PL212096B1 - Wyizolowane szczepy Bifidobacterium infantis i środek farmaceutyczny - Google Patents

Wyizolowane szczepy Bifidobacterium infantis i środek farmaceutyczny

Info

Publication number
PL212096B1
PL212096B1 PL378435A PL37843504A PL212096B1 PL 212096 B1 PL212096 B1 PL 212096B1 PL 378435 A PL378435 A PL 378435A PL 37843504 A PL37843504 A PL 37843504A PL 212096 B1 PL212096 B1 PL 212096B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cure
strains
bifidobacterium
glutamine
bifidobacterium infantis
Prior art date
Application number
PL378435A
Other languages
English (en)
Other versions
PL378435A1 (pl
Inventor
Göran Molin
Siv Ahrné
Bengt Jeppsson
Original Assignee
Probi Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Probi Ab filed Critical Probi Ab
Publication of PL378435A1 publication Critical patent/PL378435A1/pl
Publication of PL212096B1 publication Critical patent/PL212096B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/51—Bifidobacterium
    • A23V2400/529—Infantis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe szczepy Bifidobacterium infantis, zdolne do wytwarzania in vivo glutaminy i ewentualnie argininy, oraz środek farmaceutyczny zawierający te szczepy.
Glutamina jest najpowszechniejszym aminokwasem w organizmie. Jest ona „przenośnikiem azotu pomiędzy tkankami i „paliwem dla enterocytów, kolonocytów, limfocytów i komórek proliferujących. U pacjentów z niedoborem glutaminy zaburzone są funkcje jelit, w szczególności z powodu utraty ochrony przed przemieszczeniem bakterii i/lub endotoksyny ze światła jelita do krążenia wrotnego. Ubytek glutaminy występuje u ciężko chorych pacjentów oraz u pacjentów z urazami i może przyczyniać się do wysokiego stopnia wystąpienia zakażenia i zaniku mięśni.
Podawanie dojelitowe glutaminy przynosi korzystne skutki zdrowotne u pacjentów z różnymi wskazaniami. W jednostce intensywnej opieki medycznej podawanie glutaminy pacjentom z dysfunkcją wielu narządów obniżyło powikłania zakaźne u tych pacjentów (Houdijk i In., Lancet, 352:772-776, 1998). Podobne efekty obserwowano u pacjentów z przeszczepem szpiku kostnego, otrzymujących pozajelitowo wzbogacone glutaminą żywienie (Ziegler i in., Annals Internal Medicine, 116:821-828, 1992). Innym przykładem są pacjenci z zespołem krótkiego jelita, u których stwierdzono zasadniczą poprawę zdolności wchłaniania po uzupełniającym podawaniu glutaminy (Byrne i in., Annals of Surgery, 222:243-255, 1995). Wykazano, że doustne uzupełnienie glutaminy podczas i po chemioterapii istotnie zmniejszyło zarówno czas trwania, jak i ostrość związanego z chemioterapią zapalenia jamy ustnej. Wywnioskowano, że podawanie doustne glutaminy może być prostym i przydatnym sposobem zwiększania komfortu wielu pacjentów z wysokim ryzykiem rozwoju opryszczkowego zapalenia jamy ustnej powstającego w wyniku intensywnej chemioterapii przeciwnowotworowej (Anderson i in., Cancer 1998; 83:1433-9). Uzupełnianie odżywiania glutaminą po intensywnym wysiłku obniżyło także częstość zakażeń, a w szczególności zakażeń górnych dróg oddechowych (Castell, Amino acids 2001; 20(1):49-61). Jednakże dokładny wpływ glutaminy na obniżenie odporności nie został dotychczas ustalony.
Głównym problemem technicznym w stosowaniu glutaminy jest fakt, że podczas przetwórstwa i przechowywania glutamina ł atwo ulega przemianie w kwas glutaminowy (glutaminian), czyli glutamina jest stosunkowo niestabilnym związkiem, trudnym do wprowadzania do preparatów do podawania doustnego. Ponadto podawana doustnie glutamina w kwaśnym środowisku żołądka w znacznym stopniu ulega przemianie w kwas glutami-nowy i nie będzie w stanie dotrzeć do jelita i wchłonięta w postaci glutaminy.
Arginina wzmacnia działanie odpornościowe i przyspiesza gojenie ran. Podawanie argininy stosowano pooperacyjnie oraz u pacjentów będących pod intensywną opieką medyczną. W większości badań klinicznych argininę podawano razem z innymi substancjami, takimi jak RNA i tran. Istnieją wskazania, że podawanie argininy moduluje pooperacyjną odpowiedź immunologiczną. Daly, John E.
i in., Surgery 112: 55-67, 1992, wykazali, ż e odż ywki dojelitowe wzbogacone argininą , RNA i kwasami ω-3-tłuszczowymi u pacjentów po operacji poprawia obronę immunologiczną poprzez różne mechanizmy. Arginina zmniejsza powikłania u pacjentów poddawanych chemoradiacji i leczeniu chirurgicznemu (Tepaske i in., 2001; Lancet 358:696-701), oraz skraca pobyt pacjentów w jednostce intensywnej opieki medycznej (Bauer i in., 1995, Critical Case Medicine 23:436-449).
Wydłużone przeżycie można obserwować u zwierząt karmionych dietą wzbogaconą argininą. Ilościowe zliczanie kolonii oraz obliczony procent pozostających żywych bakterii wykazały, że zdolność do uśmiercania przeniesionych organizmów była znacznie podwyższona u zwierząt otrzymujących argininę (Adawi, D. i in., 1997, Hepatology 25:642-647).
Szczepy Bifidobacterium spp. czyli bifidobakterie są często obecne w dużej ilości w jelicie człowieka, w szczególności u niemowląt karmionych piersią. Bakterie Bifidobacterium spp. uważa się za probiotyki, co oznacza, że żywe bakterie po przyjęciu dostarczają gospodarzowi korzyści zdrowotne. Uznano, że duża liczba Bifidobacterium spp. w jelicie wywiera korzystne skutki zdrowotne. Jednakże, przebieg działania wspomnianych korzystnych efektów jest w dużej mierze nieznany.
Matteuzzi i in. [Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur) 1978; 129 B, 175-181] przebadali dużą liczbę bifidobakterii z różnych środowisk pod względem ich zdolności uwalniania wolnych aminokwasów do pożywki hodowlanej. Uzyskane dane wskazywały, że kilka gatunków bifidobakterii było zdolnych do syntetyzowania wszystkich aminokwasów potrzebnych do wzrostu, a także do uwalniania tych związków do pożywki hodowlanej. Stwierdzono, że B. thermophilum, B. bifidum i B. adolescentis są najlepszymi szczepami wytwarzającymi aminokwasy, a aminokwasami najczęściej występującymi w pożywPL 212 096 B1 ce hodowlanej były głównie alanina, walina i kwas asparaginowy. Przypuszczano, że Bifidobacterium spp. odgrywa rolę w metabolizmie aminokwasów w przewodzie żołądkowo-jelitowym.
W WO 01/83700 (University of Maryland) ujawniono ś rodek i sposób leczenia i profilaktyki uszkodzenia przewodu żołądkowo-jelitowego, noworodkowego martwiczego zapalenia jelita cienkiego i okrężnicy (NEC) oraz posocznicy bakteryjnej. Preparat ten zawiera połączenie bakterii Gram dodatnich, w szczególności Lactobacillus i Bifidobacterium oraz glutaminy i powinien być podawany doustnie lub donosowo/doustnie. Stwierdzono, że preparat ten blokuje przemieszczenie czynników bakteryjnych, takich jak bakterie Gram ujemne.
