelu. Można również stosować innego rodzaju barwniki.
Dla otrzymania i sekwencjonowania fragmentu DNA, zawartego w polimorficznym prążku OPC021150, można wykorzystać również inne niż opisane w pkt. 1 b), dostępne metody, np. sekwencjonowanie bezpośrednie po wyodrębnieniu prążka z żelu.
Skład mieszaniny reakcyjnej, przedstawiony w Tabeli 1 jest optymalny, tym niemniej można stosować inne zakresy stężeń i ilości poszczególnych składników, jak również inną objętość końcową reakcji tj.:
Mg w zakresie stężeń od 1,25 do 2,5 mM i wyższych, dNTPs - od 0,1 do 0,2 mM, startery w ilości od 1 pmola do 4 pmoli oraz polimerazę od 0,5 do 5 jednostek enzymatycznych (u) - na 25 μΐ objętości reakcji;
objętość końcowa reakcji może wynosić od 10 do 100 μΐ.
Można również stosować w mieszaninie reakcyjnej związki chemiczne oraz białka w celu podniesienia specyficzności reakcji oraz zwiększenia specyficzności enzymu, np. detergenty niejonowe, BSA, glicerol, DMSO i inne.
Warunki reakcji PCR, zamieszczone w Tabeli 2 również są optymalne, można jednak stosować inne wartości temperatur oraz czasy trwania poszczególnych etapów reakcji, tj.: denaturacja wstępna w temp. od 90 do 95°C - od 1 do 5 min., denaturacja w temp. od 90 do 95°C - od 10 sek. do 30 sek. i więcej, przyłączanie startera w temp. od 50 do 65°C - od 20 sek. do 1 min., elongacja w temp. od 70 do 75°C - od 1 do 3 min., elongacja końcowa od 5 do 20 min., po zakończeniu reakcji próby inkubowane są w temp. od 4 do 25°C do momentu ich wyjęcia z termocyklera.
Ilość cykli może wynosić od 20 do 45 i więcej.
Wizualizacja produktów DNA w żelu agarozowym może odbywać się nie tylko poprzez przez barwienie, lecz mogą być też wykorzystywane inne techniki takie jak techniki fluorescencyjne, chemiluminescencyjne, radioizotopowe, enzymatyczne lub ich kombinacje.
Przedstawione przykłady realizacji nie wyczerpują możliwości zastosowań rozwiązań według wynalazku mieszczących się w spektrum ich istoty.
Tym samym zaprojektowane startery według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie również w badaniu ekspresji informacji genetycznej metodą RT/PCR, jak również jako sondy hybrydyzacyjne do identyfikacji oraz analizy rejonu genomowego DNA rzepaku sprzężonego z genem restorerem Rfo.
PL 212 433 B1
LITERATURA
Bartkowiak-Broda I., Rouselle P., Renard M. (1979) Investigations of two kinds of cytoplasmic male sterility in rapeseed (Brassica napus L.). Genetica Polonica 20: 487-497.
Delourme R., Bouchereau A., Hubert N., Renard M., Landry B.S. (1994) Identification of RAPD markers linked to fertility restorer gene for the Ogura radish cytoplasmic male sterility of rapeseed (Brassica napus L.). Theor Appl Genet 88: 741-748.
Delourme R., Foisset N., Horvais R., Barret P., Champagne G., Cheung W.Y., Landry B.S., Renard M. (1998) Characterization of the radish introgression carrying the Rfo restorer gene for the Ogu-INRA cytoplasmic male sterility in rapeseed (Brassica napus L.). Theor Appl Genet 97: 129-143.
Doyle J.J., Doyle J.L. (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13-15.
Heyn F.W. (1976) Transfer of restorer genes from Raphanus to cytoplasmic male sterile Brassica napus. Cruciferae Newsl 1: 15-16.
Mikołajczyk K., Matuszczak M., Piętka T., Bartkowiak-Broda I., Krzymański J., (1998) Zastosowanie markerów DNA do badań składników odmian mieszańcowych rzepaku./Use of DNA markers for studying of rapeseed hybrid varieties components. Rośliny Oleiste - Oilseed Crops XIX (2): 463-471.
Pelletier G., Primard C., Vedel F., Chetrit P., Renard M., Pellad-Delourme R. (1987) Molecular, phenotypical and genetic characterization of mitochondrial recombinants in rapeseed. In: Proc 7th Int Rapeseed Cong, vol 1 Poznan, Poland, pp 113-118.
