PL207187B1

PL207187B1 - Pochodne 6-[2-(fosfonometoksy) alkoksy] pirymidyny, sposób ich wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna zawierająca te pochodne oraz ich zastosowanie

Info

Publication number: PL207187B1
Application number: PL366852A
Authority: PL
Inventors: Jan M.R. Balzarini; Clercq Erik Desire Alice De; Antonin Holy
Original assignee: Acad Of Science Czech Republic; Rega Stichting
Priority date: 2001-06-29
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2010-11-30
Also published as: BRPI0210746B8; NO20131091L; CA2452036A1; HUP0400345A2; HU230519B1; WO2003002580A1; JP4545434B2; AP2004002953A0; US20030109499A1; EA200400117A1; NO333788B1; HUP0400345A3; KR20040027521A; CZ2004142A3; EP1406911B1; NZ530685A; TR200302288T2; US6818633B2; PL366852A1; AU2002315625B2

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku i stan techniki

Wynalazek dotyczy pochodnych 6-[2-(fosfonometoksy)alkoksy]pirymidyny, sposobu ich wytwarzania, kompozycji farmaceutycznej zawierającej te pochodne oraz ich zastosowania.

Acykliczne analogi nukleotydów zawierających grupy fosfonowe są ujawnione na przykład w amerykańskich opisach patentowych nr nr 4 659 825, 4,808,716, 4,724,233 5 142 051, 5 302 585, 5 208 221, 5 352 786, 5 356 886, europejskich opisach patentowych nr nr 269 947, 481 214, 630 381, 369 409, 454 427, 468 119, 434 450, 618 214 i 398 231 oraz w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych nr WO 95/07920, WO 94/03467 i WO 96/33200. Wskazówki zawarte w tych dokumentach patentowych obejmują związki, w których grupa fosfonowa jest związana z określoną zasadą purynową lub pirymidynową, ogólnie w pozycji 1 lub 9 zasady purynowej lub pirymidynowej poprzez grupę 2-(metoksy)propylową, 2-(metoksy)etylową, 2-metoksy-3-hydroksypropylową lub 2-metoksy-3-fluoropropylową, odpowiednio znane jako związki PMP, PME, HPMP i FPMP purynowe lub pirymidynowe. Związki te wykazują działanie antywirusowe i cytostatyczne.

Daluge i inni (34^th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Oct. 4-7, 1994) ujawnia pochodne carboviru, w których puryna jest podstawiona w pozycji 6 przez grupę cyklopropyloaminową, N-cyklopropylo-N-metyloaminową lub N-aziridynylową.

Cihlar i inni., ujawnia w „Antimicrobial Agents and Chemotherapy” 39 (1): 117-124 (1995) N⁶-aminoheksylo-PMEDAP.

Holy i in., „ACS Symp. Ser.” 401: 57-71 (1989) oraz Holy, „Kem. Ind.” 38 (10): 457-462 (1989) opisują działanie antywirusowe pewnych N⁶-podstawionych analogów nukleotydów.

Inne analogi pirymidyny podstawione grupami fosfonowymi są ujawnia Holy i in., „Collect. Czech Chem. Commun.” 64: 242-256 (1999), Eter i in., „J. Med. Chem.” 37: 3057-3061 (1994), Wormstadt i in., „J. Heterocyclic Chem.” 37: 1187-1191 (2000) oraz Franchetti i in. „Nucleosides & Nucleotides” 14 (3-5): 607-610 (1995). Ostatnie trzy publikacje dotyczą łańcuchów bocznych zawierających grupy fosfonowe połączone z 2-4podstawioną pirymidyną przez podstawnik 6-N.

Przedmiot wynalazku

Przedmiotem wynalazku są pochodne 6-[2-(fosfonometoksy)alkoksy]pirymidyny o działaniu antywirusowym, szczególnie przeciwko wirusom RNA i DNA, takim jak HIV, HBV i HSV. Przedmiotem wynalazku są również pochodne przydatne do wytwarzania żywic jonowymiennych lub mediów chiralnych. Kolejnym przedmiotem wynalazku są produkty pośrednie i sposoby wytwarzania takich związków.

Przedmiot wynalazku został przedstawiony poniżej.

Przedmiotem wynalazku jest pochodna 6-[2-(fosfonometoksy)alkoksy]pirymidyny o wzorze (I)

w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową;

R2 oznacza atom wodoru, grupę metylową, fluorowiec, -N(R5)2, grupę hydroksylową, zabezpieczoną grupę hydroksylową lub grupę o wzorze (la)

X * ^-φο'^'Ρίοχζ^ (la)

PL 207 187 B1

R3 oznacza niezależnie atom wodoru, grupę metylową, hydroksymetylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową;

R4 oznacza atom wodoru lub fluorowiec;

X niezależ nie oznacza atom tlenu, siarki lub wią zanie;

Z niezależnie oznacza grupę hydroksylową, grupę estrową lub grupę amidową;

R5 oznacza niezależnie atom wodom, grupę C1-C8 alkilową lub grupę zabezpieczającą; oraz * oznacza chiralny atom wę gla; oraz jego sole i solwaty.

Korzystnie, R1 i R2 oznaczają grupy aminowe, R3 oznacza atom wodoru, a X oznacza atom tlenu. Korzystnie, R1 i R2 oznaczają równocześnie grupy aminowe, R3 oznacza grupę metylową,

X oznacza atom tlenu, przy czym R3 ma konfigurację (R).

Korzystnie, R1 i R2 oznaczają równocześnie grupy aminowe, R3 oznacza grupę hydroksymetylową, X oznacza atom tlenu, przy czym R3 ma konfigurację (R).

Korzystnie, R1 i R2 oznaczają równocześnie grupy aminowe, R3 oznacza atom wodoru, X oznacza atom siarki.

Korzystnie, R1 oznacza grupę aminową, R2 oznacza grupę hydroksylową, R3 oznacza atom wodoru, a X oznacza atom tlenu.

Korzystnie, pochodna jest krystaliczna.

Korzystnie, pochodna w znaczącym stopniu jest czystym enencjomerem w odniesieniu do chiralnego atomu węgla.

Korzystnie, pochodna, będąca czystym enancjomerem, ma konfigurację (R).

Również korzystnie, pochodna, będąca czystym enancjomerem, ma konfigurację (S). Korzystnie, pochodną stanowi 2,4-diamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna.

Korzystnie, pochodną stanowi 2,4-diamino-6-(R)-[2-(fosfonometoksy) propoksy]pirymidyna. Korzystnie, pochodną stanowi 2-amino-4-hydroksy-6-[2-(fosfonometoksy) etoksy]pirymidyna. Korzystnie, pochodną stanowi 2,4-diamino-6-[(S)-3-hydroksy-2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyna.

Korzystnie, pochodną stanowi 2,4-diamino-6-[(RS)-3-hydroksy-2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyna.

Korzystnie, pochodną stanowi 2-amino-4-hydroksy-6-[(R)-2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyna.

Korzystnie, pochodną stanowi 2-amino-4-hydroksy-6-[(RS)-3-hydroksy-2-(fosfonometoksy)propoksy] pirymidyna.

Korzystnie, pochodną stanowi 2-amino-4-hydroksy-6-[(S)-3-hydroksy-2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyna.

Korzystnie, pochodną stanowi 2,4-diamino-5-bromo-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna. Korzystnie, pochodną stanowi 2-amino-5-bromo-4-hydroksy-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania pochodnej o wzorze (I)

w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową;

R2 oznacza atom wodom, grupę metylową, fluorowiec, -N(R5)2, grupę hydroksylową, zabezpieczoną grupę hydroksylową lub grupę o wzorze (la)

PL 207 187 B1

R1 oznacza niezależnie atom wodoru, grupę metylową, hydroksymetylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową;

R4 oznacza atom wodoru lub fluorowiec;

X niezależnie oznacza atom tlenu, siarki lub wiązanie;

R5 oznacza niezależnie atom wodoru, grupę C1-C8 alkilową lub grupę zabezpieczającą; oraz * oznacza chiralny atom węgla, znamienny tym, że przeprowadza się reakcję związku o wzorze (II)

w którym

R2 oznacza atom wodoru, grupę metylową, fluorowiec, -N(R5)2, grupę hydroksylową lub zabezpieczoną grupę hydroksylową; oraz

X oznacza O lub S; ze związkiem o wzorze (III) *

Y-CH₂CH(R₃)-O-CH₂P(O)(Z)₂ (III) w którym

Z oznacza grupę estrową alb grupę amidową;

* oznacza chiralny atom wę gla;

R3 oznacza H, grupę metylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową; oraz

Y oznacza grupę opuszczając ą , w dwupolamym rozpuszczalniku aprotycznym w obecnoś ci zasady.

Korzystnie, sposób obejmuje dodatkowo wyizolowanie uzyskanej pochodnej o wzorze (I). Korzystnie, w przedmiotowym sposobie, Z oznacza grupę estrową lub amidową oraz dodatkowo przeprowadza się reakcję hydrolizy jednej lub obu grup Z wytwarzając pochodną o wzorze (I), w którym co najmniej jedna z grup Z jest grupą hydroksylową.

Korzystnie, w przedmiotowym sposobie Z oznacza (OR4)2, a R4 oznacza grupę izopropylową. Korzystnie, w przedmiotowym sposobie R3 oznacza grupę metylową, a Y oznacza grupę p-toluenosulonyloksylową.

Przedmiotem wynalazku jest także inny sposób wytwarzania pochodnej o wzorze (I)

PL 207 187 B1 w którym

R1 oznacza H, grupę aminową lub metylosulfanylową;

R2 oznacza -N(R5)2,

R3 oznacza niezależnie H, grupę metylową, hydroksymetylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową;

R4 oznacza H lub fluorowiec;

X niezależ nie oznacza tlen lub siarkę;

R5 oznacza niezależnie H, grupę C1-C8 alkilową lub grupę zabezpieczającą; oraz * oznacza chiralny atom węgla; znamienny tym, że obejmuje przeprowadzenie reakcji pochodnej o wzorze (IV)

w którym

R3 oznacza H, grupę metylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową; X niezależ nie oznacza O lub S; oraz;

Z oznacza grupę estrową lub grupę amidową; z N(R5)2.

Korzystnie, w tym innym sposobie dodatkowo przeprowadza się reakcję hydrolizy jednej lub obu grup Z uzyskując pochodną o wzorze (I), w którym co najmniej jedna grupa Z jest grupą hydroksylową. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania pochodnej o wzorze (V)

w którym

R1 oznacza atom wodom, grupę metylową, hydroksymetylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową;

R5 oznacza niezależnie atom wodoru, grupę C1-C8 alkilową lub grupę zabezpieczającą;

X oznacza tlen lub siarkę ;

* oznacza chiralny atom węgla; znamienny tym, że obejmuje przeprowadzenie reakcji pochodnej o wzorze (IVa)

z N(R5)2 w rozpuszczalniku niewodnym, wodorotlenkiem alkalicznym lub wę glanem alkalicznym w roztworze wodnym.

PL 207 187 B1

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania pochodnej o wzorze (VI)

w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową;

R3 oznacza atom wodom, grupę metylową, hydroksymetylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową;

Z oznacza niezależ nie grupę hydroksylową , grupę estrową lub grupę amidową; oraz * oznacza chiralny atom wę gla; znamienny tym, obejmuje przeprowadzenie reakcji zwią zku o wzorze (VII)

w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową ze związkiem o wzorze (VIII)

HOCH₂CH(R₃)OCH₂P(O)(Z)₂ (VIII) w którym Z oznacza grupę amidową lub grupę estrową w obecności zasady.

Korzystnie, w sposobie wytwarzania związku o wzorze VI dodatkowo przeprowadza się reakcję hydrolizy jednej lub obu grup Z wytwarzając pochodną o wzorze (VI), w którym 1 lub 2 grupy Z są grupami hydroksylowymi.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania pochodnej o wzorze (XIII)

w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulafanylową; * oznacza chiralny atom wę gla;

R2 oznacza atom wodoru, chlor, grupę hydroksylową lub aminową;

PL 207 187 B1

R3 oznacza atom wodoru, grupę metylową, fluorowcometylową lub hydroksymetylową; oraz Z oznacza grupę amidową lub grupę estrową ; znamienny tym, ż e obejmuje (a) przeprowadzenie reakcji związku o wzorze (IX)

w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową;

R2 oznacza atom wodom, chlor lub grupę aminową; ze związkiem o wzorze (X)

w którym

* oznacza chiralny atom wę gla;

R6 oznacza grupę hydroksylową lub zabezpieczoną grupę hydroksylową; lub

R3 i R6 są połączone zabezpieczającą cykliczną grupę acetalową lub ketalową; w obecności zasady bez rozpuszczalnika lub w obecności rozpuszczalnika aprotycznego uzyskując pochodną o wzorze (XI)

w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową;

* oznacza chiralny atom wę gla;

R2 oznacza atom wodoru, chlor lub grupę aminową;

R3 oznacza atom wodoru, grupę metylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową; oraz (b) przeprowadzenie reakcji pochodnej (XI) ze związkiem o wzorze (XII)

Y-CH2-P(O)(OZ)2 (XII) w którym

Y oznacza grup ę opuszczają cą ;

Z oznacza grupę amidową lub grupę estrową, w obecności zasady w dimetyloformamidzie lub tetrahydrofuranie uzyskując pochodną o wzorze (XIII).

Korzystnie w powyższym sposobie przeprowadza się dodatkowo reakcję hydrolizy grupy Z wytwarzając pochodną o wzorze (XIII), w którym 1 lub 2 grupy Z są grupami hydroksylowymi.

PL 207 187 B1

Przedmiotem wynalazku jest jeszcze inny sposób wytwarzania pochodnej o wzorze (I)

w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową;

R3 oznacza atom wodoru, grupę metylową, hydroksymetylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową;

R4 oznacza fluorowiec;

X oznacza atom tlenu;

Z niezależnie oznacza grupę hydroksylową, grupę estrową lub grupę amidową; oraz * oznacza chiralny atom wę gla; znamienny tym, ż e obejmuje (a) przeprowadzenie reakcji pochodnej o wzorze (VI)

w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową;

Z niezależ nie oznacza grupę estrową ;

* oznacza chiralny atom wę gla; z fluorowcem w postaci pierwiastkowej w oboję tnym rozpuszczalniku uzyskując pochodną o wzorze (I).

Korzystnie, w tym innym sposobie przeprowadza się dodatkowo reakcję hydrolizy grupy Z wytwarzając pochodną o wzorze (I), w którym 1 lub 2 grupy Z są grupami hydroksylowymi.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja zawierająca farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę i pochodną o wzorze I.

Przedmiot wynalazku obejmuje także pochodną o wzorze I do zastosowania jako lek.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie pochodnej o wzorze I do wytwarzania leku do leczenia infekcji wirusowej.

Korzystnie wirus jest wirusem DNA.

Korzystnie wirus jest retrowirusem lub wirusem z rodziny Hepadna.

Szczegółowe omówienie przedmiotu wynalazku

Stosowany w niniejszym dokumencie termin „grupa alkilowa”, o ile nie zostanie określone inaczej, oznacza rozgałęzione, normalne lub cykliczne węglowodory i obejmuje grupy metylową, etylową, propylową, cyklopropylową, cyklobutylową, izopropylową, n-, sec-, iso- i tert-butylową, pentylową, izopentylową, 1-metylobutyłową, 1-etylopropylową, neopentylową i t-pentylową.

PL 207 187 B1

Fluorowiec oznacza zwykle chlor, lecz obejmuje również brom, fluor oraz jod.

R1 oznacza zwykle H, grupę aminową, lecz może być również grupą metylosulfanylową (tj. metylotiolową).

R2 oznacza zwykle grupę hydroksylową lub -N(R5)2 gdzie R5 oznacza niezależnie H lub grupę C1-C8 alkilową.

R3 oznacza zwykle H lub grupę metylową, lecz może być także grupą hydroksymetylową (zwykle w konfiguracji (S) wolnej w znaczący sposób od enancjomeru (R)) lub fluorowcometylową i, jeśli jest grupą metylową lub fluorowcometylową, jest korzystnie w konfiguracji (2R) w znaczący sposób wolnej od konfiguracji (2S). Grupa fluorowcometylową oznacza zwykle fluorometylową.

R5 oznacza zwykle H, lecz może być także niższą (C1-C3) grupą alkilową (w jednym lub obu przypadkach).

Jak jest to opisane dalej w niniejszym dokumencie, Z jest korzystnie grupą estrową lub grupą amidową stosowaną w przypadku fosfonianów nukleotydowych. Gdy Z jest grupą estrową, ma strukturę OR7. R7 oznacza zwykle H (tj. Z jest grupą hydroksylową) w związkach o działaniu antywirusowym per se, choć inne grupy estrowe R7 opisane poniżej są odpowiednie jako grupy zabezpieczające lub jako grupy profunkcyjne w prolekach.

X oznacza korzystnie O.

Z jest grupą estrową lub grupą amidową, gdy jest pożądana ochrona związków według wynalazku przed niepożądanymi reakcjami lub gdy celem wynalazku jest prolek in vivo tego związku. W innym przypadku, Z oznacza OH.

Estry lub amidy są użyteczne jako zabezpieczone związki pośrednie w syntezie związków według wynalazku w których Z = OH. W tym wariancie wynalazku, wybór estru lub amidu nie jest istotny i zależ y od istoty wykorzystanej reakcji chemicznej. Wszystko to jest potrzebne, aby podstawnik Z nie został usunięty aż do etapu reakcji, w którym jest to pożądane i jeśli nie jest to dostrzegalne na gruncie rozważań teoretycznych, może być to określone w trakcie podstawowych eksperymentów. Dla przykładu, estry są w szczególności stosowane do ochrony grup hydroksylowych fosfonianu przed alkilowaniem.

W przypadku, gdy Z sł u ż y jako grupa funkcyjna proleku, grupa estrowa lub amidowa jest usuwana z fosfonianu in vivo. Dogodnymi estrami lub amidami proleków są ewentualnie wybrane w oparciu o specyficzność substratowa estereaz oraz/lub karboksypeptydaz, które mogą się znajdować w komórkach w sytuacji, gdy wymagany jest prekursor hydrolizy. Gdy specyficzność tych związków nie jest znana, potrzebne jest zbadanie wielu analogów nukleotydów według wynalazku, aż znajdzie się pożądaną specyficzność substratowa. Wskazywać będzie na to pojawienie się wolnych fosfonianów lub aktywności antywirusowej. Wybierane są związki, które (i) nie hydrolizują lub hydrolizują stosunkowo powoli w górnej części jelita, (ii) są zdolne przenikać do jelita i komórek oraz (iii) hydrolizują w cytoplazmie komórkowej oraz/lub ogólnoustrojowym układzie krążenia. W celu identyfikacji prekursorów uwalnianych w organach podatnych na określoną infekcję wirusową lub drobnoustrojową, np. w przypadku wątroby, leki prekursorowe zdolne do hydrolizy w wątrobie, stosuje się skriningowanie komórek z określonych tkanek. Inne infekcje, np. CMV czy HIV, są ewentualnie leczone przy pomocy prekursorów hydrolizujących w zbliżonym tempie i zbliżonym stopniu we wszystkich tkankach. Do tych celów odpowiednie są próby znane w stanie techniki, w tym analizy stabilności światła jelita, przenikalności komórkowej, stabilności homogenatu wątroby oraz stabilności plazmy. Analizy te są stosowane do określania charakterystyki biodostępności prekursorów.

Typowe przykłady grup estrowych lub amidowych Z znajdują się w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych WO95/07920, WO98/04569 oraz w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 481214 A1. Jakikolwiek rodzaj estru czy amidu opisany w tych publikacjach (oraz w korzystnym porządku określonym w tych publikacjach) może być zastosowany jako grupa Z.

Zwykle, obie grupy Z są grupami hydroksylowymi lub obie są grupami estrowymi oraz/lub amidowymi, tj. zwykle albo obie albo żadna z grup Z nie jest grupą hydroksylową. Ogólnie, gdy żadna z grup Z nie jest grupą OH, jedna z grup Z jest grupą amidową, a druga estrową. Korzystne są amidy występujące wraz z naturalnymi aminokwasami oraz estry z grupami fenolowymi. Wolne grupy karboksylowe aminokwasów grup Z są zwykle estryfikowane przez grupy C1-C8 alkilowe.

Zwykle, Z jest grupą hydroksylową w związkach przeznaczonych do bezpośredniego stosowania antywirusowego, tj. związki takie są stosowane, gdy nie jest wymagana hydroliza in vivo estrów, czy amidów.

PL 207 187 B1

Grupy zabezpieczające grupy hydroksylowe obejmują acetale, ketale lub grupy C1-C8 alkilowe. Typową grupą zabezpieczającą dla grup aminowych jest grupa tritylowa. Znane są również inne konwencjonalne grupy zabezpieczające (Greene i in., „Protecting Groups in Organic Synthesis, wyd. II, 1991, str. 10-142 oraz 309-405),

Zastosowanie pochodnych według wynalazku

Pochodne według wynalazku są użyteczne w leczeniu chorób wirusowych, lub jako związki pośrednie w procesie wytwarzania takich związków. Przykładowe infekcje wirusowe, które mogą być leczone lub badane w celu określenia podatności na działanie związków według wynalazku obejmują infekcje powodowane przez wirusy DNA lub RNA, takie jak wirusy herpes (CMV, HSV 1, HSV 2, EBV, wirus ospy wietrznej i półpaśca (VZV), herpeswirus bydła typ 1, herpeswirus koni typ 1, HHV-6, papillomawirusy (wirusy brodawczaków) (HPV typy 1-55, w tym rakotwórcze HPV), flaviwirusy (w tym wirusy żółtej febry, wirusy afrykańskiego pomoru świń oraz wirus japońskiego zapalenia mózgu), togawirusy (w tym wenezuelskiego końskiego zapalenia mózgu i rdzenia), wirusy grypy (typy A-C), retrowirusy (HIV-1, HIV-2, HTLV-1, HTLV-II, SIV, FeLV, FIV, MoMSV), adenowirusy (typy 1-8), wirus ospy krowiej (wirus yaccinia), enterowirusy (wirus polio typy 1-3, wirus Coxackie, wirus zapalenia wątroby A oraz wirus ECHO), wirusy żolądkowo-jelitowe (wirusy Norwalk, rotawirusy), hantawirusy (wirus Hantaan), wirus Polyoma, wirusy Papowa, rhinowirusy, wirusy paragrypy typ 1-4, wirus wścieklizny, syncytialny wirus oddechowy (RSV), wirusy zapalenia wątroby A, B, C i E oraz podobne.

