PL211866B1 - Sposób uzyskiwania heparyny wysokoaktywnej z heparyny niskoaktywnej lub odpadów - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania wysokoaktywnej heparyny o dużej czystości, z heparyny surowej niskoaktywnej lub odpadów produkcyjnych zawierających substancje nieaktywne oraz inne zanieczyszczenia.

Heparyna jest sulfonowanym mukopolisacharydem o średniej masie cząsteczkowej około 17 tysięcy. W swojej budowie zawiera siarkę jako ugrupowanie sulfoamidowe lub jako ester kwasu siarkowego. Posiada silnie ujemny ładunek elektryczny co powoduje, że tworzy kompleksy z białkami, szczególnie protaminą.

Heparyna znajduje szerokie zastosowanie w lecznictwie gdzie wykorzystywane jest jej działanie przeciwko krzepliwości krwi, a tym samym powstawaniu skrzepów. Stosowana jest leczniczo i zapobiegawczo w chorobach zakrzepowo-zatorowych i zakrzepach tętnicowych na przykład w stanach przedzawałowych i zawałach. Jej działanie polega głównie na kompleksowaniu antytrombiny III, głównego inhibitora układu krzepnięcia. W mniejszym stopniu kompleksuje także inne proteazy osoczowe układu krzepnięcia.

Heparynę wydziela się głównie z niektórych organów zwierzęcych np. z płuc lub śluzu jelitowego.

Pierwszym etapem produkcji heparyny w każdej z obecnie stosowanych metod, jest ekstrakcja surowca zwierzęcego, wodnym roztworem chlorku sodu, ewentualnie z innymi dodatkami ułatwiającymi penetrację ekstrahenta do komórek.

Przykładowo PL. 95 201 stosuje 20-28%-owy roztwór NaCl z dodatkiem 2,5% CaCl2 w temperaturze 50-70°C.

Etap następny polega na wydzielaniu heparyny z ekstraktu i w stadium końcowym uzyskaniu preparatu suchego. Istnieje kilka metod wydzielania heparyny z ekstraktu. Przykładowo PL 162 607 przewiduje wydzielanie heparyny przy użyciu kolumn wypełnionych jonowymienną żywicą syntetyczną, a następnie przeprowadzenie selektywnej desorpcji. Uzyskuje się w ten sposób stężone eluaty wykazujące wielokrotne zagęszczenie.

Inna metoda opisana w PL. 61 042 przewiduje wytrącanie heparyny z ekstraktów przy pomocy bromku laurylopirydynowego, który tworzy z heparyną nierozpuszczalne osady. Niezależnie od stosowanej technologii ekstrakcji i zagęszczania, etap końcowy każdej technologii polega na wytrącaniu heparyny z roztworów wodnych, alkoholem najczęściej metanolem lub etanolem, w których heparyna się nie rozpuszcza. Przed wytrącaniem heparyny różne technologie stosują najczęściej dodatkowe sposoby oczyszczania. Końcowym produktem wszystkich technologii jest heparyna w postaci białego lub biało-kremowego proszku, z którego przemysł farmaceutyczny przygotowuje gotowe leki w formie roztworów lub maści.

W ocenie przydatności konkretnej technologii produkcji heparyny ważna jest nie tylko ilość uzyskanego produktu czyli wydajność procesu liczona w kilogramach, ale również, a nawet przede wszystkim aktywność uzyskanego produktu.

Użytkową aktywność heparyny określa się podobnie jak antybiotyki, w jednostkach na mg lub cm³ roztworu (j/mg, j/cm³). Oznaczenia dokonuje się metodą biologiczną, badając jej wpływ na krzepnięcie krwi wołowej lub baraniej przez porównanie z wzorcem międzynarodowym heparyny sodowej.

Heparyna nie jest jednorodnym związkiem chemicznym, jest ona mieszaniną wielosiarczanów mukopolisacharydów. Działanie heparyny, a więc jej aktywność zależy od masy cząsteczkowej oraz zawartości i rodzaju wiązań siarki, a ta z kolei zależy od rodzaju użytego surowca oraz zastosowanej technologii.

