PL211565B1 - Zastosowanie nienukleozydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy jako związków antagonistycznych rozrostu komórek i induktorów różnicowania komórek - Google Patents

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 374038 (22) Data zgłoszenia: 23.12.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

23.12.2002, PCT/EP02/014727 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

10.07.2003, WO03/055493 (11) 211565 (13) B1 (51) Int.Cl.

A61K 31/495 (2006.01) A61K 31/535 (2006.01) A61K 31/55 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01)

Zastosowanie nienukleozydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy jako związków antagonistycznych rozrostu komórek i induktorów różnicowania komórek (73) Uprawniony z patentu:

ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA, Rzym, IT (30) Pierwszeństwo:

24.12.2001, IT, RM2001A000767 19.08.2002, IT, MI2002A001833 (43) Zgłoszenie ogłoszono:

19.09.2005 BUP 19/05 (72) Twórca(y) wynalazku:

CORRADO SPADAFORA, Rzym, IT PATRIZIA LAVIA, Rzym, IT ELISABETTA MATTEI, Rzym, IT GUGLIELMO PALOMBINI, Rzym, IT RODOLFO NELLO LORENZINI, Blera, IT CLARA NERVI, Rzym, IT (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

31.05.2012 WUP 05/12 (74) Pełnomocnik:

rzecz. pat. Grażyna Padee

PL 211 565 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie pewnych nienukleozydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy (RT) jako związków antagonistycznych rozrostu komórek i induktorów różnicowania komórek do stosowania terapeutycznego w leczeniu i/lub zapobieganiu chorobom rozrostowym i różnicowania, takim jak rak.

Endogenna, nietelomeryczna odwrotna transkryptaza (RT) jest enzymem kodowanym przez dwie klasy obficie występujących powtarzalnych elementów we wszystkich eukariotycznych genomach: retrotranspozonach i endogennych retrowirusach (di Marzo Veronese F, Copeland TD, DeVico AL, Rahman R, Oroszlan S, Galio RC, Sarngadharan MG Science (1986) 231, 1289-91 - Characterization of highly immunogenic p66/p51 as the reverse transcriptase of HTLV-III/LAV; Grob PM, Wu JC, Cohen KA, Ingraham RH, Shih CK, Hargrave KD, McTague TL, Merluzzi VJ AIDS Res Hum Retroviruses (1992) 8, 145-52 Nonnucleoside inhibitora of HIV-1 reverse transcriptase: nevirapine as a prototype drug). Ekspresja kodują cych RT genów jest zwykle tł umiona w koń cowe zróż nicowanych niepatologicznych tkankach - gdzie jest wykrywalna tylko w ilościach podstawowych - jednak jest wysoce aktywna w zarodkowych, embrionalnych tkankach ssaków i komórkach nowotworowych. Rola RT w takich fundamentalnych procesach jak wzrost i różnicowanie komórek musi być jeszcze wyjaśniona.

Newirapina, efawirenz i reskryptor, również znane pod nazwami handlowymi VIRAMUNE®, SUSTIVA® i RESCRIPTOR® odpowiednio, są znane jako nienukleozydowe inhibitory RT i są szeroko stosowane w terapii AIDS jako środki przeciwretrowirusowe. W szczególności newirapina ma następujący wzór empiryczny C15H14N4O. W stanie czystym jest krystaliczną substancją stałą o masie cząsteczkowej 266,302, z temperaturą topnienia 247-249°C i rozpuszczalnością 0,1 mg/ml w wodzie i 5,5 mg/ml w etanolu i moż na ją wytwarzać zgodnie ze wskazaniami z europejskiego opisu patentowego nr EP 429987. Newirapina (5,11-dihydro-11-cyklopropylo-4-metylo-6H-dipirydo-[3,2-b:2',3'-e]-[1,4]-diazepin-6-on) jest obejmowana grupą związków, 5,11-dihydro-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][1,4]-diazepin, które są znane jako nienukleozydowe inhibitory RT i stosowane w zapobieganiu i leczeniu infekcji HIV, jak opisano w europejskim opisie patentowym nr EP 429987.

Efawirenz (masa cząsteczkowa 315,68) (-)-6-chloro-4-cyklopropyloetynylo-4-trifluorometylo-1,4,-dihydro-2H-3,1-benzoksazynon [odnośniki dołączane jako odnośniki literaturowe: 1.YOUNG, S.D.; BRITCHER, S.F.; TRAN, L.O.; PAYNE, L.S.; LUMMA, W.C.; LYLE, T.A.; HUFF, J.R.; ANDERSON, P.S.; OLSEN, D.B.; CARROLL, S.S.; PETTIBONE, D.J.; O'BRIEN, J.A.; BALL, 30 R.G.; BALANI, S.K.; LIN, J.H.; LONG, W.J.; BYRNES, V.W.; EMINI, E.A.; i in., L-743, 726 (DMP-266): A NOVEL, HIGHLY POTENT NONNUCLEOSIDE INHIBITOR OF THE HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE 1 REVERSE TRANSCRIPTASE. ANTIMICROB AGENTS CHEMOTHER 39(12):2602-2605 (1995)].

Reskryptor (masa cząsteczkowa 552,68) [1-(5-metano-sulfonamido)-1H-indol-2-ilo-karbonylo)-4-[3-(izopropyloamino)-2-pirydynylo]piperazyna] (odnośniki dołączane jako odnośniki literaturowe:

1. ROMERO, D.L.; MORGE, R.A.; GENIN, M.J.; BILES, C.; BUSSO, M.; RESNICK, L.; ALTHAUS,

I.W.; REUSSER, F.; THOMAS, R.C.; TARPLEY, W.G. BIS(HETEROARYL)-PIPERZINE(BHAP) RT INHIBITORS: STRUCTURE-ACTIVITY RELATIONSHIPS OF NOVEL SUBSTITUTED INDOLE ANALOGUES AND THE IDENTIFICATION OF MONOMETHANESULFONATE(U-90152S). J MED CHEM 36(10):1505-1508 (1993).

2. ROMERO, D.L.; OLMSTED, R.A.; POEL, T.J.; MORGE, R.A.; BILES, C; KEISER, B.J.; KOPTA, L.A.; FRIIS, J.M.; HOSLEY, J.D.; STEFAŃSKI, K.J.; WISHKA, D.G.; EYANS, D.B.; MORRIS, J.; STEHLE, R.G.; SHARMA, S.K.; YAGI, Y.; YOORM AN, R.L.; ADAMS, W.J.; TARPLEY, W.G. TARGETING DELAVIRDINE/ATEVIRDINE RESISTANT HIV-1: IDENTIFICATION OF (ALKYLAMINO) PIPERIDINE-CONTAINING BIS(HETEROARYL)PIPERAZINES AS BROAD SPECTRUM HIV-1 REVERSE TRANSCRIPTASE INHIBITORS. J MED CHEM 39 (19):3769-3789 (1996).

