CN113384585A - 依法韦仑在制备治疗小细胞肺癌的药物中的应用 - Google Patents

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CN113384585A CN202110412629.7A CN202110412629A CN113384585A CN 113384585 A CN113384585 A CN 113384585A CN 202110412629 A CN202110412629 A CN 202110412629A CN 113384585 A CN113384585 A CN 113384585A
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萨尔瓦多·罗·布
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Abstract

本发明提出了依法韦仑在制备治疗小细胞肺癌的药物中的应用，涉及小细胞肺癌技术领域。本发明提供了依法韦仑用于制备治疗小细胞肺癌的药物，依法韦仑具有靶向性，对于正常细胞无毒性，同时揭示了依法韦仑治疗小细胞肺癌的分子机制，为联合用药等后续临床应用奠定分子生物学的基础。

Description

依法韦仑在制备治疗小细胞肺癌的药物中的应用
技术领域
本发明涉及小细胞肺癌技术领域，具体而言，涉及依法韦仑在制备治疗小细胞肺癌的药物中的应用。
背景技术
小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)是起源于支气管黏膜或腺体的一类肺恶性肿瘤，约占肺癌的20％。小细胞肺癌以增殖快速和早期广泛转移为特征，初次确诊时60％～88％已有脑、肝、骨或肾上腺等转移，两年生存率不到5％，在肺癌中恶性度最高，发病原因不明。
依法韦仑是一种非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)，最初在医疗界用作抵抗艾滋病毒的特效药物。在前期研究中发现，依法韦仑可以通过抑制LINE-1转座子编码的逆转录酶L1-RT的表达及活性，发挥抗肿瘤作用。然而，该药物是否能用于治疗小细胞肺癌还未可知，如果能够研究证明依法韦仑可用于治疗小细胞肺癌，则可为小细胞肺癌的治疗提供一种新的临床治疗思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种依法韦仑在制备治疗小细胞肺癌的药物中的应用。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本申请实施例提供一种依法韦仑在制备治疗小细胞肺癌的药物中的应用。
相对于现有技术，本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果：
本发明提供了依法韦仑用于制备治疗小细胞肺癌的药物，并揭示了依法韦仑治疗小细胞肺癌的分子机制，为依法韦仑用于制备抗小细胞肺癌药物的后续研究奠定了分子生物学的基础。
本发明研究表明，依法韦仑治疗小细胞肺癌具有靶向性，即靶向小细胞肺癌细胞，抑制其增殖同时促进小细胞肺癌细胞的凋亡，同时不伤害正常组织细胞，反映其在小细胞肺癌临床给药中可能产生的毒性较低。
通过对依法韦仑抗小细胞肺癌的分子机制的研究，在后续出现耐药性或者其他因素导致的抗癌效果差时，可根据分子机制选择与依法韦仑互补的药物进行联用，以增强临床治疗中对小细胞肺癌的抗肿瘤效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为人正常肺部组织及小细胞肺癌组织石蜡切片的免疫组化染色结果；
图2为依法韦仑抑制小细胞肺癌细胞的增殖并促进其凋亡的结果图；
图3为依法韦仑抑制裸鼠接种的人源小细胞肺癌肿瘤的生长的结果图；
图4为依法韦仑给药对人类小细胞肺癌细胞系H69细胞的miRNA表达谱的影响；
图5为依法伟仑给药对小细胞肺癌细胞及正常组织细胞增殖的影响。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
本申请实施例提供依法韦仑在制备治疗小细胞肺癌的药物中的应用。
在本发明的一些实施例中，上述应用中所述依法韦仑通过抑制小细胞肺癌细胞的增殖或诱导小细胞肺癌细胞的凋亡抗小细胞肺癌。
在本发明的一些实施例中，上述应用中所述依法韦仑通过激活Caspase3信号通路促进小细胞肺癌的凋亡。
在本发明的一些实施例中，上述应用中所述依法韦仑通过下调miR-93、miR-21、miR-20a、miR-130a和miR-106a中的一种或多种抑制小细胞肺癌的发生和发展。
