CN108330166A - 一种酶制剂的饲用活性评估方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种酶制剂的饲用活性评估方法，包括：使用添加有待评估酶制剂的饲料饲喂动物，同时设置对照组；取饲喂动物粪便，通过16S rDNA测序方法分别得出动物肠道菌群状况；对比对照组，评估动物肠道菌群状况是否具备正向调节的饲用活性。本发明还提供了一种酶制剂饲用活性的综合评估方法，结合动物肠道菌群状况以及饲喂动物性状指标进行综合的评估。本发明提供的评估方法从动物肠道菌群方面出发，依托宏基因组技术，建立了一种全新的酶制剂饲用效果评估方法，填补了目前酶制剂功效评估方面的空白，并为其他饲料添加剂的评估方式开拓了新的思路。

Description

一种酶制剂的饲用活性评估方法
技术领域
本发明涉及饲料及饲料添加剂领域，具体涉及一种酶制剂的饲用活性评估方法。
背景技术
随着畜牧业的不断发展，饲用酶制剂的应用也越发成熟。不仅单酶品种繁多，各种特色复合酶也层出不穷。虽然酶制剂的作用效果得到了广泛认可，但我国对其相关活性指标却没有统一的规定。
目前，在评价酶制剂质量的时候，往往过于依赖检测酶制剂酶活的方法，但是用酶活来评估酶制剂在动物生产中的实际效果是不科学的，酶活高低并不能用来预测产品的相对性能。因为，第一，测定酶活的条件和饲料复合酶在动物体内发挥作用的条件不同，高酶活不代表高饲用效果；第二、测定酶活受底物的种类和供应情况影响较大；第三，测定酶活时都是测定单一酶的酶活，不能很好地反映复合酶的组合效应。因此，迫切需要一种更加全面、更加准确、具有实际参考意义的酶制剂饲用活性评估方法。
发明内容
为填补酶制剂的饲用活性评估方面的空白，本发明的一个目的是提供一种酶制剂的饲用活性评估方法，可准确、客观评估酶制剂在畜牧饲料领域作为添加成分的饲用效果。
本发明提供的酶制剂的饲用活性评估方法包括以下步骤：
S1：使用添加有待评估酶制剂的饲料饲喂动物，同时设置不含所述酶制剂的饲料饲喂动物作为对照组；
S2：取饲喂动物粪便，通过16S rDNA测序方法分别得出动物肠道菌群状况；以及
S3：对比对照组，评估动物肠道菌群状况是否具备以下特征：有益菌菌群丰度上调、致病菌菌群丰度下调或消失；如果具有该特征，则判定所述酶制剂具有肠道菌群正向调节的饲用活性，反之，则判定所述酶制剂具有肠道菌群负向调节的饲用活性。
具有肠道菌群正向调节活性的酶制剂添加至饲料后可改善动物肠道菌群结构和机体代谢，从而有利于提高饲喂动物的生长性能，由此可反映出酶制剂具备良好的饲用活性。反之，肠道菌群负向调节的饲用活性由于致病菌的增多而有益菌的减少势必会引起饲喂动物的腹泻等肠道疾病，无法达到改善动物生长性能的目的，由此可说明酶制剂不具备良好的饲用活性，不适合用作饲料添加剂。
本发明所述的评估方法中，所述的有益菌可以包含饲喂动物肠道菌群中的所有有益菌种类，都可作为反映肠道菌群状况的指标。进一步地，可以选用常见的几种肠道有益菌如拟杆菌、梭菌、双歧杆菌、乳杆菌、乳酸杆菌等的丰度来反映肠道菌群状况。
本发明所述的评估方法中，所述的致病菌可以包含饲喂动物肠道菌群中的所有致病菌种类，都可作为反映肠道菌群状况的指标。进一步地，可以选用常见的几种肠道致病菌如肠球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌等的丰度来反映肠道菌群状况。
本发明所述的评估方法中，所述待评估酶制剂可以为单一种类的酶制剂，也可以为多种类的复合酶制剂。
本发明所述的评估方法中，所述步骤S2包括：取饲喂动物的粪便之后，构建所述动物源菌群的小鼠模型或离体恒化器模型，对所述小鼠或所述离体恒化器模型的菌群进行16S rDNA测序从而得出动物肠道菌群状况；或取饲喂动物的粪便之后，直接进行16S rDNA测序从而得出动物肠道菌群状况。
