ES2309222T3 - Inhibidores no nucleosidos de la transcriptasa inversa como antagonistas de la proliferacion celular e inductores de la diferenciacion celular. - Google Patents

Abstract

Utilización de un compuesto seleccionado de entre el grupo constituido por la clase de compuestos de 5,11dihidro-6H-dipirido[3,2-b:2'',3''-e][1,4]diazepina, nevirapina, efavirenz, delavirdina, y sales correspondientes y/o derivados farmacéuticamente aceptables de nevirapina, efavirenz y delavirdina para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de patologías caracterizadas porque presentan pérdida de diferenciación celular y crecimiento celular incontrolado, en la que las patologías se seleccionan de entre el grupo constituido por leucemia, tumores epiteliales, tumores del sistema nervioso, teratocarcinomas, fibro y osteosarcomas, carcinoma de colon, carcinoma de mama, glioma y hepatoma.

Description

Inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa como antagonistas de la proliferación celular e inductores de la diferenciación celular.

Campo de la invención

La presente solicitud describe inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa (RT) como antagonistas de la proliferación celular e inductores de la diferenciación celular para su utilización terapéutica en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades proliferativas y de diferenciación tales como el cáncer.

Antecedentes de la invención

La transcriptasa inversa (RT) endógena, no telomérica es una enzima codificada por dos clases de elementos repetidos abundantes en todos los genomas eucariotas: retrotransposones y retrovirus endógenos (di Marzo Veronese F, Copeland TD, DeVico AL, Rahman R, Oroszlan S, Gallo RC, Sarngadharan MG Science (1986) 231,1289-91 - Characterization of highly immunogenic p66/p51 as the reverse transciptase of HTLV-III/LAV; Grob PM, Wu JC, Cohen KA, Ingraham RH, Shih CK, Hargrave KD, McTague TL, Merluzzi VJ AIDS Res Hum Retroviruses (1992) 8,145-52 Nonnucleoside inhibitors of HIV-1 reverse transciptase: nevirapin as a prototype drug). La expresión de genes que codifican para RT generalmente está reprimida en tejidos no patológicos diferenciados de manera terminal - en los que es detectable solamente en niveles basales - aunque es altamente activa en la línea germinal de mamíferos, tejidos embrionarios y células tumorales. Queda por aclarar el papel desempeñado por la RT en procesos fundamentales tales como el crecimiento celular y la diferenciación. Se conocen nevirapina, efavirenz y rescriptor, también conocidos con los nombres comerciales de VIRAMUNE®, SUSTIVA® y RESCRIPTOR® respectivamente, como inhibidores no nucleósidos de la RT y se utilizan ampliamente en el tratamiento del SIDA como agentes antirretrovirales. En particular, la nevirapina tiene la siguiente fórmula empírica: C_{15}H_{14}N_{4}O. En su estado puro es un sólido cristalino de peso molecular 266,302, con un punto de fusión de 247-249ºC y una solubilidad de 0,1 mg/ml en agua y 5,5 mg/ml en etanol y puede prepararse según las indicaciones presentes en la patente EP 429.987. La nevirapina (5,11-dihidro-11-ciclopropil-4-metil-6H-dipirido-[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ona) está comprendida en el grupo de compuestos de la 5,11-dihidro-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepinas, que se conocen como inhibidores no nucleósidos de la RT y se utilizan en la prevención y el tratamiento de infecciones por VIH, tal como se describe en el documento EP 429.987.

Efavirenz (P.M. 315,68) (-)-6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazinona [Referencias que se incorporan a la presente memoria como referencia: 1.YOUNG, S.D.; BRITCHER, S.F.; TRAN, L.O.; PAYNE, L.S.; LUMMA, W.C.; LILE, T.A.; HUFF, J.R.; ANDERSON, P.S.; OLSEN, D.B.; CARROLL, S.S.; PETTIBONE, D.J.; O'BRIEN, J.A.; BALL, R.G.; BALANI, S.K.; LIN, J.H.; LONG, W.J.; BYRNES, V.W.; EMINI, E.A.; ET AL., L-743,726(DMP-266): A NOVEL, HIGHLY POTENT NONNUCLEOSIDE INHIBITOR OF THE HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE 1 REVERSE TRANSCRIPTASE. ANTIMICROB AGENTS CHEMOTHER 39(12):2602-2605 (1995)].

Rescriptor (P.M. 552,68) [1-(5-metanosulfonamido)-1H-indol-2-il-carbonil)-4-[3-(isopropilamino)-2-piridinil]piperazina] (Referencias que se incorporan a la presente memoria como referencia: 1. ROMERO, D.L.; MORGE, R.A.; GENIN, M.J.; BILES, C.; BUSSO, M.; RESNICK, L.; ALTHAUS, LW.; REUSSER, F.; THOMAS, R.C.; TARPLEY, W.G. BIS(HETEROARIL)PIPERZINE(BHAP) RT INHIBITORS: STRUCTURE-ACTIVITY RELATIONSHIPS OF NOVEL SUBSTITUTED INDOLE ANALOGUES AND THE IDENTIFICATION OF MONOMETHANESULFONATE (U-90152S). J MED CHEM 36(10):1505-1508 (1993).

2. ROMERO, D.L.; OLMSTED, R.A.; POEL. T.J.; MORGE, R.A.; BILES, C.; KEISER, B.J.; KOPTA, L.A.; FRIIS, J.M.; HOSLEY, J.D.; STEFANSKI, K.J.; WISHKA, D.G.; EVANS, D.B.; MORRIS, J.; STEHLE, R.G.; SHARMA, S.K.; YAGI, Y.; VOORM AN, R.L.; ADAMS, W.J.; TARPLEY, W.G. TARGETING DELAVIRDINE/
ATEVIRDINE RESISTANT VIH-1: IDENTIFICATION OF (ALKYLAMINO)PIPERIDINE-CONTAINING BIS(HETEROARYL)PIPERAZINES AS BROAD SPECTRUM VIH-1 REVERSE TRANSCRIPTASE INHIBITORS. J MED CHEM 39(19):3769-3789 (1996).