Claims (18)
1. Sekwencje nukleotydowe starterów specyficznych dla krańcowych rejonów badanego fragmentu DNA, sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, znamienne tym, że mają postać:
C-02_f1: 5' TGTAACATAAGAAACGCTTGGC 3'
C-02_rev1: 5' AAGGATCATTAAACGTCTTTAGGC 3'
2. Sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla fragmentu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, znamienny tym, że stosuje się parę starterów posiadających następujące sekwencje nukleotydowe:
C-02_f1: 5' TGTAACATAAGAAACGCTTGGC 3'
C-02_rev1: 5' AAGGATCATTAAACGTCTTTAGGC 3' przy czym dla rozdziału produktów amplifikacji korzystnie stosuje się elektroforezę na żelu agarozowym.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że rozdział fragmentu DNA podczas elektroforezy jak również podczas prób po reakcji PCR prowadzi się przy procentowości żelu agarozowego od 0,8-2,0%, przy czym elektroforezę korzystnie prowadzi się przez kilka godzin, przynajmniej przez 0,5 godziny.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że korzystnie podczas reakcji PCR denaturację wstępną prowadzi się w temperaturze od 90 do 95°C w czasie od 1 min. - 5 min., denaturację właściwą w temperaturze od 90 do 95°C w czasie od 10 sek. do 30 sek. i więcej, przyłączanie startera w temp. od 50 do 65°C w czasie od 20 sek. do 1 min., elongację w temp. od 70 do 75°C w czasie od 1 min. do 3 min., elongację końcową w temp. od 70 do 75°C w czasie 5 do 20 min., zaś po zakończeniu reakcji próby inkubuje się w temperaturze od 4 do 25°C do momentu ich wyjęcia z termocyklera, przy czym korzystnie wykonuje się do 45 cykli.
5. Sposób według zastrz. 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że podczas reakcji PCR stosuje się zakresy stężeń i ilości poszczególnych składników, jak również objętość końcową reakcji jak poniżej:
PL 212 433 B1
Mg2+ w zakresie stężeń od 1,25 do 2,5 mM i wyższych, dNTPs - od 0,1 do 0,2 mM, startery w ilości od 1 pmola do 4 pmoli oraz polimerazę od 0,5 do 5 jednostek enzymatycznych (u) - na 25 μΐ objętości reakcji, przy czym objętość końcowa reakcji może wynosić od 10 do 100 μΐ, przy czym korzystnie w mieszaninie reakcyjnej stosuje się dodatkowo związki chemiczne oraz białka podnoszące specyficzność reakcji oraz zwiększające specyficzność enzymu, takie jak detergenty niejonowe, BSA, glicerol, DMSO i inne.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w celu dokonania wizualizacji i rozdziału na żelu agarozowym rozdzielane próbki barwi się dodając korzystnie do buforu elektroforetycznego lub do żelu bromek etydyny.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że przed analizą PCR korzystnie stosuje się co najwyżej kilkunastokrotne rozcieńczenie próbek DNA.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że korzystnie stosuje się czas reakcji PCR poniżej 3 godzin.
9. Sposób uzyskania sekwencji nukleotydowej fragmentu DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, znamienny tym, że fragment DNA zawarty w polimorficznym prążku znanego markera DNA typu RAPD OPC-021150, sprzężonego z genem restorerem Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności typu ogura, przygotowuje się do sekwencjonowania korzystnie poprzez wycięcie fragmentu żelu zawierającego ten polimorficzny prążek, odzyskuje się DNA poprzez elucję DNA oraz jego ponowną amplifikację w reakcji PCR z zastosowaniem startera RAPD OPC-02 o następującej sekwencji nukleotydowej: 5'GTGAGGCGTC 3'., przy podwyższonej temperaturze przyłączania startera, przy czym dla uzyskania jednorodnego produktu reakcji czynności te powtarza się kilkukrotnie, po czym tak otrzymany fragment DNA wklonowuje się do plazmidu, a następnie plazmidowy DNA zawierający insert pC-02 sekwencjonuje się, po czym odczytuje się wyniki sekwencjonowania uzyskując sekwencję nukleotydową rejonu genomowego DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, przedstawioną na Fig. 3.
10. Sposób uzyskania markera DNA typu SCAR dla identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura, znamienny tym, że marker DNA typu RAPD OPC-021150, sprzężony z genem restorerem Rfo dla genowocytoplazmatycznej męskiej sterylności typu ogura przekształca się w odpowiadający mu marker typu SCAR w ten sposób, że na podstawie odczytanej uzyskanej sekwencji nukleotydowej rejonu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo, przedstawionej na Fig. 3, projektuje się startery specyficzne dla krańcowych regionów sekwencji badanego fragmentu DNA, mające postać
C-02_f1: 5' TGTAACATAAGAAACGCTTGGC 3'
C-02_rev1: 5' AAGGATCATTAAACGTCTTTAGGC 3' i wraz sekwencją nukleotydową rejonu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo stanowiące marker SCAR odpowiadający markerowi RAPD OPC-02.