本发明所述的评估方法中，所述步骤S1中的动物的饲喂时间为8～15天。
本发明所述的评估方法中，所述饲喂动物的数量优选为200～300只。
本发明所述的评估方法中，所述饲喂动物可以为家畜、家禽、水产养殖领域常见的养殖动物，一般而言，考察酶制剂在某类动物饲料中的饲用活性时，相应选取该类动物进行饲喂；优选为猪、牛或羊；更优选为荣昌猪。
本发明还提供了一种酶制剂饲用活性的综合评估方法，其包括对于饲喂动物性状指标的评估以及肠道菌群状况的评估，其中，所述肠道菌群状况的评估采用以上技术方案任一项所述的酶制剂的饲用活性评估方法。
本发明所述的综合评估方法中，根据不同种类的饲喂动物，所述性状指标可包括养殖业目前已有的任意生长性状指标，例如动物的外观表型性状、常见的健康状况指标等等。进一步地，所述性状指标可包括以下一种或多种：日采食量、日增重、料肉比、腹泻指数、毛光泽度及皮肤红润度。
本发明提供的酶制剂的饲用活性评估方法从动物肠道菌群方面出发，依托宏基因组技术，建立了一种全新的酶制剂饲用效果评估方法。通过动物肠道菌群状况，可反映出酶制剂对于动物肠道菌群的调节作用，肠道菌群正向调节活性有利于提高饲喂动物的生长性能。由此可见，本发明的评估方法可全面、准确地反映出单一酶制剂或复合酶制剂作为饲料添加剂时对于饲喂动物的饲养效果，并为其他饲料添加剂的评估方式开拓了新的思路。
本发明提供的酶制剂的饲用活性综合评估方法结合动物内在的肠道菌群状况以及外在的表型性状，可全方位建立一套酶制剂的饲用活性综合评估体系，填补了目前酶制剂功效评估方面的空白。
具体实施方式
以下通过具体实施例说明本发明，但实施例仅用于说明，并不限制本发明的范围。
定义
1.宏基因组学从技术上看包括16S rDNA高变区测序和全基因组的宏基因组测序两个层次。16S rDNA高变区测序可获得微生物多样性与丰度、种群结构、进化关系等相关信息；而对微生物菌群全基因组进行测序，可进一步对微生物基因功能、各微生物菌群相互协作关系、菌群与环境之间的关系等方面进行深入研究。
2. 16S rDNA是指：即16S ribosomal DNA，是原核核糖体30S小亚基的组成部分，相对分子质量约为0.6Mda，长度约为1540nt。
3.离体恒化器模型是指：一种通过控制培养基中营养物，主要是生长限制因子的浓度，来调控微生物生长繁殖与代谢速度的连续流动培养器。它以恒定的速度流出培养液，使容器中的微生物生长繁殖始终低于最快生长速度。
4.操作分类单位是指：运算分类单元(OTU)，用于物种分类及物种相对丰度分析的基本单元。一般情况下，若序列之间，比如不同的16Sr DNA序列的相似性低于98％就可以把它定义为一个OTU，每个OTU对应于一个不同的16S rDNA序列，即每个OTU对应于一个不同的细菌(微生物)种。
模型构建
(1)无菌动物小鼠模型构建
将无菌C57BL/6J小鼠饲养于无菌隔离器中，饲养环境20～24℃，湿度40％～70％，严格12h光照12h黑暗。经高温高压灭菌或Co-60γ50kGy射线辐照灭菌的饲料和垫料，鼠笼、饮水和饮水瓶等均采用高温高压灭菌(121℃，60min)。将所得的无菌小鼠平均分成2组，每组雌雄各半，各30只，4周龄，依次为：酶制剂组及对照组，灌喂0.3mL猪粪便悬液，待菌群定植3周，即成猪源菌群小鼠(SPF小鼠)。
两组均分笼养于无菌饲养隔离器中，实验周期为8周，每周都用逼迫法取小鼠粪便，称量小鼠体重，将所得小鼠粪便进行后续的16S rDNA测序。(2)离体恒化器模型构建
参照中国专利ZL 200710028346.2组装离体恒化器，向离体恒化器模型的发酵罐中注入灭菌的肠道菌群培养基500ml，蜡封，使整个系统处于无菌、密闭环境。开启连接新鲜培养基的蠕动泵以35ml.h-1流速运行，输送新鲜培养基不断补充营养物质，废液以同等流速移出，保证培养液恒定。