W niż ej wymienionych publikacjach ujawniono nienukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy jako związki antagonistyczne rozrostu komórek i induktory różnicowania komórek do stosowania terapeutycznego w zapobieganiu i leczeniu nowotworów:

1. SHAW A. et al., „Kaposi's sarkoma regression following treatment with a triple antiretroviral regimen containing nevirapine, International Journal of STD & AIDS, England Jun 1999, vol. 10, No. 6, June 1999, str. 417-418,

PL 211 565 B1

2. GRIMAUDO S. et al, Selective induction of apoptosis in multidrug resistant HL60R cells by the thiazolobenzoimidazole derivative 1-(2,6-difluorophenyl)-1H,3H-thiazolo[3,4-a]benzimidazole (TBZ), European Journal of Cancer, Pergamon Press, Oxford, BG, vol. 34, No.11, October 1998, str. 1756-1763,

3. GHORI K. et al, Telomerase inhibition as potential new therapy for colorectal cancer, Colorectal disease 2000 united Kingdom, vol. 2, No. 2, 2000, str. 106-112,

4. LAM S.K. et al, Hypsin, a novel thermostable ribosome-inactivating protein with antifungal and antiproliferative activites from fruiting bodies of the edible mushroom hypsizigus marmoreus, Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 285, No. 4, 27 July 2001, str. 1071-1075.

Wstępne badania w naszej grupie wykazały, że newirapina i efawirenz powodują wczesne i skuteczne zatrzymanie rozwoju młodych mysich embrionów po dodaniu do hodowli embrionów wytworzonych w testach zapłodnienia in vitro (IVF). Ta obserwacja pierwsza wskazała, że oba leki mogą potencjalnie hamować rozrost komórek i zachęciła nas do testowania ich działania na komórki nowotworowe.

Streszczenie wynalazku

Niniejszy wynalazek opiera się na odkryciu, że nienukleozydowe inhibitory RT sprzyjają różnicowaniu komórek przy jednoczesnym osłabianiu rozrostu komórek.

Istota wynalazku jest zastosowanie związku wybranego z grupy składającej się ze związków z klasy 5,11-dihydro-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin, newirapiny, efawirenzu, delawirdyny, odpowiednich soli i/lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych pochodnych, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do terapii patologii i/lub zapobiegania patologiom związanym z utratą różnicowania komórek i niekontrolowanym rozrostem komórek, w którym te patologie są wybrane z grupy zawierającej białaczki, nowotwory nabłonka, nowotwory układu nerwowego, potworniaki, włókniako- i kostniako-mięsaki, raka okrężnicy, raka piersi, glejaka i wątrobiaka.

Korzystnie związek wybiera się z grupy: newirapiny, efawirenzu, delawirdyny, odpowiednich soli i/lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych pochodnych.

Korzystnie związek łącznie powoduje różnicowanie komórek i redukcję rozrostu komórek.

Korzystnie kompozycje farmaceutyczne obejmują ponadto nośniki i/lub rozcieńczalniki i/lub rozpuszczalniki i/lub zaróbki do wytwarzania kompozycji do doustnego, dożylnego, domięśniowego lub podskórnego wstrzykiwania.

Korzystnie kompozycje farmaceutyczne mają postać pigułek, zawiesin lub roztworów.

Korzystnie związki stosuje się do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych z aktywnością przeciwrozrostową albo indukujących różnicowanie komórek.

Termin inhibitor stosowany w wynalazku odnosi się do związków, które wpływają na enzymatyczną aktywność przez bezpośrednie wiązanie z cząsteczkami RT. Dokładniej, zarówno newirapina, jak i efawirenz, wiążą hydrofobową kieszeń na podjednostce p66 RT, która jest zlokalizowana blisko katalitycznego miejsca - a więc jej funkcjonowanie jest upośledzone. Zgodnie z tą definicją, i w zakresie niniejszego wynalazku, dostępne w handlu związki wspomniane powyżej, to jest VIRAMUNE (newirapina), SUSTIVA (efawirenz) i RESCRIPTOR (delawirdyna), jak też inne związki zdolne do zakłócania aktywności RT, można stosować w terapii i/lub zapobieganiu patologiom charakteryzującym się utratą różnicowania komórek i niekontrolowanym wzrostem komórek. Zatem, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie nienukleozydowych związków wykazujących aktywność hamowania RT zgodnie z powyższym mechanizmem, które można stosować w zapobiegawczej i/lub leczniczej terapii dla zapobiegania utracie różnicowania w patologiach utraty różnicowania i jako przeciwrozrostowe leki w terapii nowotworów. W szczególności, inhibitory RT antagonizujące procesy rozrostu komórek i utraty różnicowania można stosować w terapii ludzkich nowotworów, w szczególności nowotworów nabłonka, nowotworów mezenchymalnych i nowotworów układu nerwowego, w tym białaczek i litych nowotworów, takich jak potworniaki, włókniako- i kostniako-mięsaki, rak okrężnicy, rak piersi, glejak i wątrobiak.

Pośród nienukleozydowych inhibitorów RT, niniejszy wynalazek jawnie obejmuje zastosowanie dostępnych w handlu związków, które są obecnie stosowane do leczenia AIDS, które wykazują aktywność jako nienukleozydowe inhibitory RT, w tym ich pokrewnych farmaceutyczne postaci. Pośród nich szczególnie korzystne są: Viramune® (newirapina) (Boehringer), Sustiva® (efawirenz) (BristolMyers Squibb) i Rescriptor® (delawirdyna) (Agouron Pharmaceuticals).

Powyżej cytowane związki, oraz newirapina jako konkretny przykład, w ich zwykle stosowanych i dostępnych w handlu farmaceutycznych formach, są proponowane jako przykłady związków przydatnych w wytwarzaniu kompozycji farmaceutycznych do stosowania w przypadkach, w których trzeba

PL 211 565 B1 kontrolować różnicowanie i/lub rozrost komórek, a więc różnicowanie i aktywność przeciwnowotworową. Lecznicze działanie cząsteczek jest uzależnione od ich zdolności inhibicji RT.

Dalsze przedmioty wynalazku będą oczywiste ze szczegółowego opisu wynalazku.