3. Shaw et al., Int. J. de STD & AIDS, 1999; 10: 417-418 enseñan la cura del sarcoma de Kaposi combinando juntos nevirapina y dos principios activos adicionales, de naturaleza nucleosídica, que son inhibidores de la transcriptasa inversa.

4. Grimaudo et al., European J. of Cancer, Vol. 34, Nº 11, 1756-1763 (1998) y el documento US nº 6.258.839, se refieren ambos a inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa (NNRTI) evaluados para determinar su actividad antitumoral con pruebas in vitro. Se evalúa la actividad del compuesto descrito en Grimaudo midiendo la expresión de la proteína p53 y Bcl-2 en células de leucemia humana HL60. El documento US nº 6.258.839 da a conocer una clase de compuestos de naturaleza flavonoide. Los datos notificados en el mismo muestran que dosis crecientes de los compuestos descritos reducen el crecimiento celular en líneas celulares tumorales humanas. Sin embargo, no se proporcionan evidencias con el fin de explicar el fenómeno observado.

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5. Ghori et al., Colorectal disease 2000 UK, Vol. 2., Nº 2, 106-112, (2000) da a conocer pruebas in vitro de análogos de nucleósidos con el fin de establecer su eficacia en un mecanismo que implica la inhibición de la telomerasa.

6. Lam et al., Biochem. and Biophys. Research Communications, Vol. 285, nº 4, 1071-1075, (2001) da a conocer la hipsina como una proteína que muestra actividad antiproliferativa para células de leucemia y hepatoma.

Estudios preliminares en el grupo de investigadores actual han demostrado que tanto la nevirapina como el efavirenz provocan una detención en el desarrollo eficaz e inicial en embriones de ratón tempranos cuando se añaden a cultivos de embriones preparados en ensayos de fertilización in vitro (FIV). Esta observación indicó por primera vez que ambos fármacos pueden inhibir potencialmente la proliferación celular e indujo a someter a prueba su efecto sobre células tumorales.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el hallazgo de que los inhibidores no nucleósidos de la RT promueven la diferenciación celular concomitante con la reducción de la proliferación celular.

El término "inhibidores" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a compuestos que interfieren con la actividad enzimática a través de una unión directa con moléculas de RT. Más específicamente, tanto nevirapina como efavirenz se unen al espacio hidrófobo en la unidad p66 de la RT, que está próxima al sitio catalítico (cuya función, por tanto, se ve comprometida). Según esta definición, la presente solicitud describe que los compuestos disponibles comercialmente mencionados anteriormente, es decir VIRAMUNE (nevirapina), SUSTIVA (efavirenz) y RESCRIPTOR (delavirdina), así como otros compuestos que pueden interferir con la actividad de la RT, pueden utilizarse en el tratamiento y/o la prevención de patologías caracterizadas por pérdida de diferenciación celular y crecimiento celular incontrolado. Por consiguiente, la presente solicitud describe la utilización de compuestos no nucleósidos que muestran actividad de inhibición de RT según el mecanismo anterior, que pueden utilizarse en el tratamiento preventivo y/o curativo para contrarrestar la pérdida de diferenciación en patologías de desdiferenciación y como fármacos antiproliferativos en el tratamiento de tumores. En particular, pueden utilizarse inhibidores de la RT que antagonizan con los procesos de proliferación celular y desdiferenciación en el tratamiento de tumores humanos, en particular de tumores epiteliales, tumores mesenquimatosos y tumores del sistema nervioso, incluyendo leucemias y tumores sólidos tales como teratocarcinomas, fibro y osteosarcomas, carcinoma de colon, carcinoma de mama, glioma y hepatoma.

Por tanto, un objetivo de la invención consiste en la utilización de un compuesto seleccionado de entre el grupo constituido por la clase de compuestos de 5,11-dihidro-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepina, nevirapina, efavirenz, delavirdina, y sales correspondientes y/o derivados farmacéuticamente aceptables de nevirapina, efavirenz y delavirdina para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de patologías caracterizadas por pérdida de diferenciación celular y crecimiento celular incontrolado, en la que las patologías se seleccionan de entre el grupo constituido por leucemia, tumores epiteliales, tumores del sistema nervioso, teratocarcinomas, fibro y osteosarcomas, carcinoma de colon, carcinoma de mama, glioma y hepatoma.

En una forma de realización preferida, dicho compuesto se selecciona de nevirapina, efavirenz, delavirdina, y sales correspondientes y/o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Preferentemente, el compuesto promueve la diferenciación celular concomitante con la reducción de la proliferación celular.

En una forma de realización preferida de una utilización según la invención, la composición farmacéutica obtenida presenta actividad antiproliferativa. En otra forma de realización preferida de una utilización según la invención, la composición farmacéutica obtenida presenta actividad de inducción para diferenciación celular.

Entre los inhibidores no nucleósidos de la RT seleccionados de entre el grupo constituido por la clase de compuestos de 5,11-dihidro-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepina, nevirapina, efavirenz, delavirdina, y sales correspondientes y/o derivados farmacéuticamente aceptables de nevirapina, efavirenz y delavirdina, la presente invención comprende explícitamente la utilización de compuestos comercialmente disponibles que se utilizan actualmente para el tratamiento del SIDA, que presentan actividad como inhibidores no nucleósidos de la RT, incluyendo sus formas farmacéuticas relativas. Entre ellos, se prefieren particularmente: Viramune® (nevirapina) (Boehringer), Sustiva® (efavirenz) (Bristol-Myers Squibb) y Rescriptor® (delavirdina) (Agouron Pharmaceuticals).

Los compuestos mencionados anteriormente, y nevirapina como ejemplo particular, en sus formas farmacéuticas comúnmente utilizadas y comercialmente disponibles, se proponen como ejemplos de compuestos útiles para la preparación de composiciones farmacéuticas que van a utilizarse en casos en los que debe controlarse la diferenciación y/o la proliferación celular, por tanto con actividad de diferenciación y antitumoral. El efecto terapéutico de las moléculas debe situarse en relación con su capacidad de inhibición de la RT.

La invención describe además el tratamiento preventivo o terapéutico de la proliferación celular en mamíferos, en particular en seres humanos, con acciones de diferenciación y antitumorales.

