PL206818B1

PL206818B1 - Memnopeptydy, sposób ich wytwarzania, ich zastosowanie oraz kompozycja je zawierająca

Info

Publication number: PL206818B1
Application number: PL358300A
Authority: PL
Inventors: Laszlo Vertesy; Herbert Kogler; Astrid Markus; Matthias Schiell
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 2000-02-29
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2010-09-30
Also published as: WO2001064715A2; HK1052712B; EP1261625A2; WO2001064715A3; ME00379B; US20010031857A1; SI1261625T1; MXPA02007845A; AU2001250318B2; RU2002125877A; SK287310B6; EP1130027A1; DK1261625T3; KR100997073B1; PL358300A1; HRP20020703B1; ES2254394T3; CZ20022904A3; DE60116063D1; SK12262002A3

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 358300 (22) Data zgłoszenia: 15.02.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

15.02.2001, PCT/EP01/001661 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

07.09.2001,WO01/64715 (11) 206818 (13) B1 (51) Int.Cl.

C07K 7/06 (2006.01)

C12P 21/02 (2006.01)

A61K 38/08 (2006.01)

A61P 9/04 (2006.01)

A61P 3/10 (2006.01)

A61P 31/04 (2006.01)

C12R 1/645 (2006.01)

Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy

Memnopeptydy, sposób ich wytwarzania, ich zastosowanie oraz kompozycja je zawierająca

	(73) Uprawniony z patentu: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH,
(30) Pierwszeństwo:	Frankfurt, DE
29.02.2000, EP, 00104114.4	(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 09.08.2004 BUP 16/04	LASZLO VERTESY, Eppstein-Vockenhausen, DE HERBERT KOGLER, Glasfmtten, DE ASTRID MARKUS, Liederbach, DE MATTHIAS SCHIELL, Brechen, DE
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.09.2010 WUP 09/10	(74) Pełnomocnik:
	rzecz. pat. Barbara Gugała

PL 206 818 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne peptydowe, nazywane memnopeptydami, wytwarzane przez fermentację Memnoniella echinata FH2272, DSF 13195 w pożywce, sposób wytwarzania memnopeptydów, kompozycja je zawierająca i zastosowanie memnopeptydów jako środków farmaceutycznych, na przykład do wytwarzania środka farmaceutycznego do leczenia niewydolności serca.

Zaburzenia sercowo-naczyniowe są główną przyczyną śmierci w zachodnich krajach przemysłowych. Znaczną ich częścią są chorzy z rozpoznaniem niewydolności serca. Niewydolność serca oznacza nieodpowiednie działanie serca. Serce nie jest zdolne do wytwarzania wydajności odpowiadającej wymaganiom danej osoby. Niewydolność serca jest ostrą chroniczną niezdolnością serca, pod obciążeniem lub nawet spoczynku, dostarczania wydajności krwi koniecznej dla metabolizmu lub do przyjmowania powrotu krwi żylnej do serca. Jest to stan serca, w którym mechanizmy wyrównywania, takie częstość akcji serca, pojemność wyrzutowa serca lub nadciśnienie, nie wystarczają już do utrzymania normalnej wydajności serca. Niewydolność serca ma szereg przyczyn, na przykład zapalne lub zwyrodnieniowe zmiany mięśnia sercowego, zaburzenia krążenia wieńcowego i zawał serca. Niewydolność serca powoduje zmiany krążenia obwodowego, pogorszenie oddychania, działania nerek i równowagi elektrolitycznej, a także do zmniejszenia wytrzymałości umięśnienia kości, w końcu często prowadzi do śmierci.

Niewydolność serca występuje zwykle w podeszłym wieku. Częstość jej występowania na 1000 mieszkańców na rok w wieku od 35 do 64 lat wynosi 3, a w grupie wiekowej od 65 do 94 lat wynosi 10. Umieralność osób w wieku 75 lat wzrasta prawie 200-krotnie w porównaniu do grupy wiekowej od 35 do 44 lat. Umieralność pozostawała prawie bez zmiany w okresie od 1970 do 1983, jak pokazały badania w USA. Dla RFN należy przyjąć takie same liczby. Ponad 50% chorych umiera w ciągu pierwszych 5 lat po rozpoznaniu. Badanie statystyczne tego zjawiska wykazuje duże znaczenie niewydolności serca dla całej populacji, ale jednocześnie potwierdza niedostateczne możliwości farmakoterapii obecnie dostępnej dla lekarza.

Ze względu na nieodpowiedniość obecnych sposobów farmakoterapii opracowano nowe koncepcje leków sercowych. Zdolność mięśni serca i umięśnienia kości do kurczenia się i do wykonywania pracy mechanicznej należy zatem od (1) kurczliwych elementów strukturalnych (włókienek mięśniowych) i (2) od dostępnej energii chemicznej (ATP) włókienek mięśniowych, która jest zamieniana w energię mechaniczną podczas do kurczenia. W procesie kurczenia występuje skracanie się włókienek mięśniowych. Może być on inicjowany przez impulsy czynnościowe w nerwie, pod wpływem których jony wapnia (Ca²⁺) przechodzą w ciągu kilku milisekund z przedziału pozakomórkowego do przestrzeni sarkoplazmatycznej i opróżniane są depoty wapnia. W przypadku niewydolności serca stężenie jonów Ca²⁺ we włókienkach mięśniowych może ulec zmniejszeniu. Jednak jony Ca²⁺ są niezbędne do aktywacji układu kurczliwości. Gdy zwiększa się zapotrzebowanie, to Ca²⁺ jest zwykle pompowane do siateczki sarkoplazmatycznej (SR) pod katalitycznym działaniem zależnego od Ca²⁺-błoniastego enzymu Mg²⁺-ATPase: enzym ten także nazywa się Sarco(Endo)plasmatic Reticulum Ca²⁺ATPase (SERCA2). Według analizy hydropatycznej Ca²⁺ATPase zawiera 10 przezbłoniastych helis i pewną liczbę pętli pozabłoniastych. Po stronie cytosolowej tworzą się domeny wiązania Ca²⁺ z ATP, fosforylowania i oddziaływania z modulatorem - proteinowym fosfolambanem (PLB). Ten ostatni jest pentamerem proteinowym, który znajduje się w błonie SR i hamuje wpływ SERCA2 w stanie niefosforylowanym. Pod wpływem stresu fizjologicznego zachodzi fosforylowanie PLB, co zwiększa powinowactwo SERCA2 i w ten sposób zwiększa szybkość przenoszenia jonów Ca²⁺ do SR. Fosforylowanie PLB (białka zawierającego 52 aminokwasy) ma miejsce na resztach dwóch aminokwasów: seryna-16 może być fosforylowana przez zależną od cAMP kinazę proteinową, a treonina może być fosforylowana w poło ż eniu 17 przez kinazę zależ n ą od Ca²⁺/kalmoduliny. Fosforylowanie powoduje zmianę konformacji w PLB z następnym wzrostem powinowactwa SERCA2 do Ca²⁺. Przeciwciała anti-PLB mogą naśladować wpływ fosforylowania PLB i w ten sposób potwierdzić kluczową rolę PLB jako regulatora aktywacji kurczliwości serca (Phospholamban: Protein Structure, Mechanism of Action and Role in Cardiac Function. H.K. Simmerman i L.F. Jones, Physiologica Reviews, tom 78, nr 4, strona 921 i następne). Tak więc, aktywatory SERCA2 powinny wpływać korzystnie na niewydolność serca.

Stwierdzono nieoczekiwanie, że pożywki szczepu grzybowego Memnoniella echinata FH2272, DSF 13195 zawierają substancje naturalne, które mogą wywierać korzystny wpływ na serce i krążenie. Wydzielone związki aktywne, memnopeptydy, są naturalnymi substancjami zawierającymi swoiste grupy składników. Te grupy składników zawierają jednostki terpenowe, tak zwane ugrupowanie poliketydowe i grupę zawierającą azot.

PL 206 818 B1

Terpeny są związkami występującymi w naturze, które formalnie można uważać za produkty polimeryzacji węglowodoru - izoprenu.

W zależnoś ci od liczby grup izoprenowych odróżnia się monoterpeny (C10), seskwiterpeny (C15), diterpeny (C20) i tak dalej. Dużą liczbę związków można utworzyć ze struktur macierzystych przez podstawienie, cyklizację, przegrupowanie, utlenianie i tym podobne; tak więc w literaturze opisano wiele tysięcy terpenów. Wymieniano także pochodne związki zawierające azot, ale zalicza się je do alkaloidów (na przykład alkaloidy gencjany) [Rompp's Chemie Lexikon [Rompp's Chemical Encyclopedia, wydanie 9, tom 6, strony 4508 i następne, Georg Thieme Verlag, Stuttgart/New York, 1992].

Jednak te terpeny różnią się zasadniczo od memnopeptydów według wynalazku, przy czym terpeny te nie zawierają ugrupowania poliketydowego, za pomocą którego mogą wiązać azot.