Podawanie dożylne glutaminy jest bardzo skuteczne ale drogie i skomplikowane. Lepszym sposobem podawania glutaminy będzie oczywiście zastosowanie szczepu bakteryjnego wykazującego zdolność wytwarzania znacznych ilości glutaminy w jelitach. Jednakże jak dotychczas nie opisano żadnych takich szczepów.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że konkretne szczepy Bifidobacterium są zdolne do wytwarzania glutaminy w pożywce wzrostowej naśladującej środowisko ludzkiego jelita. Zatem wspomniane szczepy można stosować do wytwarzania glutaminy in vivo po doustnym lub dojelitowym podaniu ssakowi, w szczególności człowiekowi. Niektóre z tych szczepów są także zdolne do wytwarzania argininy.
Wynalazek dotyczy wyizolowanego szczepu Bifidobacterium infantis, wybranego z grupy obejmującej Bifidobacterium infantis CURE 21, DSM 15159, i Bifidobacterium infantis CURE 26, DSM 15160, wykazującego zdolność do przeżycia w przewodzie jelitowym oraz do wytwarzania glutaminy in vivo.
Korzystny jest szczep według wynalazku, wykazujący zdolność przyswajania amoniaku.
Wynalazek dotyczy również wyizolowanego szczepu Bifidobacterium infantis, wybranego z grupy obejmującej Bifidobacterium infantis CURE 19, DSM 15158, Bifidobacterium infantis CURE 28, DSM 15161, i Bifidobacterium infantis CURE 29, DSM 15162, wykazującego zdolność do przeżycia w przewodzie jelitowym oraz do wytwarzania glutaminy in vivo.
Korzystny jest szczep według wynalazku, wykazujący zdolność przyswajania amoniaku.
Korzystny jest szczep według wynalazku, wykazujący zdolność do wytwarzania argininy.
Wynalazek dotyczy ponadto środka farmaceutycznego, charakteryzującego się tym, że zawiera jeden lub większą liczbę szczepów Bifidobacterium infantis zdefiniowanych powyżej w połączeniu z noś nikiem.
Korzystnie środek według wynalazku stanowi środek farmaceutyczny, w którym nośnik stanowi terapeutycznie dopuszczalny nośnik.
Korzystnie środek według wynalazku zawiera także jeden lub większą liczbę szczepów Lactobacillus.
Zgodnie z wynalazkiem jeden lub większa liczba szczepów zdefiniowanych w zastrz. 1-5 jest przeznaczonych do stosowania jako lek.
Szczepy Bifidobacterium infantis według wynalazku mają zdolność przeżycia w przewodzie jelitowym i wytwarzania glutarniny in vivo. W szczególności glutamina jest wytwarzana w okrężnicy człowieka. Przeżycie w tym kontekście oznacza, że szczepy bakteryjne wyizolowano z próbek kału osobnika pobranych w różnych momentach. Tak więc bakterie z pewnością rosną i przeżywają u gospodarza przez pewien czas. Szczepy bifidobakterii według wynalazku mogą rosnąc na pożywce o pH poniżej 7, zwłaszcza o pH 5,5-6,5. Agar Rogosa stanowi jeden przykład takiej pożywki, a innym jest MRS.
W korzystnej postaci nowe szczepy wykazują takż e zdolność przyswajania amoniaku.
Jak już wspomniano, szczepy według wynalazku należą do gatunków Bifidobacterium infantis.
Takimi szczepami Bifidobacterium infantis są szczepy zdeponowane w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 23 sierpnia 2002, Bifidobacterium infantis CURE 19 (DSM 15158); Bifidobacterium infantis CURE 21 (DSM 15159); Bifidobacterium infantis CURE 26 (DSM 15160); Bifidobacterium infantis CURE 28 (DSM 15161); Bifidobacterium infantis CURE 29 (DSM 15162).
W korzystnej postaci wspomniane szczepy są zdolne do wytwarzania glutaminy bez zmniejszenia ilości kwasu glutaminowego.
Poniższe szczepy, które wszystkie zdeponowano w Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH 23 sierpnia 2 002 i nadano i numery dostępu, Bifidobacterium infantis CURE 19, DSM 15158, Bifidobacterium infantis CURE 28, DSM 15161, oraz Bifidobacterium infantis CURE 29, DSM 15162, są zdolne do wytwarzania, oprócz glutaminy, także argininy.
PL 212 096 B1
Nowe szczepy wyizolowano z kału małych dzieci i wyselekcjonowano je przez hodowanie na agarze o pH poniżej 7. Następnie szczepy te scharakteryzowano przez rybotypowanie i REA.
Środki farmaceutyczne według wynalazku, takie jak zawiesiny, tabletki, kapsułki, proszki można podawać doustnie. Można je także podawać w postaci lewatywy.
Środek farmaceutyczny może zawierać terapeutycznie dopuszczalny nośnik. Szczepy wytwarzające glutaminę, a także szczepy wytwarzające argininę, można ponadto stosować w preparatach do odżywiania dojelitowego.
Przyswajające amoniak szczepy Bifidobacterium infantis według wynalazku można podawać pacjentom z przejściowym uszkodzeniem nerek, takim jak obserwowane u pacjentów pozostających pod intensywną opieką medyczną po operacji chirurgicznej oraz przy powikłaniach lub po innych chorobach, takich jak poważne zakażenia i zatrucia. W takich przypadkach oczekuje się, że działanie nerek wróci do normy i leczenie mające na celu obniżenie obciążenia azotem z jelita może spowodować uniknięcie potrzeby dializy. Przyswajające amoniak szczepy można podawać pacjentom z uszkodzeniem wątroby i encefalopatia, np. w przypadku zapalenia wątroby lub zatrucia albo przy nadużywaniu alkoholu. Obniżone przyswajanie substancji azotowych z jelita w tych sytuacjach przyniesie poprawę w encefalopatii i działaniu wątroby. Przyswajające amoniak szczepy Bifidobacterium infantis można podawać małym dzieciom, ludziom starszym lub konsumentom, u których występują choroby hamując ich wydolność wątroby w przemianie amoniaku w mocznik albo u których występuje zwiększone przyswajanie azotu z jelita, np. u pacjentów z przewlekłym zaburzeniem nerek lub wątroby o stopniu od niewielkiego do średniego, którzy jeszcze nie wymagają przeszczepu lub dializy.
W szczególnej postaci środek według wynalazku może także zawierać jeden lub większą liczbę szczepów Lactobacillus.
Oprócz dodatkowych korzystnych efektów działania pałeczek kwasu mlekowego jako takich, bakterie te mogą chronić bifidobakterie przed szkodliwym wpływem tlenu.
Szczepy należące do gatunku Bifidobacterium infantis są odpowiednie do stosowania w terapii.
Zgodnie z wynalazkiem możliwe jest zastosowania jednego lub większej liczby szczepów Bifidobacterium infantis CURE 19, DSM 15158; Bifidobacterium infantis CURE 21, DSM 15159; Bifidobacterium infantis CURE 26, DSM 15160; Bifidobacterium infantis CURE 28, DSM 15161; Bifidobacterium infantis CURE 29, DSM 15162; do wytwarzania leku do leczenia pacjentów pozostających pod intensywną opieką medyczną z dysfunkcją wielu narządów i zaburzeniem jelit, do profilaktyki w chemioterapii pacjentów oraz u pacjentów z chorobami zapalnymi oraz do pooperacyjnego podawania po dużej operacji chirurgicznej.
Szczepy według wynalazku można stosować także w środkach spożywczych, w którym nośnikiem jest produkt spożywczy. Wytwarzające glutaminę szczepy Bifidobacterium można podawać małym dzieciom, ludziom starszym, sportowcom i zwyczajnym konsumentom, którzy chcą zachować sprawność w celu polepszenia działania mięśni i zapobieżenia depresji immunologicznej po wysiłku fizycznym. Wytwarzające argininę szczepy Bifidobacterium można podawać zwyczajnym konsumentom, którzy chcą zachować sprawność i chcą przeciwdziałać negatywnemu wpływowi na funkcjonowanie układu immunologicznego.