Otros objetivos resultarán evidentes a partir de la descripción detallada de la invención.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Transcriptasa inversa en líneas celulares de ratón y ser humano. Figura 1A. Ensayo de la actividad de RT funcional tras la incubación de ARN de MS2 con lisados de los siguientes tipos celulares de ser humano (carriles 1-9) y ratón (10-22): carril 1, leucemia NB4; carril 2, leucemia R4; carril 3, leucemia Kasumi-1; carril 4, leucemia HL60; carril 5, osteosarcoma Saos-2; carril 6, carcinoma de mama MDA-231; carril 7, carcinoma de mama MCF7; carril 8, glioma U343 Mg; carril 9, carcinoma de colon HT-29; carril 10, fibroblastos embrionarios NIH/3T3; carril 11, mioblastos C2C7; carril 12, teratocarcinoma F9; carril 13, fibrosarcoma L929; carril 14, reacción de control con lisado F9 pero sin ARN de MS2; carril 15, solamente tampón; carril 16, lisado de células no mamíferas; carril 17, ni ARN de MS2 ni lisado celular; carril 18, reacción de control positivo con RT comercial; carril 19, oligonucleótidos no específicos para MS2; carriles 20-22: reacción completa con lisado de F9 incubado previamente con 1 (carril 20), 10 ( carril 21) y 100 (carril 22) \muM de nevirapina. Carriles M, marcadores de peso molecular de ADN; carril 23, reacción de control positivo con Ti comercial. Figura 1B. Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de proteínas RT (paneles superiores) y \alpha-tubulina (paneles inferiores) en WCE y núcleos. Los WCE fueron de: F9 (carril 1), NIH/3T3 (carril 2), MCF7 (carril 3), MDA-231 (carril 4), NB4 (carril 5), HL60 (carril 6) y blastocitos ML2 (carril 7). Los extractos nucleares fueron de: F9 (carril 1), MCF7 (carril 2), MDA-231 (carril 3), NIH 3T3 (carril 4), HL60 (carril 5) y NB4 (carril 6).

Figura 2: La nevirapina inhibe la proliferación en líneas celulares de ratón y ser humano. Se cultivaron las células con (línea discontinua) y sin (DMSO, línea continua) nevirapina. Se expresa la tasa de proliferación como la proporción de células contadas en los tiempos indicados con respecto al número inicial de células cultivadas, tomadas como 1. Los puntos representan el valor medio y las barras la desviación estándar de por lo menos tres ensayos independientes para todos los tipos celulares.

Figura 3A: Análisis del ciclo celular en células control y expuestas a nevirapina. La distribución de las fases del ciclo celular se determinó mediante FACS tras 72 h desde el inicio del tratamiento con nevirapina. En la línea celular de glioma U343, se analizó separadamente el ciclo celular en la fracción celular diploide (que representaba aproximadamente 2/3 de todas las células) y en la fracción restante (aproximadamente 1/3) que desarrolla aneuploidía. Figura 3B. Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de ciclina D1 (panel superior) en extractos de los tipos celulares indicados, cultivados durante 72 h con (+, carriles 2, 4 y 6) o sin (-, carriles 1, 3 y 5) nevirapina. El filtro se volvió a sondar con anticuerpo antiactina para controlar la carga equivalente (panel inferior).

Figura 4: Diferenciación de células miogénicas C2C7 tras exposición a nevirapina. Se sometieron a tinción mioblastos C2C7 tratados previamente con DMSO (A, C) o nevirapina (B, D, E) antes de cultivar en medio de diferenciación con antiMHC (FITC, verde) y Hoechst 33258 para visualizar núcleos (en azul); se muestran las fotografías combinadas. En aumento de 20x, los miotubos en los cultivos control (figura 4A) son más finos y menos frecuentes que tras el tratamiento con nevirapina (figura 4B). Figura 4C, aumento de 60x de miotubos en A. Figura 4D, aumento de 60x magnificación de miotubos en B. Figura 4E, aumento de 60x de mioblastos positivos para MHC en el campo en B.

Figura 5: Diferenciación morfológica en células F9 expuestas a RA y nevirapina. Los cultivos de F9 expuestos a DMSO (controles, figura 5a, figura 5b, figura 5c, figura 5d), nevirapina (figura 5e, figura 5f, figura 5g, figura 5h) o RA (figura 5i, figura 5j, figura 5k, figura 5l) se examinaron en primer lugar in vivo tras 72 h de cultivo para registrar la reorganización morfológica (paneles de figura 5a, figura 5e, figura 5i, objetivo de 60x). Tras 96 h, se fijaron las muestras y se procesaron para IF de cadena de colágeno tipo IV (a1) (figura 5c, figura 5g, figura 5k) y tinción DAPI de núcleos (figura 5b, figura 5f, figura 5j); las fotografías están combinadas en la figura 5d, figura 5h y figura 5l (objetivo de 100x).

Figura 6: El tratamiento con nevirapina libera el bloqueo de la diferenciación en blastocitos de AML. Diferenciación morfológica, revelada mediante tinción de Wright-Giemsa, en la línea celular promielocítica NB4; células HL60; y blastocitos de dos pacientes con AML (AML nº 1 y AML nº 2) tras el tratamiento con nevirapina 400 \muM (Nev) durante 5 días. También se trataron células NB4 con RA 1 \muM, que induce diferenciación de granulocitos. Las células no tratadas se muestran como controles.

Figura 7: La nevirapina induce variaciones en la expresión génica en células F9. El ARN total de células F9 cultivadas con DMSO (controles), nevirapina o RA se sometió a amplificación mediante RT-PCR con oligonucleótidos para los genes indicados genes, se sometió a inmunotransferencia y se hibridó con oligonucleótidos internos. Se muestran los paneles representativos en la figura 7A y la figura 7B: Variaciones cuantitativas en la expresión génica. Se cuantificaron los productos de RT-PCR hibridados con oligonucleótidos internos mediante densitometría. Se normalizó la razón de la señal en nevirapina con respecto a los cultivos control con relación a la que se obtuvo para la acción \beta en el mismo experimento. Los histogramas oscuros representan el valor medio y los histogramas claros la desviación estándar de por lo menos tres experimentos para cada gen.

