PL213388B1

PL213388B1 - Sposób uzyskiwania preparatów bakteriofagowych obejmujacy namnazanie bakteriofagów w komórkach bakterii, poddawanie lizie komórek z bakteriofagami

Info

Publication number: PL213388B1
Application number: PL382800A
Authority: PL
Inventors: Janusz Boratynski; Bożena Szermer-Olearnik; Beata Weber-Dąbrowska; Andrzej Górski
Original assignee: Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Pan We Wroclawiu; Instytut Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Panwe Wroclawiu
Priority date: 2007-06-29
Filing date: 2007-06-29
Publication date: 2013-02-28
Also published as: PL382800A1; US20100227376A1; WO2009005380A1

Abstract

Sposób uzyskiwania preparatów bakteriofagowych zawierających śladową zawartość endotoksyn, znamienny tym, że znaną metodą uzyskuje się lizat bakteriofagowy, otrzymany lizat inkubuje się w środowisku o pH 4-10, przy czym w trakcie inkubacji endotoksyny zawarte w lizacie bakteriofagowym ulegają rozkładowi.

Description

Opis wynalazku

Wyzwaniem obecnych czasów jest wygranie wyścigu z mikroorganizmami przekazującymi miedzy sobą informację genetyczną umożliwiającą im nabycie oporności na antybiotyki. Powszechnie stosowana antybiotykoterapia spowodowała, że mikroorganizmy stały się miej wrażliwe na antybiotyki, w tym na wankomycynę - antybiotyk zakłócający biosyntezę peptydoglikanu. Obecnie lawinowo narasta liczba informacji mówiących o alternatywie dla terapii antybiotykowej - wykorzystaniu bakteriofagów. Wśród tych informacji jest wypowiedź laureata Nagrody Nobla profesora Lederberga zapowiadająca wykorzystanie bakteriofagów w terapii zakażeń bakteryjnych. Badania nad terapeutycznym wykorzystaniem bakteriofagów są prowadzone w kilku ośrodkach na świecie i liczba ich będzie rosła. Najdłuższe tradycje terapii fagami ma Instytut Mikrobiologii i Wirusologii w Tbilisi i Instytut Immunologii PAN we Wrocławiu. Obecnie powstaje wiele firm nastawionych na wykorzystanie fagów w terapii zakażeń bakteryjnych. Przykłady to: Novolytics, Do-CoopTechnologies Ltd, CEO Novolytics Ltd, Phico Therapeutics Ltd itd.

W cyklu litycznym w trakcie terapii bakterie zostają zniszczone przez namnażające się w nich bakteriofagi. Do środowiska uwalniane są potomne, zwielokrotnione w liczbie cząsteczki bakteriofagów, które lizują następne populacje bakterii.

W przypadku produkcji lizatów bakteriofagowych do celów technologicznych znaczenie ma nie tylko liczba potomnych cząsteczek fagowych ale i uwalniane do środowiska elementy budulcowe bakterii, takie jak kwasy nukleinowe, białka i składniki ściany komórkowej. Ściana bakterii Gram ujemnych zbudowana jest z w istotnym ułamku (nawet do 70%) z lipopolisacharydów (nazywanych pirogenami, endotoksynami), peptydoglikanów i białek.

Efektywne usunięcie pirogenów z lizatów bakteryjnych jest kluczowym wymogiem otrzymywania preparatów bakteriofagowych dedykowanych terapii zakażeń bakteryjnych. Endotoksyny są silnymi stymulatorami układu immunologicznego indukując produkcję interleukin, TNF, NO, itd.