11. Sposób identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowocytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura, na podstawie polimorfizmu fragmentu DNA badanej próbki, który to fragment powiela się w reakcji łańcuchowej polimerazy PCR z wykorzystaniem pary odpowiednich oligonukleotydowych starterów zdolnej do wykrycia tego polimorfizmu, znamienny tym, że jako startery wykrywające ten polimorfizm stosuje się parę oligonukleotydowych starterów o sekwencjach
C-02_f1: 5' TGTAACATAAGAAACGCTTGGC 3'
C-02_rev1: 5' AAGGATCATTAAACGTCTTTAGGC 3' stanowiących, wraz sekwencją nukleotydową rejonu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo, marker SCAR odpowiadający markerowi RAPD OPC-02, przy czym wymieniony fragment DNA wykazujący polimorfizm powiela się przy użyciu tych starterów prowadząc amplifikację fragmentu genomowego DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo, przy odpowiednim składzie mieszaniny reakcyjnej i zdefiniowanych warunkach reakcji, zaś produkty reakcji analizuje się dostępnymi sposobami, koPL 212 433 B1 rzystnie stosując elektroforezę w żelach agarozowych, zaś uzyskiwane po wizualizacji charakteryzujące te produkty prążki archiwizuje się i poddaje się analizie, uzyskując produkt stanowiący marker SCAR dla genu restorera Rfo dla fragmentu DNA rośliny posiadającej gen restorer Rfo, oraz brak takiego produktu dla fragmentu DNA rośliny nie posiadającej genu restorera Rfo.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że elektroforezę dla rozdziału fragmentu DNA jak również podczas prób po reakcji PCR prowadzi się przy procentowości żelu agarozowego od 0,8-2,0%, przy czym elektroforezę korzystnie prowadzi się przez kilka godzin, przynajmniej przez 0,5 godziny.
13. Sposób według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że korzystnie podczas reakcji PCR denaturację wstępną prowadzi się w temperaturze od 90 do 95°C w czasie od 1 min. - 5 min., denaturację właściwą w temperaturze od 90 do 95°C w czasie od 10 sek. do 30 sek. i więcej, przyłączanie startera w temp. od 50 do 65°C w czasie od 20 sek. do 1 min., elongację w temp. od 70 do 75°C w czasie od 1 min. do 3 min., elongację końcową w temp. od 70 do 75°C w czasie od 5 do 20 min., zaś po zakończeniu reakcji próby inkubuje się w temperaturze od 4 do 25°C, przy czym korzystnie wykonuje się do 45 cykli.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że podczas reakcji PCR stosuje się zakresy stężeń i ilości poszczególnych składników, jak również objętość końcową reakcji jak poniżej:
Mg2+ w zakresie stężeń od 1,25 do 2,5 mM i wyższych, dNTPs - od 0,1 do 0,2 mM, startery w ilości od 1 pmola do 4 pmoli oraz polimerazę od 0,5 do 5 jednostek enzymatycznych (u) - na 25 μΐ objętości reakcji, przy czym objętość końcowa reakcji może wynosić od 10 do 100 pi, przy czym korzystnie w mieszaninie reakcyjnej stosuje się dodatkowo związki chemiczne oraz białka podnoszące specyficzność reakcji oraz zwiększające specyficzność enzymu, takie jak detergenty niejonowe, BSA, glicerol, DMSO i inne.
15. Sposób według zastrz. 11 albo 12 albo 14, znamienny tym, że w celu dokonania wizualizacji i rozdziału na żelu agarozowym rozdzielane próbki barwi się dodając korzystnie do buforu elektroforetycznego lub do żelu bromek etydyny.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że przed analizą PCR stosuje się korzystnie co najwyżej kilkunastokrotne rozcieńczenie próbek DNA.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że korzystnie stosuje się czas reakcji PCR poniżej 3 godzin, zaś czas elektroforezy znacznie poniżej 2 godzin.