分别准确称取酶制剂组和对照组的猪粪便样品10g，灭菌0.85％生理盐水5倍稀释，充分匀浆后过滤，分别接种于已平衡了24h的发酵罐中，实验周期为48h，对离体恒化器中的培养液进行16S rDNA测序。
肠道菌群培养用的培养基配方(g/L)：蛋白胨3.0g，牛奶乳酪蛋白3.0g，脂蛋白0.6g，果胶0.6g，木聚糖0.6g，淀粉5.0g，L-半胱氨酸0.4g，胆固醇0.25g，鹅脱氧胆酸0.25g，胆酸0.25g，阿拉伯半乳糖0.6g，KH2PO4 2.0g，NaHCO30.1g，CaCl2.2H2O 0.45g，MgSO4.7H2O0.5g，氯化高铁血红素0.01g。
16S rDNA测序及菌群波动评估
提取样品总DNA，参照文献(Sun,W.et al.Mechanism and Effect ofTemperature on Variations in Antibiotic Resistance Genes during AnaerobicDigestion of Dairy Manure.Sci.Rep.6,30237；doi:10.1038/srep30237(2016).)进行扩增，扩增完成的PCR产物纯化之后进行上机测序。整个测序流程由上海锐翌生物科技有限公司完成，使用Illumina HiSeq PE250进行上机测序。通过对测序结果进行OUT(操作分类单位)聚类分析，反映出肠道菌群群落的物种组成、物种间进化关系及群落多样性。
通过对小鼠粪便或离体恒化器中的培养液进行16S rDNA测序，考察肠道菌群是否发生如下变化：
1、拟杆菌、梭菌、双歧杆菌、乳杆菌、乳酸杆菌等有益菌菌群的丰度上调；
2、肠球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌等致病菌菌群的丰度下调或消失。
实施例1
将荣昌猪饲喂含有植酸酶酶制剂的饲料，并设置对照组，通过16S rDNA测序(宏基因组测序)，测定酶制剂对肠道菌群的正向调节作用或负向调节作用。
同时测定日采食量、日增重、料肉比等性状指标。
1、试验动物与时间地点
试验选择平均体重为4.3kg左右，体质健康，同批转群的荣昌猪8个栏，按体重相近的原则随机将试验猪分为对照组和试验组(试验组饲喂添加有植酸酶酶制剂的基础饲料(添加量5g/kg)、对照组仅饲喂基础饲料)，每个处理4个重复，每个重复30头荣昌仔猪，共240头，进行为期10天的饲养试验。
本试验于2017年3月7日到2017年3月17日在惠州桑梓湖猪场进行。
2、试验日粮
对照组日粮和试验组日粮由大亚湾工厂负责生产和提供，试验料的生产日期均为2017年3月3日。
表1日粮组成与营养成分表
3、饲养管理
试验猪的管理以桑梓湖猪场实际饲养管理为基础，专人管理，各组在相同的饲养管理和环境条件下进行，保持饲料新鲜，保持猪舍环境舒适，每天观察试验猪采食、健康及活动情况，发现病猪后为该猪作标记号，跟踪记录发病日期、持续时间、治疗方案、康复情况，严重发病要剔除试验栏，并称取病猪的体重，做好日期和体重的记录。
4、试验指标的测定
生产性能：日采食量、日增重、料肉比等。
分别收集试验组和对照组粪便，通过16S rDNA测序(宏基因组测序)，测定酶制剂对猪肠道菌群的正向调节作用或负向调节作用。
5、试验结果与分析
如表2所示，试验结果表明：(1)在平均日采食量方面，对照组为141g/头，试验组为157g/头，试验组比对照组增加10.56％；(2)在平均日增重方面，对照组为104g/头，试验组为118g/头，试验组比对照组增加13.56％；(3)在料肉比方面，试验组(1.33)比对照组(1.36)降低2.21％。
表2生产性能试验结果
结果表明试验组生产性能优于对照组，添加植酸酶酶制剂的配方能提高仔猪的生产性能。
分别收集试验组(A组)和对照组(B组)粪便，通过16S rDNA测序(宏基因组测序)，测定酶制剂对猪肠道菌群的正向调节作用或负向调节作用。结果如表3所示。