Procedury usuwania lub izolacji endotoksyn bazują na ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi jak na przykład wodnym roztworem fenolu Westphal O., Lueritz O., Bister F. Uber die Extraktion von Bakterien mit Phenol/wasser. Z. Naturforsch. 7: 148-155, 1952), mieszaniną kwasów i amin alifatycznych (Patent application Publicatiom US 2007/0020292A1), metodami ekstrakcyjnymi i chromatograficznymi (Patent Application publication US 2007/0031447A1). Oczyszczanie preparatów biologicznych z endotoksyn przeprowadzano wykorzystując interakcje jonów metali z białkami (patent US 6,942,802 B2 Sep. 13, 2005; WO02083710A1; WO04003215A1), przez precypitację endotoksyn alkoholem i dwuwartościowymi przeciwjonami (US 5039610). Zastosowanie dwuwartościowych jonów w kombinacji z alkoholami, żywicami i detergentami jest przedmiotem wielu patentów na przykład EPO 407037B1. Do usuwania endotoksyn wykorzystywano białka izolowane z limfy kraba (US 5760177). Opisano wiele metod chromatografii kolumnowej. Wykorzystuje się w nich powinowactwo lipopolisacharydu do zasadowych haptenów takich jak polimysksyna (Petsch D, Beeskow TC, Anspach FB, Deckwer WD, (1997) Membrane adsorbers for selective removal of bacterial endotoxin. J. Chromatogr B Biomed Sci Appl. 693(1):79-91), złoże oparte na krzemianie wapnia (Hang JP, Wang Q, Smith TR, Hurst WE, Sulpizio T, (2005) Endotoxin removal using a synthetic adsorbent of crystalline calcium silicate hydrate. Biotechnol Prog. 21(4):1220-5), polimery syntetyczne (Hirayama Ch, Sakata M, (2002) Chromatographic removal of endotoxin from protein solutions by polymer particles. Journal of Chromatography B, 781:419-432) lub złoża polianionowe (Boratyński J, Syper D, Weber-Dabrowska B, Łusiak-Szelachowska M, Poźniak G, Górski A. Preparation of endotoxin-free bacteriophages Cell Mol Biol Lett. 2004; 9(2):253-9).

Przedmiotem wynalazku jest sposób uzyskiwania preparatów bakteriofagowych obejmujący namnażanie bakteriofagów w komórkach bakterii, poddawanie lizie komórek z bakteriofagami charakteryzujący się tym, że obejmuje:

a) zwiększanie stężenia kationów magnezu w lizacie, korzystnie poprzez traktowanie lizatu roztworem EDTA lub dodanie soli magnezu i następnie korzystnie inkubację roztworu na co najmniej godzinę;

b) ekstrakcję lizatu z etapu a) rozpuszczalnikami organicznymi nie mieszającymi się w pełni z wodą, korzystnie wybranymi z grupy zawierającej 1-oktanol, 1-butanol, korzystanie mieszanie przez co najmniej jedną godzinę;

c) zbieranie fazy wodnej z roztworu z etapu b) metodą wybraną z grupy zawierającej dializę w obecności alkoholu, korzystnie 25% alkoholu etylowego lub izopropylowego i kolejnej roztworem

PL 213 388 B1 soli, korzystnie 0,15 M NaCl, przy czym korzystnie stężenie enodotoksyn obniża się nie mniej niż 4% stężenia wyjściowego w lizacie, oznaczonych testem LAL (Limulus Amebocyte Lysate). Równie korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że dializę w obecności alkoholu i następnie solą z etapu c) powtarza się wielokrotnie, korzystanie co najmniej 3 krotnie. Korzystniej sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że inkubacje z etapu a) prowadzi się w zakresie temperatur od 0 do temperatury 45°C, korzystnie 14-37°C. W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku sposób charakteryzuje się tym, że wydzielaną frakcję wodną z etapu c) poddaje się zagęszczaniu poprzez odparowanie nadmiaru rozpuszczalnika lub przez ultrafiltrację. W następnej korzystnej realizacji wynalazku sposób charakteryzuje się tym, że z zagęszczonego preparatu bakteriofagowego usuwa się śladowe zanieczyszczenia prowadząc filtrację żelową preparatów bakteriofagowych na sitach molekularnych, przy czym jako eluent stosuje się wodny roztwór alkoholu etylowego lub izopropylowego, korzystnie 5% roztwór alkoholu izopropylowego. Najkorzystniej sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że preparat po usunięciu zanieczyszczeń rozpuszczalnikami organicznymi poddaje się filtracji żelowej, w której eluentem jest roztwór dedykowany przechowywaniu preparatów bakteriofagowych.

Zaobserwowano, że w trakcie przechowywania bakteriofagów poziom endotoksyn oznaczany testem LAL (Limulus Amebocyte Lysate) ulega obniżeniu a następnie dynamika obniżania ulega zahamowaniu.

Przyjęto, że endotoksyny ulegają destrukcji, która może być powodowana naturalną ich niestabilnością, jak również destrukcja może być wspomagana przez enzymy obecne w lizatach bakteriofagowych. Bazując na tym założeniu znaleziono warunki, w których procesy destrukcji zachodziły z dużą wydajnością. Celem było opracowanie metody usuwania endotoksyn z lizatów bakteriofagowych. Wykazano, że w wyniku naturalnej destrukcji, której szybkość można było modulować obecnością jonów metali, stężenie endotoksyn obniżało się do 5-10%. Następnym etapem jest ekstrakcja z bulionu zawierającego bakteriofagi lipopolisacharydów i ich fragmentów rozpuszczalnikami organicznymi nie mieszającymi się w pełni z wodą. Jako rozpuszczalniki wybrano alkohole oraz inne rozpuszczalniki takie jak chlorowcopochodne.