Figura 8: El efavirenz inhibe la proliferación en líneas celulares murinas (figura 8A líneas celulares 3T3; figura 8B: células F9). Se cultivaron las células con (líneas discontinuas) y sin (DMSO, línea continua) efavirenz. La tasa de proliferación se expresa como la razón de las células contadas en los tiempos indicados con respecto al número inicial de células cultivadas, tomadas como 1. Los puntos representan el valor medio de por lo menos tres ensayos independientes.

Figura 9: El efavirenz inhibe la proliferación en líneas celulares humanas. (Figura 9A HeLa 1^{er} ciclo; figura 9B: HeLa 2º ciclo, figura 9C SAOS 1^{er} ciclo, figura 9D SAOS 2º ciclo). Se cultivaron las células con (línea discontinua) y sin (DMSO, línea continua) efavirenz. La tasa de proliferación se expresa como la razón de las células contadas en los tiempos indicados con respecto al número inicial de células cultivadas, tomadas como 1. Los puntos representan el valor medio de por lo menos tres ensayos independientes.

Figura 10: Crecimiento de hepatoma de Morris en ratas control (línea continua) y tratadas con nevirapina (línea discontinua). La tasa de crecimiento tumoral se expresa como el volumen (en cm^{3}) a lo largo del tiempo (en días desde el momento de la inoculación).

Figura 11: Muestras de tejido de ratas tratadas con nevirapina (paneles NEV) y muestra no tratada (paneles CTR). En los paneles superiores (objetivo de 10x), las áreas transformadas en el panel NEV de la figura 11B están reducidas sorprendentemente en comparación con el tejido no tratado (CTR) (figura 11A). En los paneles inferiores (objetivo de 40x), las células que experimentan apoptosis son claramente visibles en la muestra de NEV (figura 11 D) pero no en la de CTR (figura 11C).

Figura 12: Crecimiento de hepatoma de Morris en ratas control (línea continua) y dos ratas tratadas con efavirenz (línea discontinua, EFV1 y EFV2). La tasa de crecimiento tumoral se expresa como el volumen (en cm^{3}) a lo largo del tiempo (en días desde el momento de inoculación).

Descripción detallada de la invención

Se detectó inicialmente una actividad de RT endógena, la enzima seleccionada como diana por los inhibidores, en una variedad de extractos de línea celular tumoral de ratón y ser humano utilizando un ensayo de RT basado en PCR.

Entonces se añadió nevirapina 350-400 \muM, o efavirenz 10-20 \muM, durante varios días en cultivos de células progenitoras de ratón (es decir, células precursoras miogénicas C2C7; fibroblastos embrionarios NIH/3T3) y líneas celulares tumorigénicas de ratón y ser humano (teratocarcinoma F9; fibrosarcoma L929; carcinoma de colon HT-29; carcinoma de mama que expresa el receptor de estrógenos (ER+) MCF-7; carcinoma de mama, negativo para expresión de ER (ER-) MDA-231; glioma U343 Mg y osteosarcoma Saos-2). Los resultados mostraron que los inhibidores de la RT inducen una disminución en la tasa de proliferación celular y promueven la diferenciación celular. También se observo diferenciación en líneas celulares de leucemia mieloide aguda (AML) (NB4, HL60, Kasumi-1) y blastocitos primarios de dos pacientes con AML, tal como se indicó mediante ensayos morfológicos, funcionales e inmunofenotípicos.

El análisis de RT-PCR de ARNm extraído de células F9 antes y tras la exposición a nevirapina representó una reprogramación sustancial de la expresión génica en un conjunto de genes que regulan fundamentalmente el ciclo celular: se regularon por disminución la ciclina D1 y D3; a la inversa, su antagonista p16 se reguló por incremento; en menor medida, el inhibidor de cinasa p27 y los genes relacionados con retinoblastoma Rb-1 y Rb-2 también se regularon por disminución.

Estos resultados apoyan el punto de vista de que: a) una actividad de RT endógena está implicada en la oncogénesis y b) los inhibidores de la RT promueven la conversión de fenotipos tumorales a fenotipos normales. Se estudió la diferenciación inducida por nevirapina con mayor detalle en líneas celulares C2C7 miogénicas y F9 multipotentes mediante el seguimiento de la aparición de marcadores de diferenciación específicos que no se expresan en las células progenitoras, es decir cadena \alpha de colágeno IV en células F9 y miosina en células C2C7, respectivamente. Además, los estudios en los niveles morfológico (razón núcleo/citoplasma y basofilia disminuida), funcional (ensayo de NBT) e inmunofenotípico (expresión de antígenos de superficie específicos de linaje) indican que el tratamiento con nevirapina puede rescatar el bloqueo de la diferenciación presente en las líneas celulares de AML humana en blastocitos transformados primarios de pacientes con AML.

Basándose en estos hallazgos, se propone que los compuestos no nucleósidos que muestran actividad de inhibición de RT según el mecanismo anterior seleccionados de entre el grupo constituido por la clase de compuestos de 5,11-dihidro-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepina, nevirapina, efavirenz, delavirdina, y sales correspondientes y/o derivados farmacéuticamente aceptables de nevirapina, efavirenz y delavirdina se utilicen en el tratamiento preventivo y/o curativo como fármacos antiproliferativos en tratamiento de tumores de tumores epiteliales, tumores mesenquimatosos y tumores del sistema nervioso, incluyendo leucemias y tumores sólidos tales como teratocarcinomas, fibro y osteosarcomas, carcinoma de colon, carcinoma de mama, glioma y hepatoma.

Los compuestos preferidos seleccionados de entre el grupo constituido por la clase de compuestos de 5,11-dihidro-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepina, nevirapina, efavirenz, delavirdina, y sales correspondientes y/o derivados farmacéuticamente aceptables de nevirapina, efavirenz y delavirdina que están comercialmente disponibles y se utilizan para el tratamiento del SIDA que presentan actividad como inhibidores no nucleósidos de la RT. Se prefieren particularmente: Viramune (nevirapina) (Boehringer), Sustiva (efavirenz) (Bristol-Myers Squibb) y Rescriptor (delavirdina) (Agouron Pharmaceuticals).

