PL210327B1 - Sposób otrzymywania i hodowli macierzystych komórek mięśniowych - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania i hodowli macierzystych komórek mięśniowych.

Znany sposób hodowli macierzystych komórek mięśniowych polega na tym, że pacjentowi wycina się część mięśnia, na przykład z podudzia, który to wycinek zanurza się w jakimś roztworze, na przykład w płynie Hanksa korzystnie bez jonów wapnia i magnezu aby nie uczynnić naturalnych procesów enzymatycznych tkanki, które mogłyby w sposób nie kontrolowany naruszyć jej integralność i na płytce Petriego pozbawia się skalpelem tkanki łącznej i tłuszczowej. Następnie wycinek mięśnia roztrawia się przy pomocy proteolitycznych roztworów enzymatycznych rozszczepiających białka, jak trypsyny czy pronazy ewentualnie z dodatkiem kolagenozy w płynie Hanksa z jonami wapnia i magnezu w celu oddzielenia komórek mięśniowych. Tak oddzielone od siebie komórki mięśniowe wysiewa się na podłożu hodowlanym z żelatyny lub poli-L-Lizyny lub lamininy z udziałem takich czynników wzrostu jak płodowa surowica cielęca - znana w literaturze angielskojęzycznej jako FCS - i/lub zasadowy, fibroblastowy czynnik wzrostu FGF - znany w literaturze angielskojęzycznej jako fibroblast growth factor o stężeniu od 0,1 do 20 ng/ml i/lub EGF - znany w literaturze angielskojęzycznej jako epithelial growth factor - przy czym w celu ich maksymalnego namnożenia po każdym rozmnożeniu się komórek na kolejnym podłożu odtrawia się je roztworem trypsyny, zlewa się takim samym medium hodowlanym i ponownie wysiewa na takim samym podłożu. Ponieważ wycinek tkanki ma niewielką objętość badacze pragnęli pozyskać jak największą liczbę komórek, dlatego też do roztrawiania tkanki stosowali takie roztwory jak trypsyna czy pronaza o silnym działaniu „rozbijającym połączenia międzykomórkowe. Nie dostrzeżono, że przy silnym rozbijaniu tkanki oprócz komórek pożądanych tak zwanych mioblastów pozyskiwano także inne komórki zanieczyszczające później hodowlę prawdopodobnie fibroblasty, przez co całe następowe namnażanie było zaburzone i nie kontrolowane. Ponadto, silnie działające roztwory jak trypsyna i pronaza prawdopodobnie powodowały naruszenie punktów adhezji mioblastów, przez co i mioblasty słabiej się kolonizowały. Czystość populacji komórek macierzystych osiągana znanym sposobem wynosiła od 7 do 80%. Tak zanieczyszczone komórki mięśniowe przetaczane do mięśnia sercowego, w postaci nie homogennej, mogły powodować arytmię serca lub nawet zgon.

Celem wynalazku było znalezienie takiego sposobu otrzymywania i hodowli komórek mięśniowych, który miałby możliwie mały wpływ na destrukcję ich powierzchni oraz zapewniał uzyskanie ich możliwie dużej ilości w możliwie krótkim czasie i to o możliwie małym zróżnicowaniu ich charakterystyk nie odbiegających od charakterystyk macierzystych komórek mięśniowych.

Istota sposobu według wynalazku, polega na tym, że wycinek mięśnia roztrawia się wyłącznie w mieszaninie kolagenazy z pł ynem Hanksa z jonami wapnia i magnezu, uzyskane pojedyncze komórki zawiesza się w medium hodowlanym w postaci mieszaniny płodowej surowicy cielęcej FCS, z zasadowym, fibroblastowym czynnikiem wzrostu FGF o stężeniu od 20 do 100 ng/ml° oraz ekstraktu z zarodków kurczę cia a z namnoż onych komórek oddziela się mioblasty za pomocą powierzchniowych struktur NCAM, CD 56.

