PL212286B1

PL212286B1 - Sposób otrzymywania bakteriofagów

Info

Publication number: PL212286B1
Application number: PL391551A
Authority: PL
Inventors: Krystyna Dabrowska; Anna Oślizło; Paulina Budynek; Agnieszka Piotrowicz; Andrzej Górski
Original assignee: Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Pan
Priority date: 2010-06-20
Filing date: 2010-06-20
Publication date: 2012-09-28
Also published as: EP2582797B1; PL391551A1; WO2011162627A1; EP2582797A1

Description

Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania oczyszczonych preparatów bakteriofagowych. Uzyskane preparaty bakteriofagowe mogą znaleźć liczne zastosowania, zwłaszcza w wytwarzaniu produktów wymagających wysokiej czystości takich jak produkty lecznicze.

W cyklu litycznym w trakcie terapii bakterie zostają zniszczone przez namnażające się w nich bakteriofagi. Do środowiska uwalniane są potomne, zwielokrotnione w liczbie cząsteczki bakteriofagów, które lizują następne populacje bakterii.

W przypadku produkcji lizatów bakteriofagowych do celów technologicznych znaczenie ma nie tylko liczba potomnych cząsteczek fagowych ale i uwalniane do środowiska elementy budulcowe bakterii, takie jak kwasy nukleinowe, białka i składniki ściany komórkowej. Ściana bakterii Gram ujemnych zbudowana jest z w istotnym ułamku (nawet do 70%) z lipopolisacharydów (nazywanych pirogenami, endotoksynami), peptydoglikanów i białek.

Efektywne usunięcie pirogenów z lizatów bakteryjnych jest kluczowym wymogiem otrzymywania preparatów bakteriofagowych dedykowanych terapii zakażeń bakteryjnych. Endotoksyny są silnymi stymulatorami układu immunologicznego indukując produkcję interleukin, TNF, NO, itd.

Procedury usuwania lub izolacji endotoksyn bazują na ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi jak na przykład wodnym roztworem fenolu Westphal O., Lueritz O., Bister F. Uber die Extraktion von Bakterien mit Phenol/wasser. Z. Naturforsch. 7: 148-155, 1952), mieszaniną kwasów i amin alifatycznych (Patent application Publicatiom US 2007/0020292A1), metodami ekstrakcyjnymi i chromatograficznymi (Patent Application publication US 2007/0031447A1). Oczyszczanie preparatów biologicznych z endotoksyn przeprowadzano wykorzystując interakcje jonów metali z białkami (patent US 6,942,802 B2 Sep. 13, 2005; WO02083710A1; WO04003215A1), przez precypitację endotoksyn alkoholem i dwuwartościowymi przeciwjonami (US 5039610). Zastosowanie dwuwartościowych jonów w kombinacji z alkoholami, żywicami i detergentami jest przedmiotem wielu patentów na przykład EPO 407037B1. Do usuwania endotoksyn wykorzystywano białka izolowane z limfy kraba (US 5760177). Opisano wiele metod chromatografii kolumnowej. Wykorzystuje się w nich powinowactwo lipopolisacharydu do zasadowych haptenów takich jak polimysksyna (Petsch D, Beeskow TC, Anspach FB, Deckwer WD, (1997) Membrane adsorbers for selective removal of bacterial endotoxin. J. Chromatogr B Biomed Sci Appl. 693(1):79-91), złoże oparte na krzemianie wapnia (Hang JP, Wang Q, Smith TR, Hurst WE, Sulpizio T, (2005) Endotoxin removal using a synthetic adsorbent of crystalline calcium silicate hydrate. Biotechnol Prog. 21(4):1220-5), polimery syntetyczne (Hirayama Ch, Sakata M, (2002) Chromatographic removal of endotoxin from protein solutions by polymer particles. Journal of Chromatography B, 781:419-432) lub złoża polianionowe (Boratyński J, Syper D, Weber-Dabrowska B, Łusiak-Szelachowska M, Poźniak G, Górski A. Preparation of endotoxin-free bacteriophages Cell Mol Biol Lett. 2004; 9(2):253-9).

Nadal istnieje zapotrzebowanie na dostarczenie sposobu oczyszczania lizatów bakteriofagowych, zwłaszcza z endotoksyn, który mógłby być wykorzystany do przemysłowej produkcji preparatów bakteriofagowych przeznaczonych do stosowania w leczeniu zakażeń bakteryjnych występujących u ludzi. Pomimo mnogości opisanych metod oczyszczania lizatów bakteriofagowych, nie spełniają one w stopniu dostatecznym wymogów stawianych przed sposobami przemysłowej produkcji preparatów o wskazanym powyżej przeznaczeniu.