Obecnie na rynku najczęściej występuje heparyna o aktywności 140-170 j/mg, a bywają też również produkty surowe o aktywności poniżej 100 j/mg. Dokładna budowa cząsteczek heparyny nie została jednoznacznie ustalona. Czyste preparaty heparyny można elektroforetycznie rozdzielić na dwie frakcje o nazwie α ι β. α-Heparyna wykazuje dużą aktywność, jest polisacharydem zbudowanym z D-glukozaminy i kwasu D-glukozonowego, natomiast nieaktywna β-heparyna jest polisacharydem, zawierającym podobnie związane w dwusacharydowe podjednostki budowy D-galaktozaminę i kwas D-glukozonowy oraz grupy N-acetylowe. Związki te różnią się nieznacznie i dlatego ich rozdział jest trudny.

Obecnie przemysł farmaceutyczny jest coraz bardziej zainteresowany heparyną o bardzo wysokiej aktywności powyżej 190 j/mg. Heparyna taka jest produkowana przez niewiele firm i jest znacznie droższa w przeliczeniu na jednostkę w porównaniu do heparyny o aktywności poniżej 160 j/mg. Przekroczenie aktywności heparyny powyżej 180-190 j/mg wymaga zastosowania specjalnych technologii.

PL 211 866 B1

Heparynę taką można uzyskać stosując odwróconą osmozę lub np. elektroforezę. Bądź też przez wielokrotną krystalizację z roztworów wodno-alkoholowych. Metody te prowadzą jednak do dużych strat produktu.

Sposób według wynalazku jest prosty w zastosowaniu i umożliwia uzyskiwanie heparyny o bardzo wysokiej aktywności nawet powyżej 200 j/mg z dużą wydajnością. Sposób ten nadaje się do otrzymania preparatów z heparyny surowej, a nawet z odpadów produkcyjnych. Obecnie na rynku jest dostępna heparyna surowa o niskiej aktywności uzyskiwana jako substancja zasorbowana na nośniku, najczęściej ziemi okrzemkowej bez dalszego jej odzysku. Substancja ta o aktywności często poniżej 100 j/mg nie może być bezpośrednio zastosowana do produkcji leków.

W trakcie przeprowadzonych badań nieoczekiwanie stwierdzono, ż e istnieje niewielka, ale wyraźna, różnica rozpuszczalności heparyny czynnej i związków nieaktywnych w roztworach wodno-alkoholowych. W sposobie według wynalazku wykorzystano tę właściwość. Okazało się, że jeżeli do wodnych lub wodno-solnych roztworów heparyny wlewa się powoli na przykład alkohol alifatyczny, to po przekroczeniu pewnego stężenia alkoholu zaczyna się wytrącać heparyna. Pierwsze frakcje wytrącanej heparyny są wysoko aktywne, to prawie czysta heparyna α. W miarę dalszego dodawania alkoholu, a więc zwiększając gradient stężenia, wytrąca się heparyna coraz mniej aktywna, ewentualnie mieszanina α ι β heparyny. Przy dodaniu znacznej ilości alkoholu uzyskuje się wytrącenie całej ilości rozpuszczonej heparyny i powstaje z reguły produkt nisko aktywny.

W obecnie stosowanych technologiach stosuje się zwykle znaczny nadmiar alkoholu aby uzyskać największą wydajność w kilogramach, jednak najczęściej przy niskiej aktywności. Niekiedy stosując przy wytrącaniu nadmiar alkoholu, uzyskuje się również dość wysoką aktywność, nawet powyżej 160 j/mg jest to jednak wynikiem zastosowanego surowca, który zawiera przeważającą ilość heparyny α. Stwierdzono, że w celu praktycznego zastosowania metody selektywnego wytrącania nie wystarczy stopniowe wlewanie alkoholu do wodnego roztworu heparyny. Wytrąca się wówczas heparyna w postaci emulsji trudnej do wydzielenia.