Takie środki zawierają jeden lub większą liczbę szczepów Bifidobacterium według wynalazku w połączeniu z nośnikiem. Przykłady noś ników obejmują kleik z mąki owsianej, żywność fermentowaną kwasem mlekowym, inulinę, laktulozę, fruktooligosacharydy, odporną skrobię, β-glukany i gumę guarową. W celu poprawy proliferacji bifidobakterii i zwiększenia wytwarzania odpowiednio glutaminy i argininy oraz wiązania amoniaku w okrężnicy do opisanego środka należy dodawać włókna spożywcze. Włóknami spożywczymi są przykładowo inulina, fruktooligosacharydy, maltodekstryny, β-glukany i guma guarowa. W związku z tym wynalazek dotyczy także opisanego preparatu zawierającego dodatkowo włóknik spożywczy.
Poniżej opisano figury rysunku dla dokładniejszego przedstawienia wynalazku.
Figura 1 przedstawia elektroforogramy uzyskane z analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) szczepów CURE 19, CURE 21, CURE 26, CURE 28 i CURE 29, otrzymanych przez trawienie DNA enzymami odpowiednio BcoRI i HindIII, a następnie hybrydyzację z sondą w postaci DIG znakowanego fragmentu o długości 420 pz (pozycja 506 - 926, numeracja E. coli) genu 16SrRNA L. casei podgatunek pseudoplantarum DSM 20008, z zastosowaniem hybrydyzacji Southern biot. Jako wzorzec zastosowano znacznik masy cząsteczkowej DNA II (Roche) i znacznik masy cząsteczkowej DNA VI (Roche), znakowane DIG.
PL 212 096 B1
Figura 2 przedstawia zdjęcie rozdzielonych fragmentów DNA uzyskanych przez trawienie chromosomalnego DNA szczepów CURE 19 (ścieżka 1), CURE 29 (ścieżka 2) i CURE 28 (ścieżka 3) enzymem restrykcyjnym EcoRI (analiza z użyciem endonukleazy restrykcyjnej, REA). Jako wzorce zastosowano znacznik DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (BRL) i znacznik masy cząsteczkowej DNA VI (Roche) (ścieżka 4).
Figura 3 przedstawia zdjęcie rozdzielonych fragmentów DNA uzyskanych przez trawienie chromosomalnego DNA szczepów CURE 19 (ścieżka 2), CURE 28 (ścieżka 3) i CURE 29 (ścieżka 4) enzymem restrykcyjnym HindIII. Jako wzorce zastosowano znacznik DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (BRL) i znacznik masy cząsteczkowej DNA VI (Roche) (ścieżki 1 i 5).
Figura 4 przedstawia zdjęcie rozdzielonych fragmentów DNA uzyskanych po trawieniu DNA szczepów CURE 21 (ścieżka 1) i CURE 26 (ścieżka 2) enzymem restrykcyjnym EcoRI. Jako wzorce zastosowano znacznik DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (MD, USA) i znacznik masy cząsteczkowej DNA VI (Roche) (ścieżka 3).
Figura 5 przedstawia zdjęcie rozdzielonych fragmentów DNA uzyskanych po trawieniu DNA szczepów CURE 21 (ścieżka 2) i CURE 26 (ścieżka 3) enzymem restrykcyjnym HindlII. Jako wzorce zastosowano znacznik DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (MD, USA) i znacznik masy cząsteczkowej DNA VI (Roche) (ścieżki 1 i 4).
Figura 6. Wskaźnik aktywności chorobowej w dniu 4, 5, 6 i 7. * oznacza p < 0,05 w porównaniu z kontrolą zapalenia okrężnicy, a oznacza p < 0,05 w porównaniu z L. gasseri, # oznacza p < 0,05 w porównaniu z L. paracasie.
Wynalazek ilustrują poniższe przykłady, w których opisano przeprowadzone doświadczenia.
Izolowanie szczepów
Wszystkie szczepy wyizolowano z kału małych dzieci w wieku od tygodnia do jednego roku. Próbki kału rozcieńczono seryjnie w roztworze do rozcieńczania (0,9% [wag./obj.] NaCl, 0,1% [wag./obj.] pepton, 0,1% [wag./obj.] Tween 80, 0,02% [wag./obj.] cysteina-HCl) i rozprowadzono na płytkach z agarem Rogosa. Izolaty wyselekcjonowano pod względem ich zdolności do wzrostu na agarze Rogosa, pH 5,4 i powtórzono izolację od jednego osobnika. Izolaty pobrano z płytek z agarem Rogosa po inkubacji w 37°C przez 72 godziny. Zidentyfikowano je do poziomu rodzaju drogą PCR specyficznej dla rodzaju (Roy i in., 2000; FEMS Microbiological Letters 191:17-24) oraz do poziomu gatunku przez sekwencjonowanie 16S rDNA (Pettersson i in., 2002; Systematic and Applied Microbiology 23:332-336). Szczepy można było wyizolować co najmniej dwukrotnie od tego samego osobnika z przerwą od jednego do czterech tygodni pomię dzy pobieraniem próbek, co wyraź nie wskazuje, ż e szczepy wykazują pewną zdolność do kolonizacji przewodu GI (żołądkowo-jelitowego). Szczepy zidentyfikowano przez rybotypowanie, czyli analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych, RFLP, genu 16S rRNA, oraz REA, czyli analizę z użyciem endonukleazy restrykcyjnej.
Wyizolowano następujące szczepy:
1) Bifidobacterium infantis CURE 19; ma zdolność wzrostu na agarze Rogosa oraz w pewnym stopniu fermentacji kleiku z mąki owsianej, „kwaśny zapach po fermentacji.
2) Bifidobacterium CURE 20; ma zdolność wzrostu na agarze Rogosa oraz w pewnym stopniu fermentacji kleiku z mąki owsianej, „kwaśny zapach po fermentacji.
3) Bifidobacterium infantis CURE 21; ma zdolność wzrostu na agarze Rogosa oraz w pewnym stopniu fermentacji kleiku z mąki owsianej, „kwaśny zapach po fermentacji.
4) Bifidobacterium CURE 22; ma zdolność wzrostu na agarze Rogosa oraz w pewnym stopniu fermentacj i kleiku z mąki owsianej, „przyjemny zapach po fermentacji.
5) Bifidobacterium CURE 23; ma zdolność wzrostu na agarze Rogosa oraz w pewnym stopniu fermentacji kleiku z mąki owsianej, „przyjemny zapach po fermentacji.
6) Bifidobacterium infantis CURE 24; ma zdolność wzrostu na agarze Rogosa oraz w pewnym stopniu fermentacji kleiku z mąki owsianej, „przyjemny zapach po fermentacji.
7) Bifidobacterium CURE 25; ma zdolność wzrostu na agarze Rogosa oraz fermentacji kleiku z mą ki owsianej.
8) Bifidobacterium infantis CURE 26; ma zdolność wzrostu na agarze Rogosa oraz fermentacji kleiku z mąki owsianej.
9) Bifidobacterium dentium CURE 27; ma zdolność wzrostu na agarze Rogosa oraz fermentacji kleiku z mąki owsianej.
10) Bifidobacterium infantis CURE 28; ma zdolność wzrostu na agarze Rogosa oraz fermentacji kleiku z mąki owsianej.
PL 212 096 B1
11) Bifidobacterium infantis CURE 29; ma zdolność wzrostu na agarze Rogosa oraz fermentacji kleiku z mąki owsianej.
12) Bifidobacterium infantis CURE 30; ma zdolność wzrostu na agarze Rogosa oraz fermentacji kleiku z mąki owsianej.
Wytwarzanie glutaminy
Wyizolowane szczepy 1-12 zbadano pod względem wytwarzania glutaminy w pożywce hodowlanej, z zastosowaniem następującej procedury.
Badane szczepy hodowano w 37°C przez 4 dni w pożywce wzrostowej (bulion) w zmodyfikowanej wersji pożywki opisanej w Matteuzzi i in. (Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur, 1978, 129B:175-181). Bulion zawierał: octan sodu, 10 g/l; kwas askorbinowy, 10 g/l; siarczan amonu ((NH4)2SO4), 5 g/l; wodorofosforan potasu (K2HPO4), 3 g/l; diwodorofosforan potasu (KH2PO4), 3 g/l; MgSO4x7H2O, 0,32 g/l; FeSO4x7H2O, 0,01 g/l; MnSO4xH2O, 0,007 g/l; NaCl, 0,01 g/l; ekstrakt drożdżowy, 0,5 g/l, glukozę, 20 g/l; Tween 80, 1 ml/l. Przed umieszczeniem w autoklawie pH doprowadzono do 6,18-6,24 z uż yciem 1M NaOH.