W każdej badanej próbie po usunięciu śladowej obecności czynnika ekstrakcyjnego obserwowano obniżenie zawartości substancji dających pozytywny wynik w teście LAL.

P r z y k ł a d y

Wprowadzenie - ogólna procedura przygotowania lizatów bakteriofagowych

Bakteriofagi do doświadczeń uzyskano namnażając je na szczepach docelowych bakterii: Escherichia coli B w przypadku bakteriofagów T4 i HAP-1 i Pseudomonas aeruginosa w przypadku faga F-8.

W tym celu odpowiednie bakterie namnożono w 37°C w wodzie peptonowej o składzie:

0,4 g wyciąg mięsny, 5,4 g enzymatyczny hydrolizat kazeiny, 1,7 g hydrolizat drożdży, 4,0 g pepton, 3,5 g NaCl rozpuszczony w 1 litrze wody. Do zawiesiny docelowych bakterii znajdującej się w fazie logarytmicznego wzrostu dodano w formie uprzednio przygotowany lizat zawierający odpowiedniego bakteriofaga.

Korzystne realizacje:

1. Do probówki zawierającej 1,2 ml 1-oktanolu dodano 1,6 ml lizatu bakteriofaga T4 wydializowanego uprzednio do 0,04 M EDTA w 0,1 M octanie sodu pH 7,0. Próbkę poddano łagodnemu mieszaniu na rotatorze przez 1 godzinę, następnie odwirowano (5 min, 3076xg) i zebraną dolną fazę wodną dializowano do 25% wodnego roztworu alkoholu etylowego (dializę zmieniano 3x). Przed testowaniem biologicznym próbę dializowano do 0,15 M NaCl (dializę zmieniano 4x). Oznaczono poziom endotoksyn testem LAL (15,7 EU/ml). Poziom endotoksyn w próbce kontrolnej (700 EU/ml). W trakcie procedury oczyszczania faga T4 nastąpiła utrata aktywności litycznej poniżej jednego rzędu.

2. Bakteriofagi F-8 uzyskano namnażając je na szczepie Pseudomonas aeruginosa. Do probówki zawierającej 1,2 ml 1-oktanolu dodano 1,6 ml lizatu bakteriofaga Ps-F8 wydializowanego uprzednio do 0,04 M EDTA w 0,1 M octanie sodu pH 7,0. Próbkę poddano łagodnemu mieszaniu na rotatorze przez 1 godzinę, następnie odwirowano (5 min, 3076xg) i zebraną dolną fazę wodną dializowano do 25% wodnego roztworu alkoholu etylowego (dializę zmieniano 3x). Przed testowaniem biologicznym próbę dializowano do 0,15 M NaCl (dializę zmieniano 4x). Oznaczono poziom endotoksyn testem LAL (8,2 EU/ml). Poziom endotoksyn w próbce kontrolnej (380 EU/ml). W trakcie procedury oczyszczania faga F-8 nastąpiła utrata aktywności litycznej poniżej jednego rzędu.

3. Bakteriofagi HAP-1 uzyskano namnażając je na szczepie Escherichia coli B w 37°C. Do probówki zawierającej 1,2 ml 1-oktanolu dodano 1,6 ml lizatu bakteriofaga HAP-1 wydializowanego

PL 213 388 B1 uprzednio do 0,04 M EDTA w 0,1 M octanie sodu pH 7,0. Próbkę poddano łagodnemu mieszaniu na rotatorze przez 1 godzinę, następnie odwirowano (5 min, 3076xg) i zebraną dolną fazę wodną dializowano do 25% wodnego roztworu alkoholu etylowego (dializę zmieniano 3x). Przed testowaniem biologicznym próbę dializowano do 0,15 M NaCl (dializę zmieniano 4x). Oznaczono poziom endotoksyn testem LAL (14 EU/ml). Poziom endotoksyn w próbce kontrolnej (60 000 EU/ml). W trakcie procedury oczyszczania faga HAP-1 nastąpiła utrata aktywności litycznej poniżej jednego rzędu.