18. Zestaw testowy do identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura, zawierający nośnik, startery o określonych sekwencjach, enzym polimerazę, odczynniki do amplifikacji fragmentów DNA poprzez prowadzenie reakcji PCR, kontrolne próbki genomowego DNA z roślin rzepaku posiadających gen Rfo oraz nie posiadających tego genu, oraz ewentualnie instrukcję, według wynalazku charakteryzuje się tym, że jako startery zawiera startery, których sekwencje nukleotydowe mają postać:
C-02_f1: 5' TGTAACATAAGAAACGCTTGGC 3'
C-02_rev1: 5' AAGGATCATTAAACGTCTTTAGGC 3' umieszczone w odrębnych pojemniczkach, korzystnie w postaci liofilizowanej, a nadto standardowy osprzęt do przeprowadzenia reakcji PCR oraz identyfikacji produktu specyficznego, korzystnie metodą elektroforetyczną.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL380290A PL212433B1 (pl) | 2006-07-21 | 2006-07-21 | Sekwencje nukleotydowe starterów specyficznych dla krańcowych rejonów badanego fragmentu DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy PCR za pomocą starterów specyficznych dla fragmentu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania sekwencji nukleotydowej fragmentu DNA (54) sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania markera DNA typu SCAR dla identyfikacjiroślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura, sposób identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura i zestaw testowy do identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL380290A PL212433B1 (pl) | 2006-07-21 | 2006-07-21 | Sekwencje nukleotydowe starterów specyficznych dla krańcowych rejonów badanego fragmentu DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy PCR za pomocą starterów specyficznych dla fragmentu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania sekwencji nukleotydowej fragmentu DNA (54) sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania markera DNA typu SCAR dla identyfikacjiroślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura, sposób identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura i zestaw testowy do identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL380290A1 PL380290A1 (pl) | 2008-02-04 |
| PL212433B1 true PL212433B1 (pl) | 2012-10-31 |
Family
ID=43027787
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL380290A PL212433B1 (pl) | 2006-07-21 | 2006-07-21 | Sekwencje nukleotydowe starterów specyficznych dla krańcowych rejonów badanego fragmentu DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy PCR za pomocą starterów specyficznych dla fragmentu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania sekwencji nukleotydowej fragmentu DNA (54) sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania markera DNA typu SCAR dla identyfikacjiroślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura, sposób identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura i zestaw testowy do identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL212433B1 (pl) |
-
2006
- 2006-07-21 PL PL380290A patent/PL212433B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL380290A1 (pl) | 2008-02-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI604056B (zh) | 對應於基因轉殖品系ｍｏｎ８７７０１之大豆植物及種子及其檢測方法 | |
| JP4623910B2 (ja) | 生物学的サンプル中のエリートイベントｇａｔ−ｚｍ１を同定する方法およびキット | |
| Hu et al. | Target region amplification polymorphism: a novel marker technique for plant genotyping | |
| CN113355453B (zh) | 一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo的SNP分子标记及其应用 | |
| CN110066886B (zh) | 一种鉴定水稻品种的试剂、方法及应用 | |
| KR101091157B1 (ko) | 무 세포질 판별용 엽록체 ｄｎａ 마커 | |
| KR100842429B1 (ko) | 잔디에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 | |
| CN101016554A (zh) | 转基因油菜Rf3事件外源插入载体旁侧序列及其应用 | |
| JP2002512523A (ja) | ＢＲＡＳＳＩＣＡ ＮＡＰＵＳにおけるＯＧＵＲＡ Ｒｆ遺伝子の遺伝子型決定のための分子マーカーの使用 | |
| PL212433B1 (pl) | Sekwencje nukleotydowe starterów specyficznych dla krańcowych rejonów badanego fragmentu DNA sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy PCR za pomocą starterów specyficznych dla fragmentu genomowego DNA sprzężonego z genem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania sekwencji nukleotydowej fragmentu DNA (54) sprzężonego z genem restorerem Rfo dla CMS ogura u rzepaku, sposób uzyskania markera DNA typu SCAR dla identyfikacjiroślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura, sposób identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura i zestaw testowy do identyfikacji roślin rzepaku posiadających gen restorer Rfo dla genowo-cytoplazmatycznej męskiej sterylności ogura | |
| CN114561489B (zh) | 一种鉴定自交不亲和系ⅱ类s单元型青花菜的引物对及其应用和鉴定方法 | |
| Kaur | Pollen identification using sequencing techniques | |
| CN105132579B (zh) | 锌指蛋白33b基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用 | |
| US9631232B2 (en) | Recovery of genomic DNA from remnant extracted seed samples | |
| KR101480155B1 (ko) | 베치에서 유래한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 | |
| KR101395645B1 (ko) | 고온 스트레스 저항성 배추의 선별을 위한 ｒａｐｄ 프라이머 및 이를 이용한 고온 스트레스 저항성 배추의 선별방법 | |
| JPH0739400A (ja) | オリゴヌクレオチドを用いる植物品種の識別方法 | |
| US20190300970A1 (en) | Determining the genotype of a male gametic cell | |
| JP7181522B2 (ja) | プライマーセット、及びそれを用いた標的ヌクレオチド配列の増幅方法 | |
| KR100769367B1 (ko) | 기장에서 유래한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 | |
| KR100842446B1 (ko) | 생강에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 | |
| Auteri et al. | Genomic Characterization of Transgenic Wheat (Triticum Aestivum L.) Using Fluorescence IN SITU Hybridization | |
| CN121023081A (zh) | 用于鉴定甘蓝显性雌性不育表型的分子标记及其应用 | |
| CN119799949A (zh) | 用于检测棉花mon531转基因序列结构变异的引物和方法 | |
| CN118932104A (zh) | 一种与箭筈豌豆低温耐受性相关的分子标记及应用 |