Korzystnie, pochodne według wynalazku przeznaczone do leczenia infekcji powodowanych przez herpeswirusy, wirus z rodziny Hepadna oraz HIV to pochodne, w których R1 = NH2, R2 = NH2 lub OH, X = O oraz R3 = H lub grupa metylowa. Inne działanie antywirusowe pochodnych według wynalazku są określane w rutynowych analizach aktywności antywirusowej przy wykorzystaniu analiz inhibitowania enzymów, analiz hodowli tkanek, analiz modeli zwierzęcych i podobnych, znanych osobom biegłym w stanie techniki.

Nowe pochodne według wynalazku są także użyteczne per se jako związki pośrednie, stosowane do wytwarzania polimerów o szerokich i różnorodnych zastosowaniach diagnostycznych, leczniczych i przemysłowych.

Pochodne według wynalazku są odpowiednie jako związki pośrednie do wytwarzania mediów do absorpcji powinowactwa zawierających podstawniki o właściwościach użytecznych do absorbowania związków z zanieczyszczonych mieszanin. Są one wytwarzane i stosowane w ten sam sposób jak inne media jonowymienne zawierające te same podstawniki, np. grupy fosfonowe lub aminowe. Dla przykładu, grupy fosfonianowe związków według wynalazku są kowalencyjnie związane z nierozpuszczalną matrycą, a wolne podstawniki aminowe R1 przy zasadach heterocyklicznych pełnią rolę centrów wymiany jonowej. Alternatywnie, aminowe grupy zasad heterocyklicznych są związane z matrycą, a wolne grupy fosfonianowe są użyteczne w chromatograficznej absorpcji cząsteczek naładowanych dodatnio. Inne unieruchomione pochodne według wynalazku są użyteczne do oczyszczania białek, np. enzymów, z którymi pochodne według wynalazku mogą się związać, p. białka transportujące (patrz Cihlar, powyżej).

Odpowiednie metody wbudowywania pochodnych według wynalazku w nierozpuszczalne matryce, takie jak żywice polimerowe, są znane osobom biegłym w dziedzinie. Pochodne według wynalazku mogą być unieruchamiane przez sieciowanie kowalencyjne grup aminowych lub hydroksylowych pirymidyny w nierozpuszczalnej matrycy. Podobnie, pochodne według wynalazku są wbudowywane w nierozpuszczalne matryce poprzez wią zanie grup hydroksylowych grupy fosfonianowej lub grupy hydroksymetylowej R3 z matrycą lub żywicą poprzez znane środki łączące kowalencyjnie. Odpowiednie sposoby łączenia są opisane przez Cihlar'a (supra).

Pochodne według wynalazku są również użyteczne jako związki sieciujące lub dystansujące do wytwarzania matryc do absorpcji powinowactwa (w przeciwieństwie do funkcjonowania jako cząsteczki wiążące per se, jak to opisano w poprzednich akapitach). Pochodne według wynalazku obejmują wiele grup funkcyjnych, które są użyteczne jako miejsca do sieciowania pożądanych substancji. Powszechnie łączy się reagenty wiążące takie jak hormony, peptydy, przeciwciała, enzymy leki i podobne nierozpuszczalne substraty. Te nierozpuszczalne reagenty stosowane są zgodnie ze znanymi sposobami w celu absorpcji substancji z wytworzonych kompozycji, próbek diagnostycznych i innych zanieczyszczonych mieszanin. Podobnie, unieruchomione enzymy są stosowane to przeprowadzania przemian katalitycznych z ułatwionym oddzielaniem enzymu od produktu.

W pewnych wariantach wynalazku, nie jest konieczne, by pochodne wedł ug wynalazku był y usieciowane w materiale nierozpuszczalnym. Dla przykładu, mogą być zastosowane to łączenia subPL 207 187 B1 stancji analizowanych z grupami wykrywalnymi podczas wytwarzania rozpuszczalnych reagentów diagnostycznych.

Sposoby sieciowania wykorzystujące podstawniki znajdujące się w związkach według wynalazku są dobrze znane w stanie techniki. Dla przykładu, kwas fosfoniowy jest stosowany do tworzenia estrów z alkoholami lub amidów z aminami. Podobnie, grupy aminowe, fluorowce, grupy hydroksylowe i inne reaktywne centra znajdują ce się przy pirymidynie są odpowiednie. Oczywiś cie, gdzie to jest potrzebne, stosuje się ochronę grup reaktywnych w trakcie tworzenia reagenta usieciowanego. Ogólnie, zastosowanie pochodnych według wynalazku polega na łączeniu ich poprzez kwas fosfoniowy do grup hydroksylowych lub aminowych związku łącznikowego oraz wiązanie kowalencyjne z innym związkiem-partnerem poprzez inny podstawnik. Przykładowo, pierwszy wiążący związek-partner, taki jak hormon sterydowy, jest estryfikowany przez kwas fosfoniowy według wynalazku, a następnie ten sprzężony związek jest sieciowany poprzez grupy hydroksymetylowe R3 do aktywowanego bromocyjanem żelu Sepharose tak, że uzyskuje się unieruchomiony steryd. Znane są również inne procesy chemiczne odpowiednie do uzyskania takich sprzężeń, przykładowo w Maggio „Enzyme-Immunoassay” (CRC, 1988, str. 71-135) i cytowanych tam odnośnikach.

Kompozycje farmaceutyczne

Pochodne według wynalazku i ich fizjologicznie dopuszczalne sole i solwaty (odnośnie których stosowana będzie nazwa składniki aktywne) są przygotowywane w celu podawania w dowolny sposób, dostosowany do stanu leczonego pacjenta. Korzystnie, pochodne i kompozycje są sterylne.

Składniki aktywne są umieszczane w kompozycjach farmaceutycznych. Kompozycje zarówno do stosowania weterynaryjnego, jak i dla ludzi, zawierają co najmniej jeden składnik aktywny, określony powyżej, wraz z jednym lub więcej dopuszczalnych nośników oraz ewentualnie inne składniki lecznicze. Nośniki muszą być „dopuszczalne” w sensie zgodności z innymi składnikami kompozycji i nie mogą być szkodliwe dla leczonego.

Kompozycje korzystnie mają postać jednostkowych form dawkowania i mogą być przygotowane jakimkolwiek sposobem znanym w farmacji. Ogólnie, kompozycje są wytwarzane poprzez jednorodne i dokładne wią zanie skł adników aktywnych z noś nikami ciek ł ymi lub dokł adnie rozdrobnionymi no ś nikami stałymi lub z obydwoma rodzajami nośników jednocześnie, a następnie, o ile jest to konieczne, formowany jest produkt.

Kompozycje według wynalazku odpowiednie do podawania doustnego mogą mieć jednostkową postać dawkowania, taką jak kapsułki, kapsułki a opłatka, czy tabletki, przy czym każda z postaci dawkowania zawiera wstępnie określoną ilość składnika aktywnego, w formie proszku lub granulek, roztworu lub zawiesiny w środowisku wodnym lub niewodnym, lub w formie emulsji olej w wodzie, lub woda w oleju. Składnik aktywny może mieć również postać dużej dawki (bolus), powidełka lub pasty.

W przypadku infekcji zewnętrznych oka czy innych tkanek zewnę trznych, np. ust i skóry, kompozycja jest korzystnie stosowana w formie maści lub kremu do stosowania miejscowego, zawierającego składnik/składniki aktywne w ilości, przykładowo od 0,075 do 20% wag. (zawierające składnik aktywny w ilości z zakresu od 0,1 do 20%, o przyrostach wynoszących 0,1% wag., na przykład 0,6% wag., 0,7% wag. itd.), korzystniej od 0,2 do 15% wag. i najkorzystniej od 0,5 do 10% wag. W przypadku, gdy kompozycja ma postać maści, składniki aktywne mogą być stosowane albo w zaróbce parafinowej, albo w zaróbce rozpuszczalnej w wodzie.

Jeśli jest to pożądane, wodna faza kremu może obejmować, przykładowo, co najmniej 30% wag. alkoholu polihydroksylowego, tj. alkoholu posiadającego dwie lub więcej grup hydroksylowych, takiego jak np. glikol propylenowy, butano-1,3-diol, mannitol, sorbitol, glicerol i glikol polietylenowy (w tym PEG 400) lub ich mieszaniny. Kompozycje do stosowania miejscowego mogą zawierać dodatkowo związki poprawiające absorpcję lub wnikanie składników aktywnych przez skórę lub inne dotknięte chorobą obszary. Przykładem związku poprawiającego wnikanie skórne jest między innymi sulfotlenek dimetylu i analogi.

Faza oleista emulsji według wynalazku może składać się ze składników znanych ze stanu techniki. Faza ta może zawierać tylko emulgator lub mieszaninę co najmniej jednego emulgatora z tłuszczem lub olejem, lub zarówno z tłuszczem, jak i olejem. Korzystnie, emulgator hydrofilowy jest stosowany wraz z emulgatorem lipofilowym, działającym jako stabilizator. Również korzystnie stosuje się razem olej i tłuszcz. Stabilizatory emulsji, odpowiednie do stosowania w kompozycjach według wynalazku obejmują Tween^® 60, Span^® 80, alkohol cetostearylowy, alkohol benzylowy, alkohol mirystylowy, jednostearynian glicerydu oraz laurylowy siarczan sodowy. Odpowiednie oleje i tłuszcze obejmują proste i rozgałęzione jedno- i dwuzasadowe estry alkilowe takie jak diizoadypinian, stearynian izocety12

PL 207 187 B1 lu, diester glikolu propylenowego i kokosowych kwasów tłuszczowych, mirystynian izopropylu, oleinian decylu, palmitynian izopropylu, stearynian butylu lub palmitynian 2-etyloheksylu. Wymienione związki mogą być użyte pojedynczo lub w kombinacji, w zależności od wymaganych właściwości. Alternatywnie, mogą być stosowane lipidy o wysokiej temperaturze topnienia, takie jak biała parafina oraz/lub ciekła parafina lub inne oleje mineralne.

Kompozycje według wynalazku przeznaczone do stosowania miejscowego do oczu mogą mieć postać kropli do oczu, w których składnik aktywny jest rozpuszczony lub zawieszony w odpowiednim nośniku, zwłaszcza w rozpuszczalniku wodnym. Składnik aktywny jest zwykle obecny w takich kompozycjach w stężeniu od 0,01 do 20% wag.

Kompozycje przeznaczone do podawania donosowego, w których zastosowany jest stały nośnik mogą mieć postać gruboziarnistego proszku o rozmiarze cząstek od 20 do 500 μm (mikronów) (zawierającego cząstki o rozmiarach od 20 do 500 μm, o przyrostach wynoszących 5 μ^ι, na przykład 30 μm, 35 μm, itd.), który jest podawany na drodze szybkiej inhalacji przez kanał nosowy ze zbiornika proszku. Odpowiednie kompozycje, w których zastosowany jest ciekły nośnik, są przeznaczone do podawania jako spray lub krople do nosa, zawierają wodne lub oleiste roztwory składnika aktywnego. Kompozycje przeznaczone do podawania aerozolowego mogą być przygotowane standardowymi sposobami i mogą być podawane wraz z innymi czynnikami leczniczymi, jak np. pentamidyna do leczenia zapalenia płuc wywołanego przez Pneumocystis carinii.

Kompozycje przeznaczone do podawania dopochwowego mogą mieć postać pesarium, tamponów, kremów, żeli, past, pianek lub sprayów zawierających oprócz składnika aktywnego odpowiednie, znane ze stanu techniki nośniki.

Kompozycje przeznaczone do podawania pozajelitowego mogą mieć postać wodnych lub niewodnych roztworów do wstrzykiwania, które mogą zawierać antyutleniacze, roztwory buforowe, bakteriostatyczne oraz rozpuszczone substancje, powodujące, że kompozycja jest izotoniczna z krwią pacjenta; oraz wodnych i niewodnych sterylnych zawiesin, które mogą zawierać środki zawieszające i zagęszczające. Kompozycje mogą być obecne w pojemnikach o jednostkowych dawkach lub do wielokrotnego dawkowania, na przykład zamkniętych ampułkach i fiolkach, mogą być przechowywane w postaci liofilizowanej wymagającej jedynie dodatku sterylnego ciekłego nośnika, na przykład wody do wstrzykiwania, bezpośrednio przed użyciem. Kompozycje do wstrzykiwań, niewymagające długiego przygotowywania, mogą być wytwarzane ze sterylnych proszków, granulek i tabletek opisanych wcześniej. Korzystnymi formami dawkowania kompozycji są te zawierające dawkę dobową składnika aktywnego lub jednostkę poddawki dobowej, jak opisano powyżej, lub odpowiednią jej część.

Wynalazek dotyczy także kompozycji weterynaryjnych zawierających, co najmniej jeden składnik aktywny określony powyżej wraz z nośnikiem weterynaryjnym. Nośniki weterynaryjne stanowią materiały umożliwiające podawanie kompozycji i mogą być stale, ciekłe lub gazowe, które są albo obojętne albo dopuszczalne weterynaryjnie oraz są zgodne ze składnikiem aktywnym. Kompozycje weterynaryjne mogą być podawane doustnie, pozajelitowo lub w jakikolwiek pożądany sposób.

Pochodne opisane w tym dokumencie są ewentualnie używane w kompozycjach farmaceutycznych o kontrolowanym uwalnianiu, zawierających jako składnik aktywny jeden lub więcej związków aktywnych, w których uwalnianie składnika aktywnego jest kontrolowane i regulowane, pozwalając na rzadsze podawanie dawki lub poprawiając farmakokinetykę lub profil toksyczny danego związku. Zwykle, pochodne są podawane z układów o kontrolowanym uwalnianiu, takich jak implanty ze zgłoszenia międzynarodowego W092/14450 lub amerykańskiego dokumentu patentowego nr 5 098 443, lub matryc z amerykańskiego dokumentu patentowego nr 4 740 365, lub 5 141 752. Wiele innych, znanych układów będzie odpowiednich do tego celu.

Sposoby podawania terapeutycznego

Odpowiednie drogi podawania obejmują podawanie doustne, doodbytnicze, donosowe, miejscowe (w tym dooczne, dopoliczkowe i podjęzykowe), dopochwowe i pozajelitowe (w tym podskórne, domięśniowe, śródszkłistkowe, dożylne, śródskórne, wewnątrzoponowe i zewnątrzoponowe). Korzystna droga podawania zależeć będzie m. in. od stanu pacjenta, toksyczności związku oraz obszaru infekcji oraz innych zagadnień znanych lekarzowi.

Dla każdego z wyżej wymienionych wskazań terapeutycznych, wymagana ilość składnika aktywnego (określonego powyżej) zależeć będzie od licznych czynników, w tym ciężkości stanu, który ma być leczony, czynnika odpowiedzialnego za infekcję, przyczyny podawania (profilaktycznie czy do leczenia ostrej infekcji), obszaru infekcji lub stanu patologicznego oraz innych czynników do ostatecznego rozważenia przez lekarza czy weterynarza. Jednakże, odpowiednia dawka będzie zwykle leżeć

PL 207 187 B1 w zakresie dawki typowej dla analogicznych metoksyfosfonianów (patrz powyż ej), biorą c pod uwagę różnice w sile działania w testach in vitro i wynosić zwykle od 0,1 do 250 mg na kilogram masy ciała pacjenta na dawkę (zawartość składnika aktywnego wynosić będzie od 0,1 do 400 mg/kg/dawkę, o przyrostach wynoszą cych 0,5 mg/kg/dawkę , na przykł ad 2,5 mg/kg/dawkę , 3,0 mg/kg/dawkę , itd.), zwykle od 0,5 do 50 mg/kg/dawkę i najczęściej od 1 do 300 mg/kg/dawkę.

Pożądana dawka jest podawana z odpowiednimi przerwami w jednostkowych formach dawkowania, zwykle ze stosunkowo wysoką dawką początkową i niższymi, mniej częstymi dawkami utrzymującymi. Pochodne mogą być również stosowane profilaktycznie, na przykład poprzez podawanie od 1 do 7 dni przed infekcją wirusową . Guzy lub rozrosty spowodowane przez HPV lub opryszczkowe zmiany patologiczne są zwykle leczone miejscowo, albo poprzez zastrzyk miejscowy albo przy wykorzystaniu żeli, maści lub innych podobnych środków do stosowania miejscowego.

Pochodne według wynalazku są ewentualnie stosowane w połączeniu z innymi środkami terapeutycznymi do leczenia lub zapobiegania określonych powyżej infekcji lub stanów. Przykłady takich dodatkowych środków terapeutycznych obejmują środki efektywne w leczeniu lub zapobieganiu infekcji wirusowych. Grupa ta zawiera m. in.: NRTI, 3'-azydo-3'deoksytymidynę (zidowudyna, AZT), 2'-deoksy-3'-tiacytydynę (3TC), 2',3'-dideoksy-2',3'-dihydrotymidynę (D4T), karbowir (karbocykliczna 2',3'-dideoksy-2',3'didehydroguanozyna), abakawir (ABC), 2',3'-dideoksyinozynę (ddl), didanozynę, 2',3'-dideoksycytydynę (ddc, zalcytabina), 3'-azydo-2',3'-dideoksyurydynę, (E)-5-(bromowinylo)-2-deoksyurydynę (BVDU), 2-chloro-2'-deoksyadenozynę, 2-deoksykoformycynę, 5-fluoroacyl, 5-fluorourydynę, 5-fluoro-2'-deoksyurydynę, 5-trifiuorometylo-2'-deoksyurydynę, 6-azaurydynę, kwas 5-fluoroorotowy, metotreksat, triacetylourydynę, 1 -(2'-deoksy-2'-fluoro-1 -e-D-arabinosylo)-5-jodocytydynę (FIAC), tetrahydroimidazo-(4,5,1-jk)-(1,4)-benzodiazepino-2-(1H)tion (TIBO) lub inne nienukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy (na przykład newirapinę, delawirydynę, efawirenz, deparywinę i inne), inhibitory proteazy (na przykład sakwinawir, indinawir, ritonawir, amprenawir i im podobne), 2-niecykliczne-GMP, arabinozyd 6-metoksypuryny (ara-M), 2'-O-walerianian arabinozydu 6-metoksypuryny, arabinozyd cytozyny (ara-C), acykliczne nukleozydy, takie jak acyklowir, walacyklowir, pencyklowir, famcyklowir, gancyklowir, acykliczne analogi nukleotydów, takie jak HPMPC, PMEA, PMEG, PMPA, PMPDAP, FPMPA, HPMPA i HPMPDAP, (2R,5R)-9-[tetrahydro-5-(fosfonometoksy)-2-furanylo]adenina, (2R,5R)-1-[tetrahydro-5-(fosfonometoksy)-2-furanylo]tymina, inne środki przeciwwirusowe obejmujące rybawirynę (arabinozyd adeniny), 2-tio-6-azaurydynę, tubercydynę, kwas aurynotrikarboksylowy, 3-deazanoplanocynę, neoplanocynę, rimantydynę, adamantynę i foskamet (fosfonomrówczan trzysodowy).

Sposoby syntezy

Pochodne określone wzorem (I) są syntetyzowane poprzez alkilowanie odpowiedniej zasady 6-hydroksypirymidynowej przez 2-chloroetoksymetylofosfonian dialkilowy (lub jego analogi o innych podstawnikach R3) w obecności NaH, Cs2CO3 lub DBU (1,8-diazabicyklo[5.4.0]undek-7-en) w dipolarnym rozpuszczalniku aprotycznym, zwykle DMF i ewentualnie odbezpieczenie przy pomocy na przykład bromotrimetylosilanu, a następnie hydrolizy. Produktowi o wzorze (I) towarzyszy różna ilość utworzonego odpowiedniego N1-izomeru, tj. dwupodstawionego w pozycjach 2 i 4 1-[2-(fosfonometoksy)-etylo]piymidyn-6-onu. Może być on usunięty chromatograficznie jako obojętny diester przed reakcją z bromotrimetylosilanem.

Inny sposób wytwarzania związków o wzorze (I) obejmują przekształcanie podstawionych w pozycji 2 pochodnych 4-chloro-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyny (i ich analogów o innych podstawnikach R3) na drodze reakcji z pierwszo- i drugorzędowymi aminami w rozpuszczalniku niewodnym (np. etanolu), wodorotlenku alkalicznym lub w węglanie alkalicznym w wodzie. Reakcja może być katalizowana na przykład przez 1,3,5-triazole, imidazole lub korzystnie przez DABCO (diazabicykloktan). Ewentualnie, grupy zabezpieczające są następnie usuwane, na przykład przy pomocy reakcji z bromotrimetylosilanem i hydrolizę.

Pochodne o wzorze (I) mogą być również uzyskane poprzez reakcję dwupodstawionych w pozycjach 2 i 4 6-fluorowcopirymidyn z sodowym alkoholanem 2-hydroksyetylofosfonianu dialkilowego (lub jego analogami o innych podstawnikach R3), po której następuje ewentualnie odbezpieczenie. Zaletą tego sposobu jest fakt, że otrzymuje się jedynie izomer O-6. Wybór odpowiednich sposobów syntezy zależy od dostępności heterocyklicznej pochodnej pirymidyny, stosowanej jako materiał wyjściowy.

Pochodne o wzorze (I) mogą być również otrzymane na drodze reakcji dwupodstawionych w pozycjach 2 i 4 6-(2-hydroksyalkilo)pirymidyn z p-toluenosulfonylooksymetylofosfonianem dialkilo14

PL 207 187 B1 wym w obecności NaH. Wyjściowe materiały są wytwarzane przez przeprowadzenie reakcji 6-chloropirymidyny z zabezpieczonym lub niezabezpieczonym diolem w obecności zasady.