在本发明的一些实施例中，上述应用中所述miR-93的靶向基因为PTEN、E2F1和/或Six1；所述miR-21的靶向基因包括PTEN、PDCD4和/或RECK。
在本发明的一些实施例中，上述应用中所述miR-20a的靶向基因包括E-cadherin和/或vimentin；所述miR-130a的靶向基因包括RUNX3和/或TNF-α。
在本发明的一些实施例中，上述应用中所述miR-106a的靶向基因包括PI3K和/或Akt。
在本发明的一些实施例中，上述应用中所述依法韦仑通过上调miR-145或miR-let-7d抑制小细胞肺癌的发生和发展。
在本发明的一些实施例中，上述应用中所述miR-145的靶向基因包括OCT4和/或MUC1；所述miR-let-7d的靶向基因包括PPARγ。
在本发明的一些实施例中，上述应用中所述依法韦仑抑制小细胞肺癌的细胞增殖的半数有效浓度为22μM；所述依法韦仑诱导小细胞肺癌的细胞凋亡的半数有效浓度为69μM。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
试验例
1.小细胞肺癌肿瘤组织中L1-RT的表达量显著高于癌旁组织
为了研究小细胞肺癌是否适用于依法韦仑为核心药物分子的抗肿瘤疗法，首先需要研究小细胞肺癌肿瘤细胞中L1-RT的表达量是否明显高于正常肺部组织细胞。本实施例选取小细胞肺癌患者的肿瘤组织及正常肺部组织，制作石蜡切片，并使用靶向L1-RT的单克隆抗体进行免疫组织化学染色实验，分析小细胞肺癌肿瘤组织(T)、癌旁组织(N)及正常肺部组织细胞中L1-RT表达量的差异。免疫组化步骤如下：
(1)洗载玻片：将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中，目的是为了是载玻片上的硅胶等除去，同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整，便于组织吸附，然后置于清水中清洗，除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右)，再将载玻片浸泡于酒精之中，然后放到架子上，置于37℃温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。
(2)包埋组织：先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织(手术切除的肿瘤组织或癌旁的正常肺部组织)置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。
(3)切片：将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5μm，如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40℃温水中。
(4)捞组织：当组织载玻片置于40℃温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2，一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差较小。捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出的载玻片置于架子上，放入37℃温箱中烘干。
(5)脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100％酒精-100％酒精-95％酒精-90％酒精-80％酒精-70％酒精。依据相似相溶的原理，起脱蜡作用的主要是二甲苯，每种试剂中放置10min-15min。脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3％H2O2浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中加热3min(中火)，一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再加热一次，冷却至室温，加热的目的是暴露抗原位点。
(6)血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，封闭一些非特异性的抗原位点。然后放入37℃温箱中半小时。血清封闭液需要稀释10倍后使用(900μl PBS:100μl血清封闭液)。