Dzięki jednoczesnemu zastosowaniu łagodnego, enzymatycznego trawienia wycinka mięśnia, bez udziału silnie działającej trypsyny czy pronazy, nie naruszającego struktury komórek a jedynie rozluźniającego połączenia łącznotkankowe, zastosowaniu czynników wzrostu o znacznie zwiększonej aktywności, umożliwiających dużo szybsze namnażanie komórek, bez zmiany ich wymaganej charakterystyki oraz selekcja mioblastów po hodowli, w oparciu o charakterystyczną dla mioblastów strukturę NCAM (CD 56) uzyskano prawie 100%-ą jednorodność uzyskiwanych komórek macierzystych, bardzo istotną przy aplikacjach tych komórek. Łagodne, enzymatyczne trawienie wycinka mięśnia uzyskano przez jego roztrawianie wyłącznie w mieszaninie kolagenazy z płynem Hanksa z jonami wapnia i magnezu a więc bez udziału silnie działającej trypsyny czy pronazy. Zwiększenie aktywności czynników wzrostu uzyskano przez dodanie do znanej płodowej surowicy cielęcej FCS, zasadowego, fibroblastowego czynnika wzrostu FGF o wielokrotnie większym stężeniu jak też dodaniu ekstraktu z zarodków kurczęcia. Równoczesne stosowanie tych dwóch czynników wzrostu a więc FGF o wielokrotnie większym stężeniu oraz ekstraktu z embrionów kurczęcia prawdopodobnie wywołało efekt synergistyczny powodujący nieproporcjonalnie duże zwiększenie aktywności czynników wzrostu, znacznie przyśpieszając namnażanie komórek, co w większości dalszych aplikacji komórek ma istotne znaczenie.

Przedmiot wynalazku przedstawiono w poniższym przykładzie wykonania.

PL 210 327 B1

Z czworogłowego mięśnia uda w warunkach aseptycznych wycięto skalpelem mięsień o objętości około 3 cm³, zanurzono w płynie Hanksa bez jonów wapnia i magnezu i pozbawiono go tkanki łącznej i tłuszczowej. Wszystkie poniższe procedury prowadzono w kabinie ze sterylnym, laminarnym przepływem powietrza. Wilgotny fragment tkankowy wyjęto z płynu Hanksa bez jonów wapnia i magnezu rozpreparowano i pocięto na fragmenty 1 mm³ na szalce Petriego. Następnie uzyskane fragmenty mięśnia o długości około 1 mm przenoszono odpłukując płynem Hanksa małymi objętościami z płytki Petriego do sterylnej probówki polipropylenowej z kolagenozą I rozpuszczoną w płynie Hanksa z jonami wapnia i magnezu. Następnie inkubowano fragmenty tkankowe przez 15 minut w 15°C z wytrząsaniem zawiesiny w łaźni wodnej. Następnie zawiesinę agregatów komórkowo-tkankowych przeciągano przez pipetę Pasteura i ponownie inkubowano przez 15 minut w tych samych warunkach.