Nieoczekiwanie sposób spełniający określone powyżej wymogi został zaproponowany w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania bakteriofagów charakteryzujący się tym, że: a) prowadzi się hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego w odpowiedniej dla niego pożywce, hodowlę zaszczepia się bakteriofagami i uzyskuje się lizat bakteriofagowy, b) prowadzi się oczyszczanie lizatu bakteriofagowego techniką chromatografii powinowactwa, d) z uzyskanego przesączu przygotowuje się oczyszczony preparat bakteriofagowy, przy czym w etapie a) jako szczep gospodarza bakteryjnego wykorzystuje się komórki bakteryjne zawierające sekwencję kodującą białko fuzyjne wchodzące w skład kapsydu bakteriofaga obecnego w otrzymywanym lizacie zawierające polipeptyd posiadający powinowactwo do złoża chromatograficznego wykorzystywanego w etapie b) oraz polipeptyd pochodzący z fagowego białka strukturalnego.

Korzystnie polipeptyd posiadający powinowactwo do złoża chromatograficznego jest wybrany z grupy obejmującej HisTag oraz GST. Przykładowy polipeptyd pochodzący z fagowego białka strukturalnego jest kodowany przez sekwencję kodującą białko HOC przedstawione na figurze 1. KorzystPL 212 286 B1 nie w trakcie etapu a) hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego prowadzi się w bulionie hodowlanym o pH około 7,2 zawierającym wyciąg mięsny, enzymatyczny hydrolizat kazeiny, hydrolizat drożdży, pepton, NaCI.

Korzystnie w trakcie etapu a) jako szczep gospodarza bakteryjnego stosuje się szczep bakteryjny wrażliwy na lityczne działanie namnażanego bakteriofaga.

Korzystnie w trakcie etapu a) hodowlę zaszczepia się szczepem bakteriofaga pozbawionym genu fagowego białka strukturalnego wchodzącego w skład białka fuzyjnego kodowanego przez sekwencję zawartą w szczepie gospodarza bakteryjnego.

Korzystnie w trakcie etapu a) uzyskany lizat fagowy podaje się sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 μm.

Chromatografia powinowactwa jest ustaloną, bardzo wydajną strategią oczyszczania pojedynczych białek różnego pochodzenia. Nieoczekiwanie zastosowanie tej metody w sposobie według wynalazku do izolowania całych kapsydów bakteriofagowych, stanowiących złożone i rozbudowane przestrzennie struktury białkowe, pozwoliło na zachowanie aktywności przeciwbakteryjnej izolowanych bakteriofagów, mimo iż ich kapsydy zostały istotnie zmodyfikowane w celu umożliwienia stosowania chromatografii powinowactwa. W przykładowej realizacji wykorzystano technikę phage display do wprowadzenia motywów wiążących do kapsydu fagowego, a następnie oparto się na wiązaniu tak zmodyfikowanych bakteriofagów do złoża powinowactwa odpowiedniego dla wybranego motywu wiążącego.

P r z y k ł a d 1

Procedura zakłada przygotowanie i wykorzystanie szczepu bakteriofaga macierzystego, w którym jeden z nieesencjonalnych genów strukturalnych (geny kodujące fakultatywne białka kapsydu, których brak nie blokuje aktywności fagowej) jest poddany delecji lub uszkodzeniu. W bakteriofagu T4 może to być defektywny gen hoc lub soc. W roli gospodarza dla defektywnego bakteriofaga T4 wykorzystano szczepy ekspresyjne Escherichia coli transformowane ekspresyjnymi plazmidami zawierającymi poprawny gen hoc w fuzji z sekwencją kodującą wybrany motyw wiążący. W tak prowadzonej hodowli bakteriofag defektywny pod względem wybranego białka kapsydowego ma możliwość suplementowania tego braku za pomocą ekspresjonowanego jednocześnie w komórce bakteryjnej z ekspresyjnego plazmidu białka rekombinowanego: Hoc z motywem wiążącym. Powstają stabilne struktury kapsydowe zawierające rekombinowane białko, a zatem zawierające i prezentujące na powierzchni motywy o silnym powinowactwie do złóż wiążących.

Mogą być zastosowane dwa alternatywne sposoby uwalniania bakteriofagów ze złoża: (i) elucja kompetytywna, tj. wypieranie za pomocą związków zdolnych do oddziaływania z motywami wiążącymi na kapsydach i/lub złożem wiążącym (glutation, imidazol), lub (ii) uwalnianie proteolityczne za pomocą proteazy rozpoznającej rzadkie motywy aminokwasowe. Druga strategia wymaga wprowadzenia na etapie projektowania ekspresyjnej konstrukcji plazmidowej przewidzianej do produkcji w komórce rekombinowanego białka, sekwencji rozpoznawanej przez odpowiednią proteazę. W wypadku uwalniania proteolitycznego kapsyd bakteriofagowy jest pozbawiany motywów wiążących.