Pochodne o wzorze (I) mogą być także otrzymane przez podstawienie pierścienia pirymidyny w różnorodnych pozycjach. W ten sposób można otrzymać pochodne 5-fluorowcowe poprzez reakcję z pierwiastkowym fluorowcem lub w reakcji wymiany anionu fluorowca.

Amidowe lub estrowe grupy Z są przekształcane w grupy hydroksylowe przy pomocy hydrolizy.

Monoestry można łatwo uzyskać z di-estrów lub z mieszaniny di- i monoestrów, poprzez traktowanie azydkiem litu lub sodu w DMF (A. Holy, „Synthesis 1998” 381-385, (1998)).

Wszystkie cytaty zostały umieszczone w niniejszym opisie jako odnośniki. Wynalazek będzie bardziej zrozumiały na podstawie następujących przykładów.

P r z y k ł a d 1

(a) 2,4-diamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]piryimidyna i 2,4-diamino-1-[2-(fosfonometoksy)-etylo] pirymidyn-6-(1H)-on

Mieszaninę 2,4-diamino-6-hydroksypirymidyny (2,52 g, 20 mmol), węglanu cezu (3,25 g, 10 mmol) w dimetyloformamidzie (40 ml) mieszano przez 30 minut w temperaturze 80C i następnie dodano 2-chloroetoksymetylofosfonian diizopropylowy (3,5 g, 23,4 mmol). Mieszaninę mieszano przez 16 godzin w temperaturze 100°C, a następnie odfiltrowano od soli. Przesącz odparowano pod próżnią, a pozostałości oczyszczano chromatograficznie na kolumnie z żelem krzemionkowym (300 ml) przy pomocy chloroformu. Wymyty produkt wykrystalizowano z mieszaniny octanu etylu i estru naftowego i uzyskano 1,2 g (17,2%) 2,4-diamino-6-[2-(diizopropylofosfonylometoksy)etoksy]pirymidyny, TT 159°C.

Dla C13H25N4O5P (348,3) obliczono: 44,83% C, 7,23% H, 16,08% N, 8,89% P; uzyskano: 44,99% C, 7,28% H, 16,18% N, 9,03% P.

Widmo masowe: 349,3 (MH⁺) (100), 265,1 (MH⁺ - 2 x iPr) (6); 139 (26); 127,1 (zasada H⁺).

PL 207 187 B1

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 1,24 d, 6H i 1,24 d, 6H, J (CH3, CH) = 6,2 (4 x CH3); 3,74 m, 2H (H-2'); 3,78 d, J (CH2-P) = 8,2 (CH2-P); 4,22 m, 2H (H-1')' 4,59 dh, 2H, J (CH, P) = 8,2, J (CH, CH3) = 6,2 (2 x CH); 5,02 s, 1H (H-6); 5,85 bs, 2H i 6,00 bs, 2H (2 x NH2).

Widmo ¹³C NMR (CD3SOCD3): 23,85 d, J (CH3, P) = 4,6 (2 x CH3); 23,99 d, J (CH3, P) = 4,1 (2 x CH3); 63,65 (C-1'); 65,02 d, J (CH2-P) = 164,4 (CH2P); 70,32 d, J (CH, P) = 6,0 (2 x CH-O); 71,05 d, J (2', P) = 11,9 (C-2'); 76,35 (C-5); 163,01, 166,15 i 169,92 (C-2, C-4 i C-6).

Związek ten (1,0 g, 2,9 mmol) poddawano działaniu BrSiMe3 (4 ml) w acetonitrylu (40 ml) przez noc. Rozpuszczalniki usunięto pod próżnią, a pozostałości współoddestylowano z acetonirylem (2 x 25 ml), a następnie dodano do pozostałości wodę (50 ml). Roztwór alkalizowano stężonym wodnym roztworem amoniaku i odparowano pod próżnią. Pozostałości wprowadzono w roztworze wodnym do kolumny (100 ml) zawierającej Dowex 50X8 (postać H+), a następnie eluowano kolumnę wodą (3 ml/min). Eluat badano nieprzerwanie przy pomocy UV o długości fali 254 nm. Po usunięciu frakcji nie absorbujących UV, kolumnę eluowano 2,5% roztworem wodnym amoniaku i zbierano frakcję absorbującą UV. Frakcję tą odparowano pod próżnią, rozpuszczono ponownie w wodzie, roztwór doprowadzono do pH 9-10 przy pomocy stężonego roztworu wodnego amoniaku i prowadzono do kolumny (70 ml) zawierającej Dowex 1 x 2 (postać octanowa) wstępnie przepłukanej wodą. Po elucji wodą (z retencją) uzyskano produkt, który wykrystalizowano z wody otrzymując 2,4-diamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy] pirymidynę (0,60 g, 78,3%).

TT 279°C (woda), EUp 0,80.

Dla C7H13N4O5P (264,2) obliczono 31,83% C, 4,96% H, 21,21% N, 11,72% P; uzyskano 31,58%

C, 5,04% H, 20,96% N, 11,53% P.

Widmo UV (ε^χ)] (pH 2): 276 (9100), (pH 7): 265 (7500).

Dane te są zgodne z widmem UV opublikowanym dla 2,4-diamino-6-metoksypirymidyny ((A_maxodpowiednio 263 i 275).

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3, 40°C): 3,58 d, 2H, J (CH2, P) = 8,7 (CH2, P); 3,74 t, 2H, J (2'1') = 4,9, (H-2'); 4,23 t, 2H J (1',2') = 4,9 (H-1'); 5,07 s, 1H (H-5); 5,86 bs, 2H i 6,01 bs, 2H (2 x NH2).

Widmo ¹H NMR (D2O): 3,69 d, 2H, J (CH2, P) = 8,7 (CH2, P); 3,91 m, 2H, J (H-2'); 4,30 m, 2H (H-1'); 5,45 s, 1H (H-5).

Widmo ¹³C NMR (D2O): 69,30 (C-1'); 70,28 d, J (CH2-P) = 151,3 (CH2, P); 73,35 d, J (2', P) = 10,3 (C-2'); 79,63 (C-5); 165,46, 169,35 i 171,08 (C-2, C-4 i C-6).

Pozycja sygnału pochodzącego od atomu węgla C-1' przesunięta w stronę mniejszych częstotliwości w przypadku O-izomerów (diestry i wolny fosfonian) (S odpowiednio 63,65 i 69,30) wskazuje, że grupa PME jest związana z atomem tlenu przy C-6.

W wyniku dalszej elucji na kolumnie z żelem krzemionkowym przy pomocy chloroformu uzyskano 1,8 g (26%) amorficznego 2,4-diamino-1-[2-(diizopropylofosfonylometoksy)etylo]pirymidyn-6(1H)-onu (Rf 0,35, S1), który wysuszono pod próżnią nad P2O5. Tt 196-197°C. Pozostałości (5,17 mmol) poddawano działaniu bromotrimetylosilanu (6 ml) w acetonitrylu (60 ml) przez noc i obrobiono tak jak opisano dla O-izomeru. Po oczyszczaniu odsolonej mieszaniny na kolumnie zawierającej Dowex 1 (elucja wodą) uzyskano produkt, który następnie wykrystalizowano z wody i otrzymano 0,95 g (65%) 2,4-diamino-1-[2-(fosfonometoksy)etylo]pirymidyn-(1H)-onu.

Tt 228°C (woda). EUp 0,90.

Dla C7H13N4O5P · H2O (282,2) obliczono 29,79% C, 5,36% H, 19,85% N, 10,98% P; uzyskano 29,76% C, 5,22% H, 20,01% N, 10,92% P.

Widmo masowe: 349,2 (MH+) (100); 265,1 (MH+ -2x iPr) (35); 126 (BH+) (26).

Widmo UV [A_max fc_max)] (pH 2): 264 (18000), (pH 7): 267 (12200). Wartość jest zgodna z wartością opublikowaną dla 2,4-diamino-1-metylopirymidyn-6-(1H)-onu (268 nm).

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 3,59 d, 2H, J (CH2, P) = 8,4 (CH2, P); 3,60 t, 2H, J (2', 1 ') = 6,1, (H-2'); 3,96 t, 2H J (1', 2') = 6,1 (H-1'); 4,61 s, 1H (H-5); 5,88 bs, 2H 1 6,61 bs, 2H (2 x NH2).

Widmo ¹H NMR (D2O): 3,48 d, 2H, J (CH2, P) = 8,4 (CH2, P); 3,76 t, 2H, J (1',2') = 5,2 (H-1'); 4,09 t, 2H J (2', 1') = 5,2 (H-2'); 5,06 s, 1H (H-5).

Widmo ¹³C NMR (D2O): 45,15 (C-1'); 70,41 d, J (CH2-P) = 154,7 (CH2P); 74,09 d, J (2', P) = 11,8 (C-2'); 81,05 (C-5); 159,73, 166,79 i 168,04 (C-2, C-4 i C-6).

Przesuniecie położenia C-1' w stronę większych częstotliwości (S 45,15) wskazuje na podstawienie przy atomie azotu. Dwa sygnały pochodzące od grup NH2 (δ 6,61 i 5,88) obserwowane na widmie ¹H NMR w DMSO wykluczają podstawienie w zewnętrznej pozycji 2-NH2 oraz/lub 2-NH2 i są zgodne z oczekiwanym podstawieniem przy atomie N(1).

PL 207 187 B1

(a) 2-amino-4-cliloro-6-|2-(diizopropylofosfonylometoksy)etoksy]pirymiidyna i 2-amino-4-chloro-1-(2-(diizopropylofosfonylometoksy)etylo]pirymidyn-6-(1H)-on

Jednowodzian 2-amino-4-cliloro-6-hydroksypirymidyny (25 mmol) wspóloddestylowano wraz z toluenem (3 x 50 ml) pod próżnią , a pozostał ości poddano dział aniu DMF (50 ml), DBU (3,8 ml) i 2-chloroetoksymetylofosfonianu diizopropylowego (7 ml). Mieszaninę mieszano przez 16 godzin w temperaturze 100°C, a substancje lotne usunię to przez odparowanie w temperaturze 50°C i ciśnieniu 2 kPa. Pozostałości przeniesiono do chloroformu (200 ml), odfiltrowano i przemyto nasyconym roztworem NaCl (100 ml). Wodny roztwór użyty do przemywania ekstrahowano chloroformem (5 x 50 ml), połączone ekstrakty wysuszono nad siarczanem magnezu i odparowano. Po rozdzieleniu na kolumnie z żelem krzemionkowym (150 ml) przy zastosowaniu chloroformu i mieszaniny chloroform-etanol uzyskano 2-amino-4-chloro-6-[2-(diizopropylofosfonylometoksy)etoksy]pirymidynę z wydajnością 27,2%, Tt 89°C.

PL 207 187 B1

Dla C13H23CIN3O5P (367,77) obliczono 42,46% C, 6,30% H, 9,64% Cl, 11,43% N, 8,42% P; uzyskano 42,34% C, 6,34% H, 9,79% Cl, 11,30% N, 8,23% P.

Widmo masowe: 368,3 (MH⁺) (100).

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 1,22 d, 6H i 1,23 d, 6H, J (CH3, CH) = 6,1 (CH3); 3,78 d, J (CH2-P) = 8,3 (CH2-P); 3,80 m, 2H (H-2')' 4,37 m, 2H (H-1'); 4,58 m, 2H, (P-OCH); 6,06 s, 1H (H-5); 7,05 bs, 2H (NH2).

Widmo ¹³C NMR (CD3SOCD3): 23,83 d, 2C, J (CH3, P) = 4,9 i 23,97 d, 2C, J (P, C)-3,9 (CH3); 65,15 d, J (P, C) = 164,1 (P, C); 65,15 (C-1'); 70,35 d, 2C, J (P, C) = 6,7 (P-OC) = 11,7 (C-2'); 94,46 (C-5); 160,12 (C-2), 162,97 (C-4); 170,56 (C-6).

W wyniku dalszej elucji i krystalizacji z eteru etylu octowego otrzymano 2-amino-4-chloro-1-[2-(diizopropylofosfonylometoksy)etylo]pirymidyn-6-(1H)on, wydajność 54,4%, T,=95 °C.

Dla C13H23CIN3O5P (367,77) obliczono 42,46% C, 6,30% H, 9,64% Cl, 11,43 N, 8,42% P; uzyskano 42,28% C, 6,22% H, 9,65 Cl%, 11,50% N, 8,27% P.

Widmo masowe: 368,4 (MH⁺) (100).

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 1,20 d, 6H i 1,22 d, 6H, J (CH3, CH) = 6,1 (CH3); 3,69 t, 2H, J (2', 1') = 5,5 (H-2'); 3,76 d, J (CH2-P) = 8,1 (CH2-P); 4,06 t, 2H, J (1', 2') = 5,5 (H-1'); 4,55 M, 2H (P-OCH), 5,67s, 1H (H-5); 7,6 bs, 2H (NH2).

Widmo ¹³C NMR (CD3SOCD3): 23,84 d, 2C, J (CH3, P) = 3,9 i 23,97 d, 2C, J (P, C) = 3,9 (CH3); 40,29 (C-1') 65,03 d, J (P, C)=164,1 (P-C); 69,01 d, 2C, J (P, C) = 11,7 (C-2'); 70,41 d, 2C, J (P, C) = 5,9 (P-OC); 98,28 (C-5), 155,73 (C-2); 157,87 (C-4); 161,48 (C-6).

(b) 2-amino-4-hydroksy-6-[2(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna

Mieszaninę 2-amino-4-chloro-6-[2-(diizopropylofosfonylometoksy)etoksy]pirymidyny (5,7 g), DABCO (3,6 g) i K2CO3 (9,0 g) w wodzie (100 ml) destylowano pod chłodnicą zwrotną przez 150 minut z mieszaniem, schłodzono i zakwaszono przez dodanie Dowex 50 x 8 (forma H⁺). Zawiesinę alkalizowano stężonym wodnym roztworem amoniaku i po 5 minutach mieszania odfiltrowano, a żywicę przemyto 50% wodnym roztworem metanolu (200 ml). Przesącz odparowano, dodano etanol (50 ml), a nastę pnie mieszaninę odparowano. Pozosta ł o ś ci rozdzielono chromatograficznie na kolumnie z żelem krzemionkowym (150 ml) przy pomocy mieszaniny chloroform-etanol o zmiennym stężeniu i uzyskano krystaliczną 2-amino-6-[2-(diizopropylofosfonylometoksy)etoksy]-4-hydroksypirymidynę, Tt 154°C, z wydajnoś cią 78%.

Dla C13H24N3O6P (349,3) obliczono 44,70% C, 6,92% H, 12,03% N, 8,37% P; uzyskano 44,58% C, 7,02% H, 11,95% N, 8,53% P.

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 1,24 d, 6H i 1,23 d, 6H, J (CH3, CH) = 6,2 (4 x CH3); 3,74 m, 2H (H-2'); 3,76 d, J (CH2-P) = 8,3 (CH2-P); 4,19 m, 2H (H-1'); 4,59 m, 2H (P-OCH); 4,75 s, 1H (H-5); 6,65 bs, 2H (NH2); 10,45 s, 1H (OH).

Widmo ¹³C NMR (CD3SOCD3): 23,87 d, 2C, J (CH3, P) = 4,9 i 24,01 d, 2C, J (P, C) = 3,9 (CH3); 65,03 d, J (P, C)= 164,6 (P-C); 65,04 (C-1'); 70,37 d, 2C, J (P, C) = 6,3 (P-OC); 70,87 d, J (P, C) = 11,7 (C-2'); 79,95 (C-5); 155,68 (C-4), 164,25 (C-2); 171,01 (C-6).

Otrzymany produkt poddawano działaniu bromotrimetylosilanu (10 ml) w acetonitrylu (80 ml) przez noc, odparowano pod próżnią, a do pozostałości dodano wody (50 ml). Po 10 minutach dodano stężony wodny roztwór amoniaku do odczynu alkalicznego, a następnie mieszaninę odparowano. Pozostałości dejonizowano na kolumnie (100 ml) zawierającej Dowex 50 x 8, a amoniakalny eluat absorbujący promieniowanie UV odparowano. Osad rozpuszczono w minimalnej ilości gorącej wody poprzez dodanie stężonego wodnego roztworu amoniaku i zakwaszono stężonym HCl do pH 3-3,5. Zebrano osad, przemyto wodą, etanolem i wysuszono pod próżnią. Wydajność 0,7 g, Tt 227°C.

Dla C7H12N3O6P (265,16) obliczono 31,71% C, 4,56% H, 15,85% N, 11,68% P; uzyskano 31,55% C, 4,62% H, 16,15% N, 11,51% P.

P r z y k ł a d 3 (a) 2,4-diamino-6-(S)-[2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyna (H-3560) (S)-2-(4-tołuenosulfonyloksy)propyioksymetylofosfonian diizopropylowy (25,7 g, 63 mmol) w DMF (40 ml) dodano w temperaturze 90°C do mieszanej mieszaniny 2,4-diamino-6-hydroksypirymidyny (60 mmol), DMF (40 ml) i DBU (10,6 ml, 60 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 100°C przez 24 godziny i następnie odparowano pod próżnią. Pozostałości przeniesiono do chloroformu (200 ml), odfiltrowano i przemyto nasyconym roztworem NaCl (100 ml). Wodny roztwór użyty do przemywania ekstrahowano chloroformem (5 x 50 ml), połączone ekstrakty wysuszono nad siarczanem magnezu i odparowano. Po rozdzieleniu na kolumnie z żelem

PL 207 187 B1 krzemionkowym (150 ml) przy zastosowaniu chloroformu i mieszaniny chloroform-etanol o zmiennym stężeniu uzyskano główny produkt (izomer-O6) jako oleistą substancję, którą suszono pod próżnią nad pięciotlenkiem fosforu przez noc. Następnie do roztworu dodano acetonitryl (80 ml) i bromotrimetylosilan (20 ml) i pozostawiono w kolbie z doszlifowanym korkiem. Substancje lotne odparowano pod próżnią, a do pozostałości dodano wody (100 ml). Po 10 minutach dodano stężony wodny roztwór amoniaku do odczynu alkalicznego, a następnie mieszaninę odparowano. Pozostałości dejonizowano na kolumnie (100 ml) zawierającej Dowex 50 x 8, a amoniakalny eluat absorbujący promieniowanie UV odparowano. Produkt w wodzie (20 ml) alkalizowano stężonym wodnym roztworem amoniaku i przeniesiono do kolumny (200 ml) zawierają cej Dowex 1 x 2 (forma octanowa) wstę pnie przepł ukanej wodą. Kolumnę eluowano wodą, a następnie kwasem octowym o zmieniającym się stężeniu (0-0,5 M, 1,5 l każdy). Główną frakcję absorbującą promieniowanie UV odparowano, a pozostałości współoddestylowano z wodą (3 x 50 ml), a następnie wykrystalizowano z wody. Wydajność 3,5 g (19,7%); Tt 281°C.

Dla jednowodzianu C8H15N4O5PH2O (296,22) obliczono 32,44% C, 5,78% H, 18,91% N, 10,46% P; uzyskano 32,67% C, 5,86% H, 19,40% N, 10,60% P.

Widmo ¹H NMR (D2O + NaOD): 1,26 d, 3H J (3',2') = 6,4 (H-3'); 3,51 dd, 1H J (CH3, P) = 9,4, J (gem) = 12,2 (CH3, P); 3,60 dd, J (CH3, P) = 9,4 (CH2-P), J (gem) = 12,2 (CH3P); 3,92 m, 2H (H-2'); 3,92 m, 2 H (H-2'); 4,06 dd, 1H (1'b, 2) = 5,5, J (gem) = 10,5 (H-1'b); 4,14 dd, 1H, J (1'a, 2') = 3,7, J (gem) = 10,5 (H-1'a); 5,41 s, 1 H (H-5).

Widmo ¹³C NMR (D2O): 15,84 (C-3'); 66,99 d, J (CH2-P) = 149,9 (P-C); 69,68 (C-1'); 75,14 d, J (2', P) = 11,2 (C-2'); 76,84 (C-5); 166,74 (C-2), 162,83 (C-4); 171,05 (C-6).

(b) 2,4-diamino-6-(R)-[2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyna (H-3567)

Enancjomer (R) przygotowano analogicznie do sposobu z przykładu 3(a) z (R)-2-(4-toluenosulfonyloksy)propyloksymetylofosfonianu izopropylowego (50 mmol), 2,4-diamino-6-hydroksypirymidyny (60 mmol) i DBU (60 mmol) w DMF (70 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 100°C przez 24 godziny. Dalsza obróbka była taka sam jak opisana w przykładzie 4. Wydajność 24%, nie ulega stopieniu poniżej 290°C.

Dla jednowodzianu C₈H₁₅N₄O₅P ·Η₂Ο (296,22) obliczono 32,44% C, 5,78% H, 18,91% N, 10,46% P; uzyskano 32,54% C, 5,90% H, 19,10% N, 10,65% P.

Widma ¹H NMR i ¹³C NMR są identyczne jak w przypadku enancjomeru (S).

P r z y k ł a d 4

2,4-diamino-6-[2-(fosfonometoksy)etylosulfanylo]pirymidyna

Zawiesinę półsiarczanu 2,4-diamino-6-sulfanyłopirymidyny (2,616g, 13,7 mmol) w DMF (40 ml) poddano działaniu wodorku sodu (1,0855 g, 27 mmol, 60% dyspersja w oleju parafinowym) mieszając przez 1 godzinę, a następnie 2-chloroetoksymetylofosfonianu diizopropylowego (9 ml, 17,2 mmol). Mieszaninę mieszano przez 8 godzin w temperaturze 80C, przefiltrowano przez wkładkę celitową

PL 207 187 B1 i odparowano pod próżnią. Pozostałość w chloroformie oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym (150 ml) przy pomocy mieszaniny chloroform-etanol (49:1) i uzyskano 2,4-diamino-6-[2(diizopropylofosfonylometoksy)etylosulfanylo]pirymidynę (4,0 g, 80%), Tt 109°C.