Następnie ponownie przeciągano zawiesinę przez pipetę i filtrowano z użyciem siatki nylonowej o średnicy oczek 80 μm. Przefiltrowany supernatant wirowano w temperaturze pokojowej przy 1200 obr/min przez 10 minut, po czym supernatant dekantowano a komórki z osadu zawieszono w medium hodowlanym to jest w Dulbecco minimal essential medium z dodatkiem 20% płodowej surowicy cielęcej FCS, roztworu Glutamax (finalnie 2 mM Mm-glutaminy - InVitrogen) oraz roztworze Antibiotic/antimycotic solution (100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin sulphate, 50 g/ml gentamicin, 2,5 g/ml amphotericin). Dno flaszki hodowlanej o powierzchni 25 cm² pokryto uprzednio 0,1% roztworem żelatyny. Żelatynę przygotowano w wodzie destylowanej autoklawując przy 120°C przez 20 minut. Wystudzony roztwór żelatyny zalewano na flaszkę hodowlaną przez 1 godzinę w 37°C. Płyn dekantowano z flaszki. Następnie wprowadzono komórki w wyżej opisane medium hodowlane ale już z dodatkiem ekstraktu zarodków kurzych SLI, finalnie w 1%-wym roztworze, w którym rosły komórki w 1-szym pasażu (7-10 dni hodowli, w temperaturze 37°C i w atmosferze 5% CO2 i w inkubatorze. Komórki wysiano w stężeniu 10⁴ komórek na 1 cm² powierzchni flaszki. Po osiągnięciu konfluencji czyli po rozmnożeniu komórek na całej powierzchni flaszki w trakcie pierwszej inkubacji odtrawiono je roztworem trypsyny (wyjściowo jest to 2,5% trypsyna rozpuszczona w 0,9% roztworze soli fizjologicznej) z dodatkiem EDTA wg następującej procedury. Medium hodowlane zlano a powierzchnię flaszki płukano dwukrotnie płynem Hanksa bez jonów wapnia i magnezu. Następnie trypsynę EDTA 10-krotnie rozcieńczono płynem Hanksa bez jonów wapnia i magnezu (finalny pracujący roztwór trypsyny to 0,25%, dodatek EDTA przygotowanego w stężeniu 2 g/litr wody również rozcieńcza się 10-krotnie w płynie Hanksa) i dodano do flaszki (w 5 ml objętości/flaszkę) a flaszkę oklepuje się celem oddzielenia komórek od podłoża. Procedurę trypsynizacji powtarzano dwukrotnie. Roztwór trypsyny neutralizowano dodatkiem (w proporcji obj/obj 1:1) medium hodowlanego zawierającego płyn Hanksa z jonami wapnia i magnezu oraz dodatkiem 20% surowicy cielęcej FCS. Komórki wirowano w 50 ml probówce wirówkowej przy 1200 obr/min w temperaturze pokojowej przez 10 minut i wysiewano na dużą flaszkę hodowlaną o powierzchni 75 cm². Od drugiej inkubacji medium hodowlane zawiera wszystkie dodatki opisane w pierwszym zdaniu procedury, ekstrakt zarodków kurczęcia oraz dodatkowo zasadowy FGF o stężeniu 80 ng/ml medium hodowlanego. Po uzyskaniu stanu konfluencji, komórki trypsynizowano wg procedury opisanej powyżej i przeprowadzano dalsze ekspansje przy zastosowaniu trójpodziałowych flaszek hodowlanych o powierzchni 500 cm². Hodowlę prowadzono do 6 tygodni, po którym to okresie komórki odtrawiono i identyfikowano w odczynie immunohostochemicznym na tzw. barwienie desminą. Z wyhodowanych komórek wydzielono mioblasty a więc te komórki, które mają struktury charakterystyczne dla macierzystych komórek mięśniowych. Separację mioblastów przeprowadzono korzystając z wysoko specyficznego przeciwciała - najczęściej mysiego - reagującego ze strukturą NCAM. Na to przeciwciało reagowano drugim przeciwciałem sprzężonym z ziarenkami ferrytyny, na przykład króliczym lub anty-mysim sprzężonym z ferrytyną. Następnie tak wyznakowaną zawiesinę komórkową wprowadzono w pole magnetyczne. W polu magnetycznym pozostają tylko komórki wyznakowane, pozytywne na NCAM czyli mioblasty a inne wypływają swobodnie z pola magnetycznego. Następnie odcina się przeciwciało znakowane kuleczkami, tak aby uzyskane mioblasty nie były nośnikiem obcych substancji. Selekcję czystości populacji mioblastów, w oparciu o strukturę NCAM przeprowadza się pomiędzy 2 a 3 tygodniem hodowli lub po 2-3 pasażach komórkowych, ponieważ po tym czasie mioblasty zaczynają tracić strukturę NCAM w hodowli in vitro.

Claims (1)

1. Sposób otrzymywania i hodowli macierzystych komórek mięśniowych, znamienny tym, że wycinek mięśnia roztrawia się wyłącznie w mieszaninie kolagenazy z płynem Hanksa z jonami wapnia i magnezu, uzyskane pojedyncze komórki zawiesza się w medium hodowlanym w postaci mieszaniny płodowej surowicy cielęcej FCS, z zasadowym, fibroblastowym czynnikiem wzrostu FGF o stężeniu od 20 do 100 ng/ml oraz ekstraktu z zarodków kurczęcia a z namnożonych komórek oddziela się mioblasty za pomocą powierzchniowych struktur NCAM, CD 56.