Szczegółowy przykład realizacji sposobu według wynalazku podano poniżej.

Komórki gospodarza bakteryjnego uzyskano stosując szczepy ekspresyjne Escherichia coli, które transformowano ekspresyjnymi plazmidami zawierającymi poprawny gen hoc w fuzji z sekwencją kodującą wybrany motyw wiążący. W przykładowej realizacji wykorzystano plazmid pDEST15 (Invitrogen), który zawierał kasetę ekspresyjną pozwalającą uzyskać białko zawierające Hoc w fuzji z GST (figura 2) lub kasetę ekspresyjną kodującą białko zawierające Hoc w fuzji z Histag (figura 3).

Skuteczność transformacji komórek E.Coli Rosetta badano obserwując ekspresję białka Hoc w fuzji z tagami GST i Histag (figura 4).

Rekombinowane komórki gospodarza bakteryjnego hodowano w temp. 37°C do OD600 0,7 na medium LB (LB-Broth, high salt) o składzie: enzymatyczny hydrolizat kazeiny 10 g/l, ekstrakt drożdżowy 5 g/l, chlorek sodu 10g/l, pH 7,5. Następnie komórki przenoszono do świeżego LB (w stosunku 1:100 względem LB) z dodatkiem 0,0025 M IPTG oraz 1:100 objętości lizatu faga HAP1 (~3x10⁹ pfu/ml). Indukcja ekspresji oraz infekcja miały zatem miejsce jednocześnie. Zainfekowane komórki hodowano w 37T przy 160 rpm przez 8 godzin.

W opisywanej przykładowej realizacji wynalazku rekombinowane bakterie Escherichia coli zakazano defektywnym bakteriofagiem T4 (tj. szczepem HAP1 zdeponowanym w PCM jako F/00028 ujawnionym we wcześniejszym zgłoszeniu patentowym PL355355, dla którego udzielony został patent

PL 212 286 B1

PL 195 815) indukując jednocześnie ekspresję białka Hoc, prowadzono jednocześnie lizę fagową i indukcję ekspresji białka rekombinowanego.

Lizat fagowy filtrowano, po czym inkubowano z odpowiednim złożem agarozowym: sefaroza glutationowa (ang. Glutathione sepharose) lub agarozowym z jonami metali kompleksujących reszty imidazolowi histydyn (n.p. NiNTA agarowe). Lizaty inkubowano z odpowiednim złożem przez noc w temp. 4°C z lekkim kołysaniem. Po usunięciu niezwiązanej frakcji złoża płukano 3 I buforu : 50 mM Na2HPO4 300 mM NaCI, pH 7,5.

Następnie stosowano typową dla chromatografii powinowactwa procedurę oczyszczania tj. złoże poddano płukaniu, bakteriofagi eluowano lub zwalniano ze złoża proteolitycznie.

W przypadku złoża GST stosowano dwa sposoby elucji: elucję kompetytywną, 40 mM zredukowanym glutationem;

- bufor do elucji : 40 mM zredukowany glutation, 50 mM Tris, pH 8.0. Przed zebraniem każdej frakcji, złoże inkubowano z buforem 20 minut; zwalnianie proteolityczne za pomocą proteazy AcTEV;

- bufor dla proteazy: 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 8.0. Enzymu dodawano w ilości μ l na 1 ml złoża (aktywność - 10 U/ μ l). Proteolizę prowadzono 7 dni.

W przypadku złoża NiNTA fagi wypierano imidazolem w gradiencie 100-500 mM

-bufor do elucji : 100-500 mM imidazol (zależnie od frakcji), 50 mM Na2HPO4,300 mM NaCI, pH 7,5

Płukanie oraz elucje prowadzono w temperaturze pokojowej.

Metody analizy wyników

Specyficzność bakteriofagów modyfikowanych względem złoża wnioskowano na podstawie porównania profilu elucji fagów T4 modyfikowanych, fagów T4 niemodyfikowanych oraz fagów T4 modyfikowanych niepasującym do złoża Tagiem. Profil elucji wyznaczano poprzez ocenę miana fagowego w poszczególnych frakcjach. Efektywność oczyszczania sprawdzano poprzez oznaczanie poziomu endotoksyn w eluowanych (bądź zwalnianych) frakcjach.

Wyniki

Uzyskane wyniki przedstawiono na zawartych w niniejszym opisie figurach oraz tabeli.

Przedstawione na figurach wykresy zawierają porównanie poszczególnych profili elucji. W przypadku eksperymentów porównawczych, które miały potwierdzić specyficzność fagów do złoża, wyjściowe miana preparatu kontrolnego oraz potencjalnie specyficznego były identyczne. Te same objętości lizatów inkubowano z tą samą ilością złoża, płukano oraz eluowano w tych samych warunkach.