表3微生物菌群丰度
细菌 A组 B组
双歧杆菌 5.84±0.25 5.05±0.25
乳杆菌 5.2±0.11 5.0±0.13
肠球菌 6.38±0.13 6.4±0.14
梭菌 5.85±0.02 5.23±0.12
大肠杆菌 5.05±0.13 5.85±0.15
沙门氏菌 4.56±0.28 4.8±0.15
葡萄球菌 3.89±0.12 4.1±0.18
注：菌数量级为10^8
由表2、3的结果可知：仔猪饲料中添加植酸酶后，肠道菌群中的梭菌、双歧杆菌、乳杆菌等有益菌的丰度上调；肠球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌等致病菌的丰度下调或消失，植酸酶具有肠道菌群正向调节的饲用活性。采用添加植酸酶的饲料饲喂仔猪，在日采食量、日增重、料肉比等方面也有明显的提高。综合以上，说明植酸酶具有优异的、全面的饲用活性。
实施例2
将荣昌猪饲喂添加有蛋白酶+葡萄糖氧化酶的复合酶制剂的饲料，并设置对照组，通过16S rDNA测序(宏基因组测序)，测定复合酶制剂对肠道菌群的正向调节作用或负向调节作用。
同时测定日采食量、日增重、料肉比、腹泻指数等性状指标。
1、试验动物与时间地点
试验选择同批转群，体重在5kg左右的健康丹系(杜×长×大)三元杂交断奶仔猪128头，随机分为2个组(试验组A组，添加量5g/kg，蛋白酶和葡萄糖氧化酶添加量为1：1)和对照组B组，基础日粮)，每个处理4个重复，每个重复16头仔猪，进行为期10天的饲养试验。
本试验于2017年4月11日到2017年4月21日在惠州桑梓湖猪场进行。
2、试验日粮组成
试验料的生产日期为3月28日。试验料的日粮组成及营养成分见表4。
表4日粮组成与营养成分表
3、饲养管理
试验猪的管理以桑梓湖猪场实际饲养管理为基础，专人管理，各组在相同的饲养管理和环境条件下进行，保持饲料新鲜，保持猪舍环境舒适，每天观察试验猪采食、健康及活动情况，发现病猪后为该猪作标记号，跟踪记录发病日期、持续时间、治疗方案、康复情况，严重发病要剔除试验栏，并称取病猪的体重，做好日期和体重的记录。
4、试验指标的测定
生产性能：日采食量、日增重、腹泻率、毛肤色等。
分别收集试验组和对照组粪便，通过16S rDNA测序(宏基因组测序)，测定复合酶制剂(蛋白酶和葡萄糖氧化酶)对猪肠道菌群的正向调节作用或负向调节作用。
5、试验结果与分析
如表5所示，试验结果表明：(1)在仔猪平均日采食量方面，对照组为153g/头，试验组为173g/头，试验组比对照组提高13.07％，试验组仔猪平均日采食量明显优于对照组；(2)在仔猪平均日增重方面，对照组为111g/头，试验组为129g/头，试验组比对照组增加16.22％；(3)试验组料肉比(1.34)比对照组(1.37)降低2.19％；(4)在毛肤色方面，试验组也优于对照组；(5)在腹泻指数方面，试验组明显低于对照组。
表5生产性能试验结果
B组 A组
试验天数 10 10
试验初头数 64 64
试验初始日龄 18.30 18.30
初均重(kg) 4.818±0.474 4.840±0.293
末头数 64 64
末均重(kg) 5.929±0.573 6.132±0.286
ADFI(g) 153±28 173±12
ADG(g) 111±21 129±10
FCR 1.37±0.03 1.34±0.02
毛色评分 3.73±0.21 3.77±0.26
肤色评分 3.56±0.10 3.66±0.23
腹泻指数 1.03±0.021 0.82±0.010
结果表明试验组生产性能优于对照组，添加复合酶制剂的配方能提高仔猪的生产性能。
分别收集试验组(A组)和对照组(B组)粪便，通过16S rDNA测序(宏基因组测序)，测定酶制剂对猪肠道菌群的正向调节作用或负向调节作用。结果如表6所示。