W sposobie wedł ug wynalazku zastosowano rozpuszczanie heparyny w wodnym roztworze soli. Następuje wówczas wytrącanie w postaci łatwo sączalnego osadu lub półstałej cieczy, która po przemyciu stężonym alkoholem daje gotowy produkt w postaci stałej. Sól najczęściej chlorek sodu daje się w różnej ilości w zależności od tego jaką formę heparyny chce się uzyskać. Stwierdzono, że najmniejsza ilość soli działająca aktywnie na koagulację emulsji wynosi około 3%. Ilość soli można zwiększać praktycznie do około 20%. Większe stężenie soli może spowodować współwytrącanie się jej wraz z heparyną. W zależ ności od ilości uż ytej soli zmienia się częściowo konieczna ilość użytego alkoholu. Stwierdzono również, że na selektywność wytrącania heparyny z roztworu oraz formę uzyskanego produktu ma także wpływ kwasowość roztworu solankowego. Przy pH silnie alkalicznym 11-12 wytrąca się heparyna oleista o barwie żółtej, z której uzyskuje się produkt żółto-brązowy. W miarę obniżania pH wytrącana heparyna jest coraz jaśniejsza. Przy pH około 3 wydziela się w formie krystalicznej. Jednakże już przy pH 2 następuje współwytrącanie heparyny z solą. Sposób według wynalazku polega więc na selektywnym wytrącaniu heparyny aktywnej-alkoholem, z roztworów wodno-solankowych o odpowiednio dobranej iloś ci soli i odpowiednio dobranym pH. Jako wytr ą calnika heparyny z roztworu solankowego, w metodzie według wynalazku, można teoretycznie użyć każdy rozpuszczalnik organiczny rozpuszczalny w wodzie, w którym nie rozpuszcza się heparyna. Praktycznie stosuje się alkohole alifatyczne, głównie metanol i etanol oraz ketony głównie aceton.

Omawianym sposobem, przy odpowiednio dobranych parametrach i ilości rozpuszczalnika można uzyskać produkt o odpowiednio wysokiej aktywności i oddzielić go od substancji o aktywności około 0 j/mg.

Druga część sposobu według wynalazku opiera się na odwrotności zjawiska selektywnego wytrącania, mianowicie na selektywnym rozpuszczaniu. Metodę tą można stosować do otrzymywania preparatów wysokoaktywnych, z heparyny oczyszczonej ale o niskiej aktywności. Sposób ten polega na tym, że heparynę w postaci proszku wsypuje się do odpowiedniego roztworu wodno-rozpuszczalnikowego z dobraną ilością soli i określonym pH, przy mieszaniu. Do roztworu przechodzi głównie heparyna nieaktywna, a heparyna aktywna pozostaje nie rozpuszczona w formie oleistej lub krystalicznej w zależności od kwasowości i ilości soli. Jest to więc metoda wymywania substancji nieaktywnych. W metodzie tej stwierdzono, że zastosowanie roztworu alkoholowego poniżej 35% nie daje żadnego rozdziału, następuje całkowite rozpuszczanie produktu. Natomiast stężenie powyżej 55% praktycznie nie powoduje odmywania substancji nieaktywnych. Preparat pozostaje niezmieniony. Nieco inne proporcje są przy zastosowaniu acetonu. Obie wersje sposobu według wynalazku nie prowadzą

PL 211 866 B1 do ilościowego oddzielenia heparyny α i β, pozwalają jednak uzyskiwać preparaty o bardzo dużej aktywności.

Jeżeli jako produkt wyjściowy stosuje się heparynę surową, silnie zanieczyszczoną, przed procesem selektywnego wytrącania, solankowy roztwór heparyny poddaje się wstępnemu oczyszczeniu i ewentualnie odbarwieniu. W obecnie stosowanych technologiach do odbarwiania heparyny stosuje się najczęściej nadmanganian potasu. Jednakże w metodzie selektywnego wytrącania okazało się to niedogodne. Zastosowano więc do odbarwiania nadtlenek wodoru, w środowisku alkalicznym, w temperaturze 60-90°C. Z uwagi na to, ze heparyna jest produktem naturalnym, skład stosowanych surowców różni się niekiedy znacznie w zależności od rodzaju surowca zwierzęcego oraz zastosowanej technologii jej wydzielania. W tej sytuacji stosowane proporcje roztworu heparyny i rozpuszczalnika, a także ilości soli w roztworze oraz kwasowości roztworu muszą być każdorazowo określane laboratoryjnie dla każdej nowej dużej partii surowca.