Dla C13H25N4O4PS (364,40) obliczono 42,85% C, 6,91% H, 15,38% N, 8,50% P, 8,80% S; uzyskano 42,48% C, 6,94% H, 15,50% N, 8,63% P, 9,01% S.

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 1,24 d, 6H i 1,25 d, 6H, J (CH3, CH) = 6,1 (CH3); 3,17 t, 2H (1',2') = 6,6 (H-1'); 3,68 t, 2H J (2',1') = 6,6 (H-2'); 3,77 d, J (CH2-P) = 8,3 (CH2-P); 4,60 m, 2H (P-OCH); 5,60 s, 1H (H-5); 5,95 brs, 2H i 6,17 brs, 2H (NH2).

Otrzymany związek w acetonitrylu (50 ml) poddawano działaniu bromotrimetylosilanu (5 ml) przez noc, a następnie odparowano substancje lotne pod próżnią. Do pozostałości dodano wody (100 ml). Po 10 minutach dodano stężony wodny roztwór amoniaku do odczynu alkalicznego, a następnie mieszaninę odparowano. Pozostałości dejonizowano na kolumnie (100 ml) zawierającej Dowex 50 x 8, a amoniakalny eluat absorbujący promieniowanie UV odparowano. Produkt w wodzie (20 ml) alkalizowano stężonym wodnym roztworem amoniaku i przeniesiono do kolumny (100 ml) zawierającej Dowex 1 x 2 (forma octanowa) wstępnie przepłukanej wodą. Kolumnę eluowano wodą, a następnie kwasem octowym o zmieniającym się stężeniu (0-0,5 M, 1,5 l każdy). Główną frakcję absorbującą promieniowanie UV odparowano, a pozostałości wspóloddestylowano z wodą (3 x 50 ml), a następnie wykrystalizowano z wody. Uzyskano 2,8 g (91%), 2,4-diamino-6-[2-(fosfonometoksy)etylosulfanylo]pirymidyny. Tt 246°C.

Dla C7H13N4O4PS (280,24) obliczono 30,00% C, 4,68% H, 19,99% N, 11,05% P, 11,44% S; uzyskano 30,27% C, 4,80% H, 19,74% N, 10,98% P, 11,60% S.

Widmo ¹H NMR (D2O + NaOD): 3,18 t, 2H J (2', 1') = 6,8 (H-1'); 3,56 d, 2H J (CH2, P) = 8,7; 3,68 t, J (2', 1') = 6,8 (H-2'); 5,70 s, 1H (H-5); 6,32 brs, 2H (2-NH2); 6,48 brs, 2H (4-NH2).

P r z y k ł a d 5

PL 207 187 B1

4-amino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksyjpirymidyna oraz 4-amino-l-[2-(fosfonometoksy)etylo]pirymidyn-6-(1H)-on

4-amino-6-hydroksy-2-sułfanylopirymidynę (20 g) we wrzącym etanolu (300 ml) poddawano w trakcie mieszania dział aniu katalizatora niklowego typ Raney'a, do momentu rozpoczę cia zaniku materiału wyjściowego. Zawiesinę odfiltrowano na gorąco, osad przemyto gorącym etanolem (300 ml) a przesą cz odparowano. Pozostał o ś ci oszczę dzono na krystalizacji z etanolu (eter dodawany do zmętnienia). 4-amino-6-hydroksypirymidyna, Tt 272°C, wydajność 10,0 g (64,4%).

Dla C4H5N3O (111,10) obliczono 43,24% C, 4,54% H, 37,82% N; uzyskano 43,40% C, 4,65% H, 38,01% N.

Widmo masowe: 112 (MH⁺).

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 4,97 s, 1H (H-5); 6,42 brs, 2H (NH2); 7,77 s, 1H (H-2); 11,41 brs, 1H (OH).

Otrzymany związek (3,6 g, 33,6 mmol) w DMF (70 ml) poddawano działaniu NaH (1,36 g, 34 mmol, 60% dyspersja w oleju parafinowym) mieszając przez 0,5 godziny, a następnie 2-chloroetoksymetylofosfonianu diizopropylowego (9,4 ml, 40,5 mmol). Mieszaninę mieszano przez 8 godzin w temperaturze 80°C, przefiltrowano przez wkładkę celitową i odparowano pod próżnią. Pozostałość w chloroformie oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym przy pomocy mieszaniny chloroform-etanol (97,5:2,5) i uzyskano 4-amino-6-[2-(diizopropylofosfonylometoksy)etoksy]pirymidynę, którą wykrystalizowano z mieszaniny octan etylu - eter naftowy. Wydajność 3,0 g, (26,8%), Tt 112°C.

Dla C13H24N3O5P (333,32) obliczono 46,48% C, 7,26% H, 12,61% N, 9,29% P; uzyskano 46,69% C, 7,38% H, 12,45% N, 9,40% P.

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 1,22 d, 6H i 1,23 d, 6H, J (CH3, CH) = 6,1 (4 x CH3); 3,78 brt, 2H (2', 1) = 4,5 (H-2'); 3,78 d, J (CH2-P) = 8,4 (CH2-P); 4,31 brt, 2 H, J (1', 2') = 4,5 (H-1'); 4,59 m, 2H (P-OCH); 5,67 s, 1H (H-5); 6,62 bs, 2H (NH2); 8,07 s, 1H (H-2).

Widmo ¹³C NMR (CD3SOCD3): 64,42 (C-1').

Otrzymany związek poddawano działaniu bromotrimetylosilanu (10 ml) w acetonitrylu (70 ml) przez noc. Po odparowaniu pod próżnią, do pozostałości dodano wody (100 ml). Po 10 minutach dodano stężony wodny roztwór amoniaku do odczynu alkalicznego, a następnie mieszaninę odparowano. Pozostałości dejonizowano na kolumnie (100 ml) zawierającej Dowex 50 x 8, a amoniakalny eluat absorbujący promieniowanie UV odparowano.

Do produktu dodano wody, alkalizowano stężonym wodnym roztworem amoniaku i przeniesiono do kolumny (100 ml) zawierającej Dowex 1 x 2 (forma octanowa) wstępnie przepłukanej wodą. Kolumnę eluowano wodą, a następnie kwasem octowym o zmieniającym się stężeniu (0-1 M, 1 l każdy). Główną frakcję absorbującą promieniowanie UV odparowano, a pozostałości współoddestylowano z wodą (3 x 50 ml), a następnie wykrystalizowano z wody. Uzyskano 1,8 g (80%), 4-amino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyny, Tt 254°C.

Dla C7H12N3O5P (249,16) obliczono 33,74% C, 4,85% H, 16,86% N, 12,43% P; uzyskano 34,02% C, 4,80% H, 16,88% N, 12,58%P.

W wyniku dalszej elucji mieszaniny reakcyjnej na kolumnie z ż elem krzemionkowym przy pomocy mieszaniny chloroform-etanol (95:5) uzyskano oleisty 4-amino-1-[2-(diizopropylofosfonylometoksy)etylo]pirymidyn-6-(1H)-on, który następnie wysuszono pod próżnią. Wydajność 4,6 g (41,1%). Związek poddawano działaniu bromotrimetylosilanu (10 ml) w acetonitrylu (70 ml) przez noc w temperaturze pokojowej.

Po odparowaniu pod próżnią, do pozostałości dodano wody. Po 10 minutach dodano stężony wodny roztwór amoniaku do odczynu alkalicznego, a następnie mieszaninę odparowano. Pozostałości przeniesiono do kolumny (100 ml) zawierającej Dowex 50 x 8 i eluowano wodą. Główną frakcję absorbującą promieniowanie UV odparowano, a pozostałości krystalizowano z 70% wodnego roztworu etanolu (dodano eter do zmętnienia). Otrzymano 2,8 g (91%) 4-amino-1-[2-(fosfonometoksy)etylo]pirymidyn-(1H)-onu, Tt 233°C.

Dla C7H12N3O5P (249,16) obliczono 33,74% C, 4,85% H, 16,86% N, 12,43% P; uzyskano 34,02% C, 4,80% H, 16,88% N, 12,58% P.

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 3,56 d, 2 H, J (CH2, P) = 8,8 (CH2P); 3,64 t, 2H, J (2', 1') = 4,9, (H-2'); 3,90 t, 2H J (1', 2') = 4,9 (H-2'); 5,06 s, 1H (H-5); 6,45 brs, 2H (NH2), 6,90 brs, 2H (P-OH); 7,98 s, 1H (H-2).

Widmo ¹³C NMR (CD3SOCD3): 44,44 (C-1').

PL 207 187 B1

2-amino-4-dimetyloamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna i 2-amino-4-dimetyloamino-1-[2-(fosfonometoksy)etylo]pirymidyn-6-(1H)-on

Jednowodzian 2-amino-4-chłoro-6-hydroksypirymidyny (5,0 g) mieszano z 30% dimetyloaminą w etanolu (180 ml) w temperaturze 100C w reaktorze ciś nieniowym przez 16 godzin. Krystaliczny produkt odfiltrowano, przemyto wodą, acetonem, eterem i wysuszono pod próżnią, by w rezultacie otrzymać 2-amino-4-dimetyloamino-6-hydroksypirymidynę, nie ulegającą stopieniu poniżej 300°C. Wydajność 4,3 g (81%).

Dla C6H10N4O (154,17) obliczono 46,34% C, 6,54% H, 36,34% N; uzyskano 46,38% C, 6,65% H, 36,68% N.

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 2,89 s, 6H, (N-CH3); 4,51 s, 1H (H-5); 6,18 brs, 2H (NH2), 9,75 brs, 1H (OH).

Otrzymany związek (4,0 g, 26 mmol) oraz węglan cezu (4,22 g, 13 mmol) w DMF (60 ml) mieszano w temperaturze 100°C przez 1 godzinę i dodano 2-chloroetoksymetylofosfonianu diizopropylowego (8 ml). Mieszaninę mieszano w temperaturze 100°C przez 24 godzin, odfiltrowano na gorąco i odparowano pod próżnią . Pozostał o ś ci ekstrahowano gorą cym chloroformem (100 ml), odfiltrowano i oczyszczono chromatograficznie na kolumnie z ż elem krzemionkowym (200 ml).

W wyniku elucji chloroformem uzyskano 2-amino-4-dimetyloamino-6-[2-(diizopropylofosfonylometoksy)etoksy]pirymidynę w postaci gęstego oleju (4,6 g) Poddawano go działaniu bromotrimetylosilanu (5 ml) i acetonitrylu (50 ml) przez noc w temperaturze pokojowej. Po odparowaniu pod próżnią, do pozostałości dodano wody (100 ml). Po 10 minutach dodano stężony wodny roztwór amoniaku do odczynu alkalicznego, a następnie mieszaninę odparowano. Pozostałości dejonizowano na kolumnie (100 ml) zawierającej Dowex 50 x 8, a amoniakalny eluat absorbujący promieniowanie UV odparowano. Produkt w wodzie (20 ml) alkalizowano stężonym wodnym roztworem amoniaku i przeniesiono do kolumny (150 ml) zawierającej Dowex 1 x 2 (forma octanowa) wstępnie przepłukanej wodą. Kolumnę eluowano wodą, a następnie kwasem octowym o zmieniającym się stężeniu (0-0,4 M, 1 l każdy). Główną frakcję absorbującą promieniowanie UV odparowano, a pozostałości współoddestylowano

PL 207 187 B1 z wodą (3 x 50 ml), a nastę pnie wykrystalizowano z wody. Uzyskano 1,1 g 2-amino-4-dimetyloamino6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyny. Tt 168°C.

Dla C9H17N4O5P (292,23) obliczono 36,99% C, 5,86% H, 19,17% N, 10,60% P; uzyskano 37,05% C, 5,80% H, 18,98% N, 10,51% P.

Widmo ¹H NMR (DMSO): 6,69 bs, 2H (NH2); 4,69 s, 1H (H-5); 3,98 t, J = 6,0 Hz, 2H (2 x H-1'); 3,61 t, J = 6,0 Hz 2H (2 x H-2'); 3,59 d, 2H, J (H, P) = 8,3 Hz (P-CH2); 2,89 s, 6H (N(CH3)2).

Widmo ¹³C NMR (DMSO): 162,37, 161,94 i 154,67 (C-2, C-4 i C-6); 75,79 (C5); 69,82 d, J (C, P) = 10,3 Hz (C-2'); 66,76 d, J (C, P) = 158 Hz (P-CH2); -40,0 (C-l1, nałożone z DMSO); 36,93 (N(CH3)2).

W wyniku dalszej elucji na kolumnie z ż elem krzemionkowym przy zastosowaniu mieszaniny chloroform-etanol o zmiennym stężeniu uzyskano 2-amino-4-dimetyloamino-1-[2-(diizopropylofosfonylometoksy)etylo]pirymidyn-6-(1H)-on w postaci gęstego oleju (2,0 g, który poddawano działaniu bromotrimetylosilanu (5 ml) i acetonitrylu (50 ml) przez noc i poddano podobnej obróbce. Po chromatografii z wykorzystaniem Dowex 1, uzyskano w wyniku krystalizacji 2-amino-4-dimetyloamino-1-[2-fosfonometoksy)etylo]pirymidyn-6-(1H)-on, Tt 235°C.

Dla C9H17N4O5P (292,23) obliczono 36,99% C, 5,86% H, 19,17% N, 10,60% P; uzyskano 37,15% C, 5,92% H, 19,28% N, 10,66% P.

Widmo ¹H NMR (DMSO): 6,03 bs, 2H (NH2); 5,20 s, 1H (H-5); 4,26 m, 2H (2 x H-1'); 3,74 m, 2H (2 x H-2'); 3,58 d, 2H, J (H, P) = 8,8 Hz (P-CH2); 2,93 s, 6H (N(CH3)2).

Widmo ¹³C NMR (DMSO): 169,93, 164,91 i 161,92 (C-2, C-4 i C-6); 75,02 (C-5); 70,89 d, J (C, P); 66,96 d, J (C, P) = 160,7 Hz (P-CH2); 64,28 (C-1'); 36,95 (N(CH3)2).

P r z y k ł a d 7

PL 207 187 B1

2-amino-4-cyklopropyloamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna i 2-amino-4-cyklopropyloamino-1-[2-(fosfonometoksy)etylo]pirymidyn-6-(1H)-on

Jednowodzian 2-amino-4-chloro-6-hydroksypirymidyny (5,0 g) destylowano pod chłodnicą zwrotną w etanolu (150 ml) z cyklopropyloaminą przez 12 godzin.

Mieszaninę odparowano pod próżnią, współ-oddestylowano z etanolem (3 x 50 ml), zaadsorbowano z metanolu na żelu krzemionkowym i przeniesiono do kolumny z żelem krzemionkowym (200 ml) w chloroformie.

W wyniku elucji mieszaniną chloroform-etanol o zmiennym stężeniu uzyskano krystaliczny produkt, który następnie odfiltrowano z eteru i wysuszono pod próżnią by uzyskać 2-amino-4-cyklopropyloamino-6-hydroksypirymidynę, Tt 229°C. Wydajność 3,0 g.

Dla C7H10N4O5 (166,18) obliczono 50,59% C, 6,07% H, 33,71% N; uzyskano 50,49% C, 6,25% H, 33,61% N.

Widmo ¹H NMR (DMSO): 9,73 brs, 1H (OH); 6,55 bs, 2H (NH); 6,08 brs, 2H (NH2); 4,66 s, 1H (H-5); 2,30 m, 1H i 0,62 m, 2H i 040, m, 2H (C-CH2, N-CH).

Mieszaninę otrzymanego związku (3,0 g, 18 mmol) i węglanu cezu (2,92 g, 9 mmol) w DMF (50 ml) mieszano w temperaturze 100°C przez 1 godzinę i dodano 2-chloroetoksymetylofosfonianu diizopropylowego (6 ml).

Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 100°C przez 24 godzin, odfiltrowano na gorąco i odparowano pod próżnią.

Pozostałości ekstrahowano gorącym chloroformem (100 ml), odfiltrowano i oczyszczono i chromatograficznie na kolumnie z żelem krzemionkowym (200 ml). W wyniku elucji otrzymano 2-amino-4-cyklopropyloamino-6-[-2-(diizopropylofosfonylometoksy)etoksy]pirymidynę w postaci gęstego oleju (1,8 g).

Produkt poddawano działaniu bromotrimetylosilanu (5 ml) i acetonitrylu (50 ml) przez noc w temperaturze pokojowej.

Po odparowaniu pod próżnią, do pozostałości dodano wody (100 ml). Po 10 minutach dodano) stężony wodny roztwór amoniaku do odczynu alkalicznego, a następnie mieszaninę odparowano.

Pozostałości dejonizowano na kolumnie (100 ml) zawierającej Dowex 50 x 8, a amoniakalny eluat absorbujący promieniowanie UV odparowano.

Produkt w wodzie (20 ml) alkalizowano stężonym wodnym roztworem amoniaku i przeniesiono do kolumny (150 ml) zawierającej Dowex 1 x 2 (forma octanowa) wstępnie przepłukanej wodą.

Kolumnę eluowano wodą, a następnie kwasem octowym o zmieniającym się stężeniu (0-0,4 M, 1 l każdy).

Główną frakcję absorbującą promieniowanie UV odparowano, a pozostałości wspóloddestylowano z wodą (3 x 50 ml), a następnie wykrystalizowano z wody.

Uzyskano 1,0 g 2-amino-4-cyklopropyloaminy-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyny. Tt 244°C.

Dla C7H10N4O5 (304,24) obliczono 39,48% C, 5,63% H, 18,42% 5 N, 10,18% P; uzyskano 39,65% C, 5,70% H, 18,59% N, 10,11% P.

Widmo ¹H NMR (D2O + NaOD): 0,54 m, 2H i 0,80 m, 2H (C-CH2); 2,53 m, 1H (N-CH); 3,57 s, 2H, J (CH2, P) = 8,4 (CH2P); 3,91 m, 2H (H-2'); 4,32 m, 2H (H-1'); 5,61 s, 1H (H-5);

W wyniku dalszej elucji mieszaniny reakcyjnej na kolumnie z żelem krzemionkowym przy pomocy mieszaniny chloroform-etanol o zmiennym stężeniu uzyskano (po krystalizacji z mieszaniny etanol-eter) żółty 2-amino-4-cyklopropyloamino-1-[2-(diizopropylofosfonylometoksy)etylo]pirymidyn-6-(1H)-on (1,6 g), który następnie poddawano działaniu bromotrimetylosilanu (5 ml) w acetonitrylu (50 ml) przez noc w i poddano podobnej obróbce.

Produkt oczyszczono chromatograficznie (Dowex 50) z wykorzystaniem wody i odparowano pod próżnią.

Pozostałości wykrystalizowano z wody i otrzymano 2-amino-4-cyklopropyloamino-1-[2-(fosfonylometoksy)etylo]pirymidyn-6-(1H)-on, nie ulegający stopieniu poniżej 290°C.

Wydajność 0,90 g.

Dla C10H17N4O5P (304,24) obliczono 39,48% C, 5,63% H, 18,42% N, 10,18% P; uzyskano 39,70% C, 5,78% H, 18,69% N, 10,32% P.

Widmo ¹³C NMR (D2O + NaOD): 173,71, 170,07 i 165,53 (C-2, C-4 i C6); 78,75 (C-5); 73,31 d, J (C, P) = 10,3 Hz (C-2'); 72,19 d, J (C, P) = 149,4 Hz (P-CH2); 69,14 (C-1'); 25,96 (N-CH); 9,43 (2 x

CH2 z grupy cyklopropylowej).

PL 207 187 B1

2-amino-4-metylo-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna i 2-amino-4-metylo-1-[2-(fosfonometo-ksy)etylo]pirymidyn-6-(1H)-on

2-chloroetoksymetylofosfonian diizopropylowy (15 ml, 62,5 mmol) dodano do mieszaniny 2-amino-6-hydroksy-4-metylopirymidyny (6,25 g, 50 mmol) i węglanu cezu (11,3 g, 25 mmol) w DMF (70 ml), które przed dodaniem była mieszana w temperaturze 100°C przez 1 godzinę. Następnie mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 100°C przez 14 godzin, odfiltrowano na gorąco i odparowano pod próżnią. Po ekstrakcji pozostałości z chloroformem i oczyszczaniu na kolumnie z żelem krzemionkowym (250 ml) otrzymano 2-amino-4metylo-6-[-2-(diizopropylofosfonylometoksy)etoksy]pirymidyny, którą wykrystalizowano z mieszaniny octan etylu-eter naftowy. Wydajność 5,75 g, Tt 72-73°C.

Dla C14H26N3O5P (347,35) obliczono 48,41% C, 7,54% H, 12,10% N, 8,92% P; uzyskano 48,70% C, 7,60% H, 12,32% N, 9,14% P.

Widmo ¹H NMR (CDCI3): 5,95 q, 1H, J = 0,6 Hz (H-5); 4,90 b, 2H (NH2); 4,76 dh, 2H, J (H, P) = 7,6 Hz oraz J (H, H) = 6,2 Hz (2 x OCH (iPr)); 4,42 m, 2H (2 x H-r); 3,90 m, 2H (2 x H-2'); 3,82 d, 2H, J (H, P) = 8,2 Hz (P-CH2); 2,26 d, 3H, J = 0,6 Hz (CH3); 1,34 d, 6H, J = 6,2 Hz i 1,33 d, 6H, J = 6,2 Hz (4 x CH3 (iPr)).

Widmo ¹³C NMR (CDCI3): 170,36, 168,27, i 162,48 (C-2, C-4 i C-6); 97,03 (C-5); 71,17 d, J (C, P) = 10,8 Hz (C-2'); 71,06 d, J (C,P) = 6,8 Hz (OCH (iPr)); 65,99 d, J (C, P) = 167,6 Hz (P-CH2); 64,60 (C-1'); 24,04 d, J (C, P) = 3,9Hz i 23,90 d, J (C, P) = 4,9 Hz (4 x CH3 (iPr)); 23,61 (CH3).