Jako przykłady innych znanych terpenów zawierających azot można wymienić:

- Stachybocyny [J. Antibiotics, 48, 1396 (1995)];

- Stachybotryny [Y. Nozawa i inni, J. Antibiotics, 50, 35-645 (1997)];

- laktamy spirodihydrobenzofuranu [J. Antibiotics, 49, 13 (1996)];

- nakijichinony [Tetrahedron, 51, 10867-10874 (1995);

- związki od F1839-A do -J są zawierającymi azot terpenami z ugrupowaniami poliketydowymi [patenty japońskie 061864133 i 08283118]. Są to inhibitory esterazy cholesterolu.

Te pochodne terpenowe otrzymano z różnych szczepów rodzaju Memnoniella echinata i Stachybotrys i innych. Opisano je jako antagonisty receptora śródbłonka, jako inhibitory proteazy HIV-1 i esterazy cholesterolu i jako środki tonizujące do włosów.

Ponadto wydzielono inhibitor monofosfatazy inozytolu L-671,776 z hodowli szczepu Memnoniella echinata, ATCC 20928 [Y.K.T. Lam i inni, J. Antibiotics, 45, 1397-1402 (1992)].

Memnopeptydy według wynalazku mają różne zakresy aktywności. Ich istotną cechą jest ich aktywujący wpływ na SERCA2, a więc na niewydolność serca.

Przedmiotem niniejszego wynalazku są związki o wzorze (I)

w którym

R1 i R2 razem oznaczają podwójnie związany O, albo oba oznaczają H, albo H i OH, albo H i O-C1-C4-alkil;

R3 i R4 razem oznaczają podwójnie związany O, albo oba oznaczają H, albo H i OH, albo H i O- C1-C4-alkil;

R8 jest wybrany z H, OH, C1-C4-alkilu albo O- C1-C4-alkilu, takiego jak O-metyl;

R6 oznacza grupę o wzorze (II)

w którym R9, oznacza H albo glikozydowo związany cukier, albo grupę o wzorze (III)

PL 206 818 B1 w którym R10 oznacza H albo glikozydowo zwią zany cukier; i w którym, jeśli R6 oznacza grupę o wzorze (II), to R5 oznacza wiązanie z atomem węgla C9 we wzorze (II) i R7 oznacza H, albo R7 oznacza wiązanie z atomem węgla C9 we wzorze (II) i

R5 oznacza H, i jeśli R6 oznacza grupę o wzorze III, to R5 i R7 oznaczają H; A oznacza naturalny aminokwas wybrany z grupy obejmującej Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Ser, Thr, Phe, Tyr. Trp, Lys, Arg, Asp, His, Glu, Asn, Gin, Cys i Met:

n oznacza liczbę cał kowitą wybraną z liczb od 2 do 12, przy czym każ de A jest takie same albo różne od każdego innego A;

w którym atom azotu w pierś cieniu izoindolu o wzorze (I) oznacza N-koń cowy azot aminowy pierwszego aminokwasu z grupy (A)n; (A)n jest łańcuchem peptydowym, lub jego sól.

C1-C4-alkil oznacza liniowy lub rozgałęziony alkil zawierający od 1 do 4 atomów węgla, taki jak metyl, etyl, izopropyl i tert-butyl.

Cukrem może być heksoza, na przykład aldoheksoza, taka jak mannoza, glukoza lub galaktoza, która może być ewentualnie podstawiona dodatkowymi grupami, takimi C1-C4-alkil lub NH2.

Korzystnie związek o wzorze (I) ma wzór (IV)

w którym grupy R1, R2, R3, R4, R8, R9 i (A)n mają znaczenia podane powyżej.

We wzorze (IV), R1 i R2 wzięte razem mogą oznaczać podwójnie związany O, i R3 i R4 mogą oba oznaczać H i R9 może oznaczać H.

Związek o wzorze 1 przedstawia korzystnie związek o wzorze (V)

w którym grupy R1, R2, R3, R4, R5, R7, R8, R9, R10 i (A)n mają znaczenia określone powyżej albo jego sól.

W zwią zkach o wzorze 1 korzystnie (A)n oznacza ł a ń cuch peptydowy zawierają cy sekwencję aminokwasu: Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro (SEQ ID NO:1), w której Met oznacza grupę ewentualnie utlenioną do sulfotlenku.

Korzystnie R9 lub R10 oznacza aldoheksozę.

Wzór (IVb) przedstawia korzystną postać przestrzenną związków o wzorze 1:

PL 206 818 B1 w której (A)n ma podane powyżej znaczenie.

Korzystnie związkiem według wynalazku jest memnopeptyd A, C76H108N16O18S o wzorze (IVa) albo jego sól.

W tym wzorze, struktura dekalinowa z grupą 4-metylową i grupą metylenową jest ugrupowaniem terpenowym; podstawiony pierścień izoindolu jest ugrupowaniem ketydowym.

(A)n jest sekwencją aminokwasu: Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro (SEQ ID NO: 1) stanowiącą część sekwencji kazeiny. Metionina (Met) może być utleniona do sulfotlenku.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja zawierająca co najmniej jeden związek o wzorze (I), okreś lony powyż ej oraz dopuszczalny noś nik. Korzystnie wymieniona kompozycja jest kompozycją farmaceutyczną i wymieniony nośnik jest nośnikiem dopuszczalnym farmaceutycznie.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania związku o wzorze (I), albo jego soli, określonego powyżej charakteryzujący się tym, że obejmuje hodowlę Memnoniella echinata FH2272, DSF 13195, w odpowiednich warunkach w pożywce, zawierającej co najmniej jedno źródło atomów węgla i co najmniej jedno źródło atomów azotu, dopóki co najmniej związek o wzorze (I) jest obecny w pożywce, i z nastę pnym wydzieleniem wymienionego związku.

Korzystnie sposób dodatkowo obejmuje konwersję związku do co najmniej jednej postaci chemicznej wybranej z soli dopuszczalnych fizjologicznie.

Hodowlę prowadzi się w warunkach aerobowych i korzystnie co najmniej jedno źródło atomów azotu wybiera się z aminokwasów i peptydów.

Korzystnie wymieniona pożywka zawiera pepton kazeiny w stężeniu od około 0,05% wagowych do około 5% wagowych w stosunku do całej ilości roztworu pożywki.

Korzystnie wymieniona pożywka zawiera pepton kazeiny, glukozę, moczoną kukurydzę i śladowe ilości chlorku potasu, siarczanu magnezu i siarczanu żelaza.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku o wzorze (I) albo jego soli, określonego powyżej

- do wytwarzania leku do leczenia niewydolnoś ci serca,

- do wytwarzania leku do leczenia choroby, której pierwotną lub wtórną przyczyną jest niewydolność serca,

- do wytwarzania leku do leczenia cukrzycy lub

- do wytwarzania leku do leczenia zakaż enia bakteryjnego.

PL 206 818 B1

Właściwości fizykochemiczne i spektroskopowe korzystnego związku według wynalazku można przedstawić jak następuje:

Memnopeptyd A

Wygląd bezbarwna substancja rozpuszczalna w polarnych rozpuszczalnikach organicznych i w wodzie.

Trwała w środowisku obojętnym, słabo kwaśnym.

Wzór empiryczny: C76H108N16O18S,

Ciężar cząsteczkowy: 1565,87 Da,

Absorpcja UV (?,_max) : 270 nm,

Dane NMR: patrz tabela 1.

Numerację atomów węgla i związane z nimi przesunięcia chemiczne NMR sklasyfikowano zgodnie z procedurą numeracji pierścieniowych seskwiterpenów.

Figura 1. Numeracja pierścieniowego ketolidu seskwiterpenowego.

Tabela 1. Dane NMR (przesunięcia chemiczne) dla memnopeptydu A w DMSO-d6 w temperaturze 310 K

T a b e l a 1.

Dane NMR (przesunięcia chemiczne) memnopeptydu A w DMSO-d6 w temperaturze 31

	δ-¹³0	m	δ-¹Η	m	^nJHH	^nJCH (10 Hz)	przypisanie
1	2	3	4	5	6	7	8
1	15.42	q	0.668	d	1.802	1.802	Terpene-8-Me
2	15.72	q	0.978	s	-	2.035, 1.763	Terpene-10-Me
3	20.37	t	1.409 1.460	m	2.035, 1.538 2.035,	2.035	Terpene-6
4	21.43	q	0.873	d	1.678	1.678, 1.428, 0.890	Leu^a-<5
5	22.25	q	0.827	s	0.918	0.918, 2.035	Terpene-4-Me
6	22.64 22.80	t t	2.182 2.307 2.19 2.31	ddt ddt ddt ddt	4.892,2.788 2.632 4.869, 2.757. 2.635	4.892, 2.788. 2.632 4.869, 2.757, 2.635	Met¹-e
7	23.08	q	0.890	d	1.678	1.678, 1.428, 0.873	Leu^a-<5'
8	23.88 br	d	1.678	m	0.87, 0.88		Leu⁸-Y
9	23.90	t	1.764 0.962	m m	0.962, 1.416, 1.871	0.978, 1.416, 3.227	Terpene-1
10	24.22	t	1.910	m	2.144, 4.588, 3.467	2.144, 1.771,4.588, 3.467, 3.689	Pro⁹-Y
11	24.32	t	1.863	m	2.031, 1.798, 3.625	4.356. 3.625, 2.153, 1.792	Pro⁴-Y
12	24.37	t	1.927	m	(2.153), (1.814), 3.624	4.388, 3.624, 1.814	Pro⁷-Y

PL 206 818 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6	7	8
13	24.43	t	1.926	m	2.144, 1.840, 3.655, 3.538	4.224, 3.655, 3.538	Pro¹⁰-Y
14	24.77	t	1.840	m	1.416, 1.740, 0.962		Terpene-2
			1.416	m	1.840, 0.926
15	26.51	t	1.940	m	1.719, 4.484, 2.198	2.198	Gln³-e
			1.719	m	1.719, 4.484, 2.198
16	26.85	t	1.927	m	1.722,4.468, 2.166	2.166	Gln⁶-e
			1.722		1.927, 4.468, 2.166
17	27.04 br	t	2.976	dd	4.598		His⁵-e
			3.067	dd
18	27.09	t	2.937	dd	4.570	(4.570)	His²-e
			3.067	dd
19	27.50	t	2.144	m	1.771, 4.578, 1.905,	1.945, 3.689,	Pro⁹-e
					1.945	3.467. 4.578
			1.771	m	2.144, 4.578, 1.905, 1.945
20	28.34	t	2.144	m	1.840, 4.223, 1.926	4.223, 3.669, 3.533	Pro¹⁰-e
			1.840	m	2.144, 4.223, 1.926
21	28.50	q	0.918	s	0.827	0.827	Terpene-4-Me
22	28.86	t	1.798	m	4.356. 2.031, (1.863)		Pro⁴-e
			2.031	m
23	28.89	t	1.814	m	2.012, 4.388, (1.927) 1.814, 4.388, (1.927)	4.388, 3.646	Pro⁷-e
			2.012	m
24	30.63	t	1.538	m	1.430, 1.460, (1.409), (1.802) 1.538, 1.460,	0.667	Terpene-7
			1.430	m	1.802
25	30.64	t	2.166	t	1.927, 1.722	1.927, 1,722, 4. 466, 6.807	Gln⁶-Y
26	30.65	t	2.192	t	1.940, 1.719	1.940, 1.719, 4.489, 6.789	Gln³-Y
27	31.62	t	3.154	d	2.792	6.598	Terpene-11
			2.792	d	3.154
28	36.43	d	1.802	ddq	1.538, 1.430, 0.667	0.667, 2.790, 3.156	Terpene-8
29	37.22	s	-	-	-	0.903, 0.824	Terpene-4
30	37.73	q	2.548	s		2.682, 2.758	Mef-ε
	37.84		2.546			2.633, 2.783
31	39.45	d	2.035	dd	1.409, 1.460	0.903, 0.824, 0.971	Terpene-5
32	40.07 40.03	t	1.428	dt	4.536, 1.678	3.890, 0.873, 4.536	Leu⁸-e
33	41.71	s	-	-	-	3.156, 2.790, 0.977,	Terpene-10
						1.764), 2.035
34	44.25	t	4.332	-	-	4.881	Terpene-8
35	46.10		3.669 3.533		1.934	4.223, 2.147, 1.934, 1.851	Pro¹⁰-<S
36	46.53		3.689	m	1.905, 1.936	4.588, 2.165, 1.781, 1.936	Pro⁹-<S
			3.467	m

PL 206 818 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6	7	8
37	46.81	t	3.624	m	1.927	1.814. 4.388	Pro⁷-ó
38	46.87	t	3.644	m	1.863	-	Pro⁴-<5
39	48.56	d	4.534	dt	7.918, 1.428	7.918 1.428, 1.678	Leu⁸-a
40	49.44 49.70	t t	2.682, 2.758 2.633, 2.783	ddt ddt ddt ddt	2.758, 2.162, 2.289 2.682, 2.162, 2.289 2.783, 2.289, 2.162 2.633, 2.289,2.162	4.892, 2.550 4.869. 2.545	Met¹-Y
41	50.18	d	4.466	dt	8.110, 1.927, 1.722	2.166	Gln⁶-a
42	50.31	d	4.484	dt	8.206, 1.935. 1.707	2.182	Gln³-a
43	51.37	d	4.570	ddd	8.135. 2.975.3.082	2.975, 3.082	His⁵-a
44	51.68	d	4.590 4.585	ddd	8.496, 2.934. 3.067 8.506. 2.934. 3.067	2.934, 3.067	His²-a
45	53.30 53.62	d	4.892 4.869		2.162. 2.284 2.162, 2.284	2.162	Met¹-a
46	57.33	d	4.588	dd	2.144, 1.771	2.144, 1.771, 1.905. 1.945. 3.684	Pro⁹-a
47	58.31	d	4.223	dd	2.144, 1.840	3.669. 3.553, 1.926, 2.144. (1.840)	Pro¹⁰-a
48	59.20	d	4.388	dd	2.012, 1.814	2.012	Pro⁷-a
49	59.44	d	4.356	dd	2.031, 1.798	3.635, 1.880	Pro⁴-a
50	73.50 73.51	d	3.227	dd	1.840, 1.416	0.903, 0.824	Terpene-3
51	97.93 97.91	s	-	-	-	3.154, 2.792, 0.972, 0.668	Terpene-9
52	100.90 100.88	d	6.598 6.596	s	-	-	Terpene-3'
53	112.62 112.55	s	-	-	-	6.593, 4.330	Terpene-5'
54	116.92 116.90	s	-	-	-	3.154, 2.792, 6.597	Terpene-1'
55	116.95	d	7.230	s	8.655	(3.067), 2.937, 8.665	His²-;:
56	117.26	d	7.322	s	8.771	3.092. 3.000. 8.771	His⁵-;
57	129.32	s	-	-	-	8.783, 7.322, 3.083 2.976. 4.585	His5-y
58	129.63	s	-	-	-	7.230. 3.064, 2.937. 4.592	His²-Y
59	133.00 132.98	s	-	-	-	4.330	1-4'
60	133.63	d	8.655	s	7.230	7.230	His²-<5
61	133.68	d	8.771	s	7.320	7.320	His^s-<5
62	153.60 153.62	s	-	-	-	6.597, 3.157, 2.792	Terpene-2'
63	155.73	s	-	-	-	(6.597), 3.154. 2.792, 4.330	Terpene-6'

PL 206 818 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6	7	8
64	168.11 168.07	s	-	-	-	6.597. 4.330, 4.881	Terpene-7'
65	169.57	s	-	-	-	4.588, (4.223)	Pro⁹-CO
66	169.59	s	-	-	-	8.110, (4.570)	His⁵-CO
67	169.69	s	-	-	-	4.534, 1.444	Leu⁸-CO
68	169.74	s	-	-	-	8.207, 2.937, 4.585	His²-CO
69	169.97 169.89	s	-	-	-	8.513, 4.869,2.190 8.499, 4.892, 2.182	Met¹-CO
70	170.07	s	-	-	-	4.471, 1.733. 1.924, 4.356	Gln³-CO
71	170.21	s	-	-	-	4.466, 1.722, 1.927, 4.388	GIn⁶-CO
72	170.99	s	-	-	-	4.538, 4.388, 2.012, 1.844, 7.918	Pro⁷-CO
73	171.32	s	-	-	-	8.138, 4.356, 2.003, 1.805, 4.570	Pro⁴-CO
74	173.10	s	-	-	-	4 725,2.144, 1.840	Pro¹⁰-CO
75	173.80 173.81	s	-	-	-	2.19, 1.93, 1.73	3-Gln-<i-CO
76	173.88 173.86	s	-	-	-	7.26,2.19, 1.93, 1.73	4-Gln-<i-CO
	OH		9.75	br	-	NOE: 6.598	Terpene-2'-OH
	NH		8.506 8.496	d d	4.585 4.590	NOE: 4.869 /4.692	His²-NH
	NH		8.206	d	4.484	NOE : 3.072. 2.948, 4.588	GIn³-NH
	NH		8.135	d	4.563		His⁵-NH
	NH		8.110	d	4.470	NOE: 4.570, (4.470), 1.727, (1.927)	Gln⁶-NH
	NH		7.918	d	4.534	NOE: 4.388, 1.827, 1.688. 1.427	Leu⁸-NH
	NH2		7.260 6.807	s s	(6.807) (7.260)		Gln⁶-NH2
	NH2		7.230 6.789	s s	(6.789) (7.230)		Gln³-NH2

W jednym wariancie wynalazku, zwią zki o wzorze (I) moż na wytwarzać przez fermentację Memnoniella echinata FH2272, DSF 13195 albo jednego z jej wariantów lub mutantów, w odpowiednich warunkach w pożywce, dopóki co najmniej jeden memnopeptyd o wzorze (I) jest obecny w pożywce, i z nastę pnym wydzieleniem memnopeptydów.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania związku o wzorze I, który obejmuje fermentację mikroorganizmu Memnoniella echinata FH2272, DSF 13195 albo jednej z jego wariantów lub mutantów w odpowiednich warunkach w pożywce, dopóki co najmniej jeden memnopeptyd o wzorze (I) jest obecny w pożywce, z następnym wydzieleniem memnopeptydu z pożywki.