P r z y k ł a d 1. W przykładzie użyto heparynę surową o aktywności 92 j/mg stanowiącą twarde grudki o zabarwieniu beżowym. Produkt powstał w wyniku sorpcji heparyny z ekstraktu wodnego przy pomocy ziemi krzemionkowej. Produkt ten rozpuszczono w wodnym roztworze chlorku sodu o zawartości 9% NaCl. W jednym litrze tego roztworu rozpuszczono 80 g surowej heparyny. Po rozpuszczeniu powstał produkt o zabarwieniu herbaty zawierający znaczne ilości substancji nierozpuszczonych. Ciecz z osadem przesączono, klarowny roztwór zawierający około 7300 j/cm³ heparyny doprowadzono do pH 11,5, stężonym roztworem wodorotlenku sodu. Zalkalizowany roztwór ogrzano do temperatury 80-85°C, po czym wlewano do niego 30% wodny roztwór nadtlenku wodoru w ilości 1 cm³ na 100 cm³ roztworu. Temperaturę 80-85°C, utrzymywano przez 15 minut przy stałym mieszaniu. Następnie roztwór pozostawiono do ochłodzenia. Uzyskano ciecz o lekko słomkowym zabarwieniu. Roztwór zakwaszono do pH 8,9 i wlewano do niego przy stałym mieszaniu wąskim strumieniem alkohol metylowy. W miarę wlewania metanolu następowało wytrącanie się białego osadu. Po zadozowaniu metanolu w iloś ci 1:0.9 (0.9 metanolu na jedną obję tość roztworu) dozowanie metanolu przerwano i cał o ść pozostawiono do odstania na 5 godzin. Po odstaniu na dnie naczynia utworzyła się warstwa półpłynnej masy uwodnionej heparyny. Ciecz znad heparyny zlano, a z oleistej masy uzyskano heparynę w postaci proszku przemywając ją kilkakrotnie stężonym metanolem. Przemywanie metanolem powoduje odwadnianie i przechodzenie oleistego roztworu w krystaliczne ciało stałe. Do przesączu po dekantacji wlewano ponownie metanol, w ilości takiej jak w poprzedniej operacji (1:1 w stosunku do ilości pierwotnej). Ponownie wytrącił się osad. Po odstaniu warstwę dolną przemyto metanolem identycznie jak partię pierwszą. Po wysuszeniu uzyskano produktu pierwszego 38 g i drugiego 19 g.

Produkt wytrącony we frakcji pierwszej stanowiła heparyna o aktywności 183 j/mg, a produkt drugi wykazywał całkowity brak aktywności. Produkt drugi stanowiła prawdopodobnie β-heparyna.

P r z y k ł a d 2. W przykładzie użyto heparynę surową taką samą jak w przykładzie 1. Próbę wykonano podobnie jak w przykładzie 1. Do rozpuszczenia heparyny użyto 9% roztwór NaCl i rozpuszczono w 1 litrze roztworu 80 g surowca. Dalej postępowano identycznie jak w przykładzie 1 z tą różnicą, że odbarwianie nadtlenkiem wodoru prowadzono w temperaturze pokojowej (ok. 23°C) w czasie 16 godzin. Po odbarwieniu roztworu ciecz zakwaszano kwasem siarkowym do pH 3,5. Po wlaniu metanolu do roztworu heparyny w stosunku 1:1 i po odstaniu na dnie naczynia wydzielił się biały krystaliczny osad. Osad ten odsączono i przemyto czystym metanolem. Po wysuszeniu uzyskano 32 g heparyny o aktywności 195 j/mg. Do przesączu podobnie jak w przykładzie 1 wlano następną porcję metanolu. Wytrącony osad odsączono. Po wysuszeniu było go 24 g o aktywności 18 j/mg.