4. Bakteriofagi T4 uzyskano namnażając je na szczepie Escherichia coli B w 37°C. Do probówki zawierającej 1,2 ml 1-oktanolu dodano 1,6 ml lizatu bakteriofaga HAP-1 wydializowanego uprzednio do 0,03 M EDTA zobojętniony NaOH pH 7,0. Próbkę poddano łagodnemu mieszaniu na rotatorze przez 1 godzinę, następnie odwirowano (5 min, 3076xg) i zebraną dolną fazę wodną dializowano do 25% wodnego roztworu alkoholu etylowego (dializę zmieniano 3x). Przed testowaniem biologicznym próbę dializowano do 0,15 M NaCl (dializę zmieniano 4x). Oznaczono poziom endotoksyn testem LAL (6,3 EU/ml) Poziom endotoksyn w próbce kontrolnej (1950 EU/ml). W trakcie procedury oczyszczania faga T4 nastąpiła utrata aktywności litycznej jednego rzędu.

5. Bakteriofagi T4 uzyskano namnażając je na szczepie Escherichia coli B w 37°C. Do probówki zawierającej 1,2 ml 1-oktanolu dodano 1,6 ml bakteriofaga T4 zawierającego 0,02 M MgCl2 poddano ekstrakcji 1 godz. na rotatorze, odwirowano (5 min, 3076xg), zebrano dolną fazę dializowano do 25% alkoholu etylowego (dializę zmieniano 3x), następnie próbę dializowano do 0,15 M NaCl (dializę zmieniano 4x), wykonano oznaczenie endotoksyn testem LAL otrzymując wynik 5,4 EU/ml. Poziom endotoksyn w kontroli 8700 EU/ml. W eksperymencie zaobserwowano ubytek miana aktywności litycznej w granicach jednego rzędu.

6. Bakteriofagi F-8 uzyskano namnażając je na szczepie Pseudomonas aeruginosa w 37°C. Do probówki zawierającej 1,2 ml 1-oktanolu dodano 1,6 ml bakteriofaga F-8 zawierającego 0,02 M MgCl2. Próbkę poddano łagodnemu mieszaniu na rotatorze przez 1 godzinę, następnie odwirowano (5 min, 3076xg) i zebraną dolną fazę wodną dializowano do 25% wodnego roztworu alkoholu etylowego (dializę zmieniano 3x). Przed testowaniem biologicznym próbę dializowano do 0,15 M NaCl (dializę zmieniano 4x). Oznaczono poziom endotoksyn testem LAL (9 EU/ml). Poziom endotoksyn w próbce kontrolnej (1200 EU/ml). W trakcie procedury oczyszczania faga F-8 nastąpiła utrata aktywności litycznej jednego rzędu.

7. Bakteriofagi T4 uzyskano namnażając je na szczepie Escherichia coli B w 37°C. Do probówki zawierającej 1,2 ml 1-butanolu dodano 1,6 ml bakteriofaga T4 zawierającego 0,04 M MgCl2. Próbkę poddano łagodnemu mieszaniu na rotatorze przez 1 godzinę, następnie odwirowano (5 min, 3076xg) i zebraną dolną fazę wodną dializowano do 25% wodnego roztworu alkoholu etylowego (dializę zmieniano 3x). Przed testowaniem biologicznym próbę dializowano do 0,15 M NaCl (dializę zmieniano 4x). Oznaczono poziom endotoksyn testem LAL (160 EU/ml). Poziom endotoksyn w próbce kontrolnej (22200 EU/ml). W trakcie oczyszczania nastąpiła pięciokrotna utrata aktywności litycznej.

8. Bakteriofagi T4 uzyskano namnażając je na szczepie Escherichia coli B w 37°C. Do probówki zawierającej 1,2 ml 1-butanolu dodano 1,6 ml bakteriofaga T4 po dializie w obecności 0,04 M EDTA. Próbkę poddano łagodnemu mieszaniu na rotatorze przez 1 godzinę, następnie odwirowano (5 min, 3076xg) i zebraną dolną fazę wodną dializowano do 25% wodnego roztworu alkoholu etylowego (dializę zmieniano 3x). Przed testowaniem biologicznym próbę dializowano do 0,15 M NaCl (dializę zmieniano 4x). Oznaczono poziom endotoksyn testem LAL (140 EU/ml). Poziom endotoksyn w próbce kontrolnej (22000 EU/ml). W trakcie oczyszczania nastąpiła pięciokrotna utrata aktywności litycznej.