W jednym wariancie wynalazku, szczep FH2272, DSF 13195, jego mutanty i/lub warianty poddaje się fermentacji w roztworze środka odżywczego (zwanego także pożywką) zawierającym co najmniej jedno źródło atomów węgla i co najmniej jedno źródło atomów azotu i ewentualnie zawierającym stosowane zwykle sole nieorganiczne, dopóki memnopeptydy są obecne w pożywce. Następnie

PL 206 818 B1 memnopeptydy można wydzielić z pożywki i ewentualnie rozdzielić na poszczególne składniki aktywne oraz oczyścić.

W innym wariancie wynalazku, co najmniej jedno źródło atomów azotu, jako pożywkę, wybiera się z aminokwasów i peptydów.

Aminokwasy i peptydy stosowane jako źródła atomów azotu są takie same, jak określona powyżej grupa (A)n.

Sposób wytwarzania według wynalazku można zastosować do fermentacji w skali laboratoryjnej (od mililitrów do litrów) i skali przemysłowej (w skali metrów sześciennych).

Hodowano bardzo wydajną kolonię Memnoniella echinata FH2272. Izolat deponowano w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, 3300 Brunswick, Niemcy, zgodnie z zasadami Budapest Convention z dnia 14 grudnia 1999 roku, pod następującym numerem Memnoniella echinata FH2272, DSF 13195.

Memnoniella echinata FH2272, DSF 13195 ma grzybnię brązowo-zieloną i ma konidofory charakterystyczne dla rodzaju Memnoniella.

Warianty i mutanty szczepu Memnoniella echinata FH2272, DSF 13195 można także zastosować do syntezy co najmniej jednego związku z memnopeptydów według wynalazku. Takie mutanty można wytwarzać znanym sposobem za pomocą środków fizycznych, na przykład promieniowania, jak promieniowanie UV lub rentgenowskie, chemicznych mutagenów, jak metanosulfonian etylu (EMS), 2-hydroksy-4-metoksybenzofenon (MOB) lub N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG).

Możliwe warianty obejmują bardzo zbliżone rodzaje grzybów Stachybotrys, jak Stachybotrys atra, Stachybotrys chartarum lub Stachybotrys complementi.

Sortowanie mutantów i wariantów, które syntetyzują co najmniej jeden związek z memnopeptydów według wynalazku, można wykonać według następującego schematu:

- oddzielenie grzybni po fermentacji;

- ekstrakcja grzybni rozpuszczalnikiem organicznym;

- ekstrakcja memnopeptydów z przesączu pożywki za pomocą faz stałych;

- analiza metodami HPLC, DC lub za pomocą badania aktywności biologicznej.

Podane poniżej warunki fermentacji dotyczą grzybu Memnoniella echinata FH2272, deponowanego izolatu DSM 13195 i jego mutantów i wariantów.

W jednym wariancie wynalazku, Memnoniella echinata FH2272 wytwarza memnopeptyd A w pożywce zawierającej co najmniej jedno źródło atomów węgla, pepton kazeiny jako źródło atomów azotu oraz zwykłe sole nieorganiczne. W jednej odmianie wynalazku, jako Memnoniella echinata FH2272 stosuje się DSM 13195.

Możliwymi źródłami atomów węgla dla aerobowej fermentacji są asymilowane węglowodany i alkohole cukrowe, takie jak glukoza, laktoza, sacharoza, skrobie, dekstryny, fruktoza, melasa, glicerol, galaktoza i D-mannitol, i produkty naturalne zawierające węglowodany, takie jak ekstrakt słodu.

Możliwymi źródłami atomów azotu są na przykład: aminokwasy; peptydy; białka; produkty degradacji aminokwasów, peptydy i białka, takie jak kazeina, peptony i tryptony; ekstrakty mięsne; ekstrakty drożdży; ekstrakty orzeszków ziemnych; mielone nasiona, na przykład nasiona kukurydzy, pszenicy, fasoli, soi i bawełny; kompozycje zawierające nasiona; pozostałości destylacyjne z produkcji alkoholu; potrawy mięsne, ekstrakty drożdży; sole amonowe i azotany.

W jednym wariancie wynalazku, co najmniej jedno źródło atomów azotu wybiera się z otrzymywanych syntetycznie peptydów lub z otrzymywanych biosyntetycznie peptydów. Roztwór pożywki ewentualnie zawiera co najmniej jedną sól nieorganiczną.

W jednym wariancie wynalazku, sól nieorganiczną wybiera się z chlorków, węglanów, siarczanów i fosforanów.

Siarczany i fosforany można wybrać z siarczanów metali alkalicznych, fosforanów metali alkalicznych, siarczanów metali ziem alkalicznych i fosforanów metali ziem alkalicznych, przy czym metale ziem alkalicznych wybiera się z żelaza, cynku, kobaltu i manganu.

Wytwarzanie memnopeptydów według wynalazku może odbywać się w pożywce zawierającej pepton kazeiny.

W jednym wariancie wynalazku, pożywka zawiera pepton kazeiny w stężeniu od około 0,05% do około 5%.

W innym wariancie wynalazku, pożywka zawiera pepton kazeiny w stężeniu od około 0,1% do około 1%.

PL 206 818 B1

W jeszcze innym wariancie wynalazku, poż ywka zawiera pepton kazeiny w stężeniu od okoł o 0,2% do około 5%. Roztwór pożywki może zawierać glukozę.

W jednym wariancie wynalazku stężenie glukozy jest w zakresie od około 0,5% do 3%. Pożywka może zawierać także moczoną kukurydzę.

W jednym wariancie wynalazku, pożywka zawiera moczoną kukurydzę w stężeniu od 0,05% do 1%. W jeszcze innej odmianie wynalazku, pożywka zawiera moczoną kukurydzę w stężeniu od 0,1% do 0,5%. Inna pożywka może zawierać śladowe ilości co najmniej jednego składnika, takiego jak chlorek potasu, siarczan magnezu i siarczan żelaza.

W jednym wariancie wynalazku, pożywka zawiera pepton kazeiny, glukozę i śladowe ilości chlorku potasu, siarczanu magnezu i siarczanu żelaza.

W innym wariancie wynalazku, roztwór poż ywki zawiera stężenie peptonu kazeiny w zakresie od około 0,05% do około 5%, stężenie glukozy w zakresie od około 0,5% do około 3%, stężenie moczonej kukurydzy w zakresie od około 0,05% do około 1% i śladowe ilości chlorku potasu, siarczanu magnezu i siarczanu żelaza. Dane procentowe odnoszą się w każdym przypadku do wagi całej pożywki.

W tej poż ywce, Memnoniella echinata, którą moż e być FH2272, DSF 13195 tworzy mieszaninę memnopeptydów. W zależności od składu pożywki może zmieniać się stosunek ilościowy jednego lub kilku memnopeptydów według wynalazku. Ponadto, syntezę poszczególnych memnopeptydów można kontrolować za pomocą składu środowiska, przy czym memnopeptyd może w ogóle nie być wytwarzany w ilości poniżej granicy wykrywalności mikroorganizmu.

Hodowlę mikroorganizmów można przeprowadzać aerobowo, to jest na przykład przez wytrząsanie albo przez mieszanie we wstrząsanych kolbach lub kadziach fermentacyjnych, ewentualnie z doprowadzeniem powietrza lub tlenu. Moż na ją wykonywać w temperaturze w zakresie od okoł o 18°C do około 37°C, w temperaturze w węższym zakresie od około 20°C do około 32°C i w temperaturze w jeszcze węższym zakresie od około 25°C do około 30°C. Zakres pH powinien być od około 6 do okoł o 8, na przykł ad od oko ł o 6,5 do okoł o 7,5. Ogólnie, w tych warunkach hoduje się mikroorganizmy w czasie od około 24 h do około 300 h, zwykle od około 36 h do około 140 h.

Hodowlę można przeprowadzać korzystnie w kilku etapach, to znaczy, że można wytworzyć co najmniej jedną wstępną hodowlę w ciekłej pożywce i następnie można ją zaszczepić w rzeczywistej pożywce produkcyjnej, czyli w głównej pożywce, na przykład w stosunku objętościowym 1:10.

Wstępną hodowlę można wytworzyć na przykład przez zaszczepienie grzybni w pożywce i pozostawienie jej od około 36 h do około 120 h, na przykład od około 48 h do około 72 h.

Grzybnię można otrzymać na przykład przez pozostawienie szczepu w celu jego wzrostu od około 3 dni do około 40 dni, na przykład od około 4 dni do 10 dni, na stałej lub ciekłej pożywce, na przykład na agarze z drożdży słodowych lub na agarze z dekstrozy ziemniaczanej (środowisko standardowe na przykład dla grzybów pleśniowych, firmy Difco).

Przebieg fermentacji można monitorować za pomocą pH hodowli lub objętości grzybni, jak również metodami chromatograficznymi, jak chromatografia cienkowarstwowa lub wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa albo przez badanie aktywności biologicznej.

Związek według wynalazku może znajdować się zarówno w grzybni, jak również w przesączu pożywki, lecz największa jego część znajduje się zwykle w przesączu pożywki.

Opisany poniżej sposób wydzielania służy do oczyszczania memnopeptydów według wynalazku, na przykład memnopeptydu A. Wydzielanie lub oczyszczanie memnopeptydu według wynalazku od pożywki można wykonać znanymi sposobami, uwzględniającymi właściwości chemiczne, fizyczne i biologiczne substancji naturalnych.

W celu oznaczenia stężeń memnopeptydu w pożywce lub podczas poszczególnych etapach wydzielania można zastosować chromatografię cienkowarstwową, na przykład chromatografię na silikażelu, stosując jako eluent mieszaninę izopropanolu z 25%, NH3 lub metodę HPLC. Detekcję podczas rozdzielania metodą chromatografii cienkowarstwowej można wykonać na przykład za pomocą odczynników barwnych, jak kwas chlorosulfonowy/lodowaty kwas octowy, przy czym ilość wytworzonej substancji porównuje się za pomocą roztworu wzorcowego.

W celu wydzielenia memnopeptydu według wynalazku, ogólnie najpierw usuwa się grzybnię z poż ywki bulionowej zwykłymi sposobami i następnie ekstrahuje się memnopeptydy z masy komórkowej za pomocą mieszalnego z wodą rozpuszczalnika organicznego.

Faza rozpuszczalnika organicznego zawiera substancje naturalne według wynalazku; można ją ewentualnie zatężyć pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość oczyszczać dalej, jak opisano poniżej.

PL 206 818 B1

W innym wariancie wynalazku, memnopeptyd ekstrahuje się z poż ywki przez wprowadzenie rozpuszczalnika do mieszaniny grzyba z pożywką bulionową.

Przesącz pożywki można ewentualnie połączyć z koncentratem ekstraktu grzybni i ekstrahować odpowiednim, niemieszalnym z wodą rozpuszczalnikiem organicznym, na przykład n-butanolem. Następnie usuniętą fazę organiczną można ewentualnie zatężyć pod zmniejszonym ciśnieniem.

W celu odtłuszczenia cennych produktów można koncentrat rozcieńczyć niepolarnym rozpuszczalnikiem, w którym związki według wynalazku nie są dobrze rozpuszczalne, na przykład w heksanie, eterze naftowym lub eterze dietylowym. W tym sposobie memnopeptydy wytrącają się, a zanieczyszczenia lipofilowe pozostają w roztworze i mogą być z niego usunięte zwykłymi metodami rozdzielania fazy stałej od fazy ciekłej.

Osad zawierający memnopeptydy można rozpuścić w 1/30 początkowej objętości mieszaniny woda/metanol. Podczas tego osad rozpuszcza się całkowicie i może być liofilizowany. Liofilizat, nazywany następnie produktem surowym, może zawierać od około 5% do około 50% memnopeptydów i moż na go zastosować do dalszego wydzielania.

Dalsze oczyszczanie co najmniej jednego memnopeptydu według wynalazku można przeprowadzać metodą chromatografii na odpowiednich materiałach, na przykład na sitach molekularnych, na silikażelu, na tlenku glinu, na wymieniaczach jonowych lub na żywicach adsorbujących lub na fazach odwróconych (RP).

Memnopeptydy można rozdzielać metodą chromatografii. Chromatografię memnopeptydów można przeprowadzać stosując buforowane roztwory wodne lub mieszaniny roztworów wodnych i organicznych.

Mieszaniny roztworów wodnych i organicznych są to wszelkie rozpuszczalne w wodzie rozpuszczalniki organiczne, jak metanol, propanol i acetonitryl, zawierające od 5% do 80% rozpuszczalnika, korzystnie od 20% do 50% rozpuszczalnika, albo alternatywnie wszystkie buforowane roztwory wodne mieszalne z rozpuszczalnikami organicznymi, można stosować takie same bufory, jak podane powyżej.

Rozdzielanie memnopeptydów na podstawie różnic ich polarności można wykonać metodą chromatografii odwróconych faz, na przykład za pomocą MCI® (żywica adsorbująca firmy Mitsubishi, Japonia) lub Amberlite XAD® (Toso Haas) lub za pomocą innych materiałów hydrofobowych na przykład na fazach RP-8 lub RP-18. Ponadto, rozdzielanie można wykonać także za pomocą chromatografii z fazą normalną, na przykład na silikażelu, tlenku glinu i tym podobnych.

Chromatografię memnopeptydów można wykonać za pomocą buforowanych i zakwaszonych wodnych roztworów lub za pomocą mieszanin wodnych roztworów z alkoholami lub z innymi, mieszalnymi z wodą rozpuszczalnikami organicznymi.

W innym wariancie wynalazku rozpuszczalnik organiczny wybiera się z propanolu i acetonitrylu.

Buforowane lub zakwaszone wodne roztwory oznaczają co najmniej jeden roztwór lub mieszaninę roztworów. Na przykład, co najmniej jeden roztwór można wybrać z wody, buforów fosforanowych, octanu amonu, buforów cytrynianowych i kwasów.

W jednym wariancie niniejszego wynalazku, bufor cytrynianowy ma stężenie w zakresie od 0 do 0,5 M. Kwasy wybiera się z kwasu mrówkowego, kwasu octowego, kwasu trifluorooctowego i wszystkich dostępnych handlowo kwasów znanych fachowcom.

W jednym wariancie niniejszego wynalazku, handlowo dostę pny kwas ma st ężenie w zakresie od około 0 do około 1%.

W jeszcze innym wariancie niniejszego wynalazku, stężenie kwasu wynosi 0,1%.

Chromatografię można wykonać przy użyciu gradientu, który rozpoczyna się od 100% wody i kończy się na 100% rozpuszczalnika. Stosuje się co najmniej jeden rozpuszczalnik. Moż na stosować także mieszaninę dwóch lub kilku rozpuszczalników.

W jednym wariancie wynalazku, stosuje się gradient liniowy w zakresie od 20% do 50% rozpuszczalnika wybranego z propanolu i acetonitrylu.

Alternatywnie, można także wykonać chromatografię żelową lub chromatografię na fazach hydrofobowych.

Chromatografię żelową można wykonać na żelach poliakryloamidu lub jego kopolimeru, takich jak Biogel-P 2® (Biorad) lub Fractogel TSK HW 40® (Merck, Niemcy lub Toso Haas, USA).

Innym, bardzo skutecznym sposobem oczyszczania związków według wynalazku może być zastosowanie wymieniaczy jonowych.

PL 206 818 B1

Na przykład, zasadowy memnopeptyd A można korzystnie wydzielić na wymieniaczach kationowych, jak Fractogel EMD SO3'. Można stosować roztwory buforowe o pH od 5 do 8, na przykład o pH od 6 do 7,5. Eluowanie można na przykład wykonać z zastosowaniem gradientu soli. Oprócz wody można jako rozpuszczalniki stosować korzystnie mieszaniny wodnych roztworów buforowych z rozpuszczalnikiem organicznym. Ilość rozpuszczalnika organicznego może zmieniać się w zakresie od 10% do 90%, na przykład od 30% do 60%.

Kolejność stosowania wymienionych metod chromatograficznych może być odwrotna.

Innym, bardzo skutecznym sposobem oczyszczania memnopeptydów jest ich krystalizacja. Memnopeptydy można krystalizować z roztworów w rozpuszczalnikach organicznych i z mieszanin wody z rozpuszczalnikami organicznymi. Krystalizację można wykonać znanym sposobem, na przykład przez zatężenie lub ochłodzenie nasyconych roztworów memnopeptydów.

Memnopeptydy według wynalazku są trwałe w postaci stałej i w roztworach w zakresie pH od około 3 do około 8, na przykład w zakresie pH od około 5 do około 7; dlatego można je wprowadzać do zwykłych preparatów farmaceutycznych.

Tworzeniu się memnopeptydów zawierających azot może sprzyjać wprowadzenie pożądanych aminokwasów lub peptydów, jako prekursora pożywek Memnoniella echinata.

Cechą szczególną gatunku Memnoniella echinata może być wiązanie grup aminowych aminokwasów i peptydów dostarczanych przez syntezę laktamu z pięcioczłonowym pierścieniem, zwykle z systemem pierścienia izoindolowego. Wiązanie to ma miejsce albo począwszy od prekursora aldehydu podczas utleniania albo od etapu utleniania laktonu w postaci z otwartym pierścieniem lub w postaci laktonu pierścieniowego. Ta zdolność Memnoniella echinata do wiązania amin jest zupełnie nieoczekiwana i może być użyta do otrzymywania chronionych, poddanych konwersji pochodnych aminowych, jak pochodne terpenowe aminokwasów i peptydów.

Co najmniej jeden związek z memnopeptydów według wynalazku ze względu na swe cenne właściwości farmaceutyczne może być odpowiedni do stosowania w środkach farmaceutycznych do leczenia ludzi lub zwierząt.

Przedmiotem wynalazku jest więc zastosowanie związku o wzorze (I) albo jego fizjologicznie dopuszczalnej soli do wytwarzania leku sercowego do leczenia niewydolności serca lub profilaktyki.

Związki według niniejszego wynalazku można także stosować do wytwarzania środka farmaceutycznego do leczenia chorób, których pierwotną lub wtórną przyczyną jest niewydolność serca, jak na przykład w przypadku niewydolności krwioobiegu.

Mechanizm działania memnopeptydów jest niepewny, ale stwierdzono ich znaczący efekt.

W celu wykrycia aktywatorów SERCA2, które naśladują wpływ fosforylowania PLB, należy wykonać próbę kolorymetryczną, która oznacza aktywność Ca²⁺ATPase w mikrosomach serca psa w obecności badanych substancji. Próbę tę można wykonać w płytkach do mikromiareczkowania z 96 dołkami. Można zmierzyć enzymatyczne uwalnianie fosforanu nieorganicznego z ATP tworzącego niebieski kompleks z molibdenianem amonu, którego ilość można oznaczyć w spektrofotometrze przy 620 nm.

Memnopeptyd A aktywuje SERCA2 już w stężeniach od 12,5 μΜ.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest więc zastosowanie związku o wzorze (I) lub jego dopuszczalnej fizjologicznie soli do wytwarzania środka farmaceutycznego do leczenia zakażeń mikrobowych, na przykład zakażeń bakteryjnych.

Tabela 3 podaje pewne minimalne stężenia hamowania (MIC) (od „minimum inhibitory concentration) przeciwbakteryjnego widma memnopeptydu A przeciw kilku wybranym bakteriom.

T a b e l a 3

szczep	odporność na:	MIC, μg/ml
1	2	3
Staphylococcus aureus SG 511		16
Staphylococcus aureus 285	penicylinę	16
Staphylococcus aureus 503	penicylinę	16
Staphylococcus aureus FH 1982	metycylinę	16
Staphylococcus aureus 701E	metycylinę	16

PL 206 818 B1 cd. tabeli 3

1	2	3
staphylococcus aureus 707E	metycylinę	16
Staphylococcus aureus 9 ^b	ofloksacynę	16
Staph. epidermidis ZH 2c		16
Staph. epidermidis 763	metycylinę	>16
Staph. epidermidis 5747IIW	metycylinę	32
Staph. epidermidis 291	ofloksacynę	8
Staph. epidermidis 799	ofloksacynę	8
Enterococcus faecium Md8B		8
Enterococcus faecium VR1	wankomycynę	>64
Enterococcus faecium VR2	wankomycynę	>64
Streptococcus pyogenes VR3	wankomycynę	>64
Streptococcus pyogenes 308A		8
Streptococcus pyogenes 77A	-	4

Oprócz działania przeciwbakteryjnego, związki według wynalazku wykazują słabe działanie przeciwmykotyczne, to jest właściwości przeciwgrzybiczne, na przykład przeciw Candida albicans.

Ponadto, substancje według wynalazku mają pewien korzystny wpływ na translokazę glukozo-6-fosforanu(G-6-P-TL), enzymu, który jest ważny w metabolizmie glukozy i dlatego w leczeniu cukrzycy. Na przykład, związek memnopeptyd A wykazuje selektywne aktywności przeciwko G-6-P-TL, ale nie hamuje koenzymu fosfatazy G-6-P.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie związków o wzorze (I) lub jego dopuszczalnej fizjologicznie soli do wytwarzania środków farmaceutycznych stosowanych do leczenia cukrzycy.

Przedmiotem wynalazku są także preparaty farmaceutyczne co najmniej jednego związku z memnopeptydów wed ł ug wynalazku.

Co najmniej jeden związek z memnopeptydów według wynalazku ogólnie można podawać w postaci nierozcień czonej. Zastosowanie jego jako mieszaniny z odpowiednimi zaróbkami lub noś nikami jest jedną z odmian niniejszego wynalazku. Nośnikami, które mogą być stosowane w środkach farmaceutycznych, są stosowane zwykle i dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i/lub zaróbki.

Ogólnie, środki farmaceutyczne według wynalazku można podawać doustnie lub pozajelitowo, ale możliwe jest także ich podawanie odbytnicze. Odpowiednimi postaciami stałego lub ciekłego preparatu farmaceutycznego są na przykład granulki, proszki, tabletki, tabletki powlekane, (mikro)kapsułki, czopki, syropy, emulsje, zawiesiny, aerozole, krople lub roztwory do zastrzyków w postaci ampułek oraz preparaty o chronionym uwalnianiu związku aktywnego, do wytwarzania których stosuje się zwykle nośniki i dodatki i/lub zaróbki, takie jak: substancje ułatwiające rozpad, spoiwa, środki powłokowe, środki spęczniające, środki poślizgowe lub smarne, substancje zapachowe, słodzące lub ułatwiające rozpuszczanie.

Często stosowanymi nośnikami lub zaróbkami, jakie można wymienić, są na przykład węglan magnezu, ditlenek tytanu, laktoza, mannit i inne cukry, talk, laktoproteina, żelatyna, skrobia, witaminy, celuloza i jej pochodne, oleje zwierzęce i roślinne, glikole polietylenowe i rozpuszczalniki, jak sterylna woda, alkohole, glicerol i alkohole wielowodorotlenowe.

Jeśli to jest potrzebne, jednostki dawkowania można mikrokapsułkować do podawania doustnego w celu opóźnienia uwalniania lub w celu przedłużenia go na dłuższe okresy czasu, na przykład przez powlekanie lub zatapianie związku aktywnego w postaci cząsteczek w odpowiednich polimerach, woskach lub tym podobnych.

W innym wariancie wynalazku, można wytwarzać preparaty farmaceutyczne i podawać je w postaci jednostek dawkowania zawierających, jako składnik aktywny, określoną dawkę co najmniej jednego związku memnopeptydowego według wynalazku. W przypadku stałych jednostek dawkowania, jak tabletki, kapsułki i czopki, dawka ta może dochodzić do około 500 mg, ale zwykle może wynosić

PL 206 818 B1 od około 0,1 mg do około 200 mg, a w przypadku roztworów do zastrzyków w postaci ampułek do około 200 mg, ale zwykle od około 0,5 mg do 100 mg dziennie.

Dzienną dawkę podaje się ogólnie w zależności od ciężaru ciała, wieku, płci i stanu osoby. Jednak w pewnych warunkach można także stosować większe lub mniejsze dzienne dawki. Podawanie dawek dziennych można wykonać zarówno przez jednorazowe podawanie w postaci jednej jednostki dawkowania lub w postaci pewnej liczby mniejszych jednostek dawkowania lub przez wielokrotne podawanie podzielonych dawek w określonych odstępach czasu.

Środki farmaceutyczne według wynalazku można wytwarzać przez doprowadzenie co najmniej jednego związku memnopeptydowego według wynalazku do odpowiedniej postaci dawkowania przy użyciu zwykłych nośników i, jeśli to jest potrzebne, dodatków i/lub zaróbek.

Wynalazek przedstawiono ponadto w następujących przykładach. Podane ilości procentowe są procentami wagowymi. Stosunki mieszania, w przypadku cieczy, dotyczą objętości, jeśli nie podano innych szczegółów.

Następujące przykłady przedstawiają wynalazek, ale nie ograniczają jego zakresu.

Przykłady.

P r z y k ł a d 1.

Wytwarzanie pożywki glicerynowej Memnoniella echinata FH2272, DSF 13195.

100 ml roztworu pożywki (zawierający 2,0% ekstraktu słodu, 0,2% ekstraktu drożdży, 1,0% glukozy, 0,05% (NH4)2HPO4, pH 6,0) w sterylnej 300 ml kolbie Erlenmeyera zaszczepiono za pomocą szczepu Memnoniella echinata FH2272, DSF 13195 i inkubowano na obrotowej wytrząsarce w temperaturze 25°C i przy 140 obrotów na minutę w ciągu 7 dni. 1,5 ml tej pożywki rozcieńczano następnie za pomocą 2,5 ml 80% gliceryny i przechowywano w temperaturze -20°C.

P r z y k ł a d 2.

Wytwarzanie w kolbie Erlenmeyera hodowli lub wstępnej hodowli Memnoniella echinata FH2272, DSF 13195.

Sterylną 300 ml kolbę Erlenmeyera, zawierającą 100 ml następującego roztworu pożywki: 10 g/l glukozy, 5 g/l peptonu kazeiny, 1,7 g/l ciekłej moczonej kukurydzy i 7 ml roztworu śladowych ilości pierwiastków (10 g/l KCl, 10 g/l MgSO₄x7H₂O, 3,6 g/l FeSO₄x7H₂O i 6 g/l MgSO₄-H₂O) zaszczepiono za pomocą pożywki hodowanej w nachylonej rurce (ten sam roztwór pożywki, lecz zawierający 2% agaru) lub za pomocą 1 ml pożywki glicerynowej (patrz przykład 1) i inkubowano w wytrząsarce w temperaturze 30°C i przy 180 obrotów na minutę. Największą wydajność co najmniej jednego związku z memnopeptydów według wynalazku uzyskano po około 120 h. Do zaszczepienia 10 litrowych i 200 litrowych kadzi fermentacyjnych wystarczała hodowla w zanurzeniu w ciągu od 48 h do 90 h (ilość szczepienia około 10%) z tego samego roztworu pożywki.

P r z y k ł a d 3

Wytwarzanie memnopeptydów.

litrowa kadź fermentacyjna pracowała w następujących warunkach:

Środowisko pożywki:

g/l glukozy

0,5 g/l peptonu kazeiny

1,7 g/l ciekłej moczonej kukurydzy ml roztworu pierwiastków śladowych pH 6,5 (przed sterylizacją)

Roztwór pierwiastków śladowych:

g/l KCl, 10 g/l MgSO4x7H2O, 3,6 g/l FeSO4x7H2O i 6 g/l MnSO4xH2O

Czas inkubacji: 45 h

Temperatura inkubacji: 28°C

Szybkość mieszadła: 300 obrotów na minutę

Napowietrzanie: 15 l/min

Tworzenie się piany ewentualnie zmniejszono przez powtarzane wprowadzanie etanolowego roztworu poliolu. Największą wydajność uzyskano po czasie od około 35 h do około 70 h.

P r z y k ł a d 4.

Wydzielanie mieszaniny memnopeptydów z roztworu pożywki Memnoniella echinata FH2272, DSF 13195.

Po zakończeniu fermentacji Memnoniella echinata FH2272, DSF 13195 200 litrów pożywki bulionowej z kadzi fermentacyjnej otrzymanej według przykładu 3 przesączono z dodatkiem około 2%

PL 206 818 B1 pomocniczego materiału filtracyjnego (na przykład Celite®) i 22 litry masy komórek ekstrahowano za pomocą 66 litrów metanolu. Metanolowy roztwór zawierający cenną substancję uwolniono od grzybni przez przesączenie i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Koncentrat rozcieńczono wodą i wprowadzono do 17 litrowej kolumny MCI GEL, CHP20P razem z 180 litrów przesączu pożywki. Kolumnę eluowano w gradiencie wodnym od 60% propanolu-2 w wodzie. Przepływ z kolumny, 25 l/h, zbierano w postaci frakcji, po 10 litrów każ da, i połączono frakcje (od 25% do 30% propanolu-2) zawierają ce memnopeptyd.

Po zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano 20 litrów brązowego roztworu. Do kolumny o wymiarach 125 mm x 500 mm wprowadzono 6 litrów wymieniacza kationowego Fractogel® EMD SO3^-, doprowadzanego do równowagi przy pH 7 za pomocą buforu fosforanu potasu. Po obciążeniu wymieniacza jonowego 20 litrami opisanego powyżej koncentratu, eluowano go w gradiencie za pomocą od 10 mM buforu fosforanu potasu, pH 7, do 1 M NaCl w 10 mM buforu fosforanu potasu, pH 7, w wodzie/metanolu = 1:1. Przepł yw z kolumny, to jest materiał niezwią zany, zawierał 49 g memnopeptydów. Przepływ z kolumny wynosił 12 l/h, zbierano 1 litrowe porcje w postaci frakcji podczas eluowania gradientowego. Memnopeptyd A (frakcje 31 i 32) otrzymano przy użyciu 0,75 M NaCl. Frakcje 31 i 32 połączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości około 500 ml.

P r z y k ł a d 5.

Wzbogacenie memnopeptydu A metodą chromatografii żelowej.

g produktu otrzymanego wedł ug przykł adu 4 wprowadzono do kolumny (szerokość x wysokość = 10 cm x 50 cm) o pojemności 3,9 litrów, zawierającej Fractogel® TSK HW-40s. Eluent metanol/woda = 1:1 pompowano przez kolumnę z szybkością przepływu 20 ml/min i wypływ z kolumny zbierano w postaci 20 ml frakcji. Memnopeptydy A znajdowały się przeważnie we frakcjach od 75 do 85. Połączono je i usunięto metanol pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano 0,9 g mieszaniny aktywnego związku.

P r z y k ł a d 6.

Układ HPLC do wykrywania memnopeptydów.

Opisany poniżej układ umożliwił badanie czystości oraz rozdzielenie i oznaczenie ilościowe memnopeptydów, na przykład w surowej mieszaninie lub w przesączach pożywki.

Eluent: 0,1 proc. kwas trifluorooctowy w 32 proc. acetonitrylu.

Kolumna: Nucleosil 10018AB 250/4, Macherey-Nagel.

Przepływ: 1,0 ml/min.

Detekcja: absorpcja UV przy 210 nm.

W podanych warunkach memnopeptyd A może mieć nastę pujący czas retencji: Memnopeptyd A: 7,0 minut.

P r z y k ł a d 7.

Oczyszczanie memnopeptydu A.

500 ml roztworu memnopeptydu A wydzielonego i wzbogaconego według przykładu 5 naniesiono na 500 ml kolumnę Nucleosil® 100-7 C18AB i chromatografowano, stosując gradient od 25% do 50% acetonitrylu w 0,05% mieszaninie kwas trifluorooctowy/woda. Przepływ eluentu wynosił 50 ml/min; wielkość frakcji 50 ml. Memnopeptyd A znaleziono we frakcjach od 71 do 88. Po powtórnym oczyszczaniu połączonych frakcji przy stałym stężeniu rozpuszczalnika 28% acetonitrylu w 0,05% kwasie trifluorooctowym otrzymano po suszeniu sublimacyjnym 100 mg memnopeptydu C o czystości >95%.

Właściwości memnopeptydu A.

ng memnopeptydu A zhydrolizowano we wrzącym kwasie solnym i zbadano w analizatorze aminokwasów. Znaleziono następujące zwykłe aminokwasy:

kwas glutaminowy 11 nMol prolina 22 nMol histydyna 10 nMol leucyna 5,6 nMol tlenek metioniny 5,5 nMol absorpcja UV: X_max przy 269 nm, 305 nm (występ).

Widmo masowe FAB dużej rozdzielczości wykazało intensywne MH⁺ dla wartości m/z = 1765, 7819 Da, o dobrej zgodności z obliczoną masą (dla monoizotopowego C76H109N16O18S). Wyniki analizy MS/MS-fragmentacja odpowiadały wzorowi (IVa).

PL 206 818 B1

TRAKTAT BUDAPESZTAŃSKI O MIĘDZYNARODOWYM PRZYJMOWANIU DEPOZYTÓW MIKROORGANIZMÓW DO CELÓW POSTĘPOWANIA PATENTOWEGO

Formularz międzynarodowy

Hoechst Marion Roussel

Deutschland GmbH

65926 Frankfurt

POTWIERDZENIE PRZYJĘCIA PIERWOTNEGO DEPOZYTU wydane stosownie do reguły 7.1 przez MIĘDZYNARODOWY ORGAN DEPOZYTOWY zidentyfikowany na dole tej strony

Identyfikacja mikroorganizmu
I. Oznaczenie identyfikcyjne nadane przez depozytora: FH 2272	Numer rejestracyjny nadany przez MIĘDZYNARODOWY ORGAN DEPOZYTOWY: DSM 13195
II. NAUKOWY OPIS i/LUB PROPONOWANE OZNACZENIE TAKSONOMICZNE
Do mikroorganizmu zidentyfikowanego w pkt. I powyżej załączono: ( ) opis naukowy (x) proponowane oznaczenie taksonomiczne (zaznaczyć x jeżeli ma zastosowanie)
III. PRZYJĘCIE I AKCEPTACJA
Niniejszy Międzynarodowy Organ Depozytowy akceptuje mikroorganizm zidentyfikowany w pkt. I powyżej, otrzymany dnia 1999-12-09 (data pierwotnego depozytu)¹.
IV. PRZYJĘCIE PROŚBY 0 PRZEKSZTAŁCENIE
Niniejszy Międzynarodowy Organ Depozytowy otrzymał mikroorganizm zidentyfikowany w pkt. I powyżej dnia (data pierwotnego depozytu), a prośbę o przekształcenie pierwotnego depozytu w depozyt w rozumieniu Układu Budapesztańskiego otrzymał on dnia (data przyjęcia prośby o przekształcenie).
V. MIĘDZYNARODOWY ORGAN DEPOZYTOWY
Nazwa DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Adres Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig	Podpis(y) osoby (osób) posiadających upoważnienie do reprezentowania Międzynarodowego Organu Depozytowego lub upoważnionego (ych) urzędnika (ów) (-) podpis nieczytelny data: 1999-12-14

Tam, gdzie aktualna jest reguła 6.4 (d), datą tą jest data nabycia statusu Międzynarodowego Organu Depozytowego

Formularz DSMZ-BP/4 (strona pojedyncza) 0196

PL 206 818 B1

TRAKTAT BUDAPESZTAŃSKIO MIĘDZYNARODOWYM PRZYJMOWANIU DEPOZYTÓW MIKROORGANIZMÓW DO CELÓW POSTĘPOWANIA PATENTOWEGO

Formularz międzynarodowy

Hoechst Marion Roussel

Deutschland GmbH

65926 Frankfurt

OŚWIADCZENIE O ŻYWOTNOŚCI wydane stosownie do reguły 10.2 przez MIĘDZYNARODOWY ORGAN DEPOZYTOWY zidentyfikowany na dole tej strony

I. DEPONUJĄCY	II. IDENTYFIKACJA MIKROORGANIZMU
Nazwa: Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH Adres: 65926 Frankfurt/nad Menem	Numer rejestracyjny nadany przez MIĘDZYNARODOWY ORGAN DEPOZYTOWY: DSM 13195 Data zdeponowania lub przeniesienia ^x: 1999-12-09
II. OŚWIADCZENIE 0 ŻYWOTNOŚCI
Żywotność mikroorganizmu zidentyfikowanego w pkt. II powyżej sprawdzono dnia 1999-12-09². W dniu tym mikroorganizm był: (x)³ żywotny ( )³ niezdolny dalej do życia.
IV. WARUNKI PRZEPROWADZENIA TESTU ŻYWOTNOŚCI⁴

V. MIĘDZYNARODOWY ORGAN DEPOZYTOWY
Nazwa DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Adres Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig	Podpis(y) osoby (osób) posiadających upoważnienie do reprezentowania Międzynarodowego Organu Depozytowego lub upoważnionego (ych) urzędnika (ów) (-) podpis nieczytelny data: 1999-12-14

¹ Wskazuje datę pierwotnego zdeponowania. Jeżeli dokonano nowego depozytu lub przeniesienia, podać najświeższą odnośną datę (datę nowego depozytu lub datę przeniesienia).

“ W przypadkach odnoszących się do reguły 10.2(a)(ii) i (iii), odnosi się do najświeższego testu żywotności.

³ Zaznaczyć x jeżeli ma zastosowanie.

⁴ Wypełnić, jeżeli informacja ta jest żądana, lub jeżeli wyniki testu okazały się negatywne.

Formularz DSMZ-BP/9 (strona pojedyncza) 0196

PL 206 818 B1

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Związek o wzorze (I) w którym

R1 i R2 razem oznaczają podwójnie związany O, albo oba oznaczają H, albo H i OH, albo H i O-C1-C4-alkil;

R3 i R4 razem oznaczają podwójnie związany O, albo oba oznaczają H, albo H i OH, albo H i O-C1-C4-alkil;

R8 jest wybrany z H, OH, C1-C4-alkilu i O-C1-C4-alkilu;

R6 oznacza grupę wybraną z grupy o wzorze (II) w którym R9, jest wybrany z atomu H i glikozydowo zwią zanego cukru, i wybrany z grupy o wzorze (III) w którym R10 oznacza H albo glikozydowo zwią zany cukier; i w którym, jeśli R6 oznacza grupę o wzorze (II), to R5 oznacza wiązanie z atomem węgla C9 we wzorze (II) i R7 oznacza atom wodoru, albo R7 oznacza wiązanie z atomem węgla C9 we wzorze (II) i R5 oznacza H, i jeśli R6 oznacza grupę o wzorze III, to obie grupy R5 i R7 oznaczają atomy wodoru;

A oznacza naturalny aminokwas wybrany z grupy obejmuj ącej Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Ser,

Thr, Phe, Tyr. Trp, Lys, Arg, Asp, His, Glu, Asn, Gln, Cys i Met:

n oznacza liczbę cał kowitą wybraną z liczb od 2 do 12, przy czym każ de A jest takie same albo różne od każdego innego A;

w którym atom azotu w pierścieniu izoindolu o wzorze (I) oznacza N-końcowy azot aminowy pierwszego aminokwasu z grupy (A)n; (A)n jest łańcuchem peptydowym, albo jego sól.
2. Zwią zek wedł ug zastrz. 1, o wzorze (IV)

PL 206 818 B1 w którym grupy R1, R2, R3, R4, R8, R9 i (A)n są okreś lone według zastrz. 1, albo jego sól.
3. Związek według zastrz. 2, albo jego sól, znamienny tym, że R1 i R2 razem oznaczają podwójnie związany O, R3 i R4 oba oznaczają H i R9 oznacza H.
4. Związek według zastrz. 1, o wzorze (V) w którym grupy R1, R2, R3, R4, R5, R7, R8, R10 i (A)n mają znaczenia określone według zastrz. 1, albo jego sól.
5. Związek według dowolnego z poprzednich zastrz., albo jego sól, znamienny tym, ż e (A)n oznacza łańcuch peptydowy zawierający sekwencję aminokwasu: Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-LeuPro-Pro (SEQ ID NO:1), w której Met oznacza grupę ewentualnie utlenioną do sulfotlenku.
6. Zwią zek według dowolnego z poprzednich zastrz., albo jego sól, znamienny tym, ż e R9 lub R10 oznacza aldoheksozę.
7. Związek według zastrz. 1, o wzorze (IVb) w którym (A)n ma znaczenie podane według zastrz. 1.
8. Związek według zastrz. 1, memnopeptyd A, C76H109N16O18S, o wzorze (IVa) albo jego sól.

PL 206 818 B1
9. Związek według zastrz.1-8, znamienny tym, że (A)n jest sekwencją aminokwasów Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro (SEQ ID NO:1).
10. Związek według zastrz. 9, znamienny tym, że metionina (Met) jest utleniona do sulfotlenku.
11. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera co najmniej jeden związek o wzorze (I), określony w zastrz. 1-10, oraz dopuszczalny nośnik.
12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że wymieniona kompozycja jest kompozycją farmaceutyczną i wymieniony nośnik jest nośnikiem dopuszczalnym farmaceutycznie.
13. Sposób wytwarzania związku o wzorze (I), albo jego soli, określonego w zastrz. 1-10, znamienny tym, że obejmuje hodowlę Memnoniella echinata FH2272, DSF 13195, w odpowiednich warunkach w pożywce, zawierającej co najmniej jedno źródło atomów węgla i co najmniej jedno źródło atomów azotu, dopóki co najmniej związek o wzorze (I) jest obecny w pożywce, i z następnym wydzieleniem wymienionego związku.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje konwersję związku do co najmniej jednej postaci chemicznej wybranej z soli dopuszczalnych fizjologicznie.
15. Sposób według zastrz. 13 albo 14, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w warunkach aerobowych.
16. Sposób według dowolnego z zastrz. 13-15, znamienny tym, że co najmniej jedno źródło atomów azotu wybiera się z aminokwasów i peptydów.
17. Sposób według dowolnego z zastrz. 13-16, znamienny tym, że wymieniona pożywka zawiera pepton kazeiny w stężeniu od około 0,05% wagowych do około 5% wagowych w stosunku do całej ilości roztworu pożywki.
18. Sposób według dowolnego z zastrz. 13-17, znamienny tym, że wymieniona pożywka zawiera pepton kazeiny, glukozę, moczoną kukurydzę i śladowe ilości chlorku potasu, siarczanu magnezu i siarczanu żelaza.
19. Zastosowanie związku o wzorze (I) albo jego soli, określonego w zastrz. 1-10, do wytwarzania leku do leczenia niewydolności serca.
20. Zastosowanie związku o wzorze (I) albo jego soli, określonego w zastrz. 1-10, do wytwarzania leku do leczenia choroby, której pierwotną lub wtórną przyczyną jest niewydolność serca.
21. Zastosowanie związku o wzorze (I) albo jego soli, określonego w zastrz. 1-10, do wytwarzania leku do leczenia cukrzycy.
22. Zastosowanie związku o wzorze (I) albo jego soli, określonego w zastrz. 1-10, do wytwarzania leku do leczenia zakażenia bakteryjnego.