Los compuestos mencionados anteriormente, y nevirapina como ejemplo particular, en sus formas farmacéuticas comúnmente utilizadas y comercializados, se proponen como ejemplos de sustancias útiles para la preparación de composiciones farmacéuticas van a utilizarse en los casos en los que debe controlarse la diferenciación, al mismo tiempo que se contrarresta la proliferación celular, por tanto con acción en la diferenciación y antitumoral. El efecto terapéutico de las moléculas debe situarse en relación a su capacidad de inhibición de la RT.

La presente solicitud también describe que el tratamiento preventivo o terapéutico de la proliferación celular puede aplicarse en mamíferos, en particular en seres humanos.

Los sujetos que lo requieran pueden tratarse con una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en la clase de compuestos de 5,11-dihidro-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepina, nevirapina, efavirenz, delavirdina, y sales correspondientes y/o derivados farmacéuticamente aceptables de nevirapina, efavirenz y delavirdina que muestra actividad como inhibidor no nucleósido de la RT y proporciona un beneficio terapéutico al sujeto.

Los compuestos no nucleósidos seleccionados de entre el grupo constituido por la clase de compuestos de 5,11-dihidro-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepina, nevirapina, efavirenz, delavirdina, y sales correspondientes y/o derivados farmacéuticamente aceptables de nevirapina, efavirenz y delavirdina pueden utilizarse según la invención en composiciones farmacéuticas para preparar medicamentos con acción en la diferenciación y antitumoral para el tratamiento y/o la prevención de patologías caracterizadas por pérdida de diferenciación celular y crecimiento celular incontrolado, en los que las patologías se seleccionan de entre el grupo constituido por leucemia, tumores epiteliales, tumores del sistema nervioso, teratocarcinomas, fibro y osteosarcomas, carcinoma de colon, carcinoma de mama, glioma y hepatoma. La composición para las utilizaciones descritas en la presente invención pueden obtenerse mediante el mezclado conjunto de cantidades eficaces de por lo menos un principio activo con uno o más vehículos y/o diluyentes y/o disolventes y/o excipientes y auxiliares fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de los principios activos en preparaciones que puede utilizarse farmacéuticamente, tal como en forma de píldoras, disoluciones, suspensiones. Estas composiciones farmacéuticas pueden prepararse de una manera que es conocida por en sí misma, por ejemplo, por medio de procedimientos convencionales de mezclado, disolución, granulación, preparación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. La formulación apropiada depende de la vía de administración seleccionada. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por vía oral, o mediante inyección intravenosa, intramuscular o hipodérmica.

Las utilizaciones, dosificaciones y vías de administración son según las indicaciones presentes en la patente EP 429.987.

Las dosis y modalidades de administración varían según el tipo y la gravedad de la afección.

Se proporcionará a continuación en la presente memoria la descripción de algunos ejemplos experimentales utilizando las moléculas mencionadas anteriormente. Sin embargo, ha enfatizarse que, debido a la estructura química diferente de los compuestos preferidos según la presente invención, se entenderá que la invención no se limita a tales moléculas sino que pueden aplicarse también otros compuestos que muestren actividad como agentes inhibidores de la RT.

Los ejemplos siguientes deben considerarse como ilustrativos y no limitativos del alcance de la presente invención.

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Ejemplo 1 Actividad de RT endógena en células tumorales

La actividad enzimática de RT, que se selecciona como diana de los inhibidores descritos en la presente memoria, se ha detectado en todas las líneas celulares, tanto de origen murino como humano, que se han sometido a prueba en este trabajo utilizando un ensayo basado en PCR. Los resultados resumidos en la figura 1, A muestran que lisados de todas las líneas celulares albergan una actividad de RT que puede retrotranscribir in vitro un ARN exógeno (ARN del fago MS2), generando un producto amplificado del tamaño esperado, es decir 112 pb (carriles 1-13); el ADNc no se sintetiza si el ARN de MS2 (carril 14) o el lisado celular (carril 16) se omiten en la mezcla de incubación. Además, la actividad de RT se inhibe cuando se incuba previamente el lisado celular con nevirapina de un manera dependiente de la dosis: se suprime el producto con 112 pb tras la incubación con 100 \muM (carril 22) pero no con 1 (carril 20) o con 10 \muM (carril 21). La presencia de la enzima RT en células tumorales se confirma adicionalmente mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western. La figura 1, B muestra que se reconocen las moléculas de proteína por un anticuerpo policlonal antiRT específico, tanto en lisados de células enteras (WCE) como en nucleares.

Estos resultados muestran que la RT está presente en las células tumorales, como una proteína y como una actividad enzimática, y que se inhibe mediante nevirapina.

Ejemplo 2 Incubación de cultivos celulares murinos y humanos con nevirapina: ralentización de la duplicación celular

Se cultivaron células de precursores miogénicos C2C7 de ratón, de fibroblastos embrionarios NIH/3T3, de teratocarcinoma F9 y de fibrosarcoma L929, y células humanas de las siguientes líneas celulares: osteosarcoma Saos-2, carcinoma de colon HT-29, carcinoma de mama (ER-) MDA-231, carcinoma de mama (ER+) MCF7, glioma U343, en DMEM que contenía suero fetal al 10-20% y nevirapina 350 \muM diluido a partir de una disolución madre (250 mM) en DMSO al 100%. Se sembraron en placa las células a una densidad de 2-5X10^{4} en placas de Petri de 35 mm y se expusieron a nevirapina 5-6 horas más tarde. Se retiraron las muestras en tiempos específicos y se contaron las células en cultivos expuestos a nevirapina y control (expuestos a DMSO). Los resultados resumidos en la figura 2 muestran que la exposición a nevirapina (línea discontinua) disminuye la tasa de proliferación en todas las líneas celulares. Se observaron algunas diferencias específicas del tipo celular en la respuesta al efecto supresor del fármaco: las células de teratocarcinoma F9 mostraron la mayor respuesta, con una reducción de 5 veces en la tasa de proliferación tras 120 h de exposición. Se representó una eficacia comparable en células de carcinoma de colon HT-29. Las células de osteosarcoma Saos-2 fueron el tipo que respondió más lentamente, y solamente tras 5 días de la exposición la tasa de crecimiento empezó a disminuir en comparación con los cultivos control.