9. Bakteriofagi T4 uzyskano namnażając je na szczepie Escherichia coli B. Do probówki zawierającej 1,2 ml 1-oktanolu dodano 1,6 ml bakteriofaga T4 po dializie w obecności 0,04 M EDTA. Próbkę poddano łagodnemu mieszaniu na rotatorze przez 1 godzinę, następnie odwirowano (5 min, 3076xg) i zebraną dolną fazę wodną dializowano do 25% wodnego roztworu alkoholu etylowego (dializę zmieniano 3x). Przed testowaniem biologicznym próbę dializowano do 0,15 M NaCl (dializę zmieniano 4x). Oznaczono poziom endotoksyn testem LAL (20 EU/ml). Poziom endotoksyn w próbce kontrolnej (24000 EU/ml). W trakcie oczyszczania nastąpiła pięciokrotna utrata aktywności litycznej.

10. Bakteriofagi T4 uzyskano namnażając je na szczepie Escherichia coli B w 37°C. Do probówki zawierającej 1,2 ml 1-oktanolu dodano 1,6 ml bakteriofaga T4 zawierającego 0,04 M MgCl2. Próbkę poddano łagodnemu mieszaniu na rotatorze przez 1 godzinę, następnie odwirowano (5 min, 3076xg) i zebraną dolną fazę wodną dializowano do 25% wodnego roztworu alkoholu etylowego (dializę zmieniano 3x). Przed testowaniem biologicznym próbę dializowano do 0,15 M NaCl (dializę zmieniano 4x).

PL 213 388 B1

Oznaczono poziom endotoksyn testem LAL (47 EU/ml). Poziom endotoksyn w próbce kontrolnej (21000 EU/ml). W trakcie oczyszczania nastąpiła utrata aktywności litycznej poniżej jednego rzędu.

11. Bakteriofaga T4 uzyskano namnażając go na szczepie Escherichia coli B w 37°C jako podłoże zastosowano wodę peptonową o składzie na 11: 0,4 g wyciąg mięsny, 5,4 g enzymatyczny hydrolizat kazeiny, 1,7 g hydrolizat drożdży, 4,0 g pepton, 3,5 g NaCl. Do kolby zawierającej 10 l lizatu bakteriofaga T4 zawierającego 0,01 M EDTA oraz 0,01 M MgCl2 x 6H2O dodano 150 ml 1-oktanolu i poddano ekstrakcji przez wytrząsanie 1,5 h. Po oddzieleniu warstwy oktanolowej „frakcję wodną” poddano dializie połączonej z zagęszczaniem przez ultrafiltrację (10x) w obecności alkoholu izopropylowego (stężenie alkoholu 10%). Kolejny etap polegał na filtracji żelowej zagęszczonego bakteriofaga T4 w obecności 5% alkoholu izopropylowego. Filtracja żelowa była prowadzona na kolumnie wypełnionej Sefakrylem S-200 o pojemności 50 l. Wykonano oznaczenie endotoksyn testem LAL w preparacie końcowym otrzymując wynik 81 EU/ml względem kontroli która miała 5800 EU/ml. Miano w faga w oczyszczonym preparacie wynosiło 5,3x10¹².

Claims

1. Sposób uzyskiwania preparatów bakteriofagowych obejmujący namnażanie bakteriofagów w komórkach bakterii, poddawanie lizie komórek z bakteriofagami, znamienny tym, że obejmuje:

c) zbieranie fazy wodnej z roztworu z etapu b) metodą wybraną z grupy zawierającej dializę w obecności alkoholu, korzystnie 25% alkoholu etylowego lub izopropylowego i kolejnej roztworem soli, korzystnie 0,15 M NaCl, przy czym korzystnie stężenie enodotoksyn obniża się nie mniej niż 4% stężanie wyjściowego w lizacie, oznaczonych testem LAL (Limulus Amebocyte Lysate).

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dializę w obecności alkoholu i następnie solą z etapu c) powtarza się wielokrotnie, korzystanie co najmniej 3 krotnie.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inkubacje z etapu a) prowadzi się w zakresie temperatur od 0 do temperatury 45°C, korzystnie 14-37°C.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wydzielaną frakcję wodną z etapu c) poddaje się zagęszczaniu poprzez odparowanie nadmiaru rozpuszczalnika lub przez ultrafiltrację.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że z zagęszczonego preparatu bakteriofagowego usuwa się śladowe zanieczyszczenia prowadząc filtrację żelową preparatów bakteriofagowych na sitach molekularnych, przy czym jako eluent stosuje się wodny roztwór alkoholu etylowego lub izopropylowego, korzystnie 5% roztwór alkoholu izopropylowego.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że preparat po usunięciu zanieczyszczeń rozpuszczalnikami organicznymi poddaje się filtracji żelowej, w której eluentem jest roztwór dedykowany przechowywaniu preparatów bakteriofagowych.