Fig. 5 prezentuje porównanie profilu elucji fagów modyfikowanych znacznikiem GST oraz niemodyfikowanych. Powinowactwo preparatu modyfikowanego do złoża niemal 1000-krotnie przekracza powinowactwo preparatu niemodyfikowanego, co świadczy o jego specyficzności względem GST.

Fig. 6 prezentuje porównanie profilu elucji fagów modyfikowanych znacznikiem GST oraz fagów modyfikowanych znacznikiem Histaq. Powinowactwo preparatu modyfikowanego do złoża niemal 1000-krotnie przekracza powinowactwo preparatu modyfikowanego niepasującym tagiem, co świadczy o jego specyficzności względem GST.

Fig. 7 przedstawia profil proteolitycznego zwalniania modyfikowanych fagów T4 z kolumny GST.

Fig. 8 prezentuje porównanie profilu elucji fagów modyfikowanych znacznikiem Histaq oraz niemodyfikowanych. Preparaty wyjściowe charakteryzowały się tym samym mianem fagowym. Powinowactwo preparatu modyfikowanego do złoża niemal 100 000-krotnie przekracza powinowactwo preparatu niemodyfikowanego, co świadczy o jego specyficzności względem NiNTA.

Fig. 9 prezentuje porównanie profilu proteolitycznego zwalniania fagów modyfikowanych znacznikiem GST oraz fagów modyfikowanych znacznikiem Histaq z kolumny GST. Powinowactwo preparatu modyfikowanego do złoża niemal 100-krotnie przekracza powinowactwo preparatu modyfikowanego niepasującym tagiem, co świadczy o jego specyficzności względem GST

T a b e l a 1

Tabela przedstawia uzyskane wartości endotoksyn dla oczyszczanych preparatów fagowych oraz odpowiadające im miana

Preparat fagowy	Miano (pfu/ml)	Poziom endotoksyn (EU/ml)
1	2	3
T4 modyfikowany GST	1,3 x 10⁷	186
T4 modyfikowany NiNTA	4,7 x 10⁸	253

PL 212 286 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
T4 modyfikowany GST -proteoliza	4,7 x 10⁸	363
T4 modyfikowany GST -proteoliza *	1 x 10⁷	11
T4 modyfikowany HisTaq*	1 x 10⁸	16
T4 modyfikowany GST*	7 x 10⁸	13

Wnioski

Proponowana metoda umożliwia jednoetapowe a zarazem efektywne oczyszczenie preparatów fagowych, pozwala na zachowanie aktywności przeciwbakteryjnej bakteriofagów zarówno w wypadku strategii opartej o wypieranie związanych bakteriofagów ze złoża jak i o uwalnianie proteolityczne. Nie wymaga osobnych kroków podejmowanych dla usuwania zanieczyszczeń białkowych i niebiałkowych (w tym LPS). Modyfikacja białek płaszcza fagowego odpowiednimi motywami wiążącymi może umożliwiać oczyszczenie także innych szczepów bakteriofagowych techniką chromatografii powinowactwa.

Claims

1. Sposób otrzymywania bakteriofagów, znamienny tym, że:

a) prowadzi się hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego w odpowiedniej dla niego pożywce, hodowlę zaszczepia się bakteriofagami i uzyskuje się lizat bakteriofagowy, b) prowadzi się oczyszczanie lizatu bakteriofagowego techniką chromatografii powinowactwa, d) z uzyskanego przesączu przygotowuje się oczyszczony preparat bakteriofagowy, przy czym w etapie a) jako szczep gospodarza bakteryjnego wykorzystuje się komórki bakteryjne zawierające sekwencję kodującą białko fuzyjne wchodzące w skład kapsydu bakteriofaga obecnego w otrzymywanym lizacie zawierające polipeptyd posiadający powinowactwo do złoża chromatograficznego wykorzystywanego w etapie b) oraz polipeptyd pochodzący z fagowego białka strukturalnego.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd posiadający powinowactwo do złoża chromatograficznego jest wybrany z grupy obejmującej HisTag oraz GST.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) hodowlę szczepu gospodarza bakteryjnego prowadzi się w bulionie hodowlanym o pH około 7,2 zawierającym wyciąg mięsny, enzymatyczny hydrolizat kazeiny, hydrolizat drożdży, pepton, NaCI.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) jako szczep gospodarza bakteryjnego stosuje się szczep bakteryjny wrażliwy na lityczne działanie namnażanego bakteriofaga.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) hodowlę zaszczepia się szczepem bakteriofaga pozbawionym genu fagowego białka strukturalnego wchodzącego w skład białka fuzyjnego kodowanego przez sekwencję zawartą w szczepie gospodarza bakteryjnego.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie etapu a) uzyskany lizat fagowy podaje się sterylizacji filtracyjnej przez filtr jałowiący 0,22 μm.