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Ejemplo 3 Incubación de cultivos celulares con nevirapina: salida del ciclo celular

El análisis de FACS de cultivos celulares expuestos a nevirapina representó cambios en el perfil de ciclo celular de diversos tipos celulares: tal como se muestra en la figura 3A, las células con un contenido en ADN en G0/G1 se acumularon en los cultivos de NIH/3T3, HT-29, MCF-7 y U343 Mg tras 72 h de tratamiento con nevirapina, mientras que en estos mismos tiempos las muestras control mostraron perfiles de ciclo celular típicos de cultivos en proliferación. Esto estaba acompañado por una disminución sustancial en los niveles de ciclina D1 en los cultivos de NIH/3T3, HT-29, MCF-7 (figura 3B), y glioma U343 Mg (datos no representados) expuestos a nevirapina en comparación con los controles no expuestos.

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Ejemplo 4 Incubación de cultivos celulares con nevirapina: inducción de diferenciación

La nevirapina influye en el proceso de diferenciación celular tal como se muestra utilizando sistemas celulares modelo que pueden experimentar diferenciación in vitro con patrones bien caracterizados. Puede inducirse la diferenciación de las células satélites miogénicas C2C7 de ratón, que proliferan como mioblastos mononucleados con la retirada del factor de crecimiento y la formación de miotubos multinucleados que expresan genes específicos de músculo. En los experimentos se cultivaron las células C2C7 con o sin nevirapina durante 90 h (durante lo cual los cultivos control alcanzaron la densidad de saturación) y entonces se transfirieron al medio de diferenciación durante 48 h. Mediante puntuación por microscopia de campo luminoso (n = 300 células de campos seleccionados al azar), la razón entre miotubos multinucleados (es decir, células con más de tres núcleos) y células mono/binucleadas fue aproximadamente 1:1 en las muestras tratadas con nevirapina en comparación con 1:2 en las muestras no tratadas. Las monocapas de células se analizaron adicionalmente mediante inmunofluorescencia (IF) utilizando un anticuerpo policlonal frente a la cadena pesada de la miosina (MHC), un marcador tardío de la diferenciación muscular. En los cultivos control mantenidos en medio de diferenciación durante 48 h, los miotubos que contenían MHC multinucleados eran finos y notablemente menores (figura 4C) que en los cultivos tratados previamente con nevirapina (figura 4D). Los mioblastos aislados fueron la mayoría negativos para MHC en los cultivos control (figura 4A), mientras que la síntesis de miosina ya estaba activada en los mioblastos aislados en placas tratadas con nevirapina
(figura 4E).

La nevirapina también provocó la diferenciación en células de teratocarcinoma F9. Las células F9 no tratadas presentan una forma redondeada y tienden a formar agregados durante el crecimiento (figura 5a). Cuando se exponen a ácido retinoico (RA), un promotor de diferenciación bien conocido, se vuelven evidentes los signos característicos de la diferenciación morfológica tras 72 h (figura 5e), incluyendo una tendencia disminuida a formar agregados, adherencia y reorganización aumentadas de la superficie celular con la aparición de una morfología diferenciada. Se observaron cambios similares en los cultivos expuestos a nevirapina (figura 5i). La reorganización morfológica estaba acompañada por una síntesis aumentada de la cadena (\alpha1) del colágeno tipo IV (figura 5k), un marcador de la diferenciación inducido en respuesta a RA (figura 5g), sintetizado en bajos niveles en los cultivos control (figura 5c). Los resultados de figuras 4 y 5 juntos indican que la nevirapina provoca o facilita el comienzo de la diferenciación en dos tipos celulares diferentes.

Ejemplo 5 El tratamiento con nevirapina induce la diferenciación de blastocitos de leucemia mieloide aguda (AML) humana

Se analizó el efecto de nevirapina en NB4 promielocítica aguda, que expresa la oncoproteína t(15;17) PML/RAR, responsable del bloqueo de la diferenciación presente en estos blastocitos, y las líneas celulares de leucemia mieloblástica aguda HL60, en comparación con su sensibilidad conocida a la diferenciación granulocítica inducida por RA. Tras cinco días de tratamiento con nevirapina, la aparición de células con una morfología similar a la mielomonocítica era evidente en ambas líneas celulares (figura 6), mientras que se indujeron células con morfología similar a la metamielocítica mediante RA 1 \muM, tal como se notifica (figura 6 y datos no mostrados). Entonces se analizó la expresión de los tres antígenos de superficie CD11b, CD14 y CD15, tras cuatro días de cultivo en presencia de RA o nevirapina (tabla 1). La inducción de CD11b está asociada con diferenciación granulocítica, se considera que CD14 es un antígeno específico monocítico y que CD15 es un antígeno mielomonocítico. La inducción simultánea de CD14 y CD11b está relacionada con la diferenciación monocítica. De manera concordante con la inducción de diferenciación granulocítica, el tratamiento con RA aumentó los niveles de CD11b y CD15, pero no de CD14, en ambas líneas celulares. En las células NB4 y HL60 tratadas con nevirapina, se detectó una fuerte inducción de la expresión de CD15, y, en un menor grado, de los marcadores CD11b y CD14. Por tanto, el tratamiento con nevirapina induce la expresión de marcadores de diferenciación mielomonocítica, lo que concuerda con los estudios morfológicos. El tratamiento con nevirapina también aumentó el número de células positivas en el ensayo de reducción con colorante NBT en aproximadamente 2,0-3,5 veces (tabla 2).