Stężenie glutaminy w pożywce mierzono przed zaszczepieniem bakteriami i po wzroście badanego szczepu. Po wzroście, hodowlę odwirowano i supernatant wyjałowiono przez filtrację, a następnie po usunięciu komórek zamrożono w -80°C. Aminokwasy analizowano za pomocą automatycznego analizatora (Biochrom 20, Pharmacia Biotech) po dodaniu kwasu sulfosalicylowego i nastawieniu pH wodorotlenkiem litu.
Wzrost stężenia glutaminy i kwasu glutaminowego w bulionie po wzroście różnych badanych szczepów przedstawiono w tabeli 1 poniżej.
T a b e l a 1 . Wzrost stężenia glutaminy i zmniejszenie/wytwarzanie kwasu glutaminowego w pożywce hodowlanej po wzroście badanych szczepów Bifidobacterium.
Badany szczep Glutamina ^mol/l) Kwas glutaminowy [zmniejszenie ilości (R), wytwarzanie (P) w μmol/l]
B. infantis CURE 19 53 (29-67)# R
Bifidobacterium CURE 20 4,2 (3,5-4,8)$ R
B. infantis CURE 21 37 (36-38)# P 37 (31-41)
Bifidobacterium CURE 22 16(14-18)$ R
Bifidobacterium CURE 23 8,9 (8,1-9,6)$ R
B. infantis CURE 24 3,0 (0-5,9)$ R
B. infantis CURE 25 35 R
B. infantis CURE 26 36 P 60
B. dentium CURE 27 7,4 R
B. infantis CURE 28 35 R
B. infantis CURE 29 28 R
B. infantis CURE 30 37 R
# Ś rednia warto ść z trzech próbek pochodzą cych z trzech osobnych hodowli. $ Średnia wartość z dwóch próbek pochodzących z dwóch osobnych hodowli.
Wszystkie badane szczepy wytwarzały pewną ilość glutaminy, ale tylko 7 z 12 badanych szczepów wykazywało stosunkowo wysokie wytwarzanie glutaminy (> 20 μmol/l). W przypadku wszystkich, z wyjątkiem dwóch szczepów (CURE 21 i CURE 26), wzrost ilości glutaminy występował razem z silnym obniżeniem stężenia kwasu glutaminowego w pożywce. W pożywce, do której dodano bakterie, średnie wyjściowe stężenie kwasu glutaminowego wynosiło 223 μmol/l, a zawartość glutaminy wynosiła zero. Trzy szczepy CURE 20, CURE 23 i CURE 24 zużyły cały dostępny kwas glutaminowy z pożywki, podczas gdy CURE 28 obniżył stężenie kwasu glutaminowego do 247 gmol/l, CURE 29 do 220 gmol/l, CURE 22 do 187 μ^Μ, CURE 19 do 128 gmol/l, CU-RE 30 do 160 μmol/l, CURE 27 do 151 gmol/l, a CURE 25 do 47 μmol/l. Można przypuszczać, że te bakterie przetwarzają kwas glutaminowy w glutaminę. Dwa szczepy, CURE 21 i CURE 26, wytwarzały glutaminę bez jakiegokolwiek obPL 212 096 B1 niżenia stężenia kwasu glutaminowego w pożywki. W odróżnieniu od innych szczepów zwiększały one poziom kwasu glutaminowego w pożywce.
Wytwarzanie argininy
Wytwarzanie aminokwasów przez każdy z badanych szczepów zmierzono po wzroście badanego szczepu w 37°C przez 4 dni w pożywce wzrostowej (bulion) w zmodyfikowanej wersji pożywki opisanej w Matteuzzi i in. (1978). Bulion zawierał: octan sodu, 10 g/l; kwas askorbinowy, 10 g/l; siarczan amonu ((NH4)2SO4), 5 g/l; wodorofosforan potasu (K2HPO4), 3 g/l; diwodorofosforan potasu (KH2PO4), 3 g/l; MgSO4x7H2O, 0,32 g/l; FeSO4x7H2O, 0,01 g/l; MnSO4xH2O, 0,007 g/l; NaCl, 0,01 g/l; ekstrakt drożdżowy, 0,5 g/l, glukozę, 20 g/l; Tween 80, 1 ml/l. Przed umieszczeniem w autoklawie pH doprowadzono do 6,18-6,24 z użyciem 1M NaOH.
Stężenie aminokwasów w pożywce hodowlanej mierzono przed zaszczepieniem bakterii i po wzroście badanego szczepu. Po wzroście hodowlę odwirowano i supernatant wyjałowiono przez filtrację, a następnie po usunięciu komórek zamrożono w -80°C. Aminokwasy analizowano za pomocą automatycznego analizatora (Biochrom 20, Pharmacia Biotech) po dodaniu kwasu sulfosalicylowego i zastawieniu pH wodorotlenkiem litu.
Wzrost stężenia argininy i cytruliny w pożywce hodowlanej po wzroście różnych badanych szczepów przedstawiono w tabeli 2.
T a b e l a 2
Zwiększenie stężenia argininy i cytruliny w pożywce hodowlanej po wzroście badanych szczepów.
Badany szczep Argininą (pmole/l) Cytrulina (pmole/l)
B. infantis CURE 19 11 (8,8-14)# 52 (9,2-136)#
Bifidobacterium CURE 20 0$ 4,1 (4,4_3,7)$
B. infantis CURE 21 0# 0#
Bifidobacterium CURE 22 0$ 6,3 (5,8-6,7)$
Bifidobacterium CURE 23 2,0 (0-3,9)$ 6,1 (5,4-6,8)
B. infantis CURE 24 0$ 0$
B. infantis CURE 25 0 4,2
B. infantis CURE 26 2,6 0
B. dentium CURE 27 4,9 0,0
B. infantis CURE 28 37 202
B. infantis CURE 29 26 13
B. infantis CURE 30 2,0 5,7
# Ś rednia warto ść z trzech próbek pochodzą cych z trzech osobnych hodowli. $ Średnia wartość z dwóch próbek pochodzących z dwóch osobnych hodowli.
Trzy z 12 badanych szczepów zwiększyły stężenie argininy o więcej niż 10 μmoli/l, tj. CURE 19, CURE 28 i CURE 29. Dwa z wymienionych szczepów wytwarzały także w wyjątkowo wysokim stopniu cytrulinę (> 100 μmoli/l,), tj. CURE 19 i CURE 28. Cytrulina powstaje w wyniku odaminowania argininy lub w wyniku działania syntazy NO z wytworzeniem NO. Powstawanie cytruliny odzwierciedla także wytwarzanie argininy na jego wcześniejszym etapie.
Także inne aminokwasy przenikały do bulionu podczas wzrostu badanych szczepów, patrz tabela 3. CURE 21 wcale nie wytwarzał cytruliny lub argininy, ale wytwarzał znaczące podwyższone ilości kwasu asparaginowego i tyrozyny. CURE 26 wcale nie wytwarzał cytruliny, ale wytwarzał bardzo niewielkie ilości argininy i szerokie spektrum innych aminokwasów. Ponadto CURE 26 był jedynym badanym szczepem o podwyższonym stężeniu proliny w pożywce hodowlanej. Wszystkie badane szczepy wytwarzały treoninę.
PL 212 096 B1
T a b e l a 3
Wzrost stężenia aminokwasów ^moli/l), oprócz glutaminy, kwasu glutaminowego, argininy i cytruliny, w poż ywce hodowlanej po wzroście badanych szczepów
Szczep Thr Tyr Cys Asp Ala Gly Ile
CURE 19 39 15 0 23 15 0 0
CURE 21 51 21 0 96 0 0 0
CURE26 46 46 12 151 61 0 6
CURE28 44 12 14 0 0 0 0
CURE29 35 28 0 0 2 0 0
Thr - treonina; Tyr - tyrozyna; Cys - cysteina; Asp - kwas asparaginowy; Ala - alanina; Gly - glicyna; Ile - izoleucyna.
Przedstawione wartości są średnimi z trzech lub dwóch próbek pochodzących z trzech lub dwóch osobnych hodowli.
Identyfikacja genotypowa
REA
Szczepy zbadano pod względem profilu trawienia chromosomalnego DNA metodą analizy z użyciem endonukleazy restrykcyjnej - REA - według Stahl M, Molin G, Persson A, Ahrne S i Stahl S, International Journal of Systematic Bacteriology, 40:189-193, 1990 rozwiniętą przez Johansson, M-L i in., International Journal of Systematic Bacteriology 45:670-675, 1995. Schematycznie REA można opisać w następujący sposób: wyizolowano chromosomalny DNA ze szczepów objętych badaniem i strawiono je endonukleazami restrykcyjnymi. Po 0,75 gg każdego z DNA osobo trawiono w 37°C przez 4 godziny z 10 jednostkami BcoRI i HindIII; każdą endonukleazę stosowano osobno. Fragmenty strawionego DNA rozdzielano pod względem wielkości drogą elektroforezy żelowej z użyciem zanurzonych poziomych bloków żelu agarozowego. Żele zawierały 150 ml 0,9% agarozy (ultraczysta, gatunek do DNA; o niskiej elektroendoosmozie; BioRad Laboratories, Richmond, USA) i były wylane jako bloki żelu (150 na 235 mm). Jako wzorce zastosowano 0,2 gg znacznika DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (Bethesda Research Laboratories, MD, USA) razem z 0,5 gg znacznika masy cząsteczkowej DNA VI (Roche, Niemcy). Minimalne zniekształcenie prążków i ich maksymalną ostrość uzyskano przy nanoszeniu próbki DNA w buforze do nanoszenia Ficoll (2 g Ficoll, 8 ml wody, 0,25% bromofenolu).