Otrzymany związek poddawano działaniu bromotrimetylosilanu (5 ml) i acetonitrylu (50 ml) przez noc w temperaturze pokojowej, po czym substancje lotne odparowano pod próżnią. Pozostałości rozpuszczono w wodzie (100 ml), a następnie dodano stężony wodny roztwór amoniaku do odczynu alkalicznego, po czym mieszaninę odparowano. Pozostałości dejonizowano na kolumnie (100 ml) zawierającej Dowex 50 x 8, a amoniakalny eluat absorbujący promieniowanie UV odparowano. Produkt w wodzie (20 ml) alkalizowano stężonym wodnym roztworem amoniaku i przeniesiono do kolumny (150 ml) zawierającej Dowex 1 x 2 (forma octanowa) wstępnie przepłukanej wodą. Kolumnę eluowano wodą, a następnie kwasem octowym o zmieniającym się stężeniu (0-0,4 M, 1 l każdy). Główną frakcję absorbującą promieniowanie UV odparowano, a pozostałości współoddestylowano z wodą (3 x 50 ml), a następnie wykrystalizowano z wody. Uzyskano 3,67 g 2-amino-4-metylo-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyny, Tt 245°C.

PL 207 187 B1

Dla C8H14N3O5P (263,19) obliczono 36,51% C, 5,36% H, 15,97% N, 11,77% P; uzyskano 36,65% C, 5,60% H, 15,69% N, 11,92% P.

Widmo ¹H NMR (D2O + NaOD): 6,13 s, 1H (H-5); 4,39 m, 2H (2 x H-1'); 3,92 m, 2H (2 x H-2'); 3,57 d, 2H, J (H, P) = 8,5 Hz (P-CH2); 2,26 d, 3H, (CH3).

Widmo ¹³C NMR (D2O + NaOD): 173,63, 172,80, i 165,50 (C-2, C-4 1 C-6); 98,75 (C-5); 73,09 d, J (C, P) = 10,2 Hz (C-2'); 72,06 d, J (C, P) = 149,4 Hz (P-CH2); 68,85 (C-1'); 25,42 (CH3).

W wyniku dalszej elucji z kolumny z żelem krzemionkowym i dalszej krystalizacji z mieszaniny octan etylu- eter naftowy uzyskano 2-amino-4-metylo-1-[2-(diizopropylofosfonylometoksy)etylo]pirymidyn-6-(1H)-on (4,2 g), Tt 88°C.

Dla C14H26N3O5P (347,35) obliczono 48,41% C, 7,54% H, 12,10% N, 8,92% P; uzyskano 48,49% C, 7,62% H, 12,30% N, 9,08% P.

Widmo ¹H NMR (CDCI3): 5,79 q, 1H, J = 0,8 Hz (H-5); 5,62 b, 2H (NH2); 4,72 dh, 2H, J (H, P) = 7,6 Hz oraz J (H, H) = 6,2 Hz (2 x OCH (iPr)); 4,20 m, 2H (2 x H-1'); 3,90 m, 2H (2 x H-2'); 3,74 d, 2H, J (H, P) = 8,6 Hz (P-CH2); 2,12 d, 3H, J = 0,8 Hz (CH3); 1,32 d, 6H, J = 6,2 Hz i 1,29 d, 6H, J = 6,2 Hz (4 x CH3 (iPr)).

Widmo ¹³C NMR (CDCI3): 164,33, 162,93, i 156,37 (C-2, C-4 i C-6); 102,22 (C-5); 72,88 d, J (C, P) = 11,7 Hz (C-2'); 71,27 d, J (C, P) = 6,8 Hz (OCH (iPr)); 66,17 d, J (C, P) = 168,1 Hz (P-CH2); 43,06 (C-1'); 23,97 d, J (C, P) = 3,9 Hz i 23,91 d, J (C, P) = 4,9 Hz (4 x CH3 (iPr)); 23,64 (CH3).

Otrzymany produkt poddano analogicznie działaniu bromotrimetylosilanu (5 ml) w acetonitrylu (50 ml) i uzyskano, po oczyszczeniu chromatograficznym, dejonizowanej mieszaniny przy zastosowaniu Dowex 1 x 2 i krystalizacji z wody, 2-amino-4-metylo-1-[2-(fosfonometoksy)etylo)pirymidyn-6-(1H)-on. Wydajność 2,3 g, Tt 283°C.

Dla C8H14N3O5P (263,19) obliczono 36,51% C, 5,36% H, 15,97% N, 11,77% P; uzyskano 36,40% C, 5,23% H, 15,77% N, 12,00% P.

Widmo ¹H NMR (D2O + NaOD): 5,77 s, 1H (H-5); 4,18 t, 2H, J = 5,3 Hz (2 x H-1'); 3,82 t, 2H, J = 5,3 Hz (2 x H-2'); 3,50 d, 2H, J (H, P) = 8,7 Hz (P-CH,); 2,12 s, 3H, (CH3).

Widmo ¹³C NMR (D2O + NaOD): 169,48, 168,32 i 160,25 (C-2, C-4 i C-6); 102,40 (C-5); 73,17 (C-2'); 72,55 d, J (C, P) = 142,0 Hz (P-CH,); 45,60 (C-1'); 25,43 (CH3).

P r z y k ł a d 9

PL 207 187 B1

4-amino-2-metylosuIfanylo-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna 2-hydroksyetylofosfonian dietylowy (5,3g, 25 mmol) w DMF (40 ml) poddano działaniu NaH (1,0 g,

60% dyspersja w oleju parafinowym) w temperaturze 0°C, a następnie po 1 godzinie mieszania w temperaturze 0°C dodano w jednej porcji 4-amino-6-chloro-2-metylosulfanylopirymidynę (3,5 g, 20 mmol). Mieszaninę mieszano przez 16 godzin w temperaturze 100C, odparowano pod próżnią i ekstrahowano gorącym chloroformem (300 ml). Ekstrakt odparowano pod próżnią, a pozostałości poddawano działaniu bromotrimetylosilanu (10 ml) w acetonitrylu (50 ml) przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę odparowaniu pod próżnią, do pozostałości dejonizowano w kolumnie (100 ml) zawierającej Dowex 50 x 8. Główną frakcję absorbującą promieniowanie UV odparowano pod próżnią. Ten produkt w wodzie (20 ml) rozpuszczono przez dodanie stężonego wodnego roztworu amoniaku i zakwaszenie HCl do pH 3-3,5. Osad zebrano, przemyto wodą, etanolem i wysuszono pod próżnią. Uzyskano 0,8 g 4-aminometylosulfanylo-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyny, Tt 210-211°C.

Dla C8H14N3O5PS (294,19) obliczono 32,54% C, 4,78% H, 14,23% N, 10,49% P, 10,86% S; uzyskano 32,42% C, 4,93% H, 14,07% N, 10,62% P, 11,04% S.

Widmo ¹H NMR (D2O): 5,68 s, 1H (H-5); 4,36 m, 2H, (2 x H-1'); 3,94 m, 2H, (2 x H-2'); 3,72 d, 2H, J (H, P) = 8,5 Hz (P-CH2); 2,48 s, 3H, (SCH3).

Widmo ¹³C NMR (D2O): 173,70, 172,13 i 167,93 (C-2, C-4 i C-6); 84,82 (C-5); 73,53 d, J (C, P) = 10,7 Hz (C-2'); 70,01 d, J (C, P) = 156,3 Hz (P-CH2); 69,20 (C-1'); 16,02 (SCH3).

P r z y k ł a d 10

2-amino-4,6-bis-[2-(fosfonometoksy)etoksyjpirymidyna i 2-amino-4-[2-(fosfonometoksy)etoksy]-1-[2-(fosfonometoksyetoksy)etylo]pirymidyn-6-(1H)-on

2-amino-4,6-dihydroksypirymidynę (12,7 g, 0,1 mol) oraz węglan cezu (27,8 g, 85 mmol) w DMF (200 ml) mieszano w temperaturze 100°C przez 1 godzinę i dodano 2-chloroetoksymetylofosfonianu diizopropylowego (30 ml). Mieszaninę mieszano w temperaturze 100°C przez 16 godzin, odfiltrowano na gorąco i odparowano pod próżnią. Pozostałości oczyszczono chromatograficznie w kolumnie z żelem krzemionkowym (200 ml) w wyniku czego uzyskano 2,8 g oleistych pozostałości, które następnie

PL 207 187 B1 poddano działaniu bromotrimetylosilanu (7 ml) w acetonitrylu (50 ml) przez noc w temperaturze pokojowej. Pozostałości rozpuszczono w wodzie (100 ml) dodano stężonego wodnego roztworu amoniaku do odczynu alkalicznego, a następnie mieszaninę odparowano. Pozostałości dejonizowano w kolumnie (100 ml) zawierającej Dowex 50 x 8, po czym główną frakcję absorbującą promieniowanie UV odparowano. Produkt ten współoddestylowano z etanolem i odfiltrowano od etanolu. Uzyskano 1,4 g 2-amino-4,6-bis[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyny, Tt 127°C.

Dla C10H19N3O10P2 (403,22) obliczono 29,27% C, 4,75% H, 10,42% N, 15,36% P; uzyskano 29,90% C, 4,87% H, 10,24% N, 15,64% P.

Widmo ¹H NMR (DMSO): 6,55 b, 2H (NH2); 5,36 s, 1H (H-5); 4,29 m, 2H, (2 x H-1'); 3,76 m, 2H, (2 x H-2'); 3,58 d, 2H, J (H, P) = 8,6 Hz (P-CH2).

Widmo ¹³C NMR (DMSO): 171,30 (C-4, C-6); 162,76 (C-2); 78,60 (C-5); 70,70 d, J (C, P) = 11,7 Hz (C-2'); 66,86 d, J (C, P) = 160,2 Hz (P-CH2); 64,81 (C-1').

W wyniku elucji chloroformem uzyskano gęsty olej (4,8 g), który poddawano dzia łaniu bromotrimetylosilanu (10 ml) i acetonitrylu (70 ml) przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie odparowano pod próżnią. Pozostałości przepuszczono przez kolumnę zawierającą Dowex 50 x 8 (forma H⁺) (150 ml), przy czym kolumnę eluowano wodą. Po wypłukaniu kwasów nieorganicznych, uzyskano produkt z retencją. Frakcje te odparowano, a pozostałości mieszano z mieszaniną etanol-aceton (1:1, 100 ml). Produkt barwy żółtej odfiltrowano, przemyto eterem i wysuszono. Uzyskano 1,8 g 2-amino-4-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyn-6-(1H)-onu. Tt 108°C.

P r z y k ł a d 11

(a) 2,4-diamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna

Wodorek sodu (60% zawiesina w oleju parafinowym) (2,4 g, 60 mmol) dodawano ostrożnie porcjami do przedestylowanego glikolu etylenowego (50 ml) z wyłączeniem wilgoci, aż do rozpuszczenia. Następnie dodano w jednej porcji 2,4-diamino-6-chloropirymidynę (2,89 g, 20 mmol), a mieszaninę mieszano przez 6 godzin w temperaturze 80°C. Następnie mieszaninę reakcyjną ochłodzono, rozcieńczono wodą (200 ml) i przepuszczono przez kolumnę (200 ml) zawierającą Dowex 50 x 8 w cyklu kwasowym. Kolumnę przemyto wodą (1 l), a następnie żywicę zawieszono w wodzie (300 ml). Zawiesinę alkalizowano stężonym wodnym roztworem amoniaku, przefiltrowano, a żywicę przemyto wrzącą wodą (1 l). Połączone przesącze odparowano, a pozostałości krystalizowano z wody uzyskując 2,4-diamino-6-(-2-hydroksyetoksy)pirymidynę, Tt 190°C. Wydajność 2,3 g (79,4%).

Dla C6H10N4O2 (170,18) obliczono 42,34% C, 5,92% H, 30,37% N; uzyskano 42,09% C, 5,89% H, 30,63% N.

Widmo masowe 171,3 (MH⁺).

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 3,67 br q, 2H J (CH2, CH2) ~ J (CH2, OH) = 4,8 (O-CH2); 4,10 t, 2H, J (CH2, CH2) = 5,0 (O-CH2); 4,79 t, 1H, J (OH, CH2) = 4,5 (OH); 5,05 s, 1H (H-5); 5,89 br s, 2H 16,01 br s, 2H (NH2).

PL 207 187 B1

Otrzymany związek (4,25 g, 25 mmol) i p-toluenosulfonylooksymetylofosfonian diizopropylowy (8,75 g, 25 mmol) w DMF (50 ml) poddawano działaniu 60% NaH (3,5 g, 3,5 równoważników). Mieszaninę mieszano w temperaturze otoczenia przez 3 dni, po czym kroplami dodano kwas octowy (4 ml). Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, a pozostałości ekstrahowano chloroformem. Produkt reakcji oczyszczono chromatograficznie na kolumnie z żelem krzemionkowym i uzyskano, po krystalizacji z mieszaniny octanu etylu i eteru naftowego 2,4-diamino-6-[2-(diizopropylofosfonylometoksy)-etoksy]pirymidynę, Tt 159°C. Wydajność 6,45 g (74%).

Dla C13H25N4O5P (348,3) obliczono 44,83% C, 7,23% H, 16,08% N, 8,89% P; uzyskano 44,86% C, 7,15% H, 16,21% N, 9,05% P.

Widmo masowe 349,3 (MH⁺). Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3) jest identyczne z tym uzyskanym w przykł adzie 1. Przekształcenie tego zwią zku w 2,4-diamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidynę przeprowadzono zasadniczo tak jak w przykładzie 1 i uzyskano związek identyczny z materiałem autentycznym, co potwierdziły widma NMR i masowe.

(b) 2,4-diamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna

Reakcję przeprowadzono zasadniczo tak jak to opisano w podpunkcie (a) z takim wyjątkiem, że NaH został zastąpiony przez tą samą ilość moli t-butanolanu potasu (t-butatlenku potasu). Wydajność 2,4-diamino-6-(2-hydroksyetoksy)pirymidyny wynosiła 81%. Pozostała część procedury pozostała niezmieniona.

P r z y k ł a d 12

Tr- (C6H5)3C

Ts - grupa p-toluenosulfonylowa iPr - grupa izopropylowa

PL 207 187 B1 (a) 2,4-diamino-6-[(RS)-3-hydroksy-2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyna

4-hydroksymetylo-2,2-dimetylo-1,3-dioksolan (13,2 g, 0,1 mol) w świeżo przedestylowanym tetrahydrofuranie (100 ml) dodawano kroplami do zawiesiny NaH (0,2 mol) w tetrahydrofuranie (400 ml). Mieszaninę mieszano aż do rozpuszczenia po czym dodano 2,4-diamino-6-chloropirymidynę (14,46 g, 0,1 mol). Mieszaninę reakcyjną destylowano pod chłodnica zwrotną, mieszając, w atmosferze argonu przez 12 godzin, po czym zobojętniono kwasem octowym. Zawiesinę odfiltrowano, przemyto tetrahydrofuranem, a przesącz odparowano pod próżnią. W wyniku oczyszczania na kolumnie (300 ml) z żelem krzemionkowym przy wykorzystaniu chloroformu, uzyskano, po krystalizacji z mieszaniny octanu etylu i eteru naftowego, 2,4-diamino-6-[2,2-dimetylo-1,3-dioksolanylo-5-metoksy]pirymidynę, Tt 128°C. Wydajność 16,0 g (66,6%).

Dla C10H16N4O3 (240,3) obliczono 49,99% C, 6,71% H, 23,32% N; uzyskano 49,95% C, 6,84% H, 23,05% N. Widmo masowe 241,3 (MH⁺).

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 1,27 s, 3H i 1,33 s, 3H (CH3); 3,68 dd, 1H J (3'b, 2') = 6,2, J (gem) = 8,3 (H-3'b); 4,02 dd, 1H J (3'a, 2') = 6,6, J (gem) = 8,3 (H-3'a); 4,19 m, 2H (H-1'a); 4,10 dd, 1H, J (1'b, 2') = 6,0, J (gem) = 11,0, (H-1'b); 4,13 dd, 1H, J (1'a, 2') = 5,0, J (gem)= 11,0 (H-1'a); 4,30 m, 1H (H-2'); 5,06 s, 1H (H-5); 5,94 br s, 2H i 6,06 br s, 2H (NH2).

Widmo ¹³C NMR (CD3SOCD3): 25,75 i 26,94 (CH3); 65,72 (C-3'); 66,22 (C-1'); 74,00 (C-2'); 76,58 (C-5); 109,06 (CiPr), 163,23 i 166,38 i 170,11 (C-6,C-2,C-4).

Otrzymany związek (14,4 g, 60 mmol) w 0,25 M H2SO4 (250 ml) pozostawiono na noc w temperaturze pokojowej. Mieszaninę zobojętniono nasyconym roztworem wodorotlenku baru, odfiltrowano, a przesącz odparowano. Pozostałości rekrystalizowano z 90% etanolu (dodano eter do zmętnienia) i otrzymano 2,4-diamino-6-(2,3-dihydroksypropoksy)pirymidynę, Tt 160°C. Wydajność 10,0 g (83,3%).

Dla C7H12N4O3 (200,2) obliczono 42,00% C, 6,04% H, 27,99% N; uzyskano 41,84% C, 6,24% H, 28,06% N. Widmo masowe 201,2 (MH⁺).

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 3,40 d, 2H, J (3', 2') = 5,4 (H-3'); 3,72 m, 1H (H-2); 4,01 dd, 1H J (1'b, 2') = 6,2, J (gem) = 10,9 (H-1'b); 4,10 dd, 1H J (1'a, 2') = 4,4, J (gem) = 10,9 (H-1'a); 4,73 br s, 1H i 5,02 br s, 1H (OH); 5,09 s, 1H (H-5); 5,99 br s, 2H i 6,07 br s, 2H (NH2).

Widmo ¹³C NMR (CD3SOCD3): 63,14 (C-3'); 67,16 (C-1'); 70,28 (C-2'); 76,64 (C-5); 163,19 i 166,27 (C-2,C-4); 170,62 (C-6).

Mieszaninę tego związku (8,0 g, 40 mmol), chlorku trytylu (36,4 g, 131 mmol) oraz 4-dimetyloaminopirydyny (2 g) w pirydynie (160 ml) mieszano przez 15 godzin w 50°C, po czym przelano powoli, wciąż mieszając, do wody (2 l). Zawiesinę mieszano przez godzinę, zdekantowało i po mieszaniu ze świeżą porcją wody (2 l) odfiltrowano i przemyto wodą. Osad przeniesiono do chloroformu (600 ml), wysuszono nad MgSO4, odparowano, a następnie współ-oddestylowano z toluenem (3 x 100 ml) pod próżnią. Uzyskaną żywicę rozpuszczono w minimalnej ilości eteru i wkroplono szybko mieszając do eteru naftowego (1 l). Osad odfiltrowano, przemyto eterem naftowym i wysuszono. Uzyskano 33,4 g (91,5%) 6-[2-hydroksy-3-(trytyloksy)propoksy]-2,4-bis(trytyloamino)pirymidyny, Tt 138°C.

Dla C64H54N4O3 (911,1) obliczono 6,15% N; uzyskano 5,96% N. Tą pochodną trytylową (27,3 g, 30 mmol) oraz p-toluenosulfonyloksymetylofosfonian diizopropylowy (15,75 g, 45 mmol) w tetrahydrofuranie (300 ml) poddawano działaniu 60% NaH (5,4 g, 3,5 równoważnika). Mieszaninę mieszano w temperaturze otoczenia przez 3 dni, po czym zobojętniono kwasem octowym. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, pozostałości rozpuszczono w octanie etylu (800 ml) i ekstrahowano wodą (3 x 200 ml). Fazę organiczną odparowano, a pozostałości destylowano pod chłodnicą zwrotną w 80% roztworze wodnym kwasu octowego (300 ml) przez 30 minut, ochłodzono i odparowano pod próżnią. Następnie dodano wody (300 ml), po czym mieszaninę ekstrahowano eterem (4 x 100 ml). Z fazy wodnej usunięto substancje lotne przy pomocy próżni i wprowadzono do kolumny zawierającej Dowex 50 x 8 (200 ml) w formie kwasowej. Kolumnę przemywano wodą aż do spadku kwasowości i absorbancji UV, po czym eluowano 2,5% wodnym roztworem amoniaku. Amoniakalny eluat absorbujący promieniowanie UV zebrano i odparowano pod próżnią, a pozostałości współoddestylowano z etanolem (3 x 100 ml) i wysuszono nad P2O5 pod próżnią przez noc. Dodano acetonitrylu (100 ml) i bromotrimetylosilan (30 ml), a mieszaninę odseparowaną od wilgoci pozostawiono na noc. Po odparowaniu substancji lotnych pod próżnią do pozostałości dodano wodę (200 ml), a następnie stężony wodny roztwór amoniaku do odcz3mu alkalicznego. Roztwór odparowano, a pozostałości dejonizowano na kolumnie (200 ml) zawierającej Dowex 50 x 8 w zasadniczo podobnych warunkach. Amoniakalny eluat absorbujący promieniowanie UV odparowano pod próżnią, a pozostałości rozpuszczono w minimalnej ilości gorącej wody i alkalizowano amoniakiem do pH 10. Roztwór przeniesiono do kolumny (200 ml) zawierającej

PL 207 187 B1

Dowex 1 x 2 (forma octanowa) wstępnie przepłukanej wodą. Kolumnę przemywano wodą aż do spadku absorbancji UV eluatu, a następnie kwasem octowym o zmieniającym się stężeniu (0-0,3 M, 1,5 l każdy). Główną frakcję absorbującą promieniowanie UV zebrano i odparowano pod próżnią, a pozostałości współoddestylowano z wodą (2 x 100 ml). Po krystalizacji z wody uzyskano 2,4-diamino-6-[(RS)-3-hydroksy-2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidynę w formie jednowodzianu. Wydajność 3,8 g (40,6%), białe igiełki, Tt 213°C.

Dla C8H15N4O6P · H2O (312,2) obliczono 30,78% C, 5,49% H, 17,94% N, 9,92% P; uzyskano 30,98% C, 5,52% H, 17,99% N, 9,82% P. Widmo masowe 295.0 (MH⁺).