Krótki opis rysunków

Fig. 1: Odwrotna transkryptaza w liniach mysich i ludzkich komórek. Fig. 1A. Test funkcjonalnej aktywności RT po inkubacji RNA MS2 z lizatami z następujący ludzkich (ścieżki 1-9) i mysich (10-22) typów komórek: ścieżka 1, białaczka NB4; ścieżka 2, białaczka R4; ścieżka 3, białaczka Kasumi-1; ścieżka 4, białaczka HL60; ścieżka 5, kostniakomięsak Saos-2; ścieżka 6, rak piersi MDA-231; ścieżka 7, rak piersi MCF7; ścieżka 8, glejak U343 Mg; ścieżka 9, HT-29 rak okrężnicy; ścieżka 10, fibroblasty embrionalne NIH/3T3; ścieżka 11, mioblasty C2C7; ścieżka 12, potworniak F9; ścieżka 13, włókniakomięsak L929; ścieżka 14, kontrolna reakcja z lizatem F9, lecz bez RNA MS2; ścieżka 15, tylko bufor; ścieżka 16, bez lizatu komórki ssaka; ścieżka 17, bez RNA MS2 i lizatu komórkowego; ścieżka 18, pozytywna kontrolna reakcja z handlowym RT; ścieżka 19, bez specyficznych dla MS2 oligomerów; ścieżki 20-22: pełna reakcja z lizatem F9 inkubowanym przedtem z 1 (ścieżka 20), 10 (ścieżka 21) i 100 (ścieżka 22) μΜ newirapiny. Ścieżki M, znaczniki masy cząsteczkowej DNA; ścieżka 23, pozytywna kontrolna reakcja z handlowym Rt. Fig. 1B. Analiza Western białek RT (górne panele) i α-tubuliny (dolne panele) w WCE i jądrze. WCE pochodziły z: blastocytów F9 (ścieżka 1), NIH/3T3 (ścieżka 2), MCF7 (ścieżka 3), MDA-231 (ścieżka 4), NB4 (ścieżka 5), HL60 (ścieżka 6) i ML2 (ścieżka 7). Ekstrakty jądrowe pochodziły z: F9 (ścieżka 1), MCF7 (ścieżka 2), MDA-231 (ścieżka 3), NIH 3T3 (ścieżka 4), HL60 (ścieżka 5) i NB4 (ścieżka 6).

Fig. 2: Newirapina hamuje rozrost w liniach komórek myszy i ludzi. Komórki hodowano z newirapina (kreski) i bez niej (DMSO, ciągła linia). Szybkość rozrostu wyrażono jako stosunek zliczonych komórek przy wskazanych czasach względem początkowej liczby zaszczepionych komórek, przyjętej za 1. Punkty oznaczają średnią wartość i słupki standardowe odchylenie z co najmniej trzech niezależnych testów dla wszystkich typów komórek.

Fig. 3A. Analiza cyklu komórkowego w kontrolnych i wystawionych na newirapinę komórkach. Rozkład faz cyklu komórkowego określono metodą FACS po 72 godzinach od rozpoczęcia terapii newirapina. W linii komórek glejaka U343, cykl komórkowy analizowano oddzielnie w diploidalnej frakcji komórek (reprezentującej około 2/3 wszystkich komórek) i w pozostałej frakcji (około 1/3), która rozwija się z aneuploidią. Fig. 3B. Analiza hybrydyzacji Western cykliny D1 (górny panel) w ekstraktach ze wskazanych typów komórek, hodowanych przez 72 godziny z newirapina (+, ścieżki 2, 4 i 6) lub bez niej (-, ścieżki 1, 3 i 5). Filtr ponownie sondowano przeciwciałem antyaktynowym dla kontroli równych zawartości (dolny panel).

Fig. 4: Różnicowanie miogenicznych komórek C2C7 po wystawieniu na działanie newirapiny. Mioblasty C2C7 wstępnie potraktowane DMSO (A, C) lub newirapina (B, D, E) przed hodowaniem w pożywce różnicowania zabarwiono anty-MHC (FITC, zielony) i Hoechst 33258 dla uwidocznienia jąder (na niebiesko); pokazano połączone obrazy. Przy powiększeniu 20x, miotubule w kontrolnych kulturach (Fig. 4A) są cieńsze i rzadsze niż po potraktowaniu newirapina (Fig. 4B). Fig. 4C, powiększenie 60x miotubul z A. Fig. 4D, powiększenie 60x miotubul z B. Fig. 5 4E, powiększenie 60x MHC-dodatnich mioblastów w polu z B.

Fig. 5: Morfologiczne różnicowanie w wystawionych na RA i newirapinę komórek F9. Kultury F9 wystawione na DMSO (kontrolne, fig. 5a, fig. 5b, fig. 5c, fig. 5d), newirapinę (fig. 5e, fig. 5f, fig. 5g, fig. 5h) lub RA (fig. 5i, fig. 5j, fig. 5k, fig. 5l) zbadano najpierw in vivo po 72 godzinach hodowli dla stwierdzenia morfologicznej reorganizacji (panele fig. 5a, fig. 5e, fig. 5i, obiektyw 60x). Po 96 godzinach, próbki utrwalono i przetwarzano na łańcuch IF kolagenu typu IV (α1) (fig. 5c, fig. 5g, fig. 5k) i barwienie DAPI jąder (fig. 5b, fig. 5f, fig. 5j); obrazy połączono na fig. 5d, fig. 5h i Fig. 5l (obiektyw 100x).

Fig. 6: Traktowanie newirapina odblokowuje różnicowanie w blastocytach AML. Morfologiczne różnicowanie, ujawniane barwieniem Wright-Giemsa, w promielocytowej linii komórek NB4; komórkach HL60; i blastocytach od dwu pacjentów z AML (AML#1 i AML#2) po terapii 400 μM newirapiny (Nev) przez 5 dni. Komórki NB4 również potraktowano 1 μM RA, co indukuje różnicowanie granulocytów. Nietraktowane komórki pokazano jako kontrolne.

Fig. 7: Newirapina indukuje zmienność ekspresji genu w komórkach F9. Całość RNA z komórek F9 hodowaną z DMSO (kontrolne), newirapina lub RA poddano wzmocnieniu RT-PCR z oligonukleotydami na wskazane geny, umieszczono na bibule i hybrydyzowano z wewnętrznymi oligonukleotydami. Reprezentatywne panele pokazano na fig. 7A. Fig. 7B: Ilościowe wahania w ekspresji genu. Produkty RT-PCR hybrydyzowane z wewnętrznymi oligonukleotydami oceniono ilościowo metodą

PL 211 565 B1 densytometrii. Stosunek sygnałów w newirapinie względem kontrolnych kultur znormalizowano względem otrzymanego dla β-aktyny w tym samym eksperymencie. Ciemne histogramy oznaczają średnią wartość, a jasne histogramy standardowe odchylenie, z co najmniej trzech eksperymentów dla każdego genu.

Fig. 8: Efavirenz hamuje rozrost w liniach komórek myszy (fig. 8A linie komórek 3T3; fig. 8B: komórki F9). Komórki hodowano z efawirenzem (kreski) i bez niego (DMSO, ciągła linia). Szybkość rozrostu wyraża się jako stosunek zliczonych komórek we wskazanych czasach względem początkowej liczby zaszczepionych komórek przyjętych za 1. Punkty oznaczają średnią wartość z co najmniej trzech niezależnych testów.

Fig. 9: Efavirenz hamuje rozrost ludzkich linii komórek, (fig. 9A HeLa cykl pierwszy; fig. 9B: HeLa cykl drugi, fig. 9C SAOS cykl pierwszy, fig. 9D SAOS cykl drugi). Komórki hodowano z efawirenzem (kreski) i bez niego (DMSO, ciągła linia). Szybkość rozrostu wyraża się jako stosunek zliczonych komórek we wskazanych czasach względem początkowej liczby zaszczepionych komórek przyjętych za 1. Punkty oznaczają średnią wartość z trzech niezależnych testów.

Fig. 10: Wzrost wątrobiaka Morrisa w kontrolnych (ciągła linia) i potraktowanych newirapina szczurach (linia przerywana). Szybkość wzrostu nowotworu wyraża się jako objętość (w cm³) w czasie (w dniach od czasu wszczepienia).

Fig. 11: Próbki tkanek z potraktowanych newirapiną (panele NEV) i nietraktowanych (panele CTR) szczurów. Na górnych panelach (obiektyw 10x), przekształcone powierzchnie w panelu NEV Fig. 11B są zaskakująco zmniejszone w porównaniu z nietraktowaną (CTR) tkanką (fig. 11A). W dolnych panelach (obiektyw 40x), komórki przechodzące apoptozę są wyraźnie widoczne w próbce NEV (fig. 11D) lecz nie w próbce CTR (fig. 11C).

Fig. 12: Wzrost wątrobiaka Morrisa w kontrolnych (ciągła linia) i dwu potraktowanych efawirenzem szczurów (linie przerywane, EFV1 i EFV2). Szybkość wzrostu nowotworu wyraża się jako objętość (w cm³) w czasie (w dniach od czasu wszczepienia).

Szczegółowy opis wynalazku

Odkryliśmy początkowo endogenną aktywność RT, enzymu będącego celem inhibitorów, w licznych ekstraktach z linii komórek mysich i ludzkich nowotworów stosując oparty na PCR test RT.

Następnie dodaliśmy 350-400 μM newirapiny, lub 10-20 μM efawirenzu, przez kilka dni do kultur mysich komórek prekursorowych (to jest, prekursorowych komórek miogenicznych C2C7; embrionalnych fibroblastów NIH/3T3) i mysich i ludzkich nowotworogennych linii komórek (potworniak F9; włókniakomięsak L929; rak okrężnicy HT-29; rak piersi MCF-7 z ekspresją receptora estrogenu (ER+); rak piersi MDA-231, bez ekspresji ER (ER-); glejak U343 Mg i kostniakomięsak Saos-2). Wyniki pokazały, że inhibitory RT indukują spadek szybkości rozrostu komórek i sprzyjają różnicowaniu komórek. Różnicowanie również obserwowano w liniach komórek ostrej białaczki szpikowej (AML) (NB4, HL60, Kasumi-1) i pierwotnych blastocytów od dwu pacjentów z AML, jak wskazały testy morfologiczne, funkcjonalne i immunofenotypowe.

Analiza RT-PCR mRNA ekstrahowanego z komórek F9 przed i po poddaniu działaniu newirapiny zilustrowała znaczące przeprogramowanie ekspresji genu w zestawie genów, które krytycznie regulują cykl komórkowy: cyklina D1 i D3 uległa regulacji w dół; odwrotnie, ich antagonista p16 uległ regulacji w górę; w mniejszym stopniu, inhibitor kinazy p27 i Rb-1 i Rb-2 pokrewne glejakowi siatkówki geny uległy również regulacji w dół.

Te wyniki wspierają pogląd, że: a) endogenna aktywność RT jest związana z powstawaniu nowotworów i b) inhibitory RT sprzyjają konwersji fenotypów nowotworowych do normalnych fenotypów. Indukowane newirapina różnicowanie zbadano bardziej szczegółowo w liniach komórek zdolnych do różnicowania F9 i miogenicznych C2C7 śledząc pojawianie się specyficznych znaczników różnicowania, które nie ulegają ekspresji w komórkach prekursorowych, to jest odpowiednio łańcucha α kolagenu IV w komórkach F9 i miozyny w komórkach C2C7. Ponadto, badania na poziomie morfologicznym (stosunek jądro/cytoplazma i zmniejszona bazofilia), funkcjonalnym (test NBT) i immunofenotypowym (ekspresja specyficznych dla linii powierzchniowych antygenów) wskazują, że terapia newirapina może usunąć blokadę różnicowania obecną w ludzkich liniach komórek AML w pierwotnych transformowanych blastocytach od pacjentów z AML.

W oparciu o te odkrycia proponujemy, że nienukleozydowe związki, które wykazują aktywność hamowania RT zgodnie z powyższym mechanizmem można stosować w zapobiegawczej i/lub leczniczej terapii jako leki przeciwdziałające utracie różnicowania w patologiach braku różnicowania, takich jak mięśniakomięsak prążkowany, i jako leki przeciwrozrostowe w terapii nowotworowej, w szczegól6

PL 211 565 B1 ności nowotworów nabłonka, nowotworów mezenchymalnych i nowotworów układu nerwowego, w tym białaczek i litych nowotworów, takich jak potworniaki, włókniako i kostniako-mięsaki, rak okrężnicy, rak piersi, glejak i hepatoma.

Korzystne są związki, które są dostępne w handlu i stosowane do leczenia AIDS, i które wykazują aktywność jako nienukleozydowe inhibitory RT. Szczególnie korzystne są: Viramune (newirapina) (Boehringer), Sustiva (efawirenz) (Bristol-Myers Squibb) i Rescriptor (delawirdyna) (Agouron Pharmaceuticals).

Powyżej cytowane związki, i newirapina jako konkretny przykład, w ich zwykle stosowanych i dostę pnych w handlu postaciach farmaceutycznych, są proponowane jako przykł ady substancji przydatnych w wytwarzaniu kompozycji farmaceutycznych do stosowania w przypadkach, w których różnicowanie musi być kontrolowane, jednocześnie przeciwdziałając rozrostowi komórek, a więc z działaniem różnicującym i przeciwnowotworowym. Lecznicze działanie cząsteczek jest powiązane z ich zdolnością hamowania RT.

Zapobiegawcza lub lecznicza terapia rozrostu komórek według wynalazku może być prowadzona u ssaków, w szczególności ludzi.

Potrzebujący tego pacjenci mogą być potraktowani leczniczo skuteczną ilością co najmniej jednego związku, który wykazuje aktywność jako nienukleozydowy inhibitor RT i zapewnia lecznicze korzyści pacjentowi.

Nienukleozydowe związki według wynalazku można stosować w kompozycjach farmaceutycznych do wytwarzania leków z działaniem różnicującym i przeciwnowotworowym. Kompozycję do zastosowań opisanych w niniejszym wynalazku można otrzymać mieszając ze sobą skuteczne ilości co najmniej jednego składnika czynnego z jednym lub większą liczbą fizjologicznie dopuszczalnych nośników i/lub rozcieńczalników i/lub rozpuszczalników i/lub zaróbek i środków pomocniczych, które ułatwiają przetwarzanie czynnych związków w preparaty, które można stosować farmaceutycznie, takie jak postać pigułek, roztworów, zawiesin. Takie kompozycje farmaceutyczne można wytwarzać w sposób, który jest znany, np., za pomoc ą procesów konwencjonalnego mieszania, rozpuszczania, granulowania, drażetkowania, mielenia na mokro, emulgowania, kapsułkowania, więzienia lub liofilizacji. Poprawne komponowania zależy od wybranej drogi podawania. Kompozycje farmaceutyczne mogą być podawane doustnie, lub przez zastrzyk dożylny, domięśniowy lub podskórny.

Zastosowania, dawkowanie i drogi podawania są zgodne ze wskazaniami obecnymi w europejskim opisie patentowym nr EP 429987.

Dawki i drogi podawania mogą się wahać w zależności od typu i powagi choroby.

Poniżej opisano pewne doświadczalne przykłady z użyciem powyżej wspomnianych cząsteczek. Jednakże należy podkreślić, że wskutek różnej chemicznej struktury związków korzystnych według niniejszego wynalazku trzeba rozumieć, że wynalazek nie ogranicza się do takich cząsteczek, lecz można także stosować inne związki wykazujące aktywność jako środki hamujące RT.

Poniższe przykłady należy uważać za ilustrację i nie ograniczają one zakresu niniejszego wynalazku.

Przykład 1 - Endogenna aktywność RT w komórkach nowotworowych

Aktywność enzymatyczną RT, która jest celem inhibitorów opisanych w wynalazku, wykryto we wszystkich liniach komórek, mysiego i ludzkiego pochodzenia, które testowano w tej pracy stosując oparty na PCR test. Wyniki podsumowane na fig. 1A pokazują, że lizaty ze wszystkich linii komórek są miejscem aktywności RT zdolnej do retrotranskrypcji in vitro egzogennego RNA (RNA faga MS2), generując wzmocniony produkt spodziewanych rozmiarów, to jest 112 par zasad (ścieżki 1-13); cDNA nie jest syntetyzowany, jeśli pominie się RNA MS2 (ścieżka 14) lub lizat komórkowy (ścieżka 16) w mieszaninie inkubacyjnej. Ponadto, aktywność RT jest hamowana, gdy lizat komórkowy wstępnie inkubuje się z newirapina w sposób zależny od dawki: produkt o 112 parach zasad jest usuwany po inkubacji ze 100 μΜ (ścieżka 22), lecz nie 1 (ścieżka 20) lub 10 μΜ (ścieżka 21). Obecność enzymu RT w komórkach nowotworowych potwierdza ponadto analiza hybrydyzacji Western. Fig. 1B pokazuje, że cząsteczki białka są rozpoznawane przez specyficzne poliklonalne przeciwciała anty-RT, w pełnej komórce (WCE) i w jądrowych lizatach.

Te wyniki pokazują, że RT występuje w komórkach nowotworowych, jako białko i jako aktywność enzymatyczna, i że jest hamowana przez newirapinę.

Przykład 2 - Inkubacja kultur mysich i ludzkich komórek z newirapina: spowolnienie podwajania komórek.

PL 211 565 B1

Mysie prekursory miogeniczne C2C7, fibroblasty embrionalne NIH/3T3, komórki potworniaka F9 i włókniakomięsaka L929, oraz ludzkie komórki z następujących linii komórek: kostniakomięsak Saos-2, rak okrężnicy HT-29, rak piersi MDA-231 (ER-), rak piersi MCF7 (ER+), glejak U343, hodowano w DMEM zawierającym 10-20% surowicy płodowej i 350 μΜ newirapiny rozcieńczonym z roztworu podstawowego (250 mM) w 100% DMSO. Komórki rozłożono z gęstością 2-5x10⁴ na 35 mm szalkach Petriego i wystawiono na działanie newirapiny 5-6 godzin później. Próbki pobierano w określonym czasie i komórki zliczano w poddanych działaniu newirapiny i kontrolnych (poddanych działaniu DMSO) kulturach. Wyniki podsumowane na fig. 2 pokazują, że wystawienia na działanie newirapiny (linia przerywana) zmniejsza szybkość rozrostu we wszystkich liniach komórek. Zauważono pewne zależne od rodzaju komórek różnice w reakcji na tłumiące działanie leku: komórki potworniaka F9 wykazały najsilniejszą reakcję, z 5-krotną redukcją szybkości rozrostu po 120 godzinach działania. Porównywalną skuteczność zauważono w komórkach raka okrężnicy HT-29. Komórki kostniakomięsaka Saos-2 były typem reagującym najpowolniej, i dopiero po 5 dniach działania szybkość wzrostu zaczęła spadać w porównaniu z kontrolnymi kulturami.

Przykład 3 - Inkubacja kultur komórkowych z newirapiną: wyjście z cyklu komórkowego

Analiza FACS wystawionych na działanie newirapiny kultur komórkowych ilustruje zmiany w profilu cyklu komórkowego kilku typów komórek: jak pokazano na fig. 3A, komórki z zawartością DNA G0/G1 zgromadziły się w kulturach NIH/3T3, HT-29, MCF-7 i U343 Mg po 72 godzinach traktowania newirapiną, podczas gdy w tym samym czasie kontrolne próbki wykazały profile cyklu komórkowego typowe dla rozrastających się kultur. Towarzyszył temu znaczący spadek poziomów cykliny D1 w kulturach NIH/3T3, HT-29, MCF-7 (fig. 3B) i glejaka U343 Mg (dane nie pokazane) wystawionych na działanie newirapiny w porównaniu z nie wystawionymi na działanie kulturami kontrolnymi.

Przykład 4 - Inkubacja kultur komórkowych z newirapiną: indukcja różnicowania

Newirapina wpływa na proces różnicowania komórek, jak pokazano stosując systemy modelowe komórek zdolnych do przechodzenia różnicowania in vitro w dobrze scharakteryzowany sposób. Mysie miogeniczne komórki satelitarne C2C7, które rozrastają się jako monojądrowe mioblasty, można indukować do różnicowania po wycofaniu czynnika wzrostu i tworzenia wielojądrowych miotubul z ekspresją specyficznych dla mięśni genów. W naszych eksperymentach komórki C2C7 hodowano z newirapiną lub bez niej przez 90 godzin (podczas których kontrolne kultury osiągały gęstość nasycenia), a następnie przenoszono do pożywki różnicowania na 48 godzin. W obliczeniu pod mikroskopem z jasnym polem widzenia (n = 300 komórek z przypadkowo wybranych obszarów), stosunek pomiędzy wielojądrowymi miotubulami (to jest, komórkami z ponad trzema jądrami) i mono/dwu jądrowymi komórkami wynosił około 1:1 w potraktowanych newirapiną w porównaniu z 1:2 w nietraktowanych próbkach. Monowarstwy komórek zanalizowano następnie metodą immunofluorescencji (IF) stosując poliklonalne przeciwciało względem ciężkiego łańcucha miozyny (MHC), późnego znacznika różnicowania mięśni. W kontrolnych kulturach trzymanych w pożywce różnicowania przez 48 godzin, wielojądrowe zawierające MHC miotubule były cienkie i znacznie mniejsze (fig. 4C) niż w kulturach wstępnie potraktowanych newirapiną (fig. 4D). Wydzielone mioblasty były głównie MHC-ujemne w kontrolnych kulturach (fig. 4A), podczas gdy synteza miozyny była już aktywowana w wydzielonych mioblastach z potraktowanych newirapiną płytek (fig. 4E).

Newirapina również uruchamia różnicowanie w komórkach potworniaka F9. Nietraktowane komórki F9 mają okrągły kształt i tendencję do wytwarzania agregatów podczas wzrostu (fig. 5a). Po wystawieniu na działanie kwasu retynowego (RA), dobrze znanego promotora różnicowania, charakterystyczne oznaki morfologicznego różnicowania stały się oczywiste po 72 godzinach (fig. 5e), w tym zmniejszona tendencja do tworzenia agregatów, zwiększona przyczepność i reorganizacja powierzchni komórek z pojawianiem zróżnicowanej morfologii. Podobne zmiany obserwowano w wystawionych na działanie newirapiny kulturach (fig. 5i). Morfologicznej reorganizacji towarzyszyła zwiększona synteza łańcucha kolagenu typu IV(a1) (fig. 5k), znacznika różnicowania indukowanego w reakcji na RA (fig. 5g), syntetyzowanego w niewielkich ilościach w kontrolnych kulturach (fig. 5c). Razem wyniki na fig. 4 i 5 wskazują, że newirapina włącza lub ułatwia występowanie różnicowania w dwu różnych typach komórek.

Przykład 5 -Terapia newirapina indukuje różnicowanie ludzkich blastocytów ostrej szpikowej białaczki (AML)

Zanalizowaliśmy działanie newirapiny w ostrej promielocytowej NB4, z ekspresją onkoproteiny t(15;17) PML/RAR, odpowiedzialnej za blokadę różnicowania występującą w tych blastocytach i liniach komórek ostrej mieloblastycznej białaczki HL60, porównując ich znaną wrażliwość na indukowane

PL 211 565 B1 przez RA różnicowanie granulocytowe. Po 5 dniach terapii newirapiną, pojawienie komórek z morfologią typu mielomonocytycznego był o oczywiste w obu liniach komórek (fig. 6), podczas gdy komórki z morfologią typu metamielocytycznego były indukowane przez 1 μΜ RA, jako podano (fig. 6 i dane nie pokazane). Następnie zanalizowaliśmy ekspresję trzech powierzchniowych antygenów CD11b, CD14 i CD15, po czterech dniach hodowli w obecności RA lub newirapiny (tablica 1). Indukcja CD11b jest związana z różnicowaniem granulocytowym, CD14 jest uważany za specyficzny dla monocytów antygen i CD15 jest mielomonocytowym antygenem. Jednoczesna indukcja CD14 i CD11b odnosi się do różnicowania monocytów. Zgodnie z indukcją różnicowania granulocytów, traktowanie RA zwiększało poziomy CD11b i CD15, lecz nie CD14, w obu liniach komórek. W potraktowanych newirapiną komórkach NB4 i HL60 wykryto silną indukcję ekspresji CD15, i, w mniejszym stopniu, wykryto znaczniki CD11b i CD14. Tak więc, traktowanie newirapiną indukuje ekspresję znaczników różnicowanie mielomonocytów, zgodnie z badaniami morfologicznymi. Traktowanie newirapiną również zwiększa liczbę pozytywnych komórek w teście redukcji barwnika NBT około 2,0-3,5-krotnie (tablica 2).

Efekt różnicowania przez newirapinę zanalizowano następnie w komórkach białaczki szpikowej słabo wrażliwych na indukowane przez RA różnicowanie granulocytów, takich jak linia komórek Kasumi-1 z ekspresją produktu translokacji t(8;21) AML1/ETO, i w pierwotnych blaslocytach od dwu pacjentów z AML. Traktowanie newirapiną, chociaż w istocie nie wstrzymywało rozrostu, indukowało umiarkowaną, ale stałą akumulację komórek w fazie G1 cyklu komórkowego (dane nie pokazane). Ponadto komórki Kasumi-1, jak i pierwotne blastocyty AML, reagowały na traktowanie newirapiną włączając różnicowanie, jak pokazała indukcja: (i) morfologicznych zmian pokrewnych różnicowaniu mielomonocytów (fig. 6), złożonych z kondensacji chromatyny z początkową jądrową segmentacją, zmniejszeniu stosunku jądra/cytoplazma, zmniejszeniu cytosolowej bazofilii i pojawieniu przyjądrowego regionu Golgiego (specyficzne granulki były wyraźne w przypadku AML#1); (ii) funkcjonalnych zmian, wskazywanych przez zwiększoną dodatniość NBT (tablica 2); (iii) zmian w ekspresji szpikowych immunofenotypowych znaczników CD11b, CD14 i CD15 (tablica 1 i dane nie pokazane). Zakres indukcji cech różnicowania szpikowego w pierwotnych blastocytach AML był porównywalny z wykrywanym w komórkach NB4 i HL60.

Przykład 6 - Zmieniona ekspresja genów regulatorów cyklu komórkowego w potraktowanych newirapina komórkach F9

Dla ocenienia, czy zdolność newirapiny do wpływania na wzrost i różnicowanie odzwierciedla zmiany w ekspresji specyficznych genów, ekstrahowano RNA z kontrolnych, wystawionych na działanie newirapiny i RA komórek F9 i poddano je półilościowej analizie RT-PCR. Zbadaliśmy zestaw genów kodujących cykliny typu D; inhibitory wzrostu; modulatory apoptozy; i białka porządkowe. Reprezentatywne panele pokazano na fig. 7A i wyniki pokazano ilościowo na fig. 7B. Najważniejsze zmiany zarejestrowano dla genu cykliny D1, który uległ regulacji w dół 7-krotnie, podczas gdy p16^INK4a, kodujący głównego antagonistę cyklin typu D, uległ regulacji w górę niemal 8-krotnie, w kulturach F9 wystawionych na działanie newirapiny w porównaniu z nie wystawionymi. Regulację w górę zarejestrowano również dla p27^Kip1, który krytycznie moduluje rozrost w reakcji na kształt i adhezję komórki; Rb-2/p130, który jest związany z wycofywaniem z cyklu rozrostu; i Bcl-2, który może ułatwiać zatrzymywanie wzrostu w pewnych typach komórek. Ekspresja cykliny D3 uległa regulacji w dół w reakcji na newirapinę. Te zmiany są specyficzne, ponieważ ekspresja genów porządkowych (β-aktyna, GAPDH), jak też p53, była nienaruszona.

Przykład 7 - Inkubacja mysich kultur komórkowych z efawirenzem: efekt dawki

Fibroblasty embrionalne NIH/3T3 i komórki potworniaka F9 hodowano w DMEM zawierającym 10-20% surowicy płodowej i dwa stężenia efawirenzu, to jest 10 i 20 pM, rozcieńczonym z roztworu podstawowego (10 mM) w 100% DMSO. Komórki rozmieszczono przy gęstości 2-5x10⁴ w 35 mm szalkach Petriego i wystawiono na działanie efawirenzu 5-6 godzin później. Próbki pobierano w określonych odstępach czasu i komórki zliczano w kulturach komórkowych wystawionych na działanie efawirenzu w porównaniu z równolegle nie wystawionymi na jego działanie. Wyniki z fig. 8 pokazują, że wystawienie na działanie efawirenzu (linia przerywana) zmniejsza szybkość rozrostu w obu liniach komórek w sposób zależny od dawki w porównaniu z komórkami nie wystawionymi na jego działanie (ciągła linia).

Przykład 8 - Inkubacja ludzkich kultur komórkowych z efawirenzem: zależność czasowa

Wpływ efawirenzu testowano następnie w ludzkich komórkach gruczolakoraka HeLa i kostniakomięsaka Saos-2. Obie linie komórek hodowano w warunkach opisanych powyżej (przykład 6). Dla ustalenia, czy przedłużone wystawianie na działanie leku polepsza skuteczność inhibicji wzrostu, obie

PL 211 565 B1 linie komórek wystawiono na działanie efawirenzu w dwu kolejnych cyklach: podczas pierwszego cyklu komórki były ciągle wystawiane na działanie 20 μΜ efawirenzu przez 5 dni; następnie komórki rozcieńczono, posiano ponownie i drugi cykl wystawiania rozpoczęto następnego dnia ze świeżym lekiem. Wyniki na fig. 9 pokazują, że zarówno linia komórek HeLa (panele A), jak i Saos-2 (panele B) była wrażliwa na efawirenz i podlegała znaczącej redukcji szybkości wzrostu komórek. Efekt hamujący był zależny od czasu, ponieważ w kulturach HeLa i Saos-2, pierwszy cykl wystawiania (5 dni) spowodował odpowiednio 1,6- i 1,5-krotne zmniejszenie, podczas gdy 5- i 4-krotne zmniejszenie uzyskano w drugim cyklu (prowadzonym do 20 dnia od rozpoczęcia wystawiania).

Przykład 9 - Przeciwnowotworową aktywność newirapiny in vivo: leczenie wątrobiaka Morrisa 3924A u szczura

a) Szczep szczura i cechy nowotworu

Szczep szczura: ACI/T wsobny (około 180 g)

Nowotwór: wątrobiak Morrisa 3924A jest szybko rosnącym nowotworem, który rozwija się u wsobnie rozmnażanych zwierząt ACI/T. Trzy tygodnie po zaszczepieniu rozmiary nowotworu wynoszą około 10 cm³.

Przygotowanie komórek nowotworowych: komórki nowotworowe wątrobiaka wytwarza się ze zwierząt po około dwu tygodniach po zaszczepieniu. Nowotwór usuwa się chirurgicznie ze zwierzęcia, oddziela od tkanek łącznych i nekrotycznych i rozdrabnia na małe kawałki. Fragmenty nowotworu zawiesza się następnie w sterylnym fizjologicznym roztworze i zaszczepia wewnątrz jednego uda stosując strzykawkę 20 ml z dużej średnicy igłą. Rutynowo wstrzykuje się 0,5 ml zawiesiny komórek. Powodzenie implantacji nowotwór jest niemal 99%.

b) Procedury: 3 szczury wstępnie potraktowano newirapina przez wstrzykiwanie dziennie 0,2 ml/szczura roztworu newirapiny (roztwór podstawowy = 180 mg/2 ml DMSO) przez 11 dni (18 mg/ /szczura/dzień). Jedenastego dnia komórki wątrobiaka zaszczepiono podskórnie wstępnie potraktowanym i trzem nietraktowanym kontrolnym szczurom.

₃

c) Wyniki: Po 17 dniach od zaszczepienia, szczury kontrolne wykazują typowe nowotwory 2-4 cm³, podczas gdy tylko jedno z wstępnie potraktowanych newirapiną zwierząt wykazało mały guzek rozmiarów kilku milimetrów w miejscu zastrzyku. Krzywa czasowa z fig. 10 pokazuje różniczkowe szybkości wzrostu nowotworu u szczurów kontrolnych (ciągła linia) i potraktowanych newirapiną (linia przerywana). Krzywa wzrostu zwierząt kontrolnych jest średnią wartością dla trzech zwierząt, podczas gdy krzywa newirapiny odnosi się do szybkości wzrostu pojedynczego zwierzęcia, pośród potraktowanych, które rozwinęło niewielki nowotwór. Tkanki nowotworowe chirurgicznie usunięto z niepotraktowanego i potraktowanych newirapiną szczurów i poddano analizie histologicznej. Fig. 11 pokazuje, że w próbce z potraktowanego newirapiną szczura (panele NEV) transformowane obszary są zaskakująco zmniejszone, a komórki wykazują wyraźne cechy apoptotyczne, w porównaniu z nietraktowaną próbką (panele CTR).

W konkluzji, wstępne traktowanie newirapiną skutecznie antagonizuje nastąpienie i wzrost eksperymentalnie indukowanego wątrobiaka u szczurów (2/3) genetycznie predysponowanych do rozwijania tego konkretnego nowotworu. Dwa szczury pozostały trwale zdrowe po zaszczepieniu nowotworu, podczas gdy w trzecim wykryto jeden niewielki nowotwór. W tych samych warunkach, u nietraktowanych szczurów rozwinął się ten szybko rosnący nowotwór (3/3) i ogólnie zdechły one w czasie 27 dni.

Przykład 10 - Przeciwnowotworowa aktywność newirapiny in vivo: terapia myszy BALB/C zaszczepionych nowotworem otrzewnej

a) Procedura: 10 myszy BALB/C zaszczepiono dootrzewnowe (dwukrotnie) komórkami nowotworu otrzewnej wstrzykując 0,2 ml płynu otrzewnego pobranego od zwierzęcia zaszczepionego 8 dni wcześniej. Terapię newirapiną rozpoczęto tego samego dnia wstrzykując dootrzewnowe 1 mg/mysz/ dzień (roztwór podstawowy 10 mg/ml w DMSO) 5 z 10 myszy zaszczepionych komórkami nowotworowymi. Myszy potraktowano w sposób ciągły newirapiną przez siedem dni.

b) Wyniki: Po 7-8 dniach, wszystkie kontrolne zwierzęta miały spuchniętą jamę brzuszną zawierającą 5-7 ml płynu, jak określono po zabiciu zwierząt. W przeciwieństwie do tego, trzy z pięciu (3/5) potraktowanych newirapina zwierząt pozostało zdrowych bez śladów wzrostu nowotworu; nieobecność rozwoju nowotworu potwierdzono, gdy 2 z tych zwierząt zabito 15 dni po zaszczepieniu nowotworu i ciała zanalizowano. Przeżywające potraktowane zwierzę pozostało trwale zdrowe. Warto wspomnieć, że myszy zaszczepione nowotworem otrzewnej przeżywały tylko 12-14 dni.

W konkluzji, ten eksperyment udowadnia, że newirapina, wstrzykiwana jednocześnie z zaszczepieniem nowotworu, blokuje trwale wystąpienie nowotworu otrzewnej w trzech z pięciu myszy.

PL 211 565 B1

W tych samych warunkach, nowotwór powstał u niepotraktowanych szczurów (5/5), z których wszystkie padły 12-14 dni po zaszczepieniu.

Przykład 11 - Przeciwnowotworową aktywność efawirenzu in vivo: terapia wątrobiaka Morrisa 3924A szczura

Procedury i wyniki: komórki wątrobiaka Morrisa zaszczepiono u 4 szczurów (szczep 3924A). Tego samego dnia, traktowanie efawirenzem rozpoczęto u dwu z nich wstrzykując 1 mg/szczura/dzień. Fig. 12 pokazuje szybkość wzrostu nowotworów u kontrolnych (ciągła linia) i potraktowanych efawirenzem zwierząt (linia przerywana). Nowotwór rósł gwałtownie u kontrolnych zwierząt, które oba padły 27 dnia po zaszczepieniu; w przeciwieństwie do tego tylko jedno z dwu potraktowanych zwierząt uzyskało nowotwór znacznie mniejszych rozmiarów, podczas gdy drugie pozostało całkowicie zdrowe. Konkludując, ten eksperyment udowadnia, że terapia efawirenzem, rozpoczęta jednocześnie z zaszczepieniem nowotworu, skutecznie antagonizuje nastąpienie i wzrost wątrobiaka Morrisa. Z dwu potraktowanych szczurów, jeden pozostał zdrowy kilku tygodni po zaszczepieniu nowotworu, podczas gdy drugi uzyskał znacznie mniejszy nowotwór. W tych samych warunkach, nowotwór rozwinął się u niepotraktowanych szczurów (2/2) i padły one 27 dnia.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie związku wybranego z grupy składającej się ze związków z klasy 5,11-dihydro-6H-dipirydo[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin, newirapiny, efawirenzu, delawirdyny, odpowiednich soli i/lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych pochodnych, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do terapii patologii i/lub zapobiegania patologiom związanym z utratą różnicowania komórek i niekontrolowanym rozrostem komórek, w którym te patologie są wybrane z grupy zawierającej białaczki, nowotwory nabłonka, nowotwory układu nerwowego, potworniaki, włókniako- i kostniako-mięsaki, raka okrężnicy, raka piersi, glejaka i wątrobiaka.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że związek wybiera się z grupy: newirapiny, efawirenzu, delawirdyny, odpowiednich soli i/lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych pochodnych.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1-2, znamienne tym, że związek łącznie powoduje różnicowanie komórek i redukcje rozrostu komórek.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1-3, znamienne tym, że dekompozycje farmaceutyczne obejmują ponadto nośniki i/lub rozcieńczalniki i/lub rozpuszczalniki i/lub zaróbki do wytwarzania kompozycji do doustnego, domięśniowego lub podskórnego wstrzykiwania.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1-4, znamienne tym, że kompozycje farmaceutyczne mają postać pigułek, zawiesin lub roztworów.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 1-5 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych z aktywnością przeciwrozrostową.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 1-5 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych indukujących różnicowanie komórek.