Rozdział na żelu prowadzono przy stałym napięciu 40 V przez 18 godzin w około 6-8°C. Podczas elektroforezy stosowano obieg buforu (89 mM Tris, 23 mM H3PO4, 2 mM sól sodowa EDTA, pH 8,3). Następnie żele barwiono przez 20 minut w bromku etydyny (2 gg/ml) i odbarwiono w destylowanej wodzie, wizualizowano przy 302 nm z użyciem transiluminatora UV (UVP Inc., San Gabriel, USA) i fotografowano. Ten sposób prowadzenia elektroforezy zapewniał dobry rozkład i stosunkowo dobrze rozdzielone prążki do masy cząsteczkowej 1,2 x 106.
RFLP genu 16S rRNA (rybotypowanie)
Przygotowanie chromosomalnego DNA i analizę z użyciem endonukleazy restrykcyjnej przeprowadzono w sposób wcześniej opisany (Stahl i in., 1990, Stahl i in., 1994).
Sondę stanowił fragment wielkości 420 pz (pozycje 506-926, numeracja E. coli) genu 16S rRNA
L. casei podgatunek pseudoplantarum DSM 20008, otrzymany metodą PCR i znakowany techniką znakowania DNA DIG zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta (Boehringer Mannheim, Bromma, Szwecja). Ilość sondy stosowanej w reakcjach wynosiła 50 ng.
Hybrydyzacja Southern blot. Chromosomalny DNA (1 gg) trawiono 10 U EcoRI i HindIII (Boehringer Mannheim) przez 4 godziny w 37°C. Rozdział fragmentów restrykcyjnych drogą elektroforezy w żelu agarozowym przeprowadzono według Stahl i in., 1994. Jako wzorce zastosowano znakowane DIG znacznik masy cząsteczkowej DNA II i znacznik masy cząsteczkowej DNA VI (Roche, Germany). DNA unieruchomiono na dodatnio naładowanej membranie nylonowej (Roche) przez wypalanie w ciągu 30 minut w 120°C. Wstępną hybrydyzację, hybrydyzację i wykrywanie chemiluminescencyjne przy pomocy substratu CSPDX® (Roche) przeprowadzono według instrukcji dostarczonych przez producenta. Temperatura hybrydyzacji wynosiła 68°C. Wynikiem testu był pojedynczy prążek o wielkości cząsteczki około 2840 kb dla wszystkich czterech szczepów (CURE 19, 21, 26, 28 i 29), gdy chromosomalny DNA strawiono HindIII. Gdy chromosomalny DNA strawiono EcoRI, geny 16S rRNA dały
PL 212 096 B1 pojedynczy fragment o wielkości cząsteczki około 895 kb w szczepach CURE 21 i 26, podczas gdy inny pojedynczy fragment o wielkości cząsteczki około 3420 kb uzyskano dla szczepów CURE 19, 28 i 29.
Test in vivo
Test 1. Wpływ szczepów Lactobacillus i Bifidobacterium na wywołane DSS zapalenie okrężnicy u szczurów
Celem badania było porównanie wpływu szczepów Lactobacillus i Bifidobacterium na wywołane DDS (sól sodowa siarczanu dekstranu) zapalenie okrężnicy u szczurów.
Szczury Sprague Dawley podzielono na sześć grup, jedną grupę kontrolną (zapalenie okrężnicy bez podawania bakterii) oraz pięć grup, którym podawano różne szczepy bakterii (odpowiednio Lactobacillus plantarum 299v, Lactobacillus paracasei 8700:2, Lactobacillus gasseri LGl, Bifidobacterium 3B1 i Bifidobacterium infantis CURE 19). Szczepy bakteryjne podawano doustnie przez 7 dni przed wywołaniem zapalenia okrężnicy (dzień 0) i dalej podawano przez 7 dni w połączeniu z DDS (5% wag./obj. rozpuszczona w wodzie). Stopień zapalenia okrężnicy określano codziennie jako DAI (Disease Activity Index, wskaźnik aktywności choroby). Próbki pobrano w dniu 14 i oznaczono przemieszczenie bakterii i ich liczbę w jelicie.
U grup otrzymujących Lactobacillus plantarum 299v, Bifidobacterium 3B1 i Bifidobacterium CURE 19, DAI obniżył się znacząco w dniach 4, 5, 6 i 7 w porównaniu z grupą kontrolną. Ponadto DAI był znacząco niższy u grupy otrzymującej B. infantis CURE 19 w porównaniu z grupami otrzymującymi Lactobacillus paracasei 8700:2 i Lactobacillus gasseri LGl po 6 i 7 dniach. W porównaniu z grupą kontrolną zapalenia okrężnicy, przemieszczenie bakterii do krezkowych gruczołów chłonnych znacznie się zmniejszyło we wszystkich grupach, podobnie jak przemieszczenie Enterobacteriaceae do wątroby.
Podsumowując, podawane doustnie szczepy bakteryjne Lactobacillus plantarum 299v, Lactobacillus paracasei 8700:2, Lactobacillus gasseri LGl, Bifidobacterium 3B1 i Bifidobacterium infantis
CURE 19 są w stanie wywołać pozytywne działanie przez zmniejszanie przemieszczenia bakterii w doświadczalnym zapaleniu okrężnicy u szczurów. Lactobacillus plantarum 299v, Bifidobacterium 3B1 i Bifidobacterium infantis CURE 19 wykazały najsilniejsze działanie pod względem poprawy DAI w wywołanym DDS zapaleniu okrężnicy u szczurów. Bifidobacterium infantis CURE 19 był w pewnym stopniu bardziej skuteczny w przeciwdziałaniu zapaleniu okrężnicy niż inne szczepy nawet po 6- i 7-dniowym traktowaniu (patrz fig. 6).
Test 2. Przeżycie Lactobacillus i/lub Bifidobacterium w przewodzie GI po podaniu doustnym
Podanie doustne Lactobacillus lub Bifidobacterium wywołuje różne pozytywne efekty, np. zapobiegając biegunce związanej z podawaniem antybiotyków (D'Souza i in., 2002, BMJ 324:1361).
Pozytywne działanie można osiągnąć pod warunkiem, że bakterie przeżyją podanie doustne i będą mieć zdolność do przeżycia i rozwijania się w jelitach. W celu znalezienia odpowiednich szczepów, które można stosować jako probiotyki, kilka możliwych szczepów kandydackich podano doustnie zdrowym ochotnikom. Określenie częstości występowania podanych szczepów w kale pozwala zidentyfikować szczepy o dużej zdolności przeżycia. Celem tego badania było znalezienie szczepów bakterii podawanych doustnie o wyjątkowej zdolności do przeżywania i rozwijania się w przewodzie żołądkowo-jelitowym człowieka.
Projekt badania
Przez cztery tygodnie 14 ochotników piło mieszaninę zawierającą około 20 różnych szczepów Lactobacillus i Bifidobacterium. Wszystkie te szczepy były przedstawicielami szczepów występujących u ludzi lub w pożywieniu, z którego może powstawać kwas mlekowy. Próbki kału pobierano przed podawaniem, po 3 tygodniach od podawania i tydzień po zakończeniu podawania. Florę bakteryjną oznaczano przez zliczenia bakterii, które przeżyły, oraz RAPD (losowo namnażanego polimorficznego DNA; Johansson i in., 1995).
Wnioski
Wyniki wykazały, że wybrane szczepy, tj. Bifidobacterium infantis CURE 19, DSM 15158; Bifidobacterium CURE 21, DSM 15159; Bifidobacterium infantis CURE 26, DSM 15160; Bifidobacterium infantis CURE 28, DSM 15161; oraz Bifidobacterium infantis CURE 29, DSM 15162, mogą przeżyć przejście przez przewód pokarmowy nawet po podaniu doustnym. Badania prowadzone na szczurach także wykazały możliwość wywierania pozytywnego działania na doświadczalne zapalenie okrężnicy.