Además se analizó el efecto de nevirapina en la diferenciación en células de leucemia mieloide que son poco sensibles a la diferenciación granulocítica inducida por RA, tales como la línea celular Kasumi-1 que expresa el producto de translocación t(8;21) AML1/ETO, y en blastocitos primarios de dos pacientes con AML. El tratamiento con nevirapina, aunque realmente no detuvo la proliferación, indujo una acumulación modesta pero constante de células en la fase G1 del ciclo celular (datos no representados). Además, tanto las células Kasumi-1 como los blastocitos primarios de AML respondieron al tratamiento con nevirapina provocando diferenciación, tal como se reveló mediante la inducción de: (i) cambios morfológicos relacionados con la diferenciación mielomonocítica (figura 6), que consiste en condensación de cromatina con segmentación nuclear inicial, razón nuclear/citoplasmática disminuida, basofilia citosólica disminuida y aparición de región de Golgi paranuclear (resultan evidentes gránulos específicos en el caso de AML nº 1); (ii) cambios funcionales, indicados por la positividad para NBT aumentada (tabla 2); (iii) cambios en la expresión de los marcadores inmunofenotípicos mieloides CD11b, CD14 y CD15 (tabla 1 y datos no representados). El grado de inducción de las características de diferenciación mieloide en blastocitos primarios de AML fue comparable al detectado en las células NB4 y HL60.

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TABLA 1 Análisis citofluorimétrico de marcadores de la superficie celular en las líneas celulares NB4 y HL60 tras la exposición durante 4 días a RA (1 \muM) o NEV (450 \muM): intensidad de fluorescencia media (AU) de marcadores específicos

1

TABLA 2 Efecto de RA o Nev en el crecimiento y la diferenciación de las líneas celulares NB4, HL60, Kasumi-1 y blastocitos primarios de leucemia de dos pacientes con AML tras exposición durante 4 días

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Ejemplo 6 Expresión alterada de genes reguladores de ciclo celular en células F9 tratadas con nevirapina

Para evaluar si la capacidad de nevirapina de influir en el crecimiento y la diferenciación reflejó cambios en la expresión de genes específicos, se extrajo ARN de células F9 control, expuestas a nevirapina y a RA y se sometió a análisis de RT-PCR semicuantitativa. Se examinó un conjunto de genes que codifican para ciclinas de tipo D; inhibidores del crecimiento; moduladores de la apoptosis; y proteínas de mantenimiento. En la figura 7A se muestran paneles representativos y en la figura 7B se cuantifican los resultados. Se registraron las variaciones más significativas para el gen cyclin D1, que se reguló por disminución en 7 veces, mientras que p16^{INK4a}, que codifica para el principal antagonista de las ciclinas tipo D, se reguló por incremento en casi 8 veces, en los cultivos de F9 expuestos a nevirapina en comparación con los no expuestos. También se registró regulación por incremento para p27^{Kip1}, que fundamentalmente modula la proliferación en respuesta a la forma y la adhesión celulares; Rb-2/p130, que está asociado con la retirada del ciclo proliferativo; y Bcl-2, que puede facilitar la detención del crecimiento en algunos tipos celulares. La expresión de cyclin D3 se reguló por disminución en respuesta a nevirapina. Estos cambios son específicos porque no estaba afectada la expresión de los genes de mantenimiento (\beta-actina, GAPDH), ni la de p53.

Ejemplo 7 Incubación de cultivos celulares murinos con efavirenz: efecto de la dosis

Se cultivaron fibroblastos embrionarios NIH/3T3 y células de teratocarcinoma F9 en DMEM que contenía suero fetal al 10-20% y dos concentraciones de efavirenz, es decir 10 y 20 \muM, diluido a partir de una disolución madre (10 mM) en DMSO al 100%. Se sembraron en placa las células a una densidad de 2-5X10^{4} en placas de Petri de 35 mm y se expusieron a efavirenz 5-6 horas más tarde. Se retiraron las muestras en tiempos específicos y se contaron las células expuestas a efavirenz en comparación paralela con cultivos celulares no expuestos. Los resultados en la figura 8 muestran que la exposición a efavirenz (línea discontinua) disminuye la tasa de proliferación en ambas líneas celulares de una manera dependiente de la dosis cuando se compara con las células no expuestas (línea continua).

Ejemplo 8 Incubación de cultivos celulares humanos con efavirenz: dependencia del tiempo

Se sometió a prueba adicionalmente el efecto de efavirenz en células humanas de adenocarcinoma HeLa y de osteosarcoma Saos-2. Se cultivaron ambas líneas celulares en las condiciones descritas anteriormente (ejemplo 6). Para establecer si la exposición prolongada al fármaco mejoraba la eficacia de la inhibición del crecimiento, se expusieron ambas líneas celulares a efavirenz en dos ciclos posteriores: durante el 1^{er} ciclo se expusieron continuamente las células a efavirenz 20 \muM durante 5 días; entonces se diluyeron las células, se sembraron de nuevo y el 2º ciclo de exposición se inició al día siguiente con fármaco nuevos. Los resultados en la figura 9 muestran que ambas líneas celulares HeLa (paneles A) y Saos-2 (paneles B) eran sensibles a efavirenz y experimentaron una reducción significativa en la tasa de crecimiento celular. El efecto de inhibición fue dependiente del tiempo, puesto que tanto en el cultivo de HeLa como de Saos-2, el 1^{er} ciclo de exposición (5 días) produjo una reducción de 1,6 y 1,5 veces, respectivamente, mientras que se obtuvo una reducción de 5 y 4 veces en el 2º ciclo (llevado a cabo hasta el día 20 desde el comienzo de la exposición).

Ejemplo 9 Actividad antitumoral de nevirapina in vivo: tratamiento de hepatoma de Morris de rata 3924A a) Variedad de rata y características tumorales Variedad de rata: ACI/T endogámica (aproximadamente 180 g)

Tumor: El hepatoma de Morris 3924A es un tumor de crecimiento rápido de se desarrolla en animales endogámicos ACI/T. Tres semanas tras la inoculación el tamaño del tumor es de aproximadamente 10 cm^{3}. Preparación de las células tumorales: se preparan células tumorales de hepatoma del animal aproximadamente dos semanas tras la inoculación. Se extirpa quirúrgicamente el tumor del animal, se separa de los tejidos conjuntivo y necrótico y se desmenuza en trozos pequeños. Entonces se suspenden los fragmentos de tumor en disolución fisiológica estéril y se inocula en el sitio interno de un muslo utilizando una jeringuilla de 20 ml con un tamaño de aguja grande. Se inyectan rutinariamente 0,5 ml de suspensión celular. La tasa de éxito de la implantación del tumor es casi del 99%.