Widmo ¹H NMR (D2O + NaOD): 3,48 dd, 1H, J (P, CHb) = 9,8, J (gem) = 12,1 (P-CHb); 3,59 dd, J (P, CHa) = 8,9, J (gem) = 12,1 (P-CHa); 3,61 dd, 2H (H-2'); 3,92 m, 2 H (H-2'); 4,06 dd, 1H (1'b, 2) = 5,5, J (gem) = 10,5 (H-1'b); 4,14 dd, 1H, J (3'b, 2') = 6,8, J (gem) = 12,9 (H-3'b); 3,70 m, 1H (H-2'); 3,71 dd, 1H, J (3'a, 2') = 3,6 J (gem) = 12,9 (H-3'a); 4,11 dd, 1H, J (1'b, 2') = 5, J (gem) = 10,7 (H-1'b); 4,14 d, 1H, J (1'a, 2') = 4,6, J (gem) = 10,7 (H-1'a); 5,36 s, 1H (H-5).

Widmo ¹³C NMR (D2O): 60,62 (C-3'); 65,58 (C-1'); 68,03 d, J (P, C) = 149,4 (P-C); 76,63 (C-5); 79,89 d, J (P, C) = 10,7 (C-2'), 162,63 i 166,54 (C-2,C-4); 170,78 (C-6).

(b) 2,4-diamino-6-[(S)-3-hydroksy-2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyna (S)-2,2-dimetylo-4-hydroksymetylo-1,3-dioksolan (40 g, 0,3 mol) przygotowany świeżo z 1,2:5,6-diizopropylideno-D-mannitolu i przedestylowany pod próżnią dodano kroplami do zawiesiny NaH (0,3 mol) w tetrahydrofuranie (600 ml). Mieszaninę mieszano przez 30 minut, po czym dodano 2,4-diamino-6-chloropirydynę (36,2 g, 0,25 mol). Mieszaną mieszaninę reakcyjną destylowano pod chłodnicą zwrotną w atmosferze argonu przez 12 godzin, po czym zobojętniono kwasem octowym. Osad odfiltrowano, przemyto tetrahydrofuranem, a przesącz odparowano pod próżnią. Po oczyszczaniu na kolumnie z żelem krzemionkowym (600 ml) przy wykorzystaniu chloroformu oraz krystalizacji z mieszaniny octanu etylu i eteru naftowego uzyskano 2,4-diamino-6-(S)-(2,2-dimetylo-1,3-dioksolan-4-ylometoksy) pirymidynę. Wydajność 46,0 g (76,6%). Związek ten (43,3 g, 0,18 mol) w 0,25 M H2SO4 (800 ml) pozostawiono na noc w temperaturze pokojowej. Mieszaninę zobojętniono nasyconym roztworem wodorotlenku baru, odfiltrowano, a przesącz odparowano. Po krystalizacji pozostałości z 90% etanolu (eter dodano do zmętnienia) uzyskano 2,4-diamino-6-(S)-(2,3-dihydroksypropoksy)pirymidynę, Tt 149°C. Wydajność 32,0g (89%). Dla C7H12N4O3 (200,2) obliczono 42,00% C, 6,04% H, 27,99% N; uzyskano 41,94% C, 6,35% H, 27,75%. Widmo masowe 201,2 (MH⁺). Widma NMR były identyczne z tymi uzyskanymi dla mieszaniny racemicznej. Mieszaninę otrzymanego związku (32,0 g, 0,16 mmol), chlorku trytylu (140 g, 0,5 mol) 4-dimetyloaminopirydyny (3 g) w pirydynie (500 ml) mieszano przez 24 godziny w temperaturze 80°C, po czym przelano powoli, wciąż mieszając, do wody (5 l). Osad mieszano przez 1 godzinę, zdekantowało i po mieszaniu w świeżej porcji wody (2 l) przefiltrowano i przemyto wodą. Osad wytrącono w chloroformie (2 l) i wysuszono nad MgSO4, odparowano i współoddestylowano z toluenem (3 x 200 ml) pod próżnią. Uzyskaną żywicę rozpuszczono w minimalnej objętości eteru i wkroplono energicznie mieszając do eteru naftowego (2,5 l). Osad odfiltrowano, przemyto eterem naftowym i wysuszono na powietrzu przez noc. Po wysuszeniu pod próżnią uzyskano 99,5 g (69%) 6-(S)-[2-hydroksy-3-(trytyloksy)propoksy]-2,4-bis(trytyloamino)pirymidyny.

Dla C64H54N4O2 (911,1) obliczono 6,15% N, uzyskano 5,96% N. Tą pochodną trytylową (99,5 g, 0,11 mol) i p-toluenosulfonyloksymetylofosfonian diizopropylowy (42 g, 0,12) w świeżo wysuszonym tetrahydrofumie (600 ml) poddano działaniu 60% NaH (14,4 g, 0,36 mol). Mieszaninę mieszano w temperaturze otoczenia przez 3 dni, przefiltrowano przez wkładkę celitową, a przesącz poddano działaniu etanolu (20 ml). Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, a osad destylowano pod chłodnicą zwrotną w 80% roztworze wodnym kwasu octowego (500 ml) przez 30 minut, po czym pozostawiono na noc w temperaturze otoczenia. Krystaliczny produkt odfiltrowano, przemyto 80% kwasem octowym, a przesącz odparowano pod próżnią. Dodano wodę (700 ml) po czym mieszaninę ekstrahowano eterem (4 x 200 ml). Fazę wodną zatężono pod próżnią i przeniesiono do kolumny zawierającej Dowex 50 x 80 w formie kwaśnej (250 ml). Kolumnę przemywano 20% wodnym roztworem metanolu aż do spadku kwasowości i absorbancji UV, po czym eluowano 2,5% amoniakiem w 20% wodnym roztworze metanolu. Amoniakalny eluat absorbujący promieniowanie UV zebrano i odparowano pod próżnią, a pozostałości współoddestylowano z etanolem (3 x 100 ml) i wysuszono nad P2O5 pod próżnią przez noc. Dodano acetonitrylu (200 ml) i bromotrimetylosilan (50 ml), a mieszaninę odseparowaną od wilgoci pozostawiono na noc. Po odparowaniu substancji lotnych pod próżnią do pozostałości dodano wodę (300 ml), a następnie stężony wodny roztwór amoniaku do odczynu alkalicznego. Roztwór odparowano, a pozostałości dejonizowano na kolumnie (250 ml) zawierającej Dowex 50 x 8 w identyczPL 207 187 B1 nych warunkach. Amoniakalny eluat absorbujący promieniowanie UV odparowano pod próżnią, a pozostałości rozpuszczono w minimalnej ilości gorącej wody i alkalizowano amoniakiem do pH 10. Roztwór przeniesiono do kolumny (250 ml) zawierającej Dowex 1 x 2 (forma octanowa) wstępnie przepłukanej wodą. Kolumnę przemywano wodą aż do spadku absorbancji UV eluatu, a następnie kwasem octowym o zmieniającym się stężeniu (0-0,3 M, 2 l każdy). Główną frakcję absorbującą promieniowanie UV odparowano pod próżnią, a pozostałości współoddestylowano z wodą (2 x 100 ml). Po rekrystalizacji z wody uzyskano 2,4-diamino-6-(S)-[3-hydroksy-2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidynę w formie jednowodzianu. Wydajność 13,8 g (40%), biał e igiełki, Tt.

Dla C8H15N4O6P · H2O (312,2) obliczono 30,78% C, 5,49% H, 17,94% N, 9,92% P; uzyskano 31,00% C, 5,70% H, 17,79% N, 9,75% P. Widmo masowe 295,0 (MH⁺).

Widma NMR były identyczne z tymi uzyskanymi dla mieszaniny racemicznej.

P r z y k ł a d 13

Tr- (C6H5)3C

Ts - grupa p-toluenosulfonylowa iPr - grupa izopropylowa

PL 207 187 B1

2-amino-4-hydroksy-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna

4-hydroksymetylo-2,2-dimetylo-1,3-dioksolan (15 ml, 0,12 mol) dodawano kroplami przez ponad 30 minut do mieszanej zawiesiny NAH (60% dyspersja w oleju parafinowym, 4,8 g, 0,12 mol) w tetrahydrofuranie (250 ml). Po godzinie mieszania w temperaturze pokojowej dodano 2-amino-4,6-dichloropirymidynę (16,4 g, 0,1 mol), a mieszaninę utrzymywano w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną do zaniknięcia materiału wyjściowego (sprawdzane przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej na płytkach z żelem krzemionkowym; mieszanina metanol-chloroform, 1:9). Mieszaninę ochłodzono, zobojętniono dodatkiem kwasu octowego, przefiltrowano przez wkładkę celitową, przemyto tetrahydrofuranem i odparowano pod próżnią. Pozostałości zdekantowano dwukrotnie z eterem (100 ml każdy), rozpuszczono w chloroformie (100 ml) i przefiltrowano przez krótką kolumnę z żelem krzemionkowym (przemywaną 1 l chloroformu). Przesącz odparowano pod próżnią, a pozostałości rozpuszczono w gorącym octanie etylu, do ciepłego roztworu dodano ostrożnie identyczną objętość eteru, a następnie eter naftowy do uzyskania zmętnienia. Produkt wykrystalizowany w lodówce zebrano przez filtrację, przemyto mieszaniną eteru i eteru naftowego (1:1) i wysuszono pod próżnią. Uzyskano 20,5 g (79%) 2-amino-4-chloro-6-[2,2-dimetylo-1,3-dioksolano-4-ylometoksy]pirymidyny, Tt 152°C.

Dla C10H14CIN3O3 (259,7) obliczono 46,25% C, 5,43% H, 13,65% Cl, 16,18% N; uzyskano 46,45% C, 5,46% H, 13,90% Cl, 15,95% N.

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 1,28 s, 3H i 1,33 s, 3H (CH3); 3,71 dd, 1H, J (3'b, 2') = 6,1, J (gem) = 8,4 (H-3'b); 4,05 dd, 1H, J (3'a, 2') = 6,6, J (gem) = 8,4 (H-3'a); 4,22 dd, 1H J (1'b, 2') = 6,3, J (gem) = 1,2 (H-1'b); 4,28 dd, 1H J (1'a, 2') = 4,5, J (gem) = 11,2 (H-1'a); 4,35 m, 1H (H-2'); 6,10 s, 1H (H-5); 7,08 br s, 2H (NH2).

Widmo ¹³C NMR (CD3SOCD3): 25,48 i 26,76 (CH3); 65,82 i 66,84 (C-1', C-3'); 73,35 (C-2'); 94,48 (C-5); 109,05 (Cipr); 160,21 (C-2); 162,95 (C-4); 170,48 (C-6).

Mieszaninę otrzymanego związku (13 g, 50 mmol), DABCO (12 g) i K2CO3 (21,5 g) w wodzie (300 ml) mieszano przez 3 godziny w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej dodano porcjami Dowex 50 x 8 (forma kwasowa) w trakcie mieszania do uzyskania pH ok., do rozpuszczenia węglanu i zobojętnienia DABCO. Następnie lekko zalkalizowano zawiesinę poprzez dodanie stężonego wodnego roztworu amoniaku, przefiltrowano, przemyto wodą, a przesącz odparowano pod próżnią. Żywicę zawieszono ponownie w rozcieńczonym (1:20) wodnym roztworze amoniaku (300 ml), przefiltrowano i następnie przemyto żywicę wrzącą wodą (4 x 200 ml). Przesącz i roztwory użyte do przemywania odparowano pod próżnią. Pozostałości wysuszono poprzez destylację z etanolem i ekstrahowano chloroformem. Półkrystaliczny stały produkt odfiltrowano, przemyto chloroformem i zaadsorbowano z roztworem metanolowego na żelu krzemionkowym (50 ml). Otrzymany materiał przeniesiono w chloroformie do krótkiej kolumny (150 ml) i eluowano mieszaniną chloroform-metanol (9:1). Po krystalizacji z etanolu (dodano eter do uzyskania zmętnienia) uzyskano 2-amino-4-hydroksy-6-[2,2-dimetylo-1,3-dioksolan-4-ylo)metoksy]pirymidynę, Tt 258°C. Wydajność 8,2 g (68%).

Dla C10H15C3O4 (241,2) obliczono 46,25% C, 5,43% H, 13,65% Cl, 16,18% N; uzyskano 46,45% C, 5,46% H, 13,90% Cl, 15,95% N.

Widmo masowe 242 (M + H).

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 1,27s, 3H i 1,32 s, 3H (CH3); 3,67 dd, 1H, J (3'b, 2') = 6,2, J (gem) = 8,4 (H-3'b); 4,02 dd, 1H, J (3'a, 2') = 6,6, J (gem) = 8,4 (H-3'a); 4,05 dd, 1H J (1'b, 2') = 6,1, J (gem) = 11,0 (H-1'b); 4,10 dd, 1H J (1'a, 2') = 4,6, J (gem) = 11,0 (H-1'a); 4,30 qd, 1H J (1'a, 2') = 4,6, J (2', 1') ~ J (2', 3') = 6,3 (H-2'); 4,78 s, 1H (H-5); 6,67 br s, 2H (NH2).

Widmo ¹³C NMR (CD3SOCD3): 25,54 i 26,78 (CH3); 65,83 (C-3'); 66,70 (C-1'); 73,63 (C-2'); 79,99 (C-5); 108,94 (Cipr,); 164,25 i 155,69 (C-2, C-6).

P r z y k ł a d 14

2-amino-6-[2-diizopropyIofosfonylometoksy)etoksy]-4-hydroksypirymidyna

Mieszaninę 2-amino-4-chloro-6-[2-diizopropylofosfonylometoksy)etoksy]pirymidyny (5,7 g), DABCO (3,6 g) i K2CO3 (9,0 g) w wodzie (100 ml) mieszano przez 150 minut w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną, ochłodzono i zakwaszono przy pomocy Dowex 50 x 8 (forma H⁺). Następnie zawiesinę zalkalizowano stężonym wodnym roztworem amoniaku, po 5 minutach mieszania przefiltrowano, a żywicę przemyto 50% wodnym roztworem metanolu (200 ml). Przesącz odparowano pod próżnią, dodano etanolu (50 ml), po czym mieszaninę odparowano. W wyniku oczyszczania chromatograficznego na kolumnie z żelem krzemionkowym (150 ml) przy wykorzystaniu mieszaniny chloroPL 207 187 B1 form-metanol o zmiennym stężeniu składników uzyskano 2-amino-6-[2-diizopropylofosfonylometoksy)etoksy]-4-hydroksypirymidynę, Tt 154°C z wydajnością 78%.

Dla C13H24C3O6P (349,3) obliczono 44,70% C, 6,92% H, 12,03% N, 8,37% P; uzyskano 44,58% C, 7,02% H, 11,95% N. 8,53% P.

Widmo ¹H NMR (CD3SOCD3): 1,24 d, 6H i 1,23 d, 6H J (CH3, CH) = 6,2 (4 x CH3); 3,74 m, 2H, (H-2'); 3,76 d, J (CH2-P) = 8,3 (CH2-P); 4,19 m, 2H (H-1'); 4,59 m, 2H (P-OCH); 4,75 s, 1H (H-5); 6,65 bs, 2H, 2H (NH2); 10,45 s, 1H (OH).

Widmo ¹³C NMR (CD3SOCD3): 23,87 d, 2C J (CH3, P) = 4,9 i 24,01 d, 2C, J (P, C)-3,9 (CH3); 65,03 d, J (P, C) = 164,6 (P-C); 65,04 (C-1'); 70,37 d, 2C J (P, C) = 6,3 (P-OC); 70,87 d, J (P, C) = 11,7 (C-2'); 79,95 (C-5); 155,68 (C-4); 164,25 (C-2); 171,01 (C-6).

Otrzymany produkt poddawano działaniu bromotrimetylosilanu (10 ml) w acetonitrylu (80 ml) przez noc, odparowano pod próżnią, a do pozostałości dodano wody (50 ml). Po 10 minutach dodano stężony wodny roztwór amoniaku do odczynu alkalicznego, a następnie mieszaninę odparowano. Pozostałości dejonizowano na kolumnie (100 ml) zawierającej Dowex 50 x 8, a amoniakalny eluat absorbujący promieniowanie UV odparowano. Osad rozpuszczono w minimalnej ilości gorącej wody poprzez dodanie stężonego wodnego roztworu amoniaku i zakwaszono stężonym HCl do pH 3-3,5. Zebrano osad, przemyto wodą, etanolem i wysuszono pod próżnią. Wydajność 0,7g, Tt 227°C.

Dla C7H12N3O6P (265,16) obliczono 31,71% C, 4,56% H, 15,85% N, 11,68% P; uzyskano 31,55%C, 4,62%H, 16,15% N, 11,51% P.

P r z y k ł a d 15

2,4-diamino-5-bromo-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna 2,4-diamino-6-[2-diizopropylofosfonylometoksy)etoksy]pirymidynę (4,3 g, 12,3 mmol) w DMF (40 ml) mieszano z roztworem bromu w CCU (0,3 M, 50 ml) przez 3 godziny w temperaturze otoczenia, po czym alkalizowano trietyloaminą i odparowano. Surowy produkt oczyszczono na kolumnie z żelem krzemionkowym (150 ml) przy pomocy układu chloroform - etanol, a nastę pnie wykrystalizowano z mieszaniny octan etylu - eter naftowy. Uzyskano 3,9 g (11,9 mmol) dwusteru, który poddawa34

PL 207 187 B1 no działaniu bromotrimetylosilanu (20 ml) w acetonitrylu (50 ml) przez noc, po czym odparowano i roztworzono w mieszaninie amoniak-woda. Po dejonizacji w kolumnie zawierającej Dowex 50 (100 ml), pozostałości eluatu amoniakalnego oczyszczono chromatograficznie na kolumnie zawierającej Dowex 1 x 2 (100 ml) przy pomocy kwasu octowego o zmiennym stężeniu (0-0,5 M, 1 l każdy). Główną frakcję odparowano i wykrystalizowano z wody by uzyskać 3,1 g (84%) tytułowego związku, Tt 218°C.

Dla C7H12BrN4O5P (343,07) obliczono 24,51% C, 3,53% H, 23,29% Br, 16,33% N, 9,03% P; uzyskano 24,56% C, 3,55% H, 23,51% Br, 16,07% N, 8,89% P.

Reakcję tę powtórzono z 2-amino-6-[2-diizopropylofosfonyłometoksy)etoksy]-4-hydroksypirymidyną w celu uzyskania związku analogicznego podstawionego fluorowcem w pozycji 5.

P r z y k ł a d 16

Aktywność antywirusowa związków według wynalazku określano zgodnie z ogólnymi procedurami ujawnionymi przez J. Balzariniego i in. w „9-(2-phosphonylmetoxyethyl)adenine (PMEA) effectively inhibits retrovirus replication in vitro and simian immunodeficiency virus invection in rhesus monkeys” AIDS 5: 21-28, 1991 oraz przez J. Balzariniego i in. w „Differential antilierpesvirus and antiretrovirus effects on the (S) and (R) enantiomers of acyclic nucleoside phosphonates: potent and selective in vitro and in vivo antiretroviais activities of (R)-9-(2-phosphonomethoxypropyl)-2-6-diaminopurine” Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37: 332-338, 1993.

Wyniki są przedstawione w tabeli 1a, w której większa siła działania wykazana jest przez niższe wartości bezwzględne.

P r z y k ł a d 17

Wirusy

Pochodzenie wirusów MSV, HIV typ 1 (HIV-1) (szczep IIIB i Ba-L), HIV-2 (szczep ROD) oraz F1V (szczep Petaluma) zostało opisane wcześniej (Balzarini i in., AIDS 5: 21-28, 1991; De Clercq i in., Proc. Soc. Ex. Biol. Med. 137: 590-594, 1971; Egberink i in., Proc. NATO. Acad. Sci. 87: 3087-3091, 1990; Hartmann i in., Antiviral Chem. Chemoter. 5: 13-19, 1994; Popovic i in., Science 224: 497-500, 1984). HIV-1 (IIIB) I HIV-2 (ROD) zostały uzyskane z nadsączy zainfekowanych wirusami kultur komórek MT-4. HIV-1BaL rozwinięto w pierwotnych ludzkich makrofagach (M/M), których nadsącze zostały zebrane, przefiltrowane i przechowywane w temperaturze -80°C przed użyciem. Charakterystyka zgromadzonych zasobów wirusowych była następująca: 2,1 x 10⁸ HIV-RNA genomów/ml (odpowiadająca 35 g antygenów p24) oraz 5000 50% dawek infekcji kultur tkanek na ml (TCID50/ml), co określono na podstawie miareczkowań wirusów w innych pierwotnych makrofagach. Wyizolowanie i charakteryzowanie wyodrębnionych z klinicznych HIV-1 izolatów LIS, L6S i L6S/PMEA opisywano wcześniej (Thormar i in., Proc. NATO. Acad. Sci. USA 93: 3283-3287, 1995; Van Laethem i in., AIDS 15: 553-561, 2001). Izolat HIV-1/LIS uzyskano z od pacjenta nie leczonego przy pomocy NRTI (inhibitorów odwrotnej transkryptazy nukleozydowej), czy ANP, a następnie hodowano bez selektywnego wpływu jakichkolwiek leków. Z tego powodu, nie zawierał on żadnych mutacji, które są charakterystyczne dla pacjentów leczonych przy pomocy NRTI lub ANP. H1V-1/L6S jest klinicznym izolatem pochodzącym od osobnika poddawanego leczeniu, wyhodowanym bez selektywnego wpływu jakichkolwiek leków. Tak, jak jest to charakterystyczne dla pacjentów leczonych przy pomocy NRTI, zawierał on mutacje S68G, K70T, V 751, F77L, FI 16Y oraz Q151M w swoim RT. HIV-1/L6S/PMEA jest klinicznym izolatem HIV-1/L6S wyodrębnionym po hodowaniu wirusów w 11 przejściach w obecności zwiększanych stężeń PMEA (adefowir). Oprócz mutacji wymienionych dla HIV-1/L6S, uzyskał on w swojej odwrotnej transkryptazie (RT) mutację K65R charakterystyczną dla PMEA.

Odczynniki radiochemiczne

[metylo-³H] tymidynę (radioaktywność właściwa 1554 GBq/mmol (42 Ci/mmol)), [5-³H]urydynę (radioaktywność właściwa 962 GBq/mmol (26 Ci/mmol)) oraz [4,5-³H]leucynę (radioaktywność właściwa 1924 GBq/mmol (52 Ci/mmol)) uzyskano od Amersham Pharmacia Biotech (Buckingamshire, U.K.).

Pochodne według wynalazku

Następujące pochodne były używane w niniejszych badaniach:

1. 2,4-diamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna;

2. 2,4-diamino-6-{[2-(fosfonometoksy)etylo]sułfanylo}pirymidyna;

3. 4-amino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna;

4. 2-amino-4-hydroksy-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna;

5. 2-amino-4-hydroksy-6-{[2-(fosfonometoksy)etylo]sulfanylo}pirymidyna;

PL 207 187 B1

6. 2-amino-4-dietyloamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna;

7. 2-amino-4-cyklopropyloamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna;

8. 4-amino-2-metylosuł fanylo-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna;

9. 2-amino-4-metylo-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna;

10. 2,4-diamino-6-(S)-[2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyna;

11. 2,4-diamino-6-(R)-[2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyna;

PMEA, 9-[(2-fosfonometoksy)etylo]adenina, (R)-PMPA, (R)-9-[(2-fosfonometoksy)propylo]adenina.

Antywirusowe próby in vitro

Działanie skierowane przeciwko zmianom patologicznym indukowanym przez HIV-1 i HIV-2 badano w komórkach MT-4 w piątym dniu od infekcji, przy czym opierano się na oznaczaniu żywotności komórek poprzez barwienie płatka rogówki lub w hodowli komórek CEM od 4 do 5 dnia po infekcji, przy czym opierano się na badaniu mikroskopowym indukowanego przez wirusy tworzenia się komórek olbrzymich. HIV-1 i HIV-2 dodawano do hodowli komórek w dawce 100 CCID50.

Jednojądrowe komórki krwi obwodowej (PMBC) od zdrowych dawców izolowano przez odwirowywanie w gradiencie gęstości (Lyphoprep; Nycomed Phamia, AS Diagnostics, Oslo, Norwegia), po czym stymulowano fitohemaglutyniną (PHA) (Sigma Chemical Co., Bomem, Belgia) przez 3 dni. Aktywowane komórki (stymulowane PHA) przemyto PBS, po czym dokonano infekcji wirusowych, opisanych w protokołach grupy próbnej AIDS.

Pokrótce, PMBC (2 x 10⁵/200 wgłębień) umieszczono w płytce w obecności seryjnych rozcieńczeń badanego związku, po czym infekowano dawką wirusów równą 1000 CCID50/ml.

Czwartego dnia po infekcji usunięto 125 μΐ cieczy z nad zainfekowanej hodowli bakterii i zastąpiono 125 μl świeżego medium zawierającego badane pochodne w odpowiednich stężeniach.

Siódmego dnia po umieszczeniu komórek, w próbie immunosorbenta połączonego z enzymem (NEN, Paryż, Francja) wykryto w nadsączu antygen p24.

Ludzkie pierwotne makrofagi (M/M) przygotowano i oczyszczono w następujący sposób. Jednojądrowe komórki krwi obwodowej (PMBC) uzyskane od zdrowych nie zainfekowanych H1V-1 dawców wyizolowano na gradiencie Ficoll i zaszczepiono w 48-wglębieniowych płytkach po 1,8 x 10⁶ komórek/wgłębienie w 1 ml RPM 1640 zawierającego 20% cieplnie dezaktywowanego, wolnego od endotoksyn i mykoplazmy serum płodu bydlęcego (Chylone Laboratories, Inc., Logan, UT), 4mM L-glutaminy (Life Technologies), 50 U/ml penicyliny oraz 50 μg/ml streptomycyny (Life Technologies) (medium całkowite, do którego odnosić się będzie w tym dokumencie).

Pięć dni po zaszczepieniu i hodowli komórek PMBC w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze wzbogaconej 5% CO2, związane komórki ostrożnie usunięto przy pomocy powtarzanego przemywania ogrzanym RPMI-1640, pozostawiając monowarstwę związanych komórek, którą inkubowano w medium całkowitym. Jak wykazano wcześniej, komórki traktowane w tych warunkach stanowiły > 97% makrofagów, co określono w analizie cytofluorometrycznej.

Makrofagi poddawano działaniu związków przez 30 minut, po czym wystawiono na działanie 300 TCID50/ml HIY-lBa. 2 godziny po wprowadzeniu wirusów, M/M przemyto w celu usunięcia szczepionki wirusowej, uzupełniono medium całkowite tam, gdzie to było konieczne, po czym hodowano M/M przez czas trwania eksperymentu.

Każde stężenie badanego związku badano trzykrotnie, a pozytywną grupę kontrolną sześciokrotnie. Z tego powodu, pochodne wymieniano przy każdej zmianie medium. Nadsącze zbierano po 14 dniach od infekcji w celu oceny produkcji wirusów przy pomocy analizy antygenu HIV-1-p24.

Do prób anty-FIV, 10⁵ komórek CrFK zaszczepiono w 24-wgłębieniowych płytkach do hodowli tkanek. Komórki hodowano w 2 ml medium hodowlanego na każde wgłębienie zawierające 2,5% serum płodu cielęcego w obecności różnych stężeń leków. Próby przeprowadzono trzykrotnie.

Po jednogodzinnym okresie inkubacji w temperaturze 37°C, komórki zainfekowano FIV.

Wirusy pozostawiono w kontakcie z hodowlą przez 1 dzień, po czym medium usunięto i wprowadzono nowe medium zawierające odpowiednie stężenia leków.

Po 6 dniach, badano obecność antygenu p24 FIV w próbie wychwytywania antygenu.

Hamujące działanie badanych pochodnych w kierunku indukowanych przez MSV przekształceń komórek fibroblastów C3H/3T3 w zarodkach gryzoni badano mikroskopowo 6 dnia po infekcji. MSV dodano do hodowli komórek w 57 jednostkach tworzących ogniska zakażenia. Szczegółowe procedury badań antyretrowirusowych zostały opisane wcześniej (Balzarini i in., AIDS 5: 21-28, 1991; Balzarini i in., Antimicrob. Agents Chemoter. 37: 332-338, 1993; De Clercq i in.. Proc. Soc. Ex. Biol. Med. 137: 590-594, 1971).

PL 207 187 B1

Działanie anty-MSV in vitro

Hamujący wpływ pochodnych według wynalazku na rozpoczęcie tworzenia się guzów indukowanych przez MSV oraz przeżywalność myszy zaszczepionych MSV badano tak jak to opisano wcześniej (Balzarini i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 332-336, 1989; Balzarini i in.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4961-4965, 1991; Balzarini i in., Antimicrob. Agents Chemoter. 37: 332-338, 1993). Krótko, 2-3 dniowe myszy NMRI szczepiono podskórnie MSV w lewą tylnią nogę.

Myszom wprowadzano dootrzewnowo pojedynczą dawkę badanej pochodnej na 4 godziny przed infekcją (dzień 1), a następnie pojedynczą dawkę badanej pochodnej dnia 2, 3, 4 i 5.

Dawki leku wynosiły 50, 20, 8, 4 oraz/lub 2 mg/kg/dzień tenofowiru [(R)-PMPA], adefowiru (PMEA), 1 (PMEO-2,4-di-NH2-Pym), 2 (PMES-2,4-di-NH2-Pym) i 11 ((R)-PMPO-2,4-di-NH2-Pym).

Nie obserwowano toksycznego działania pochodnej nawet przy najwyższej dawce.

Wzrost i wygląd guzów wywoływanych przez MSV w miejscu zaszczepienia wirusem, jak również przeżywalność myszy obserwowano codziennie aż do 30 dni po infekcji.

Cytostatyczny i antymetaboliczny wpływ acyklicznych fosfonianów nukleozydowych in vitro

Próby wykorzystywane do badania hamowania wzrostu komórek CEM przez badane pochodne opisano już wcześniej (Balzarini i in., AIDS 5: 21-28, 1991). 50% stężenia cytostatycznego (CC50) określano jako stężenie pochodnej obniżające liczbę żyjących komórek o 50%.

W celu pomiaru toksyczności badanych pochodnych względem komórek MT-4, 5 x 10⁴ komórek

MT-4 inkubowano przez 5 dni w temperaturze 37°C we wgłębieniach 96-wgłębieniowych mikropłytek, w obecności lub nieobecności różnych stężeń badanych pochodnych. Następnie pod mikroskopem na podstawie liczby żywych komórek obliczono CC50 korzystając z techniki wykluczania barwienia płatka rogówki przy użyciu błękitu trypanu.

3 3

Wprowadzanie [metylo-³H]tymidyny, [³H]urydyny i [³H]leucyny do nierozpuszczalnej w metanolu frakcji komórek CEM było również określane na mikropłytkach. Do każdego wgłębienia dodano 10⁵komórek CEM, 5,9 pmol (9,25 Bq (0,25 μ^) [metylo-³H]tymidyny 38 pmol (37 Bq (1,0 μ^) [³H]urydyny i 19 pmol (37 Bq (1,0 μ^) [³H]leucyny oraz daną ilość badanej pochodnej.

Następnie pozwolono na proliferację komórek przez 20 godzin w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze o kontrolowanej zawartości CO2.

Pod koniec okresu inkubacji, zawartość wgłębień (200 μθ przeniesiono na 25 mm filtry z włókna szklanego (typ A/G; Gelman Instrument Co., Ann Arbor, MI) zamontowane na urządzeniu próbkującym z rurą rozgałęźną Milipore 3025.

Filtry przemywano dwukrotnie zimnym PBS (roztworem soli buforowanym buforem fosforanowym), dwukrotnie zimnym 10% kwasem trichlorooctowym, dwukrotnie zimnym 5% kwasem trichlorooctowym, jednokrotnie zimnym etanolem oraz jednokrotnie zimnym eterem. Następnie filtry pozostawiono do wyschnięcia przez 10 minut w temperaturze 60°C i analizowano pod kątem radioaktywności w scyntylacie opartym na toluenie.

Działanie anty-HIV-1 fosfonianowych analogów acyklicznych nukleozydów pirymidynowych w hodowlach komórek CEM

Warunkiem wstępnym silnej aktywności antyretrowirusowej jest obecność grupy aminowej przy węglu C-2 pierścienia pirymidynowego wraz z obecnością grupy aminowej przy węglu C-4 (pochodne 1, 2 i 11) lub grupy hydroksylowej przy węglu C-4 (pochodna 4) (tabela 1).

Struktury podstawionej przez 6-PMEO i 6-PMP pirymidyny wykazywały aktywność anty-HIV-1 przy EC₅₀ pomiędzy 0,80 a 2,0 μg/ml.

Brak grupy aminowej przy węglu C-2 (pochodna 3 lub 8) lub obecność grupy dimetylaminowej, metylowej lub cyklopropyloaminowej przy węglu C-4 (odpowiednio pochodna 6, 9 i 7) powodowało całkowity zanik aktywności antyretrowirusowej (tabela 1).

Pochodne tioeterowe były z zasady od 5 do 10 razy mniej aktywne w porównaniu do pochodnych eterowych (porównanie pochodnej 2 z pochodną 1) lub nawet były nieaktywne (pochodna 5). Co ciekawe, aktywność antyretrowirusowa nowych pirymidyn ANP wykazywała oznaczalną enacjoselektywność w kierunku HIV-1.

Pochodna pirymidyny (R)-6--PMPO (11) oznaczalnie silniej hamowała działanie wirusów niż odpowiednia pochodna (S)-6-PMPO (10) (tabela 1).

Szczątkowa aktywność antywirusowa enancjomeru-(S) mogła być spowodowana zanieczyszczeniem enencjomerem-(R) pochodzącym z wyjściowego materiału chiralnego (1-2%).

PL 207 187 B1

Dla większości pochodnych zauważano niewielką lub żadną cytotoksyczność przy stężeniu 100 μg/ml, z uderzającym wyjątkiem dla pochodnej 4 (CC₅₀: 2,5 μg/ml dla komórek CEM).

Najbardziej aktywna antywirusowo 6-PMEO-2,4-di-NH2 pochodna pirymidyny (pochodna 1) wykazywała wartości CC₅₀ ok. 11 μg/ml dla komórek CEM, podczas gdy odpowiadający jej analog tioeterowy 2 oraz (R)-6-PMPO-2,4-di-NH₂ pochodna pirymidyny 11 posiadały wartości CC₅₀ około 60 μg/ml (tabela 1).

Co ciekawe, pochodna 5-bromo pochodnej 1 była aktywna w kierunku HIV-1 w hodowlach komórek CEM przy stężeniu 2,5 μg/ml i nie toksyczna przy stężeniu 100 μg/ml.

Żadna z pochodnych 1, 2 czy 11 nie hamowała wbudowywania [metylo-³H]tymidyny, [³H]urydyny i [³H]leucyny w nierozpuszczalnym w TCA materiale komórkowym CEM przez 12 godzin inkubacji przy stężeniu 200 μg/ml.

Dodatkowo, PMEA i (R)-PMPA nie wykazywały działania hamującego w kierunku syntezy makromolekularnej przy tych stężeniach leków (dane nie pokazane).

Antyretrowirusowe działanie fosfonianowych analogów acyklicznych nukleozydów pirymidynowych w różnych układach wirusowo/komórkowych

Pochodne 6-PMEO 1 i 4, 6-PME tioeter (6-PMES) 2 oraz pochodna (R)-6-PMPO 11 były badane pod katem ich aktywności inhibitującej w różnych modelach retrowirusowych in vitro (tabela 2).

Z zasady, wielkości aktywności antywirusowej badanych pochodnych określone dla HIV-1 (IIIB) w hodowlach komórek CEM (tabela 1) były bliskie aktywnością antywirusowym określonym dla HIV-2 (ROD) w komórkach CEM, H1V-1 i HIV-2 w komórkach MT-4 oraz FIV w komórkach nerek cieląt Crandell.

Tak więc, wartości EC50 dla pochodnej 1 dla HIV mieszczą się w zakresie od 0,29 do 0,80 μg/ml, a dla pochodnej 11 w zakresie od 1,3 do 3 mg/ml.

Wartości te są bliskie tym obserwowanym dla pochodnych odniesienia - PMEA (adefowir) (EC₅₀: 0,96-2,0 μg/mml) oraz (R)-PMPA (tenofowir) (EC50: 0,36-0,52 μg/ml).

W przypadku pochodnych 6-PMO i 6-(R)-PMEO badanych względem HIV-1 w komórkach pierwotnych [HIV-1(IIIB) w PBL oraz HIV-l(Ba-L) w monocytach/makrofagach (M/M)] działanie antyretrowirusowe było jeszcze silniejsze.

W istocie, pochodne 1 i 11 hamowały działanie wirusów w PBL przy EC50 równym odpowiednio 0,07 i 0,12 μg/ml, w porównaniu do wartości 1,9 i 0,33 μg/ml uzyskanych dla związków odniesienia PMEA i (R)-PMPA.

Pochodne 6-PMEO i (R)-6-PMPO jeszcze silniej hamowały działanie HIV-1 (Ba-L) w M/M, tak jak to obserwowano dla PMEA i (R)--PMPA. Z zasady, pochodne wykazywały mniejszą cytotoksyczność w MT-4 w porównaniu do komórek CEM, przy czym nie były toksyczne w dawce 100 μg/ml w monocytach/makrofagach.

Ponieważ, jak to pokazano wcześniej, PMEA i (R)-PMPA wykazują aktywność inhibicyjną względem wirusa mięsaków Moloney'a u gryzoni (MSV) zarówno w hodowli komórkowej, jak i u nowonarodzonych myszy, aktywność przeciwko MSV in vitro nowych pochodnych 6-PMEO i (R)-6-PMPO była również badana.

Pochodne 1, 11 i 4 wykazywały bardzo silne działanie hamujące względem transformacji komórek C3H wywoływanych przez MSV. Wartości EC₅₀ były niskie - 0,05 - 0,15 μg/ml.

Wpływ naturalnych nukleozydów i zasad nukleinowych na aktywność anty-HIV fosfonianowych analogów acyklicznych nukleozydów pirymidynowych w hodowlach komórkowych

Jest powszechnie znanym faktem, iż na aktywność anty-HIV pirymidynowych analogów nukleozydowych, takich jak 3'-azydo-3'-deoksytymidyna (AZT, zydowudyna) i 2',3'-dideoksycytydyna (ddC, zalcytabina) może wpływać (zmniejszać) obecność naturalnych nukleozydów, takich jak dThd i dCyd (Balzarini i in., Textbook of AIDS Medicine, chapter 49, Broder, S., T. C. Merigan i D. Bolognesi, eds. Wiliams & Wilkins, Baltimore, Maryland, pp 751-772, 1994; Balzarini i in., Antimicrob. Agents Chemoter. 37: 332-338, 1993).

Z tego powodu, w celu określenia czy obecność naturalnych nukleozydów i zasad nukleinowych będzie wpływać na aktywność anty-HIV nowych pochodnych pirymidyny 6-PMEO i (R)-6-PMPO, zbadano wpływ nukleozydów pirymidynowych - tymidyny (dThd) i 2'-deoksy-cytydyny (dCyd), nukleozydów purynowych - adenozyny (Ado) i guanozyny (Guo) oraz zasad nukleinowych - adeniny (Ade) przy stężeniach bliskich wartościom toksycznym.

Żaden z naturalnych nukleozydów czy zasad nukleinowych nie wywierał mierzalnego wpływu na aktywność anty-HIV-1 badanych pochodnych w hodowlach komórek CEM. We wszystkich przy38

PL 207 187 B1 padkach, aktywność antyretrowirusowa związków była w pełni zachowana, podobnie jak w przypadku związków odniesienia - PMEA, (R)-PMPA i PMEG (tabela 3).

Skuteczność fosfonianowych analogów acyklicznych nukleozydów pirymidynowych względem tworzenia się guzów wywoływanych przez MSV u nowonarodzonych myszy NMRI

Badano aktywność inhibicyjną pochodnej 6-PMEO 1 oraz jej tioeterowego analogu 2 oraz pochodnej (R)-6-PMPO 11 względem tworzenia się guzów wywoływanych przez MSV oraz związanymi z tym tworzeniem przypadkami ś mierci nowonarodzonych myszy NMRI (tabela 4). PMEA (adefowir) i (R)-PMPA (tenofowir) uwzględniono jako związki odniesienia.

Spośród nowych pochodnych 6-PMEO i (R)-6-PMPO najbardziej skutecznym w zapobieganiu tworzeniu się guzów wywoływanych przez MSV oraz związanym z tym tworzeniem przypadkom śmierci nowonarodzonych myszy NMRI (tabela 4) okazała się pochodna 1.

Co najmniej 80% myszy zostało uchronionych przed tworzeniem się guzów przy dawkach 50 i 20 mg/kg, a pozostałych myszy, u których rozwinęły się guzy przeżyły przez ponad 30 dni po infekcji. Przy dawce tak małej jak 2 mg/kg, pochodna 1 była w stanie zapobiegać tworzeniu się guzów u 5% myszy i zapewnić przeżywalność długoterminową 15% myszy.

Pochodna 1 posiadała porównywalne właściwości zapobiegające tworzeniu się guzów i związanym z tym tworzeniem przypadkom śmiertelnym u zwierząt, jak PMEA i (R)-PMPA (tabela 4).

W przeciwieństwie do niego, pochodna tioeterowa 2 nie zapobiegała tworzeniu się guzów przy żadnej z badanych dawek i zapewniała przeżywalność długoterminową 20% myszy przy dawkach 8-50 mg/kg.

Efektywność pochodnej (R)-6--PMPO 11 w zapobieganiu tworzeniu się guzów i związanym z tym tworzeniem przypadkom śmiertelnym mieściła się pomiędzy skutecznością pochodnych 1 i 2.

Wszystkie leki opóźniały tworzenie się guzów wywoływanych przez MSV w stopniu zależnym od dawki. Związek 1 posiadał aktywność inhibitującą porównywalną z (R)-PMPA i PMEA.

Związek 11 wykazywał gorszą skuteczność niż związek 1, a związek 2 wykazywał wyraźną aktywność opóźniającą tworzenie się guzów przy dawce 50 mg/kg.

Podobnie jak w przypadku tworzenia się guzów, wpływ na ograniczenie śmiertelności u zwierząt był również zależny od dawki, przy czym związek 1 był co najmniej tak skuteczny w opóźnianiu śmierci jak leki odniesienia PMEA i (R)-PMPA.

Czułość zmutowanych szczepów HIV-1 względem fosfonianowych analogów acyklicznych nukleozydów pirymidynowych w hodowlach komórek CEM

Badana była aktywność inhibicyjną pochodnych 1, 2 i 11 względem szczepów HIV-1 (IIIB) posiadających w RT nienukleozydowe specyficzne względem inhibitorów mutacje (NNRTI) - L1001, K103N, Y181C oraz Y188H.

Wszystkie trzy pochodne zachowały pełną aktywność względem tych zmutowanych szczepów wirusowych (dane nie pokazane).

Aktywność inhibicyjną tych samych pochodnych była badana również względem izolatów klinicznych - HIV-1/L1S, HIV-1/L6S i HIV--1/L6S/PMEA (tabela 5).

PMEA i (R)-PMPA zostały uwzględnione w tych badaniach jako związki odniesienia. Pochodna 1 zachowała swoją aktywność antywirusową względem wszystkich trzech szczepów wirusowych. Pochodna 2, a szczególnie pochodna 11 wykazały wyraźnie ograniczoną aktywność względem izolatu H1V-1/L6S/PMEA, tak samo jak PMEA i (R)-PMPA.

Tak więc, mutacje opornościowe multi-NRTI (S68G, K70T, V751, F77L, F116Y i Q151M) oraz charakterystyczna dla PMEA mutacja K65R obecna w HIV-1/L6S/PMEA nie wpływały oznaczalnie na aktywność antywirusową pochodnej 1 i PMEA (~ 3,6 do 4,5 razy zwiększona wartość EC50), natomiast w wię kszym stopniu ograniczał y czuł o ść innych ANP (tabela 5).

PL 207 187 B1

Tabela la

Aktywność antywirusowa (EC_S0 pg/ml)

I-ISV-1

TK- CMV VZV

HSV-1

HSV-2

VMW

AD-

TK+

TK-

Kod

(KOS)

(G)

1837

169

Davis

OKA

YS

07/1

YS/R

MSV

HIV-1

H1V-1

H-3404

6,5

24

9,6

>50

1,2

1,1

2,5

1,6

0,035+

0,8 +

0,43 +

0,002

0

0,32

H-3408

29

>80

48

>50

7,5

7

20

15

1,70

5,5 +

3,0 +

2,1

1,4

H-3415

>80

>50

>40

>100

H-3418

>16

>50

12,6 ±

>100

7,6

H-3427

>400

>50

139 + 11

>100

Π-3435

240

>80

240

>50

>20

>50

>40

>100

11-3444

240

>400

240

>50

4.26 ±

56,7 +

80 +

0,75

37,9

34,6

H-3445

>400

>50

107 +

>100

10

H-3453

>400

>50

89,4 + 37,6

>100

H-3560

>80

>50

6,1

51

33

H-3567

16

48

9,6

>50

3,8

5,9

6,3

5,7

0,05

1,9

1,3

H-3574

9,6

14

16

1,1

0,9

0,6

0,08

>0,8

PL 207 187 B1

T a b e l a 1

Aktywność antyretrowirusowa i cytostatyczna fosfonianów acyklicznych nukleozydów pirymidynowych w hodowlach komórkowych zainfekowanych HIV-1

Numer kodowy pochodnej	Analog pirymidyny		EC50^a (pg/mi)	CC50^b (pg/ml)
		R1	R2	Y	Z	HIV-1 CEM	(CEM)
1	PMEDAP	NH2	NH2	O	H	0,80	11
2	PMEDAP	NH2	NH2	S	H	5,5	64
3	PMEA	H	NH2	O	H	> 100	> 100
4	PMEG	NH2	OH	O	H	2,2	2,5
5	PMEG	NH2	OH	S	H	> 100	> 100
6	PMEDAP	NH2	N(CH3)2	O	H	> 100	> 100
7	PMEDAP	NH2	NH-Cp^c	O	H	> 100	> 100
8	PMEA	SCH3	NH2	O	H	> 100	> 100
9	PMe-6-Me-MAP	NH2	CH2	O	H	> 100	> 100
10	(S)-PMEDAP	NH2	NH2	O	CH3	51	> 100
11	(R)-PMEDAP	NH2	NH2	O	CH3	1,8	62
Leki odniesienia
PMEA (adefowir)					0,96	16
(R)-PMPA (tenofowir)					0,36	125

^a 50% stężenie skuteczne lub stężenie pochodnej wymagane do zahamowania w 50% zmian patologicznych wywoływanych przez HIV-1 (IIIB) w hodowli komórek CEM ^b 50% stężenie cytostatyczne lub stężenie pochodnej wymagane do zahamowania w 50% proliferacji komórek CEM ^c CP, grupa cyklopropylowa

T a b e l a 2

Aktywność antyretrowirusowa pochodnych 6-PMEO i (R)-6-PMPO w różnych typach komórek

Nr kodowy pochodnej	EC₅₀ ^a' ^d ^g/ml)
1	2	3	4	5	6	7	8	9
	HIV-1 (IIIB) (CEM)	HIV-2 (ROD) (CEM)	HIV-1 (IIIB) (MT-4)	HIV-2 (ROD) (MT-4)	HIV-1 (IIIB) (PBL)	HIV-1 (Bal) (M/M)	FIV (CrFK)	MSV (C3H)
1	0,9±0,4	0,66±0,19	0,34±0,3	0,29	0,07±0,02	0,002±0,001	0,25±0,01	0,16±04

PL 207 187 B1 cd tabeli 2

1	2	3	4	5	6	7	8	9
2	4,6±3,1	3,0±1,4	2,5±0,3	2,9	-		0,97±0,40	1,7±0,9
11	1,9±0,5	1,3±0,4	3,0±0,4	1,6±0,6	0,12±0,01	0,005±0,0	0,66±0,14	0,05±0,01
4	1,4±0,7	1,4±1,2	1,9±0,4	2,1	-			0,08±0,03
PMEA	0,96±0,24	1,9±1,1	1,3±1,1	1,9	0,55±0,41	0,006	0,46±0,19	0,62±027
(R)-PMPA	0,36±0,24	0,43±0,41	0,46±0,006	0,52	0,09±0,03	0,003±0,001	0,13	1,4±0,9

Nr kodowy pochodnej	CC? ^c” ^d (pg/ml)
	CEM	MT-4	PBL	M/M	CrFK	C3H
1	11±2,0	46±7,4	2,2±0,8	>100	11	>40 (200)
2	64±9,8	>100	-		42	>40 (200)
11	62±2,5	>100	9,6±2,5	>100	>100	>40 (200)
4	2,5±+0,2	10±2,2	-			>16
PMEA	16±9,1	28±12	>100	>100	18	>40 (200)
(R)-PMPA	125±26	72±12	>100	>100	>100	>200

^a 50% stężenie skuteczne, lub stężenie pochodnej wymagane do zahamowania w 50% zmian patologicznych wywoływanych przez HIV-1 (tworzenia się komórek olbrzymich) w komórkach CEM i MT-4 lub produkcji antygenu p24 w PBL i M/M, lub 50% przekształcania komórek C3H wywoływanego przez MSV ^b 50% stężenie cytostatyczne, lub stężenie pochodnej wymagane do zahamowania w 50% proliferacji komórek CEM lub w 50% ograniczania żywotności komórek (MT-4, PBL, M/M) ^c Minimalne stężenie hamują ce, lub stężenie pochodnej wymagane do wywoł ania mikroskopowo widocznej zmiany morfologii komórki. Symbol „>” oznacza, że nie obserwowano toksyczności przy wskazanym stężeniu. Wielkości w nawiasach oznaczają stężenia pochodnej, przy których obserwowano toksyczność morfologiczną ^d Dane stanowią ś rednią (± SD) 2 z 4 odrębnych eksperymentów. Dane bez wartości odchylenia standardowego oznaczają wynik powtórzonego pojedynczego eksperymentu

T a b e l a 3

Wpływ naturalnych nukleozydów i zasad nukleinowych na aktywność pochodnych, antywirusową 6-PMEO i (R)-PMPO

Nr kodowy pochodnej	EC50^{a b} (pg/ml)
Po dodaniu
	Bez dodatku	dThd (10 mM)	dCyd (1 mM)	Ado (400 mM)	Guo (10 mM)	Ade (100 mM)
1	0,77±0,25	0,35±0,07	0,55±0,35	0,63±0,29	0,65±0,21	0,26±0,16
2	1,9±0,75	1,4±0,21	2,1±1,7	4,4±2,8	1,9±0,49	3,3±3,2
11	1,2±0,25	0,83±0,35	ł,l±0,51	1,5±0,7	0,77±0,38	0,35±0,17
4	1,4±0,71	1,0±0,3	2,4±1,9	1,4±0,93	1,9±0,92	1,7±1,2
PMEA	0,94±0,24	1,4±0,4	2,1±0,19	1,6±0,4	1,0±0,8	1,9±1,3
(R)-PMPA	0,57±0,26	0,43±0,0	0,53±0,26	0,46±0,23	0,43±0,0	1,6±1,
PMEG	> 0,05	> 0,25	> 0,25	> 0,05	> 0,05	> 0,05

^a 50% stężenie skuteczne lub stężenie pochodnej wymagane do zahamowania w 50% zmian patologicznych wywoływanych przez HIV-1 (IIIB) w hodowli komórek CEM ^b Dane oznaczają średnią (±SD) co najmniej 2 z 3 oddzielnych pomiarów

PL 207 187 B1

T a b e l a 4

Aktywność anty-MSV fosfonianów acyklicznych nukleozydów pirymidynowych u nowonarodzonych myszy NMRI

Pochodna	Dawka (mg/kg)^a	Całkowita liczba myszy użytych w eksperymencie	Liczba myszy, u których nie rozwinęły się guzy (%)	Liczba myszy, które przeżyły długi okres czasu (%)(>30 dni)
1 (MEO-2,4-di-NH2-Pym)	50	19	84	100^b
20	20	80	100
8	18	44	89
2	20	5	15
2 (PMES-2,4-di-NH2-Pym)	50	10	0	20
20	10	0	20
8	10	0	20
2	8	0	0
11 (MPO-2,4-NH2-Pym)	20	10	20	40^c
8	20	15	40
2	18	0	5
PMEA	100	10	100^d	d
20	29	89	94
8	30	44	77
4	20	5	35
(R)-PMPA	50	10	100	100
20	28	92	100
8	27	65	83
2	28	0	31

^a Wskazana dawka leku podana 2 godziny przed infekcją MSV, po której nastąpiły 4 dodatkowe dawki codzienne przez kolejne 4 dni po infekcji. Ś redni czas rozwoju guza w grupie kontrolnej zainfekowanej MSV wynosił 4,5 dnia, a średni okres, po którym następowała śmierć myszy zainfekowanych MSV wynosił 12,3 dni ^b Przy wskazanej dawce leku (50 mg/kg), 16% myszy zdechło przedwcześ nie (< 24 dni), prawdopodobnie z powodu toksyczności leku, bez oznak tworzenia się guzów. Przedwczesna śmierć nie była brana pod uwagę w trakcie obliczania odsetka myszy, które przeżyły długi okres czasu ^c Przy wskazanej dawce leku (20 mg/kg), 50% myszy zdechł o przedwcześ nie (< 6 dni), bez oznak tworzenia się guzów. Przedwczesna śmierć nie była brana pod uwagę w trakcie obliczania odsetka myszy, które przeżyły długi okres czasu ^d Wszystkie myszy zdechły przed 6 dniem, prawdopodobnie z powodu toksyczności leku. Żadna z myszy nie wykazywała oznak tworzenia się guzów

T a b e l a 5

Aktywność inhibicyjna fosfonianowych analogów acyklicznych nukleozydów pirymidynowych względem klinicznych izolatów HIV-1

Nr kodowy pochodnej	Oporność zmniejszona (x razy)^a
	HIV-1/LIS^b	HIV-l/L6Sc	HIV-1/L6S/PMEA^d
1	0,8	1,5	3,6
2	2,1	1,4	14
11	1,9	3,5	30
PMEA	2,0	2,7	7,3
(R)-PMPA	2,3	11	54

^a Rząd oporności zmierzony względem laboratoryjnych szczepów HIV-1/IIIB w hodowlach komórek CEM

PL 207 187 B1 ^b Kliniczne izolaty uzyskane od pacjentów, u których nie stosowano NRTI czy ANP i nie zawierające w RT mutacji specyficznych dla NRTI i ANP ^c Kliniczne izolaty uzyskane od leczonych pacjentów. RT zawiera mutacje S68G, K70T, V75I,F77L,F116Y, Q151M ^d Izolat H1V-1/L6S hodowany w obecnoś ci PMEA i zawierający K65R poza innymi mutacjami specyficznymi dla NRTI wspomnianymi w punkcie c

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Pochodna 6-[2-(fosfonometoksy) alkoksy] pirymidyny o wzorze (I) w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową;

R2 oznacza atom wodoru, grupę metylową, fluorowiec, -N(R5)2, grupę hydroksylową, zabezpieczoną grupę hydroksylową lub grupę o wzorze (la) —X * '^φο'^Ρίοχζ^ ^Κ3 (la)

R3 oznacza niezależnie atom wodoru, grupę metylową, hydroksymetylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową;

R4 oznacza atom wodoru lub fluorowiec;

X niezależ nie oznacza atom tlenu, siarki lub wią zanie;

Z niezależnie oznacza grupę hydroksylową, grupę estrową lub grupę amidową;

R5 oznacza niezależnie atom wodom, grupę C1-C8 alkilową lub grupę zabezpieczającą; oraz * oznacza chiralny atom w ęgla; oraz jego sole i solwaty.
2. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że R1 i R2 oznaczają grupy aminowe, R3 oznacza atom wodoru, a X oznacza atom tlenu.
3. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że R1 i R2 oznaczają równocześnie grupy aminowe, R3 oznacza grupę metylową, X oznacza atom tlenu, przy czym R3 ma konfigurację (R).
4. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że R1 i R2 oznaczają równocześnie grupy aminowe, R3 oznacza grupę hydroksymetylową, X oznacza atom tlenu, przy czym R3 ma konfigurację (R).
5. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że R1 i R2 oznaczają równocześnie grupy aminowe, R3 oznacza atom wodoru, X oznacza atom siarki.
6. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, ż e R1 oznacza grupę aminową, R2 oznacza grupę hydroksylową, R3 oznacza atom wodoru, a X oznacza atom tlenu.
7. Pochodna wed ł ug zastrz. 1, znamienna tym, ż e jest krystaliczna.
8. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że w znaczącym stopniu jest czystym enancjomerem w odniesieniu do chiralnego atomu węgla.
9. Pochodna wed ł ug zastrz. 8, znamienna tym, ż e ma konfigurację (R).
10. Pochodna według zastrz. 8, znamienna tym, że ma konfigurację (S).
11. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi ją 2,4-diamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna.

PL 207 187 B1
12. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi ją 2,4-diamino-6-(R)-[2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyna.
13. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi ją 2-amino-4-hydroksy-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna.
14. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi ją 2,4-diamino-6-[(S)-3-hydroksy-2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyna.
15. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi ją 2,4-diamino-6-[(RS)-3-hydroksy-2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyna.
16. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi ją 2-amino-4-hydroksy-6-[(R)-2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyna.
17. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi ją 2-amino-4-hydroksy-6-[(RS)-3-hydroksy-2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyna.
18. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi ją 2-amino-4-hydroksy-6-[(S)-3-hydroksy-2-(fosfonometoksy)propoksy]pirymidyną.
19. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi ją 2,4-diamino-5-bromo-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna.
20. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi ją 2-amino-5-bromo-4-hydroksy-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pirymidyna.
21. Sposób wytwarzania pochodnej o wzorze (I) w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową;

R2 oznacza atom wodom, grupę metylową, fluorowiec, -N(R5)2, grupę hydroksylową, zabezpieczoną grupę hydroksylową lub grupę o wzorze (la) —X * (la)

R1 oznacza niezależnie atom wodoru, grupę metylową, hydroksymetylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową;

R4 oznacza atom wodoru lub fluorowiec;

X niezależ nie oznacza atom tlenu, siarki lub wią zanie;

Z niezależnie oznacza grupę hydroksylową, grupę estrową lub grupę amidową;

R5 oznacza niezależnie atom wodoru, grupę C1-C8 alkilową lub grupę zabezpieczającą; oraz * oznacza chiralny atom węgla, znamienny tym, że przeprowadza się reakcję związku o wzorze (II)

PL 207 187 B1 w którym

R2 oznacza atom wodoru, grupę metylową, fluorowiec, -N(R5)2, grupę hydroksylową lub zabezpieczoną grupę hydroksylową; oraz

X oznacza O lub S; ze związkiem o wzorze (III) *

Y-CH₂CH(R₃)-O-CH₂P(O)(Z)₂ (III) w którym

Z oznacza grupę estrową alb grupę amidową;

* oznacza chiralny atom węgla;

R3 oznacza H, grupę metylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową; oraz

Y oznacza grupę opuszczającą, w dwupolamym rozpuszczalniku aprotycznym w obecności zasady.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo wyizolowanie uzyskanej pochodnej o wzorze (I).
23. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że Z oznacza grupę estrową lub amidową, oraz że dodatkowo przeprowadza się reakcję hydrolizy jednej lub obu grup Z wytwarzając pochodną o wzorze (I), w którym co najmniej jedna z grup Z jest grupą hydroksylową.
24. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że Z oznacza (OR4)2, a R4 oznacza grupę izopropylową.
25. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że R3 oznacza grupę metylową, a Y oznacza grupę p-toluenosulfonyloksylową.
26. Sposób wytwarzania pochodnej o wzorze (I) w którym

R1 oznacza H, grupę aminową lub metylosulfanylową;

R2 oznacza -N(R5)2,

R3 oznacza niezależnie H, grupę metylową, hydroksymetylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową;

R4 oznacza H lub fluorowiec;

X niezależnie oznacza tlen lub siarkę;

Z niezależnie oznacza grupę hydroksylową, grupę estrową lub grupę amidową;

R5 oznacza niezależnie H, grupę C1-C8 alkilową lub grupę zabezpieczającą; oraz * oznacza chiralny atom węgla; znamienny tym, że obejmuje przeprowadzenie reakcji pochodnej o wzorze (IV)

PL 207 187 B1 w którym

R3 oznacza H, grupę metylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową;

X niezależ nie oznacza O lub S; oraz;

Z oznacza grupę estrową lub grupę amidową; z N(R5)2.
27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że dodatkowo przeprowadza się reakcję hydrolizy jednej lub obu grup Z uzyskując pochodną o wzorze (I), w którym co najmniej jedna grupa Z jest grupą hydroksylową.
28. Sposób wytwarzania pochodnej o wzorze (V) w którym

R1 oznacza atom wodom, grupę metylową, hydroksymetylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową;

R5 oznacza niezależnie atom wodoru, grupę C1-C8 alkilową lub grupę zabezpieczającą;

X oznacza tlen lub siarkę ;

Z niezależnie oznacza grupę hydroksylową , grupę estrową lub grupę amidową;

* oznacza chiralny atom w ę gla; znamienny tym, ż e obejmuje przeprowadzenie reakcji pochodnej o wzorze (IVa) z N(R5)2 w rozpuszczalniku niewodnym, wodorotlenkiem alkalicznym lub w ę glanem alkalicznym w roztworze wodnym.
29. Sposób wytwarzania pochodnej o wzorze (VI) w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową;

R3 oznacza atom wodom, grupę metylową, hydroksymetylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową;

Z oznacza niezależnie grupę hydroksylową , grupę estrową lub grupę amidową; oraz * oznacza chiralny atom węgla; znamienny tym, obejmuje przeprowadzenie reakcji związku o wzorze (VII)

PL 207 187 B1 w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową ze związkiem o wzorze (VIII)

HOCH₂CH(R₃)OCH₂P(O)(Z)₂ (VIII) w którym Z oznacza grupę amidową lub grupę estrową w obecności zasady.
30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że dodatkowo przeprowadza się reakcję hydrolizy jednej lub obu grup Z wytwarzając pochodną o wzorze (VI), w którym 1 lub 2 grupy Z są grupami hydroksylowymi.
31. Sposób wytwarzania pochodnej o wzorze (XIII) w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulafanylową;

* oznacza chiralny atom wę gla;

R2 oznacza atom wodoru, chlor, grupę hydroksylową lub aminową;

R3 oznacza atom wodoru, grupę metylową, fluorowcometylową lub hydroksymetylową; oraz Z oznacza grupę amidową lub grupę estrową ; znamienny tym, że obejmuje (a) przeprowadzenie reakcji związku o wzorze (IX) w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową;

R2 oznacza atom wodom, chlor lub grupę aminową; ze związkiem o wzorze (X)

PL 207 187 B1 w którym

R3 oznacza atom wodom, grupę metylową, hydroksymetylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową;

* oznacza chiralny atom węgla;

R6 oznacza grupę hydroksylową lub zabezpieczoną grupę hydroksylową; lub

R3 i R6 są połączone zabezpieczającą cykliczną grupę acetalową lub ketalową; w obecności zasady bez rozpuszczalnika lub w obecności rozpuszczalnika aprotycznego uzyskując pochodną o wzorze (XI) w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową;

* oznacza chiralny atom węgla;

R2 oznacza atom wodoru, chlor lub grupę aminową;

R3 oznacza atom wodoru, grupę metylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową; oraz (b) przeprowadzenie reakcji pochodnej (XI) ze związkiem o wzorze (XII)

Y-CH2-P(O)(OZ)2 (XII) w którym

Y oznacza grup ę opuszczają c ą ;

Z oznacza grupę amidową lub grupę estrową, w obecności zasady w dimetyloformamidzie lub tetrahydrofuranie uzyskując pochodną o wzorze (XIII).
32. Sposób według, zastrz. 31, znamienny tym, że przeprowadza się dodatkowo reakcję hydrolizy grupy Z wytwarzając pochodną o wzorze (XIII), w którym 1 lub 2 grupy Z są grupami hydroksylowymi.
33. Sposób wytwarzania pochodnej o wzorze (I) w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową;

R3 oznacza atom wodoru, grupę metylową, hydroksymetylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową;

R4 oznacza fluorowiec;

PL 207 187 B1

X oznacza atom tlenu;

Z niezależnie oznacza grupę hydroksylową , grupę estrową lub grupę amidową; oraz * oznacza chiralny atom wę gla; znamienny tym, ż e obejmuje (a) przeprowadzenie reakcji pochodnej o wzorze (VI) w którym

R1 oznacza atom wodoru, grupę aminową lub metylosulfanylową;

R3 oznacza atom wodoru, grupę metylową, hydroksymetylową, fluorowcometylową lub zabezpieczoną grupę hydroksymetylową;

Z niezależnie oznacza grupę estrową;

* oznacza chiralny atom węgla; z fluorowcem w postaci pierwiastkowej w obojętnym rozpuszczalniku uzyskując pochodną o wzorze (I).
34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że przeprowadza się dodatkowo reakcję hydrolizy grupy Z wytwarzając pochodną o wzorze (I), w którym 1 lub 2 grupy Z są grupami hydroksylowymi.
35. Kompozycja zawierająca farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę i pochodną określoną w zastrz. 1.
36. Pochodna o wzorze 1, określona w zastrz. 1 do zastosowania jako lek.
37. Zastosowanie pochodnej o wzorze I, określonym w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia infekcji wirusowej.
38. Zastosowanie według zastrz. 37, znamienne tym, że wirus jest wirusem DNA.
39. Zastosowanie według zastrz. 38, znamienne tym, że wirus jest retrowirusem lub wirusem z rodziny Hepadna .