Claims (9)

1. Wyizolowany szczep Bifidobacterium infantis, wybrany z grupy obejmującej Bifidobacterium infantis CURE 21, DSM 15159, i Bifidobacterium infantis CURE 26, DSM 15160, wykazujący zdolność do przeżycia w przewodzie jelitowym oraz do wytwarzania glutaminy in vivo.
2. Szczep według zastrz. 1, wykazujący zdolność przyswajania amoniaku.
3. Wyizolowany szczep Bifidobacterium infantis, wybrany z grupy obejmującej Bifidobacterium infantis CURE 19, DSM 15158, Bifidobacterium infantis CURE 28, DSM 15161, i Bifidobacterium infantis CURE 29, DSM 15162, wykazujący zdolność do przeżycia w przewodzie jelitowym oraz do wytwarzania glutaminy in vivo.
4. Szczep według zastrz. 3, wykazujący zdolność przyswajania amoniaku.
5. Szczep według zastrz. 3 albo 4, wykazujący zdolność do wytwarzania argininy.
6. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera jeden lub większą liczbę szczepów Bifidobacterium infantis zdefiniowanych w zastrz. 1 - 5 w połączeniu z nośnikiem.
7. Środek według zastrz. 6, znamienny tym, że stanowi środek farmaceutyczny, w którym nośnik stanowi terapeutycznie dopuszczalny nośnik.
8. Środek według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że zawiera także jeden lub większą liczbę szczepów Lactobacillus.
9. Jeden lub większa liczba szczepów zdefiniowanych w zastrz. 1 - 5 do stosowania jako lek.
PL378435A 2003-01-31 2004-01-27 Wyizolowane szczepy Bifidobacterium infantis i środek farmaceutyczny PL212096B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE0300245A SE526711C2 (sv) 2003-01-31 2003-01-31 Nya stammar av Bifidobacterium med förmåga att överleva i magtarmkanalen och producera glutamin in vivo, samt kompositioner och användningar därav
US44727403P 2003-02-14 2003-02-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL378435A1 PL378435A1 (pl) 2006-04-03
PL212096B1 true PL212096B1 (pl) 2012-08-31