P r z y k ł a d 3. W przykładzie użyto heparynę częściowo oczyszczoną, stanowiącą biały proszek o aktywności 120 j/mg. 100 g tego proszku rozpuszczono w 1 litrze solanki o zawartości 3% NaCl. Roztwór ten doprowadzono do pH 7,2. Uzyskano roztwór klarowny, którego nie sączono i nie odbarwiano. Do roztworu tego wlewano, przy ciągłym mieszaniu 850 cm³ metanolu. Po wlaniu całej ilości metanolu roztwór pozostawiono do odstania. Po odstaniu, na dnie naczynia wydzieliła się półstała i dość twarda masa. Ciecz zdekantowano, a masę przemyto kilkakrotnie stężonym metanolem. Po wysuszeniu uzyskano 52 g heparyny o aktywności 205 j/mg. Do przesączu po odsączeniu pierwszego osadu, wlano metanol w ilości 1:1. Uzyskano osad, który po przemyciu metanolem i wysuszeniu wykazywał aktywność 50 j/mg. Produktu tego było 32 g.

P r z y k ł a d 4. W przykładzie użyto heparynę częściowo oczyszczoną taką samą jak w przykładzie 3.

100 g tego produktu rozpuszczono w 1 litrze solanki o zawartości 6% chlorku sodu. Roztwór ten doprowadzono do pH 6,5. Do roztworu tego wlewano przy ciągłym mieszaniu 1100 cm³ acetonu, po

PL 211 866 B1 czym całość pozostawiono do odstania. Po odstaniu, podobnie jak w przykładzie 3 wydzieliła się półstała masa. Półstałą masę przemyto kilkakrotnie czystym acetonem. Po wysuszeniu uzyskano 56 g produktu o aktywności 195 j/mg. Z przesączu wydzielono produkt niskoaktywny przez rozcieńczenie go acetonem 1:1. Po wysuszeniu uzyskano 30 g proszku o aktywności 35 j/mg.

P r z y k ł a d 5. W przykładzie użyto heparynę czystą o aktywności 155 j/mg o parametrach zgodnych z farmakopeą. 100 g tego produktu rozpuszczono w 1 litrze solanki o zawartości 12% NaCl. Roztwór ten doprowadzono do pH 7,2. Uzyskano ciecz klarowną o lekko słomkowym zabarwieniu. Do roztworu tego, bez sączenia i dodatkowego oczyszczania wlano wolnym strumieniem, przy ciągłym mieszaniu 750 cm³ 96%-owego alkoholu etylowego. Po odstaniu, na dnie naczynia powstała półstała gęsta warstwa. Ciecz znad wydzielonej masy zdekantowano. Oleistą masę przemyto kilkakrotnie bezwodnym alkoholem etylowym. Po wysuszeniu uzyskano 70 g białego proszku o aktywności 210 j/mg. Przesącz rozcieńczono etanolem w ilości 1:1. Po przemyciu i wysuszeniu osadu uzyskano 28 g produktu o aktywności 39 j/mg.

P r z y k ł a d 6. W przykładzie użyto heparynę odpadową o aktywności 58 j/mg. Produkt ten w iloś ci 100 g rozpuszczono w 1,5 litra 15%-owego roztworu wodnego NaCl. Uzyskano roztwór mę tny, o zabarwieniu ż ó ł to-brązowym. Ciecz przesą czono i doprowadzono do pH 12, nastę pnie odbarwiono ją nadtlenkiem wodoru w sposób identyczny jak w przykładzie 1. W trakcie odbarwiania cieczy wytrącił się dodatkowy osad. Powstały osad odsączono, a ciecz doprowadzono do pH 8,5. Po ochłodzeniu, do roztworu wlewano przy mieszaniu 1,4 litra metanolu. Po odstaniu wydzieliła się warstwa półpłynna. Ciecz znad warstwy zdekantowano. Warstwę półpłynną przemyto kilka razy metanolem. Po wysuszeniu uzyskano 34 g heparyny o aktywności 159 j/mg. Z cieczy po dekantacji uzyskano 55 g proszku o aktywnoś ci około 5 j/mg.

P r z y k ł a d 7. W przykładzie użyto heparynę czystą o aktywności 145 j/mg. Produkt ten w formie biało-kremowego proszku w ilości 100 g wsypywano wolno do 500 cm³ cieczy będącej wodnym roztworem NaCl w ilości 7% oraz metanolu w ilości 40% i pH 6,5. Po wsypaniu całej ilości ciecz mieszano mechanicznie przez okres 30 min po czym pozostawiono do odstania. Po tym czasie na dnie naczynia wydzieliła się półpłynna masa. Ciecz znad powstałej masy zdekantowano i przemyto kilkakrotnie bezwodnym metanolem. Uzyskano 69,0 g suchego preparatu o aktywności 208 j/mg.