Procedimientos: Se trataron previamente 3 ratas con nevirapina inyectando diariamente 0,2 ml/rata de disolución de nevirapina (disolución madre = 180 mg/2 ml de DMSO) durante 11 días (18 mg/rata/día). En el día decimoprimero, se inocularon las células de hepatoma por vía subcutánea en las ratas tratadas previamente y en tres controles no tratados.

Resultados: Tras 17 días desde la inoculación, las ratas control muestran tumores típicos de 2-4 cm^{3} mientras que solamente uno de los animales tratados previamente con nevirapina muestra un pequeño nódulo de pocos milímetros en el sitio de la inyección. La curva de tiempo en la figura 10 muestra las tasas diferenciales de crecimiento de tumor en las ratas control (línea continua) y en las tratadas con nevirapina (línea discontinua). La curva de crecimiento de los controles representa el valor promedio de los tres animales, mientras que la curva de nevirapina se refiere a la tasa de crecimiento del animal individual, entre los que se trataron, que desarrolló un tumor de tamaño pequeño. Se extirparon quirúrgicamente los tejidos tumorales tanto de las ratas no tratadas como de las tratadas con nevirapina y se sometieron a análisis histológico. La figura 11 muestra que en la muestra de rata tratada con nevirapina (paneles NEV) las áreas transformadas están notablemente reducidas, y las células presentan características apoptóticas claras, en comparación con la muestra no tratada (paneles CTR).

En conclusión, el tratamiento previo con nevirapina antagoniza eficazmente el comienzo y el crecimiento de un hepatoma experimentalmente inducido en ratas (2/3) genéticamente predispuestas a desarrollar ese tumor específico. Dos ratas permanecieron sanas de modo permanente tras la inoculación del tumor, mientras que en la tercera se detecta un tumor de tamaño pequeño. En las mismas condiciones, las ratas no tratadas desarrollan este tumor de crecimiento rápido (3/3) y generalmente mueren en el plazo de 27 días.

Ejemplo 10 Actividad antitumoral de nevirapina in vivo: tratamiento de ratones BALB/C inoculados con tumor ascítico

Procedimiento: Se inocularon 10 ratones BALB/C por vía intraperitoneal (dos veces) con células tumorales ascíticas inyectando 0,2 ml de líquido de ascitis retirado de un animal inoculado 8 días antes. Se inició el tratamiento con nevirapina en el mismo día inyectando por vía intraperitoneal 1 mg/ratón/día (10 mg/ml de disolución madre en DMSO) en 5 de los 10 ratones inoculados con las células tumorales. Se trataron los ratones continuamente con nevirapina durante siete días.

Resultados: Tras 7 a 8 días, todos los animales control mostraron abdomen hinchado que contenía 5-7 ml de líquido de ascitis, tal como se determinó tras sacrificar los animales. En contraposición, tres de de los cinco (3/5) animales tratados con nevirapina permanecieron sanos sin evidencia de crecimiento tumoral; la ausencia de desarrollo de tumor se confirmó cuando se sacrificaron 2 de estos animales 15 días tras la inoculación del tumor y se analizaron los cuerpos. Los animales tratados supervivientes permanecieron sanos permanentemente. Vale la pena recordar que los ratones inoculados con tumor ascítico sobreviven solamente 12-14 días.

En conclusión, este experimento demuestra que la nevirapina, inyectada al mismo tiempo que la inoculación del tumor, bloquea de modo permanente el comienzo del tumor ascítico en tres de los cinco ratones. En las mismas condiciones, las ratas no tratadas desarrollaron el tumor (5/5), de las cuales todas murieron 12 a 14 días tras inoculación.

Ejemplo 11 Actividad antitumoral de efavirenz in vivo: tratamiento de hepatoma de Morris de rata 3924A

Procedimientos y resultados: Se inocularon células de hepatoma de Morris en 4 ratas (variedad 3924A). El mismo día, se inició el tratamiento con efavirenz en dos de ellas inyectando 1 mg/rata/día. La figura 12 representa la tasa de crecimiento de los tumores en los animales control (línea continua) y los tratados con efavirenz (línea discontinua). El tumor creció rápidamente en los animales control, muriendo ambos en el día 27º tras la inoculación; en contraposición solamente uno de los dos animales tratados desarrolló un tumor de tamaño notablemente menor, mientras que el otro permaneció totalmente sano.

En conclusión, este experimento demuestra que el tratamiento con efavirenz, que se inicia al mismo tiempo que la inoculación del tumor, antagoniza eficazmente el comienzo y el crecimiento del hepatoma de Morris. De las dos ratas tratadas, una permaneció sana varias semanas tras la inoculación del tumor, mientras que la segunda desarrolló un tumor notablemente menor. En las mismas condiciones, se desarrolló tumor en las ratas no tratadas (2/2) y murieron en el día 27º.

Claims (7)

1. Utilización de un compuesto seleccionado de entre el grupo constituido por la clase de compuestos de 5,11-dihidro-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepina, nevirapina, efavirenz, delavirdina, y sales correspondientes y/o derivados farmacéuticamente aceptables de nevirapina, efavirenz y delavirdina para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de patologías caracterizadas porque presentan pérdida de diferenciación celular y crecimiento celular incontrolado, en la que las patologías se seleccionan de entre el grupo constituido por leucemia, tumores epiteliales, tumores del sistema nervioso, teratocarcinomas, fibro y osteosarcomas, carcinoma de colon, carcinoma de mama, glioma y hepatoma.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho compuesto se selecciona de entre nevirapina, efavirenz, delavirdina, y las sales correspondientes y/o los derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos.

3. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que el compuesto promueve la diferenciación celular concomitante con la reducción de la proliferación celular.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composición farmacéutica comprende además vehículos y/o diluyentes y/o disolventes y/o excipientes para la preparación de composiciones para administración por vía oral, o administración por inyección intravenosa, intramuscular o hipodérmica.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composición farmacéutica está en forma de píldoras, suspensiones o disoluciones.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la preparación de composiciones farmacéuticas con actividad antiproliferativa.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la preparación de composiciones farmacéuticas con actividad de inducción para la diferenciación celular.