表6微生物菌群丰度
细菌 A组 B组
双歧杆菌 6.35±0.21 6.11±0.29
乳杆菌 5.3±0.16 5.0±0.04
肠球菌 6.12±0.23 6.2±0.11
梭菌 5.74±0.09 5.23±0.12
大肠杆菌 5.05±0.26 5.85±0.15
沙门氏菌 4.27±0.14 4.74±0.21
葡萄球菌 4.47±0.17 4.88±0.12
注：菌数量级为10^8
由表5、6的结果可知：仔猪饲料中添加复合酶后，肠道菌群中的梭菌、双歧杆菌、乳杆菌等有益菌的丰度上调；肠球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌等致病菌的丰度下调或消失，复合酶具有肠道菌群正向调节的饲用活性。采用添加复合酶的饲料饲喂仔猪，在日采食量、日增重、料肉比、毛肤色、腹泻指数等方面也有明显的提高。综合以上，说明复合酶具有优异的、全面的饲用活性。
虽然为了说明本发明，已经公开了本发明的优选实施方案，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离权利要求书所限定的本发明构思和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改、添加和替换。

Claims (10)

1.一种酶制剂的饲用活性评估方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：使用添加有待评估酶制剂的饲料饲喂动物，同时设置不含所述酶制剂的饲料饲喂动物作为对照组；
S2：取饲喂动物粪便，通过16S rDNA测序方法分别得出动物肠道菌群状况；以及
S3：对比对照组，评估动物肠道菌群状况是否具备以下特征：有益菌菌群丰度上调、致病菌菌群丰度下调或消失；如果具有该特征，则判定所述酶制剂具有肠道菌群正向调节的饲用活性，反之，则判定所述酶制剂具有肠道菌群负向调节的饲用活性。
2.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于，所述有益菌包括拟杆菌、梭菌、双歧杆菌、乳杆菌、乳酸杆菌中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于，所述致病菌包括肠球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的评估方法，其特征在于，所述待评估酶制剂为单一种类的酶制剂或多种类的复合酶制剂。
5.根据权利要求1-4任一项所述的评估方法，其特征在于，所述步骤S2包括：取饲喂动物的粪便之后，构建所述动物源菌群的小鼠模型或离体恒化器模型，对所述小鼠或所述离体恒化器模型的菌群进行16S rDNA测序从而得出动物肠道菌群状况；或取饲喂动物的粪便之后，直接进行16S rDNA测序从而得出动物肠道菌群状况。
6.根据权利要求1-5任一项所述的评估方法，其特征在于，所述步骤S1中，动物的饲喂时间为8～15天。
7.根据权利要求1-5任一项所述的评估方法，其特征在于，所述步骤S1中，饲喂动物的数量为200～300只。
8.根据权利要求1-5任一项所述的评估方法，其特征在于，所述动物为家畜、家禽或水产动物；优选为猪、牛或羊；更优选为荣昌猪。
9.一种酶制剂饲用活性的综合评估方法，其特征在于，包括对于饲喂动物性状指标的评估以及肠道菌群状况的评估，其中，所述肠道菌群状况的评估采用权利要求1-8任一项所述的评估方法。
10.根据权利要求9所述的综合评估方法，其特征在于，所述性状指标包括以下一种或多种：日采食量、日增重、料肉比、腹泻指数、毛光泽度及皮肤红润度。
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