(7)加一抗(L1-RT单克隆抗体)：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，置于4℃冰箱中保存过夜。
(8)加二抗(生物素标记的二抗)：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加二抗，然后置于37℃温箱中半小时。
(9)加链酶亲和素-过氧化物酶复合物HRP-SA：将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加HRP-SA，然后置于37℃温箱中半小时。HRP-SA稀释100倍(990μl PBS:10μl HRP-SA)。
(10)加显色剂：将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。显色剂的配制方法如下：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀。其中各成分分别为A：DAB(二甲基联苯胺)，B：H2O2(过氧化氢)，C：磷酸缓冲液。
(11)复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色30s。
(12)脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70％酒精-80％酒精-90％酒精-95％酒精-100％酒精-100％酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
(13)封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
本实施例选取小细胞肺癌患者手术切除的肿瘤组织以及正常的肺部组织制作石蜡切片，使用L1-RT逆转录酶单克隆抗体作为一抗，二抗选用生物素标记的抗体，使用DAB-HRP辣根过氧化物酶显色并进行苏木精复染。苏木精染色的部位为细胞核染色质，染色呈现蓝紫色；L1-RT单克隆抗体靶向L1-RT蛋白质，阳性呈现深浅程度不同的棕褐色颗粒；颜色越深，代表该部位L1-RT表达量越高。
正常肺部组织及小细胞肺癌组织的石蜡切片使用L1-RT单克隆抗体及苏木精染色结果如图1所示：图1(中)小细胞肺癌肿瘤组织切片免疫组化染色结果图中标注的T代表肿瘤组织，N代表癌旁组织。图1(右)为图1(中)黑色方框区域放大示意图，其中箭头标注的、包含深棕褐色颗粒的部分为L1-RT高表达的肿瘤细胞。正常肺部组织切片主要呈现为细胞核被苏木精染色后的蓝紫色，而肿瘤组织切片中，肿瘤组织(T)与癌旁组织(N)对比，呈现出明显的棕褐色，表明该部位抗原-抗体反应阳性，即与癌旁组织及正常肺部组织相比，肿瘤组织细胞内L1-RT的表达量显著偏高。
L1-RT在肿瘤细胞与正常组织细胞中的差异性表达，意味着依法韦仑的抗肿瘤作用具有一定的靶向性，在抑制肿瘤细胞生长的同时，表现出对正常组织细胞较低的毒性作用。L1-RT在小细胞肺癌肿瘤细胞中的高表达量，意味着依法韦仑可以高效地靶向并作用于小细胞肺癌肿瘤细胞，发挥抗肿瘤作用。
2.依法韦仑可以有效抑制小细胞肺癌细胞的增殖并促进其凋亡
为了研究依法韦仑对小细胞肺癌来源的肿瘤细胞的增殖及凋亡过程的影响，本实施例选取人源小细胞肺癌细胞系H69，进行体外依法韦仑浓度梯度给药实验。依法韦仑药物工作浓度范围设定在10-7～10-3M之间，H69细胞在不同的依法韦仑给药浓度下培养48h后，进行细胞增殖及凋亡数量统计。采用CCK8试剂盒进行细胞计数，并计算细胞增殖指数(Proliferation Index,PI是指每个实验组中，经过处理48h后孔内的细胞数量与未经任何处理的初始细胞数量的比值。采用Caspase 3/7活性细胞凋亡检测试剂盒染色，结合流式细胞仪，分析细胞群中凋亡途径中关键的Caspase 3阳性细胞的百分比，以此来评估细胞的凋亡水平。
使用Prism 8.0对体外梯度给药实验的数据进行非线性回归分析，结果如图2所示(NT表示未加药处理的对照组)。结果表明：在给药浓度10-5～10-4M的条件下，依法韦仑可以有效抑小细胞肺癌细胞的增殖(EC50＝22μM)，并通过激活Caspase 3蛋白等途径促进细胞凋亡过程的发生(EC50＝69μM)。在依法韦仑最高有效浓度的给药条件下，即依法韦仑工作浓度为10-3M的条件下，细胞增殖指数降低为未加药处理组的10.3％，细胞群中代表细胞凋亡的Caspase 3+细胞百分比为98.31％。上述实验结果表明，依法韦仑可以有效抑制小细胞肺癌细胞的增殖并促进其凋亡过程，这意味着依法韦仑有潜力作为一种全新的抗肿瘤疗法，在抑制小细胞肺癌肿瘤的进展的临床治疗中应用。
3.依法韦仑可以有效抑制裸鼠接种的人源小细胞肺癌肿瘤的生长
为了进一步证明依法韦仑对小细胞肺癌的抗肿瘤作用，本实施例选取裸鼠进行小鼠体内成瘤实验，并通过依法韦仑给药研究其对肿瘤生长过程的影响。
具体实验操作及结果如下：
选取BALB/c品系的裸鼠进行体内成瘤实验。制备人源小细胞肺癌细胞系H69的细胞悬液，通过细胞计数，调整细胞浓度为106-107个/ml，按照0.2ml/只注射接种于裸鼠鼠蹊部皮下。注射后用小镊子夹针孔片刻，可避免注入液外溢。
实验分为对照组与给药组：对照组在肿瘤细胞接种后不进行给药处理，给药组在肿瘤细胞接种1天后，使用灌胃法进行给药处理，每日依法韦仑的给药剂量为：每日一次，每次60mg/kg。自接种肿瘤日起40天内，选取共计12个时间点(t＝1,8,10,14,17,21,24,28,31,35,38,40天)，进行肿瘤接种部位的拍照记录及取样，测量肿瘤大小(直径)并计算其体积。
实验结果如图3所示，图3.A为接种肿瘤后25天及40天后，未给药对照组(CTR)与依法韦仑给药组(EFV)裸鼠在接种部位的成瘤情况。可以观察到：与未给药处理的对照组相比，依法韦仑给药组的裸鼠肿瘤生长明显受到抑制，肿瘤体积明显较小。图3.B为裸鼠接种H69肿瘤细胞起40天内，未给药对照组(CTR)与依法韦仑给药组(EFV)裸鼠成瘤的体积(cm3)大小比较分析结果。由此可得知，与未给药处理的对照组相比，依法韦仑给药组的裸鼠体内肿瘤生长至可测量水平的速度较慢(CTR＝10天，EFV＝20天)，且肿瘤生长明显受到抑制，接种40天后的肿瘤平均大小仅为对照组的1/3。图3.C为裸鼠接种H69肿瘤细胞40天后，在未给药对照组(CTR)与依法韦仑给药组(EFV)中每组选取3只小鼠(n＝3)，取出测量并比较两组间肿瘤负荷的差异。可以观察到依法韦仑给药组的肿瘤体积明显较小，表明依法韦仑可以有效抑制裸鼠接种的人源小细胞肺癌肿瘤的生长。
4.依法韦仑给药改变小细胞肺癌细胞的miRNA表达谱
前述研究结果表明，依法韦仑给药可以有效抑制人源小细胞肺癌细胞的增殖并促进其凋亡。为了进一步研究依法韦仑的抗肿瘤作用机制，阐明依法韦仑给药对于肿瘤细胞基因表达谱的影响。
本实施例采用德国Febit公司的微流体Geniom生物芯片Geniom Biochip miRNAhomo sapiens，对经过DMSO处理(对照组)以及经过依法韦仑给药处理(给药组)前后的H69细胞进行miRNA表达谱的检测及差异分析。
本实施例使用的Geniom Biochip miRNA homo sapiens微流体生物芯片的规格及参数如下所示：
该微流体生物芯片检测样品中miRNA含量的原理为微流引物延伸法(Microfluidic Primer Extension Assay,MPEA)。用于检测的miRNA样品在杂交前不需要经过富集、PCR扩增或标记等预处理，可以直接导入微流体芯片的通道中，与探针完全匹配的miRNA将在通道内DNA聚合酶I的Klenow片段的作用下延伸并发出阳性信号。每张芯片含124,992阵点；包含8个独立的微通道，每个含15,624阵点，可以平行地进行8个样本的杂交检测。该芯片对样品量要求少，检测灵敏度高，常规检测只需1-2μg的总RNA；每条miRNA设置7条探针进行重复检测，以提高检测可靠性；miRNA表达谱芯片的检测分析结果与SangermiRBase 22.1同步，可以实现高效的序列比对与下游的功能性分析。
选取人类小细胞肺癌细胞系H69进行体外给药实验：
对照组-1使用DMSO处理细胞，给药组使用培养基中终浓度为30μM的依法韦仑处理细胞，给药组设置两个平行重复实验(n＝2)。持续培养72小时后，胰蛋白酶消化、收集细胞、制备样品，使用人类基因表达谱芯片进行基因表达差异分析。另外设置对照组-2为不加任何处理的H69细胞，直接收集相应数量的细胞进行样品制备及芯片杂交检测。
样品制备及使用人类基因表达谱芯片进行检测分析的操作步骤如下所示：
(1)总RNA提取：每组收集2×106个细胞，使用TRIzol法提取总RNA。
(2)使用QIAGEN RNeasy Total RNA Isolation kit纯化总RNA。使用紫外分光光度计定量及检测RNA纯度，注意总RNA量大于1-2μg，浓度大于40ng/μL。
(3)使用Ambion’s miRNA Isolation Kit试剂盒分离总RNA中的miRNA，质检通过后的miRNA样品用于芯片杂交。
(4)微流体芯片杂交：杂交炉中42℃，杂交芯片16小时。
(5)使用Geniom Realtime Analyzer分析仪对完成杂交的芯片进行洗涤、染色及扫描。
(6)数据处理及分析：