Family

ID=20290264

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL378435A PL212096B1 (pl) 2003-01-31 2004-01-27 Wyizolowane szczepy Bifidobacterium infantis i środek farmaceutyczny

Country Status (16)

Country Link
US (1) US7947482B2 (pl)
EP (1) EP1587913B1 (pl)
JP (1) JP4540664B2 (pl)
CN (1) CN100558883C (pl)
AT (1) ATE496115T1 (pl)
AU (1) AU2004208084B2 (pl)
BR (1) BRPI0407176B8 (pl)
CA (1) CA2514659C (pl)
DE (1) DE602004031079D1 (pl)
DK (1) DK1587913T3 (pl)
ES (1) ES2362496T3 (pl)
PL (1) PL212096B1 (pl)
RU (1) RU2352628C2 (pl)
SE (1) SE526711C2 (pl)
WO (1) WO2004067731A1 (pl)
ZA (1) ZA200505777B (pl)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11045507B2 (en) 2019-02-21 2021-06-29 Ewelina Sosnowska-Turek Bifidobacterium animalis AMT30 strain and the composition containing the strain of Bifidobacterium animalis AMT30

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2561629T3 (es) 2005-09-28 2016-02-29 Nordisk Rebalance A/S Tratamiento del SII usando como efectores de tratamiento tanto bacterias probióticas como cereales fermentados
DK1951272T3 (en) * 2005-10-06 2016-09-19 Probi Ab Use of lactobacillus for treatment of virus infections
CN105671120B (zh) * 2010-07-05 2019-02-19 株式会社明治 具有肠内腐败物质的减少作用的双歧杆菌
CL2010001124A1 (es) 2010-10-14 2011-01-21 Univ De Concepcion 50% Ma Loreto Ormeno 50% Alimento funcional probiotico que comprende cepas viables de lactobacillus sp.; uso de dicho alimento funcional para contrarestar los efectos colaterales de la quimioterapia.
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
CN103131647B (zh) * 2011-11-29 2017-06-27 上海上药信谊药厂有限公司 婴儿双歧杆菌及其制剂
CN104780932A (zh) 2012-02-29 2015-07-15 伊西康内外科公司 微生物区系的组合物及与其相关的方法
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
EP4529950A3 (en) 2014-10-31 2025-08-20 Pendulum Therapeutics, Inc. Methods and compositions relating to microbial treatment
WO2019046646A1 (en) 2017-08-30 2019-03-07 Whole Biome Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF MICROBIOMA ASSOCIATED DISORDERS
CN108330166A (zh) * 2017-09-06 2018-07-27 深圳市百澳飞生物技术有限公司 一种酶制剂的饲用活性评估方法
WO2020018949A2 (en) 2018-07-19 2020-01-23 Pendulum Therapeutics, Inc. Methods and compositions for microbial engraftment
RU2699967C1 (ru) * 2018-12-25 2019-09-11 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Астраханский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России) Способ комплексного лечения энтеральной недостаточности у детей с тяжелой термической травмой