P r z y k ł a d 8. W przykładzie użyto heparynę taką samą jak w przykładzie 6. Produkt ten w iloś ci 100 g wsypywano do cieczy o skł adzie: NaCl 11%, metanol 50% pH 4,5. Po wsypaniu cał ej ilości produktu ciecz mieszano przez 30 minut, podobnie jak w przykładzie 6. Po odstaniu uzyskano krystaliczny osad wydzielony na dnie. Osad ten odsączono i przemyto metanolem bezwodnym, a następnie niewielką ilością eteru etylowego. Po wysuszeniu uzyskano 85 g białego produktu o aktywności 168 j/mg

P r z y k ł a d 9. W przykładzie użyto heparynę taką samą jak w przykładzie 6 i 7, Produkt ten w iloś ci 100 g wsypano do cieczy o skł adzie: NaCl 9%, alkohol etylowy 96%-owy 45% i pH 5,2. Po wsypaniu i wymieszaniu cieczy podobnie jak w przykładzie 7 po odstaniu wydzielił się krystaliczny osad, który odsączono i przemyto kilka razy niewielkimi ilościami bezwodnego alkoholu etylowego, a nastę pnie eterem etylowym jak w przykł adzie 7. Po wysuszeniu uzyskano 73 g produktu biał o-kremowego o aktywności 195 j/mg.

Claims (3)

1. Sposób uzyskiwania heparyny wysokoaktywnej z heparyny niskoaktywnej lub odpadów polegający na tym, że heparynę o niskiej aktywności w postaci stałej rozpuszcza się w wodnym roztworze solanki, o zawartości soli nie mniejszej niż 3%, doprowadzonej do kwasowości nie niniejszej niż pH 2,5 i nie większej niż 10,5 i ewentualnie po wcześniejszym oczyszczeniu, znamienny tym, że wytrąca się rozpuszczoną heparynę selektywnie wlewając do roztworu zakwaszonej solanki przy stałym mieszaniu, wąskim strumieniem rozpuszczalny w wodzie alkohol alifatyczny, korzystnie metanol lub etanol bądź rozpuszczalny w wodzie keton, korzystnie aceton, (w ilości zależnej od użytego surowca, nie większej niż 1:1,2), i pozostawia do odstania, gdzie jako pierwsza wytrąca się frakcja heparyny wysokoaktywnej, a w następnej kolejności heparyna nieaktywna lub bardzo mało aktywna, które to frakcje odbiera się osobno, po czym wytrąconą frakcję heparyny przemywa się czystym, użytym do wytrącenia rozpuszczalnikiem w celu odwodnienia i uzyskania suchego preparatu o bardzo wysokiej aktywności.

PL 211 866 B1

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przygotowany roztwór heparyny w wodnym roztworze soli alkalizuje się do pH powyżej 9,5, po czym wprowadza się do niego roztwór nadtlenku wodoru, w ilości zależnej od stopnia zanieczyszczenia produktu wyjściowego i ogrzewa w temperaturze 80-90°C w czasie nie mniejszym niż 10 minut, bądź pozostawia w temperaturze pokojowej przez okres nie dłuższy niż 20 godzin, po czym koryguje ewentualnie jego pH i wytrąca selektywnie wysokoaktywną heparynę jak w zastrzeżeniu 1.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że heparynę niskoaktywną w postaci proszku wsypuje się do roztworu zawierającego sól nieorganiczną, najkorzystniej NaCl lub KCl w ilości 3-20% oraz alkohol alifatyczny najkorzystniej metanol lub etanol bądź keton, najkorzystniej aceton w ilości 30-55% o pH 3 do 9,5 po czym miesza, a nierozpuszczoną pozostałość w postaci oleistej lub krystalicznej przemywa acetonem lub alkoholem alifatycznym bezwodnym i po wysuszeniu uzyskuje heparynę o wysokiej aktywności.