使用Geniom Wizard Software数据处理软件分析采集自芯片的荧光强度信号。首先进行背景信号校正，每条miRNA的信号强度值为其对应的7个重复探针位点信号强度的中位值。对采集自不同样本的检测结果进行分位数标准化(Quantile Normalization)，在归一化信号数值的同时保留了每个样本内原始的miRNA表达量顺序，便于不同样本间的数据比较分析。差异表达miRNA的挑选标准需要计算实验组和对照组的信号比值取Log2后的数据，即Signal Log Ratio。有关差异表达的miRNA，其上调(Up)和下调(Down)的筛选是按如下条件计算所得，Cutoff设定为FoldChange1.5，即Up:Signal Log Ratio>＝0.58,Down:Signal Log Ratio<＝-0.58。
选取加对经DMSO处理的对照组细胞(CTR，n＝2)以及依法韦仑处理的给药组细胞(EFV，n＝2)的miRNA表达谱进行比较分析，根据差异阈值(Cutoff设定为给药组与对照组之间的FoldChange≥1.5)，获得差异表达miRNA列表。两个独立、平行的DMSO对照组(CTR)及依法韦仑给药组(EFV)的差异基因筛选结果交集揭示了20条差异表达的miRNA，各自的表达量水平经过背景信号过滤及分位数标准化归一，结果如上述热图所示，如图4所示，17条表现为下调(热图中表现为偏绿色)，3条表现为上调(热图中表现为偏橙黄色)。在依法韦仑给药后，其中17条miRNA呈现显著下调，3条呈现显著下调。通过对各条miRNA进行功能性分析发现，已有多项研究表明，这些miRNA的靶点基因多为原癌基因或抑癌基因表达相关通路的蛋白，在已被明确报道在多种肿瘤的发生及进展过程中发挥重要作用，以下述7条miRNA相关的功能性研究为例，说明依法韦仑给药的抗肿瘤作用。具体如下：
下调miRNA：
(1)Hsa-miR-93：miR-93在多种恶性肿瘤中呈现异常高表达，其通过靶向调节PTEN、E2F1、Six1等基因的表达促进肿瘤的增殖并抑制其凋亡；通过靶向调节Smad7基因诱导肿瘤细胞发生上皮-间质转换(EMT)，增强肿瘤细胞的耐药性及恶性。因此，依法韦仑给药组的miR-93表达量下调，表明肿瘤的增殖及进展受到抑制。
(2)Hsa-miR-21：miR-21在乳腺癌、胰腺癌、肺癌、食道癌、卵巢癌等多种肿瘤中表达量呈现显著升高。miR-21的靶基因涉及多条调节细胞增殖、分化、凋亡与迁移功能的信号通路，如PTEN(抑制细胞增殖及迁移)、PDCD4(抑制细胞增长)、RECK(抑制基质金属蛋白酶(MMPs)，进而抑制肿瘤的侵袭和转移)等。miR-21的高表达导致上述蛋白的功能受到抑制，肿瘤细胞的增殖及迁移能力增强。因此，依法韦仑给药组的miR-21表达量下调，表明肿瘤的生长、增殖及迁移功能受到抑制。
(3)Hsa-miR-20a：miR-20a在骨肉瘤、肺癌、胃癌、结直肠癌等肿瘤中呈现异常高表达，其通过靶向调节向E-cadherin、vimentin等蛋白的表达，影响肿瘤细胞的迁移、侵袭以及上皮-间充质转化(EMT)过程。因此，依法韦仑给药组的miR-20a表达量下调，表明肿瘤细胞的运动性及侵袭性降低，肿瘤恶性受到抑制。
(4)Hsa-miR-130a：miR-130a在肺癌、骨肉瘤、胃癌、宫颈癌等肿瘤中呈现异常高表达，其通过抑制抑癌基因PTEN，肿瘤抑制因子RUNX3，肿瘤坏死因子TNF-α等基因的功能，促进肿瘤的发生发展。因此，依法韦仑给药组的miR-130a表达量下调，表明肿瘤细胞的增殖及拮抗凋亡过程的能力受到抑制，反映了依法韦仑的抗肿瘤作用。
(5)Hsa-miR-106a：miR-106a是一种致瘤性的miRNA，在小细胞肺癌、胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌多种肿瘤中高表达，并与肿瘤耐药性密切相关。miR-106a通过抑制抑癌基因PTEN，磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt)多种靶基因，调控PI3K/Akt信号转导过程，进而在肿瘤细胞的增殖及凋亡过程中发挥重要作用。因此，依法韦仑给药组的miR-106a表达量下调，表明肿瘤细胞的生长及增殖能力受到抑制。
上调miRNA：
(1)Hsa-miR-145：miR-145在肺癌、直肠癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌和胶质瘤等多种癌症中呈现显著下调。miR-145通过靶向调节干细胞分化关键因子OCT4、肿瘤特异性粘蛋白MUC1等，影响肿瘤细胞的增殖、转移及凋亡等过程。在临床中，miR-145表达水平与肿瘤患者的诊断及预后具有良好的相关性，miR-145下调，表明患者预后较差。因此，依法韦仑给药组的miR-145表达量上调，表明肿瘤细胞的增殖及转移能力受到抑制，反映了依法韦仑的抗肿瘤作用。
Hsa-miR-let-7d：miR-let-7d在肺癌、膀胱癌、肾细胞癌、胶质瘤等多种肿瘤中呈现显著下调。在肺癌中，miR-let-7d的下调，导致核受体过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的表达量升高，进而促进肺癌细胞的增殖和侵袭能力。因此，依法韦仑给药组的miR-let-7d表达量上调，表明肿瘤细胞的增殖和侵袭能力受到抑制，反映了依法韦仑的抗肿瘤作用。
5.依法伟仑对小细胞肺癌细胞及正常组织细胞增殖的影响
为了研究作为逆转录酶抑制剂的依法韦仑对于肿瘤细胞及正常组织细胞增殖的影响，本实施例选取人正常肺上皮细胞BEAS-2B(非致瘤性)和2种小细胞肺癌细胞系H2227，H69，进行依法韦仑给药培养，给药起6天内，光学显微镜下观察细胞形态变化，并采用CCK8法检测每日细胞增殖数量，以此来研究依法韦仑对于该细胞系增殖功能的影响。
实验结果如图5所示，结果表明，在依法韦仑给药后，非致瘤性的正常组织细胞BEAS-2B的增殖几乎不受影响，而对应的小细胞肺癌细胞H2227和H69的增殖则明显受到抑制。后续研究表明，依法韦仑对肿瘤细胞增殖的抑制是可逆的，撤除药物后，细胞的增殖功能可以迅速恢复(本发明未示出)。
综上所述，通过对经依法韦仑给药处理(给药组)前后的人源小细胞肺癌细胞系H69细胞进行miRNA表达谱的检测及差异分析，可以发现依法韦仑给药对小细胞肺癌细胞的整个miRNA表达谱产生了显著的影响。通过对差异表达的miRNA进行功能性分析的结果表明，依法韦仑可以改变肿瘤细胞中多种与肿瘤发生发展相关的miRNA的表达，通过下调具有促进肿瘤进展相关，如提高细胞增殖、迁移、侵袭能力的miRNA，以及上调具有抑癌作用的miRNA的方式，抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化及凋亡等途径，达到抗肿瘤的作用效果，在此过程中对于正常细胞的增殖无影响。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.依法韦仑在制备治疗小细胞肺癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述依法韦仑通过抑制小细胞肺癌细胞的增殖或诱导小细胞肺癌细胞的凋亡抗小细胞肺癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述依法韦仑通过激活Caspase 3信号通路促进小细胞肺癌细胞的凋亡。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的应用，其特征在于，所述依法韦仑通过下调miR-93、miR-21、miR-20a、miR-130a和miR-106a中的一种或多种抑制小细胞肺癌的发生和发展。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述miR-93的靶向基因为PTEN、E2F1和/或Six1；所述miR-21的靶向基因包括PTEN、PDCD4和/或RECK。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述miR-20a的靶向基因包括E-cadherin和/或vimentin；所述miR-130a的靶向基因包括RUNX3和/或TNF-α。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述miR-106a的靶向基因包括PI3K和/或Akt。
8.根据权利要求1～3任意一项所述的应用，其特征在于，所述依法韦仑通过上调miR-145或miR-let-7d抑制小细胞肺癌的发生和发展。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述miR-145的靶向基因包括OCT4和/或MUC1；所述miR-let-7d的靶向基因包括PPARγ。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述依法韦仑抑制小细胞肺癌的细胞增殖的半数有效浓度为22μM；所述依法韦仑诱导小细胞肺癌的细胞凋亡的半数有效浓度为69μM。
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