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59155321A (ja) * 1983-02-25 1984-09-04 Riyoushiyoku Kenkyukai 整腸用製剤
DE3406772A1 (de) * 1984-02-24 1986-03-13 Angelo 8137 Berg Schuler Diaetetisches mittel zur herabsetzung der harnstoffkonzentration in koerperfluessigkeiten und seine herstellung
SE9002732D0 (sv) * 1990-08-24 1990-08-24 Kabivitrum Ab Product containing growth factor
IT1254210B (it) 1992-02-10 1995-09-14 Simone Claudio De Composizioni dietetiche e/o farmaceutiche a base di batteri lattici liofilizzati, loro preparazione e impiego
JP3623977B2 (ja) * 1993-10-29 2005-02-23 明治乳業株式会社 潰瘍性大腸炎治療剤
JP4852681B2 (ja) * 1996-02-28 2012-01-11 雪印メグミルク株式会社 腸管内細胞溶解活性抑制剤
IT1288119B1 (it) * 1996-06-28 1998-09-10 Renata Maria Anna Ve Cavaliere Composizioni dietetiche da utilizzare nell'alimentazione per via enterica
RU2112034C1 (ru) * 1996-12-26 1998-05-27 Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского Штамм bifidobacterium infantis 73-15, используемый для приготовления бифидосодержащих бактерийных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания
CN1099289C (zh) * 1997-08-01 2003-01-22 北京东方百信生物技术有限公司 改善肠道生态平衡的微生物制剂及其工艺
US6203797B1 (en) * 1998-01-06 2001-03-20 Stephen C. Perry Dietary supplement and method for use as a probiotic, for alleviating the symptons associated with irritable bowel syndrome
ID29150A (id) * 1999-01-15 2001-08-02 Entpr Ireland Cs Penggunaan lactobacillus salivarius
AU6160200A (en) * 1999-08-05 2001-03-05 Societe Des Produits Nestle S.A. New bifidobacteria preventing diarrhea caused by pathogenic bacteria
US6468525B1 (en) * 1999-08-10 2002-10-22 Renew Life, Inc. Probiotic formulation
CA2407724A1 (en) 2000-05-03 2001-11-08 University Of Maryland, Baltimore Oral gram(+) bacteria and glutamine composition for prevention and/or treatment of gastro-intestinal
AU2001265253A1 (en) * 2000-07-07 2002-01-21 First Circle Medical, Inc. Treatment of hiv using hyperthermia
JP2002186422A (ja) * 2000-12-22 2002-07-02 Morinaga Milk Ind Co Ltd ラクトバシラス・ガッセリ及びビフィドバクテリウム属の菌を含有する非発酵食品
FI109602B (fi) * 2001-01-25 2002-09-13 Valio Oy Probioottiyhdistelmä
ATE375164T1 (de) * 2001-02-06 2007-10-15 Nestle Sa Endotoxin-bindung durch milchsäurebakterien und bifidobacteria
US20030017192A1 (en) * 2001-06-19 2003-01-23 Hanny Kanafani Process for producing extended shelf-life ready-to-use milk compositions containing probiotics
PE20030284A1 (es) * 2001-07-26 2003-05-01 Alimentary Health Ltd Cepas de bifidobacterium
JP3364491B2 (ja) * 2002-07-25 2003-01-08 株式会社アトリエ・ド・フロマージュ ヨーグルトおよびその製造方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11045507B2 (en) 2019-02-21 2021-06-29 Ewelina Sosnowska-Turek Bifidobacterium animalis AMT30 strain and the composition containing the strain of Bifidobacterium animalis AMT30

Also Published As

Publication number Publication date
US20060269533A1 (en) 2006-11-30
WO2004067731A1 (en) 2004-08-12
CN1777670A (zh) 2006-05-24
SE0300245L (sv) 2004-08-01
SE0300245D0 (sv) 2003-01-31
CA2514659C (en) 2014-07-08
EP1587913A1 (en) 2005-10-26
US7947482B2 (en) 2011-05-24
PL378435A1 (pl) 2006-04-03
JP4540664B2 (ja) 2010-09-08
AU2004208084B2 (en) 2008-10-09
ES2362496T3 (es) 2011-07-06
SE526711C2 (sv) 2005-10-25
EP1587913B1 (en) 2011-01-19
CA2514659A1 (en) 2004-08-12
DK1587913T3 (da) 2011-04-11
JP2006516405A (ja) 2006-07-06
ATE496115T1 (de) 2011-02-15
RU2005127331A (ru) 2006-01-27
DE602004031079D1 (de) 2011-03-03
BRPI0407176A (pt) 2006-02-07
ZA200505777B (en) 2007-12-27
AU2004208084A1 (en) 2004-08-12
RU2352628C2 (ru) 2009-04-20
CN100558883C (zh) 2009-11-11
BRPI0407176B8 (pt) 2021-05-25
BRPI0407176B1 (pt) 2018-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2324532T3 (es) Bacteria probiotica: lactobacillus fermentum.
US10583158B2 (en) Compositions comprising bacterial strains
La Ragione et al. In vivo characterization of Lactobacillus johnsonii FI9785 for use as a defined competitive exclusion agent against bacterial pathogens in poultry
US10155015B2 (en) Probiotic compositions for use in the treatment of bowel diseases
Saulnier et al. Microbiology of the human intestinal tract and approaches for its dietary modulation
US9839657B2 (en) Prebiotic compositions comprising one or more types of bacteriophage
JP4011532B2 (ja) ビフィズス菌およびそれを含有する製剤
EP2828375B1 (en) Gaba-producing culturable bacteria derived from the human gastrointestinal tract
TW201805011A (zh) 包含細菌菌株之組合物
JP2006522766A (ja) シンビオティックな組み合わせ
CN1568365A (zh) 包含戊糖乳杆菌菌株的组合物及其用途
CN112218646B (zh) 一种组合物及其应用
PL212096B1 (pl) Wyizolowane szczepy Bifidobacterium infantis i środek farmaceutyczny
CN116396884A (zh) 鼠李糖乳杆菌和一种抑制幽门螺杆菌的组合物
US11224620B2 (en) Compositions comprising bacterial strains
RU2724585C2 (ru) Пробиотическая композиция для восстановления микрофлоры кишечника и для профилактики синдрома избыточного бактериального роста и диарей и способ ее получения
Beccati Investigations of prebiotics and of inter-and intra-molecular glycan-protein interactions
KR20230053941A (ko) 정자 기능 개선용 조성물 및 이의 용도
RU2491332C1 (ru) Консорциум бифидобактерий для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок к пище, предназначенных для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет, и способ его получения, биологически активная добавка к пище для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет и бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет
Korzenik The Potential Impact of Probiotics and Prebiotics on Gastrointestinal and Immune Health of Combat Soldiers

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification