CZ20022904A3

CZ20022904A3 - Memnopeptidy, způsob jejich přípravy a kompozice a léčiva, které je obsahují

Info

Publication number: CZ20022904A3
Application number: CZ20022904A
Authority: CZ
Inventors: Laszlo Vertesy; Herbert Kogler; Astrid Markus; Matthias Schiell
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 2000-02-29
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2002-11-13
Also published as: EE05406B1; SK12262002A3; CZ303552B6; WO2001064715A3; HRP20020703A2; BR0108757A; MEP59108A; ES2254394T3; EP1261625A2; MXPA02007845A; KR100997073B1; NZ521036A; CN1406243A; HUP0204584A3; EP1261625B1; RU2261254C2; AU2001250318B2; ZA200206841B; HK1052712B; HUP0204584A2

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká 'nových peptidových derivátů, zvaných memnopeptidy, které lze získat fermentací Memnoniella echinata FH2272, tj. DSM 13195, v kultivačním mediu, způsobu přípravy memnopeptidů a použití memnopeptidů jako léčiv, např. pro přípravu léčiv k léčení srdeční nedostatečnosti.

Dosavadní stav techniky

Kardiovaskulární poruchy se stále ještě umisťují jako první v příčinách úmrtí v západních průmyslových zemích. Nezanedbatelnou část tvoří pacienti s diagnózou srdeční nedostatečnosti. Srdeční nedostatečností se rozumí nepřiměřená činnost srdce. Srdce není schopné produkovat výdej, který by odpovídal požadavkům savce. Srdeční nedostatečnost je akutní nebo chronická neschopnost srdce, při zátěži či dokonce v klidu, shromáždit výdej krve nezbytný pro metabolismus nebo pojmout venózní návrat. Je to srdeční stav, při němž kompenzační mechanismy, jako jsou frkvence srdeční, tepový objem nebo zvýšení krevního tlaku, již dále nepostačují pro udržení normálního srdečního výdeje. Nedostatečnost srdeční má širokou škálu příčin, například zánětlivé nebo degenerativní myokardiální (srdečního svalu) změny, koronární cirkulační poruchy a infarkt myokardu. Srdeční nedostatečnost vede ke změnám v periferním oběhu, poruše dýchání, funkce ledvin a elektrolytové rovnováhy a také snižuje sílu kosterního svalstva, a konečně, často vede k úmrtí.

Nedostatečnost srdeční se obecně vyskytuje v pokročilém věku. Incidence činí 3 poruchy na 1000 obyvatel ročně ve věku 35 až 64 let a 10 poruch na 1000 obyvatel ročně ve věkové skupině od 65 do 94 let. Mortalita se ve věku 75 let zvyšuje « » ♦ · · ·

- 2 téměř ο faktor 200 v porovnání s věkovou skupinou mezi 35 a 44 roky. Míra mortality se mezi lety 1970 a 1983 udržovala přibližně na konstantní úrovni, jak ukázaly studie provedené v USA. Pro Spolkovou Republiku Německo se předpokládají stejná čísla. Více než 50 % pacientů umírá v prvních pěti letech po určení diagnózy. Tato statistická šetření ukazují vysokou závažnost srdeční nedostatečnosti pro populaci, avšak potvrzují také nedostatečné možnosti lékařského ošetření, jež jsou dnes ošetřujícímu lékaři dostupné.

Vzhledem k nedostatečnosti současných způsobů léčby, byly nalezeny nové koncepty, které by mohly vést k novým srdečním léčebným prostředkům. Schopnost srdečního a kosterního svalstva kontrahovati se, a tak vykonat mechanickou práci, je závislá na

1) kontraktilních strukturních prvcích (myofibrily) a

2) chemické energii (ATP) dostupné myofibrilám, která se během procesu kontrakce převádí na energii mechanickou. Během procesu kontrakce dochází ke zkracování myofibril. Toto může být vyvoláno motorickými nervovými impulsy, jejichž působením vápníkové ionty (Ca²⁺) během několika málo milisekund vstupují z extracelulárního prostoru do prostoru sarkoplasmatického a zásoby vápníku se vyprazdňují. Při myokardiální nedostatečnosti (srdeční nedostatečnosti) může být koncentrace Ca²⁺ v myofibrilách snížena. Ionty Ca²⁺jsou však pro aktivaci kontraktilního aparátu nepostradatelné. Pokud je zvýšená poptávka, Ca²⁺ jsou obecně pumpovány do sarkoplasmatického retikula (SR) za katalýzy membránové Ca²⁺dependentní Mg²⁺ ATPázy, tento enzym je také nazýván jako Ca²⁺ATPáza sarko(endo)plasmatického retikula (SERCA2). Podle hydropatické analýzy obsahuje Ca²⁺ ATPáza deset transmembránových spirál a mnoho extramembránových smyček. Na cytosolové straně se tvoří domény pro vazbu Ca²⁺ a ATP, pro fosforylaci a pro interakci s modulátorový protein fosfolamban (PLB). Posledně jmenovaný je proteinový pentamer, který je umístěn v membráně sarkoplasmatického retikula (SR) a vykazuje • · · · v nefosforylovaném stavu inhibiční vliv na SERCA2. Při fyziologickém stresu probíhá fosforylace PLB, která zvyšuje afinitu SERCA2 k Ca²⁺, a tak zvyšuje rychlost transportu Ca²⁺ v sarkoplasmatickém retikulu (SR). Fosforylace PLB, tj. proteinu obsahujícího 52 aminokyselin, probíhá na dvou aminokyselinových zbytcích: serin-16 může být fosforylován pomocí cAMP dependentní proteinkinázy a threonin může být fosforylován v pozici 17 pomocí Ca²⁺/kalmodulin dependentní kinázy. Fosforylace způsobuje změnu v konfirmaci PLB, následovanou zvýšenou afinitou SERCA2 vůči Ca²⁺. Anti-PLB protilátky jsou schopné napodobit PLB fosforylační účinek, a tak potvrdit klíčovou roli PLB jako regulátoru kontraktilní aktivity srdce (Phospholamban: Protein Structure, Mechanism of Action and Role in Cardiac Function, Η. K. Simmerman a L. R. Jones, Physiological Reviews, sv. 78, č. 4, 921ff, 1998). Aktivátory SERCA by proto měly příznivě působit na srdeční nedostatečnost .

Bylo překvapivě zjištěno, že kultury kmene hub Memnoniella echinata FH 2272, tj. DSM 13195, obsahují přirozené látky, které jsou schopné vykazovat příznivé účinky na srdce a cirkulaci. Izolované účinné látky, tj. memnopeptidy, jsou přirozené látky obsahující specifické skupiny složek. Tyto skupiny složek zahrnují terpenové jednotky, tzv. polyketidovou skupinu a skupinu obsahující dusík.

Terpeny jsou přirozeně se vyskytující sloučeniny, které lze formálně interpretovat jako polymerační produkty uhlovodíku isoprenu. Podle počtu isoprenových skupin lze rozlišovat monoterpeny, obsahující 10 uhlíkových atomů, sesquiterpeny, obsahující 15 uhlíkových atomů, diterpeny, obsahující 20 uhlíkových atomů, atd. Z mateřské struktury lze vytvořit velký počet sloučenin pomocí substituce, cyklizace, přeskupení, oxidace atd.; proto je v literatuře popsáno mnoho tisíc terpenů. Sloučeniny obsahující dusík a pocházející z terpenů byly také publikovány, avšak počítají se mezi • · · · alkaloidy, např. gentianové alkaloidy (Rómpp Chemie Lexikon (Rómpp's Chemical Encyclopedia), 9. vydání, sv. 6, str. 4508 ff., Georg Thieme Verlag, Stuttgart/New York, 1992). Tyto terpeny se však podstatně liší od memnopeptidů podle vynálezu, kde terpeny neobsahují polyketidovou skupinu, jejíž prostřednictvím mohou vázat dusík.

Příklady dalších známých terpenů obsahujících dusík jsou: stachybociny (J. Antibiotics, 48: str. 1396, 1995); stachybotriny (Y. Nozawa a kol., J. Antibiotics, 50: str. 635 až 645, 1997);

spirodihydrobenzofuranové laktamy (J. Antibiotics, 49: str. 13, 1996);

- nakijichinony (Tetrahedron, 51: str. 10867 až 10874, 1995); F1839-A až J, t j. terpeny s polyketidovými skupinami obsahující dusík (japonský patent 061864133 a 08283118). Jsou to inhibitory cholesterolesterázy.

Tyto terpeny byly syntetizovány z různých kmenů rodů

Memnoniella echinata a Stachybotrys a jiných. Byly popsány jako antagonisté endothelinových receptorů, jako inhibitory HIV-1 proteázy a cholesterolesterázy a jako vlasová tonika. Dále byl z kultur kmene Memnoniella echinata, ATCC 20928, izolován inhibitor inositolmonofosfatázy L-671,776 (Y. K. T.

Lam a kol. J. Antibiotics, 45, str^-. 1397 až 1402, 1992) .

Memnopeptidy podle vynálezu mají rozličné spektrum účinků.

Význačnou vlastností je jejich aktivační účinek na SERCA2, a tím na srdeční nedostatečnost.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se proto týká sloučenin obecného vzorce I • · • · · · · ·

ve kterém

Ri 'a R₂ společně znamenají dvojnou vazbou kyslíku, nebo dva atomy vodíku, nebo hydroxylovou skupinu, nebo atom vodíku skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy;

(I), navázaný atom atom vodíku a a O-alkylovou

R3 a R₄ společně znamenají dvojnou vazbou navázaný atom kyslíku, nebo dva atomy vodíku, nebo atom vodíku a hydroxylovou skupinu, nebo atom vodíku a O-alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy;

Rs se zvolí ze skupiny zahrnující atom vodíku, hydroxylovou skupinu, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy a O-alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, jako je O-methylová skupina;

R6 znamená skupinu obecného vzorce II

CH, (II), ve kterém

Rg znamená atom vodíku nebo glykosidicky vázaný cukr, nebo skupinu obecného vzorce III

(III), • · • · · · ve kterém

Rio znamená atom vodíku nebo glykosidicky vázaný cukr; přičemž pokud R6 znamená skupinu obecného vzorce II, pak R₅ znamená vazbu k uhlíkovému atomu C9 obecného vzorce II a R₇znamená atom vodíku nebo R₇_ znamená vazbu k uhlíkovému atomu C9 obecného vzorce II a R5 znamená atom vodíku, a pokud R₆ znamená skupinu obecného vzorce III, pak R₅ a R₇znamenají atom vodíku;

A znamená aminokyselinu;

n znamená celé číslo zvolené ze skupiny zahrnující čísla 1 až 12, přičemž význam každého symbolu A je stejný či odlišný od každého jiného symbolu A; přičemž dusíkový atom v isoindolovém kruhu obecného vzorce I je Nterminální aminový dusík první aminokyseliny ze skupiny (A)_n;

nebo jejich solí či derivátů; s tou výhradou, že

A znamená jinou aminokyselinu než Glu, pokud n je 1, a R_x a R2 společně znamenají dvojnou vazbou navázaný atom kyslíku, a R₃ a R₄ znamenají společně dva atomy vodíku, a R6 znamená skupinu obecného vzorce II, a R5 znamená vazbu k uhlíkovému atomu C9 skupiny obecného vzorce II, a R₇znamená atom vodíku, a R₈ znamená atom vodíku a Rg znamená atom vodíku.

V obecném vzorci I může symbol (A)_n znamenat alespoň jednu přirozenou aminokyselinu zvolenou ze skupiny zahrnující: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Ser, Thr, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, • · · · ·· ·· • · ·

Asp, His, Glu, Asn, Gin, Cys a Met. Symbol (A)_n může znamenat peptidový řetězec obsahující 2 až 12 aminokyselin. Podle jednoho provedení obsahuje (A)_n 10 aminokyselin.

Alkylová skupina obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy je alkylová skupina s přímým řetězcem nebo rozvětvená alkylová skupina obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, jako jsou, methylová skupina, ethylová skupina, isopropylová skupina a terč.butylová skupina.

Cukrem může být hexóza, například aldohexóza, jako jsou mannóza, glukóza nebo galaktóza, která může být popřípadě substituovaná dalšími skupinami, jako je alkylová skupina obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy a aminoskupina.

Předkládaný vynález se dále týká všech odvoditelných derivátů sloučenin obecného vzorce I. Deriváty jsou soli, redukční produkty, estery, ethery, acetaly a rovněž tak amidy a N-alkylační produkty, dále . všech optických antipodů, diastereomerů a všech stereomerních forem.

Podle jednoho provedení má sloučenina obecného vzorce I obecný vzorec IV

kde symboly Ri, R₂, R3, R«# R9 a (A)_n mají významy uvedené výše.

• · · · ♦ ·

V obecném vzorci IV mohou R_x a R₂ společně znamenat dvojnou vazbou navázaný atom kyslíku, R₃ a R₄ mohou společně znamenat dva atomy vodíku a Rg může znamenat atom vodíku.

Podle jednoho provedení je sloučeninou podle vynálezu memnopeptid A, C7₆Hio8Ni60i₈S, vzorce IVa

V tomto vzorci je dekalinová struktura obsahující 4methylovou skupinu a methylenovou skupinu terpenová skupina; substituovaný isoindolový kruh je ketidová skupina. Sekvence aminokyselin:

Met His Gin Pro His Gin Pro Leu Pro Pro (SEQ ID NO:1) (sekvence identifikační č. 1) je část kaseinové sekvence. Methionin (Met) může být oxidován na sulfoxid.

Obecný vzorec IVb ukazuje výhodnou prostorovou formu:

(ivb), ve kterém má symbol (A)_n významy uvedené výše.

Fyzikálněchemické a spektroskopické vlastnosti výhodné sloučeniny podle vynálezu lze shrnout následovně:

Memnopeptid A

Vzhled: bezbarvá látka rozpustná v polárních organických rozpouštědlech a ve vodě.

Je stabilní v neutrálním, mírně kyselém prostředí.

Empirický vzorec: molekulová hmotnost: Uv absorbce (X_max) : NMR data:

C76H108N16O18S,

1565,87,

270 nm, viz tabulka 1.

Číslování uhlíkových atomů a posuny jsou klasifikovány podle cyklické sesquiterpeny.

souvisej ící číslovacího

NMR chemické postupu pro

Schéma 1

Číslování cyklického sesquiterpenového ketolidu

·· ♦ · · ·

Tabulka 1

NMR data (chemické posuny) memnopeptidu A v perdeuterodimethylsulfoxidu (DMSO-dg) při 310K

	5-13C	m	δ-·>Η	m	ⁿJHH	nj_CH(10Hz)	přiřazení
1	15.42	q	0.668	d	1.802	1.802	Terpen -8-Me
2	15.72	q	0.978	s	-	2.035,1.763	Terpen -10-Me
3	20.37	t	1.409 1.460	m	2.035,1.538 2.035,	2.035	Terpen -6
4	21.43	q	0.873	d	1.678	1.678,1.428, 0.890	Leu8-5
5	22.25	q	0.827	s	0.918	0.918, 2.035	Terpen -4-Me
6	22.64 22.80	t t	2.182 2.307 2.19 2.31	ddt ddt ddt ddt	4.892,2.788 2.632 4.869, 2.757,2.635	4.892, 2.788, 2.632 4.869, 2.757, 2.635	Meťl-β
7	23.08	q	0.890	d	1.678	1.678, 1.428, 0.873	Leu8-8'
8	23.88 br	d	1.678	m	0.87, 0.88		Leu8-y
9	23.90	t	1.764 0.962	m m	0.962,1.416,1.871	0.978,1.416, 3.227	Terpen -1
10	24.22	t	1.910	m	2.144, 4.588, 3.467	2.144,1.771,4.588, 3.467,3.689	ΡΓΟθ-γ
11	24.32	t	1.863	m	2.031,1.798, 3.625	4.356, 3.625, 2.153,1.792	Pro⁴-y
12	24.37	t	1.927	m	(2.153),(1.814),3.624	4.388, 3.624, 1.814	Pro⁷ -γ
13	24.43	t	1.926	m	2.144, 1.840, 3.655, 3.538	4.224, 3.655, 3.538	ProtO-γ
14	24.77	t	1.840 1.416	m m	1.416, 1.740, 0.962 1.840, 0.926		Terpen -2
15	26.51	t	1.940 1.719	m m	1.719, 4.484,2.198 1.719, 4.484, 2.198	2.198	ΘΙη^-β
16	26.85	t	1.927 1.722	m m	1.722, 4.468, 2.166 1.927, 4.468,2.166	2.166	Glnó-β

• · • · · · · ·

17	27.04 br	t	2.976 3.067	dd dd	4.598		His5-p
18	27.09	t	2.937 3.067	dd dd	4.570	(4.570)	His^-p
19	27.50	t	2.144 1.771	m m	1.771,4.578,1.905, 1.945 2.144, 4.578,1.905, 1.945	1.945, 3.689,3.467, 4.578	Pro⁹-P
20	28.34	t	2.144 1.840	m m	1.840, 4.223,1.926 2.144,4.223,1.926	4223, 3.669, 3.533	Pro10-p
21	28.50	q	0.918	s	0.827	0.827	Terpen -4-Me
22	28.86 ·	t	1.798 2.031	m m	4.356, 2.031,(1.863)		Pro^.p
23	28.89	t	1.814 2.012	m m	2.012,4.388,(1.927) 1.814, 4.388,(1.927)	4.388, 3.646	Pro7-p
24	30.63	t	1.538 1.430	m m	1.430, 1.460, (1.409), (1.802) 1.538,1.460,1.802	0.667	Terpen -7
25	30.64	t	2.166	t	1.927, 1.722	1.927, 1.722, 4.466, 6.807	GInS-γ
26	30.65	t	2.192	t	1.940, 1.719	1.940,1.719, 4.489, 6.789	Gln^-y
27	31.62	t	3.154 2.792	d d	2.792 3.154	6.598	Terpen -11
28	36.43	d	1.802	ddq	1.538,1.430, 0.667	0.667, 2.790, 3.156	Terpen -8
29	37.22	s	-	-	-	0.903, 0.824	Terpen -4
30	37.73 37.84	q	2.548 2.546	s		2.682, 2.758 2.633, 2.783	Met1-_e
31	39.45	d	2.035	dd	1.409,1.460	0.903,0.824, 0.971	Terpen -5
32	40.07 40.03	t	1.428	dt	4.536,1.678	0.890, 0.873, 4.536	Leu⁸-p
33	41.71	s				3.156, 2.790, 0.977, (1.764), 2.035	Terpen -10
34	44.25	t	4.332	-	-	4.881	Terpen -8'
35	46.10	t	3.669 3.533		1.934	4.223, 2.147,1.934,1.851	Pro10-5
36	46.53	t	3.689 3.467	m m	1.905,1.936	4.588, 2.165, 1.781,1.936	Pro⁹-5
37	46.81	t	3.624	m	1.927	1.814, 4.388	Pro7-S
38	46.87	t	3.644	m	1.863	-	Pro<8
39	48.56	d	4.534	dt	7.918, 1.428	7.918, 1.428, 1.678	Leu⁸-a

• 4 · 4 · · ·

40	49.44 49.70	t t	2.682. 2.758 2.633, 2.783	ddt ddt ddt ddt	2.758, 2.162, 2.289 2.682, 2.162,2.289 2.783, 2.289,2.162 2.633, 2.289,2.162	4.892, 2.550 4.869, 2.545	Metl -y
41	50.18	d	4.466	dt	8.110,1.927,1.722	2.166	Gln^-a
42	50.31	d	4.484	dt	8.206,1.935,1.707	2.182	Gln^-a
43	51.37	d	4.570	ddd	8.135, 2.975,3.082	2.975, 3.082	His^-a
44	51.68	d	4.590 4.585	ddd	8.496, 2.934,3.067 8.506,2.934,3.067	2.934, 3.067	His^-a
45	53.30 53.62	d	4.892 4.869		2.162, 2.284 2.162, 2.284	2.162	Me0-a
46	57.33	d	4.588	dd	2.144,1.771	2.144,1.771,1.905, 1.945,3.684	Pro⁹-a
47	58.31	d	4.223	dd	2.144,1.840	3.669, 3.553,1.926, 2.144, (1.840)	ProlO-a
48	59.20	d	4.388	dd	2.012,1.814	2.012	Pro⁷-a
49	59.44	d	4.356	dd	2.031,1.798	3.635, 1.880	Pro⁴-a
50	73.50 73.51	d	3.227	dd	1.840,1.416	0.903, 0.824	Terpen -3
51	97.93 97.91	s				3.154, 2.792, 0.972, 0.668	Terpen -9
52	100.90 100.88	d	6.598 6.596	s			Terpen -3'
53	112.62 112.55	s				6.593,4.330	Terpen -5'
54	116.92 116.90	s				3.154, 2.792, 6.597	Terpen -Γ
55	116.95	d	7.230	s	8.655	(3.067), 2.937, 8.665	His2-e
56	117.26	d	7.322	s	8.771	3.092, 3.000, 8.771	Hís5-₆
57	129.32	s				8.783, 7.322, 3.083 2.976, 4.585	His5-y
58	129.63	s	-	-	-	7.230, 3.064, 2.937, 4.592	His^-y
59	133.00 132.98	s				4.330	1-4'
60	133.63	d	8.655	s	7.230	7.230	His2-8
61	133.68	d	8.771	s	7.320	7.320	Hís5-5
62	153.60 153.62	s				6.597, 3.157, 2.792	Terpen -2'
63	155.73	s	-	-	-	(6.597), 3.154, 2.792,	Terpen -6'

· ♦ ♦· · • · *

						4.330
64	168.11 168.07	s				6.597,4.330, 4.881	Terpen -7'
65	169.57	s	-	-	-	4.588, (4.223)	Pro^-CO
66	169.59	s	-	-	-	8.110, (4.570)	HisS-CO
67	169.69	s	-	-	-	4.534,1.444	Leu'8-CO
68	169.74	s	-	-	-	8.207, 2.937, 4.585	His^-CO
69	169.97 169.89	s				8.513, 4.869, 2.190 8.499, 4.892, 2.182	Med-CO
70	170.07	s	-	-	-	4.471,1.733, 1.924, 4.356	Gln3-CO
71	170.21	s	-	-	-	4.466,1.722,1.927, 4.388	GlnS-CO
72	170.99	s				4.538, 4.388, 2.012, 1.844, 7.918	Pro?-CO
73	171.32	s				8.138, 4.356, 2.003, 1.805, 4.570	Pro4-CO
74	173.10	s	-	-	-	4.225, 2.144,1.840	Pro1U-CO
75	173.80 173.81	s				2.19,1.93, 1.73	3-Gln-8-CO
76	173.88 173.86	s				7.26, 2.19, 1.93,1.73	4-Gln-8-CO
	OH		9.75	br		NOE: 6.598	Terpen -2'-OH
	NH		8.506 8.496	d d	4.585 4.590	NOE: 4.869/4.692	His^-NH
	NH		8.206	d	4.484	NOE : 3.072, 2.948, 4.588	Gln^a-NH
	NH		8.135	d	4.563		HisP-NH
	NH		8.110	d	4.470	NOE: 4.570, (4.470), 1.727, (1.927)	Gln^-NH
	NH		7.918	d	4.534	NOE :4.388,1.827, 1.688,1.427	LetANH
	NH2		7.260 6.807	s s	(6.807) (7.260)		Gln6-NH2
	nh₂		7.230 6.789	s s	(6.789) (7.230)		Gln³-NH₂

Podle jednoho provedení vynálezu lze sloučeniny obecného vzorce získat fermentaci Memnoniella echinata FH 2272, DSM ♦ · · ·

- 14 13195, nebo jedné z jejích variací nebo mutací, za vhodných podmínek v kultivačním mediu, dokud není alespoň jeden memnopeptid obecného vzorce I přítomen v kultivačním mediu, následovanou poté izolací memnopeptidů.

Předkládaný vynález se proto dále týká způsobu přípravy sloučeniny obecného vzorce I, který zahrnuje fermentací mikroorganismu Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195, nebo jedné z jeho variací či mutací, za vhodných podmínek v kultivačním mediu, dokud alespoň jeden memnopeptid obecného vzorce I není přítomen v kultivačním mediu a poté izolaci memnopeptidů z kultivačního media.

Podle jednoho provedení se kmen FH 2272, DSM 13195, jeho mutanty a varianty, fermentuje v živném roztoku (také zvaném kultivační medium) obsahujícím alespoň jeden zdroj uhlíkových atomů a alespoň jeden zdroj atomů dusíku a popřípadě obsahující obvyklé anorganické soli, dokud nejsou memnopeptidy přítomny v kultivačním mediu. Memnopeptidy lze poté izolovat z kultivačního media a popřípadě rozdělit na jednotlivé účinné složky a purifikovat. Podle jednoho provedení se memnopeptidy shromažďují v kultivačním mediu a rozdělí se na jednotlivé složky.

Podle jiného provedení se alespoň jeden zdroj atomů dusíku použitý pro kultivační medium zvolí ze skupiny zahrnující aminokyseliny a peptidy. Aminokyseliny a peptidy použité jako zdroje dusíkových atomů mohou být stejné jako skupina (A)_ndefinovaná výše.

Způsob podle vynálezu lze v laboratorním měřítku (rozsah použít pro mililitr až fermentací litr) a v průmyslovém měřítku (rozsah kubický metr)

Byla vypěstována silně produkující kolonie Memnoniella echinata FH 2272. Izolát byl uložen v Německé sbírce v · « · ♦ • » mikroorganismů a buněčných kultur s.r.o. (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Mascheroder Weg

1B, 3300 Brunswick, Německo, podle pravidel Budapešťské konvence 14. prosince 1999, pod následujícím číslem:

Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195.

Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195 , má hnědozelené mycelium a vyznačuje se konidiofořovými vlastnostmi rodu Memnoniella.

K syntéze alespoň jedné sloučeniny z memnopeptidů podle vynálezu lze použít také varianty a mutanty kmene Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195. Tyto'mutanty lze vytvořit způsoby o sobě známými pomocí fyzikálních prostředků, např. záření, jako např. ultrafialovými paprsky nebo rentgenovými paprsky, nebo pomocí chemických mutagenů, jako jsou ethylmethansulfonát (EMS), 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon (MOB) nebo N-methyl-N'— nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG). Mezi možné varianty patří blízce příbuzný druh Stachybotrys, jako jsou Stachybotrys atra, Stachybotrys chartarum nebo Stachybotrys complementi.

Hledání mutantů a variant, které syntetizují alespoň jednu sloučeninu z memnopeptidů podle vynálezu, lze provádět podle následujícího schématu:

separace mycelia po fermentaci;’ extrakce mycelia organickým rozpouštědlem;

- extrakce memnopeptidů z filtrátu kultury pomocí pevné fáze;

- analýza pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC), DC nebo testováním biologické aktivity.

Podmínky fermentace popsané níže lze aplikovat na houbu Memnoniella echinata FH 2272, uložený izolát DSM 13195 a její mutanty a varianty.

Podle jednoho provedení produkuje Memnoniella echinata FH 2272 memnopeptid A v živném roztoku obsahujícím alespoň jeden v · · » » 4 • · » · |·<<

zdroj uhlíkových atomů, kaseinový pepton jako zdroj dusíkových atomů a obvyklé anorganické soli. Memnoniella echinata FH 2272 je podle jednoho provedení DSM 13195.

Mezi možné zdroje uhlíkových atomů pro aerobní fermentaci patří asimilovatelné uhlohydráty a cukerné alkoholy, jako jsou glukóza, laktóza, sacharóza, škroby, dextriny, fruktóza, molázy, glycerol, galaktóza a D-mannitol, a přírodní produkty obsahující uhlovodany, jako je sladový extrakt. Mezi možné zdroje dusíkových atomů patří například aminokyseliny; peptidy; proteiny; degradační produkty aminokyselin, peptidů a proteinů, jako je kasein, peptony a tryptony; masové extrakty; kvasinkové extrakty; extrakty z arašídů; rozmělněná semena, například kukuřice, pšenice, bobů, sójy a bavlníku; kompozice obsahující semena; destilační zbytky z výroby alkoholu; masová moučka; kvasinkové extrakty; ammoniové soli a nitráty. Podle jednoho provedení se alespoň jeden zdroj dusíkových atomů zvolí ze synteticky získaných peptidů a biosynteticky získaných peptidů. Živný roztok popřípadě obsahuje alespoň jednu anorganickou sůl. Podle jednoho provedení se anorganická sůl zvolí ze skupiny zahrnující chloridy, uhličitany, sírany a fosforečnany. Sírany a fosforečnany lze zvolit ze skupiny zahrnující sírany alkalických kovů, fosforečnany alkalických kovů, sírany kovů alkalických zemin a fosforečnany kovů alkalických zemin, přičemž kovy alkalických zemin se zvolí ze skupiny zahrnující železo, zinek, kobalt a hořčík.

Tvorba memnopeptidů podle vynálezu může probíhat v živném roztoku obsahujícím kaseinový pepton. Podle jednoho provedení živný roztok obsahuje kaseinový pepton v koncentraci, která se pohybuje přibližně od 0,05 do 5 %. Jiné provedení zahrnuje koncentraci kaseinového peptonu pohybující se v rozmezí od 0,1 do 1 %. Další provedení zahrnuje koncentraci kaseinového peptonu pohybující se v rozmezí od 0,2 do 5 %. Živný roztok může obsahovat glukózu. Jedno provedení zahrnuje koncentraci glukózy pohybující se od 0,5 do 3 %. Živný roztok může také «· ··*· obsahovat kukuřičný výluh. Podle jednoho provedení obsahuje živný roztok kukuřičný výluh v koncentraci, která se pohybuje od 0,05 do 1 %. Jiné provedení zahrnuje koncentraci kukuřičného výluhu pohybující se od 0,1 do 0,5 %. Živný roztok může obsahovat stopu alespoň jedné složky zvolené ze skupiny zahrnující chlorid draselný, síran hořečnatý a síran železa.

Podle jednoho provedení obsahuje živný roztok kaseinový pepton, glukózu, kukuřičný výluh a stopu chloridu draselného, síranu hořečnatého a síranu železa. Podle jiného provedení obsahuje živný roztok kaseinový pepton v koncentraci, která se pohybuje v rozmezí přibližně od 0,05 do 5 %, glukózu v koncentraci pohybující se v rozmezí od 0,5 do 3 %, kukuřičný výluh v koncentraci pohybující se v rozmezí od 0,05 do 1 % a stopu chloridu draselného, síranu hořečnatého a síranu železa. Všechny údaje v procentech jsou udány v procentech hmotn. celkového živného roztoku.

V tomto živném roztoku vytváří Memnoniella echinata, kterou může být Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195, směs memnopeptidů. V závislosti na složení živného roztoku se může lišit kvantitativní podíl jednoho či více memnopeptidů podle vynálezu. Kromě toho lze syntézu jednotlivých memnopeptidů kontrolovat složením media tak, že se memnopeptid netvoří vůbec nebo se může tvořit v množství nižším než detekční limit mikroorganismu.

lze provádět protřepávání fermenterech, aerobně, t j . nebo míchání popřípadě se

Lze ji provádět při teplotě

Kultivaci mikroorganismů například ponořením pomocí v protřepávacích baňkách nebo zaváděním vzduchu nebo kyslíku, pohybující se přibližně v rozmezí 18 až 37° C, užším rozmezí přibližně od 20 do 32° C a ještě užším rozmezí přibližně od 25 do 30° C. Rozmezí pH by mělo být mezi 6 a 8, jako například mezi 6,5 a 7,5. Obecně se mikroorganismus kultivuje za těchto • · · · • · • · <

• · · ·

140 podmínek po dobu činící 24 až 300 hodin, zpravidla 36 až hodin.

Výhodně lze kultivaci provádět v mnoha stupních, tj. v živném mediu lze připravit alespoň jednu předkulturu a pak ji inokulovat do aktuálního produkčního media, tj. hlavní kultivace, například v obj. poměru 1:10. Předkulturu lze získat například inokulací mycelia do živného roztoku a ponecháním růst přibližně po dobu 36 až 120 hodin, jako např. po dobu 48 až 72 hodin. Mycelium lze získat například ponecháním kmene růst přibližně po dobu 3 až 40 dnů, jako např. 4 až 10 dnů, na pevném nebo v kapalném živném mediu, například slado-kvasinkovém agaru nebo bramborodextrózovém agaru (standardní medium pro plísňové houby, například od Difco).

Průběh fermentace lze monitorovat pomocí pH kultury nebo objemu mycelia a rovněž tak chromatografickými metodami, jako je tenkovrstvá chromatografie nebo vysokotlaká kapalinová chromatografie, nebo testováním biologické aktivity. Sloučenina podle vynálezu se může nacházet jak v myceliu, tak ve filtrátu kultury, avšak větší část se obvykle nachází ve filtrátu kultury.

Níže popsaný způsob izolace slouží k purifikaci memnopeptidů podle vynálezu, například memnopeptidu A. Izolaci či purifikaci memnopeptidu podle vynálezu z kultivačního media lze provádět známými způsoby, přičemž je nutno brát v potaz chemické, fyzikální a biologické vlastnosti přírodních látek. Pro testování koncentrací memnopeptidu v kultivačním mediu nebo v jednotlivých izolačních stupních lze použít tenkovrstvou chromatografií, například na silikagelu, s použitím směsi isopropanolu a 25% NH3 jako eluentu nebo HPLC. Detekci při tenkovrstvé chromatografické separaci lze provádět například pomocí barevných reagencií, jako je směs kyseliny • · • · • · tvořené chlorsulfonové a ledové kyseliny octové, množství látky se vhodně porovná s kalibračním roztokem.

K izolaci memnopeptidu podle vynálezu se obvykle nejprve mycelium vyjme z kultivačního bujónu pomocí obvyklých postupů a poté se memnopeptidy extrahují z buněčné hmoty pomocí organického rozpouštědla případně mísitelného s vodou. Fáze organického rozpouštědla obsahuje přírodní látky podle vynálezu; lze ji popřípadě koncentrovat ve vakuu a zbytek lze dále purifikovat, jak je popsáno níže. Podle jednoho provedení se memnopeptid extrahuje z kultivace přidáním rozpouštědla ke směsi hub a bujónu.

Kultivační filtrát lze výhodně smíchat s koncentrátem myceliového extraktu a extrahovat vhodným organickým rozpouštědlem nemísitelným s vodou, například n-butanolem. Následně vyjmutou organickou fázi lze případně koncentrovat ve vakuu. K odtučnění cenných produktů lze koncentrát rozředit nepolárním rozpouštědlem, ve kterém nejsou sloučeniny podle vynálezu příliš rozpustné, například hexanem, petroletherem nebo diethyletherem. Při tomto procesu memnopeptidy precipitují a lipofilní nečistoty zůstávají rozpuštěny a lze je odstranit obvyklou separací pevné/kapalné fáze.

Precipitát obsahující memnopeptidy lze rozpustit ve směsi voda/methanol 1/30 původního objemu. Precipitát se v průběhu tohoto zcela rozpustí a lze ho lyofilizovat. Lyofizát, následně zvaný jako surový produkt, může obsahovat 5 až 50 % memnopeptidů a lze ho použít pro další izolaci.

Další izolaci alespoň jednoho memnopeptidu podle vynálezu lze provádět pomocí chromatografie na vhodných materiálech, například na molekulových sítech, silikagelu, aluminiu, iontoměničích nebo na adsorbčních pryskyřicích nebo na reversních fázích (RP). Memnopeptidy lze separovat pomocí této chromatografie. Chromatografií memnopeptidů lze provádět a • · ·

• · • · · · směsí vodných a použitím pufrovaných vodných roztoků nebo organických roztoků.

Směsmi vodných a organických roztoku se rozumí všechny organická rozpouštědla mísitelná s vodou, jako jsou methanol, propanol a acetonitril, v koncentraci činící 5 až 80 % rozpouštědla, zpravidla 20 až 50 % rozpouštědla, nebo alternativně všechny pufrované vodné roztoky, které jsou mísitelné s organickými rozpouštědly. Použité pufry mohou být stejné jako výše jmenované.

Separaci memnopeptidů na základě jejich různé polarity lze provádět pomocí chromatografie s reverzními fázemi, například na MCI® (adsorbční pryskyřice od Mitsubishi, Japonsko) nebo Amberlite XAD® (Toso Haas), nebo dalších hydrofobních materiálech, jako např. na fázích RP-8 či RP-18. Kromě toho lze separaci provádět pomocí chromatografie s normálními fázemi, například na silikagelu, aluminiu apod.

Chromatografii memnopeptidů lze provádět pomocí pufrovaných nebo acidifikovaných vodných roztoků nebo směsí vodných roztoků s alkoholy či jinými organickými rozpouštědly, mísitelnými s vodou. Podle jednoho provedení se organické rozpouštědlo zvolí ze skupiny zahrnující propanol a acetonitril .

Pufrovanými nebo acidifikovanými vodnými roztoky se rozumí alespoň jeden roztok samotný nebo v kombinaci. Uvedený alespoň jeden roztok lze například zvolit ze skupiny zahrnující vodu, fosfátové pufry, ammoniumacetát, citrátové pufry a kyseliny. Podle jednoho provedení se koncentrace citrátového pufru pohybuje v rozmezí od 0 do 0,5 M. Kyseliny se zvolí ze skupiny zahrnující kyselinu mravenčí, kyselinu octovou, kyselinu trifluoroctovou a všechny komerčně dostupné kyseliny odborníkovi v oboru známé. Podle jednoho provedení se koncentrace komerčně dostupné kyseliny pohybuje v rozmezí od 0 • · do 1 %. Podle dalšího provedení koncentrace kyseliny činí 0,1 %.

Chromatografii lze provádět s použitím gradientu, který začíná 100 % vody a končí 100 % rozpouštědla. Použije se alespoň jedno rozpouštědlo. Lze také použít směs dvou nebo více rozpouštědel. Podle jednoho provedení se lineární gradient pohybuje od 20 do 50 % rozpouštědla zvoleného ze skupiny zahrnující propanol a acetonitril.

Alternativně lze také provádět gelovou chromatografii či chromatografii na hydrofobních fázích.

Gelovou chromatografii lze provádět na polyakrylamidových nebo kopolymerových gelech, jako j.sou Biogel-P 2® (Biorad) nebo Fractogel TSK HW 40® (Merck, Německo nebo Toso Haas, USA) .

Dalším, velmi účinným, způsobem purifikace sloučenin podle vynálezu může být použití iontoměničů. Například, základní memnopeptid A lze velmi výhodně izolovat na kationtových měničích, jako je Fractogel® EMD SO3. Lze použít roztoky pufrů s hodnotou pH mezi 5 a 8, jako např. pH mezi 6 a 7,5. Eluce lze například dosáhnout použitím vzestupného gradientu soli. Kromě vody může být výhodné použit jako rozpouštědlo směsi vodných pufrových roztoků s organickým rozpouštědlem. Podíl organického rozpouštědla může činit mezi 10 % a 90 %, jako např. mezi 30 % a 60 %.

Pořadí výše uvedených chromatografických metod může být změnitelné.

Dalším, velmi účinným, purifikačním stupněm pro memnopeptidy je krystalizace. Memnopeptidy lze vykrystalizovat z roztoků v organických rozpouštědlech a ze směsí vody a organických rozpouštědel. Krystalizací lze provádět způsoby o • ·

sobě známými, například koncentrací nebo ochlazením nasycených roztoků memnopeptidů.

Memnopeptidy podle vynálezu jsou stabilní v pevném stavu a v roztocích o pH v rozmezí mezi 3 a 8, například 5 a 7, a lze je proto vpravit do běžných farmaceutických prostředků.

Tvorbu memnopeptidů obsahujících dusík lze zvýhodnit přidáním žádoucích aminokyselin nebo peptidů jako prekursorů ke kultivacím Memnoniella echinata. Příznačné pro druhy Memnoniella echinata může být to, že vážou aminoskupiny aminokyselin a peptidů a mohou syntetizovat pětíčlenný kruhový laktam, obvykle isoindolový kruhový systém. K této vazbě dochází buď nastartováním z aldehydového prekursoru v průběhu oxidace nebo z laktonového oxidačního stupně v podobě otevřeného kruhu nebo v podobě cyklického laktonu. Tato schopnost Memnoniella echinata vázat aminy je zcela překvapivá a lze ji použít pro získání chráněných, konvertovaných aminových derivátů, jako jsou terpenové deriváty aminokyselin a peptidů.

Alespoň jedna sloučenina z memnopeptidů podle vynálezu může být, díky svým cenným farmakologickým vlastnostem, vhodná k použití v lidském nebo veterinárním lékařství jako léčivo.

Předkládaný vynález se proto týká použití sloučeniny obecného vzorce I nebo její fyziologicky tolerovatelné soli k přípravě srdečního léčiva k léčení či profylaxi srdeční nedostatečnosti.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu lze také použít k přípravě léčiva k léčení onemocnění, u nichž je srdeční nedostatečnost primární nebo sekundární příčinou daného onemocnění, jako je např. oběhová nedostatečnost.

Mechanismus účinku memnopeptidů je nejistý, avšak byl zaznamenán významný účinek.

• ·

K detekci aktivátorů SERCA2, které imituji fosforylační účinek PLB, lze použit kolorimetrický test, který určuje aktivitu Ca²⁺ATPázy v mikrosomech srdce psa v přítomnosti testovaných látek. Test lze provádět na devadesátišestijamkových mikrotitračních deskách. Lze stanovovat enzymatické uvolňování anorganického fosfátu z ATP, který vytváří s molybdenanem amonným modře zbarvený komplex, který lze stanovovat ve spektrofotometru při 620 nm.

Memnopeptidy aktivují SERCA2 v koncentracích od 12,5 μΜ.

Kromě toho mají mamnopeptidy antimikrobiální účinek.

Předkládaný vynález se proto týká použití sloučeniny obecného vzorce I nebo její fyziologicky tolerovatelné soli k přípravě léčiva k léčení mikrobiálních, například bakteriálních, infekcí.

Tabulka 3 ukazuje minimální ' inhibiční koncentrace (MIC) antimikrobiálního spektra memnopeptidu A proti některým vybraným baktériím.

Tabulka 3

Kmen	Resistence vůči	MIC [pg/ml]
Staphylococcus aureus SG 511	-	16
Staphylococcus aureus 285	Penicilín	16
Staphylococcus aureus 503	Penicilín	16
Staphylococcus aureus FH 1982	Methicilin	16
Staphylococcus aureus 701E	Methicilin	16
Staphylococcus aureus 707E	Methicilin	16
Staphylococcus aureus 9 Tub	Ofloxacin	16
Staph. epidermidis ZH 2c	-	16
Staph. epidermidis 763	Methicilin	>16
Staph. epidermidis 5747IIW	Methicilin	32

Staph. epidermidis 291	Ofloxacin	8
Staph. epidermidis 799	Ofloxacin	8
Enterococeus faecium Md8B	-	8
Enterococeus faecium VRl	. Vancomycin	>64
Enterococeus faecium VR2	Vancomycin	>64
Streptococcus pyogenes VR3	Vancomycin	>64
Streptococcus pyogenes 308A	-	8
Streptococcus pyogenes 77A	-	4

Kromě antimikrobiálního účinku vykazují sloučeniny podle vynálezu slabé antimykotické, tj. protihoubové, vlastnosti, například proti Candida albicans.

Kromě toho látky podle vynálezu vykazují určitý výhodný inhibiční účinek na glukóza-6-fosfáttranslokázu (G-6-P-TL), enzym, který je významný pro metabolismus glukózy, a proto pro léčení diabetes mellitus. Například sloučenina memnopeptid A vykazuje selektivní účinky proti G-6-P-TL, avšak neinhibuje koenzym G-6-P-fosfatázu.

Předkládaný vynález se proto týká použití sloučeniny obecného vzorce I nebo její fyziologicky tolerovatelné soli k přípravě léčiva k léčení diabetes mellitus.

Vynález se také týká farmaceutických prostředků alespoň jedné sloučeniny memnopeptidů podle vynálezu.

Alespoň jednu sloučeninu memnopeptidů podle vynálezu lze obecně podávat jako takovou v nerozředěné formě. Použití v podobě směsi s vhodnými pomocnými látkami nebo přísadami představuje jedno z provedení vynálezu. Přísadami, které lze použít v léčivech, mohou být obvyklé farmakologicky tolerovatelné přísady nebo/a pomocné látky.

Obecně lze léčiva podle vynálezu podávat orálně nebo parenterálně, možné je však také podání rektální. Vhodnými • · pevnými nebo kapalnými podobami farmaceutických prostředků jsou například granule, prášky, tablety, potažené tablety, (mikro)kapsle, čípky, sirupy, emulze, suspenze, aerosoly, kapky nebo injektovatelné roztoky v podobě ampule a přípravky s chráněným uvolňováním účinné sloučeniny, ve kterých jsou obvykle použity přísady a aditiva nebo/a pomocné látky, jako jsou desintegrační činidla, pojivá, potahové prostředky, bobtnací činidla, glidanty nebo lubrikanty, aromatická činidla, sladidla nebo solubilizační činidla. Často používanými přísadami nebo pomocnými látkami, které lze zmínit, jsou například uhličitan hořečnatý, oxid titaničitý, laktóza, mannitol a jiné cukry, talek, laktoprotein, želatina, škrob, vitaminy, celulóza a její deriváty, živočišné či rostlinné oleje, polyethylenglykoly a rozpouštědla, jako jsou voda, alkoholy, glycerol a polyhydroxyalkoholy.

Pokud je to vhodné mohou být dávkovači pro orální podávání mikroopouzdřené, za účelem opoždění uvolňování nebo jeho prodloužení po delší časový úsek, například pomocí potažení nebo zalití účinné sloučeniny ve formě částic do vhodných polymerů, vosků nebo podobně.

Podle jednoho provedení lze farmaceutické prostředky připravovat a podávat v dávkových jednotkách, přičemž každá jednotka obsahuje, jako účinnou složku, určitou dávku alespoň jedené sloučeniny memnopeptidů podle vynálezu. V případě pevné dávkovači formy, jako jsou tablety, kapsle a čípky, může touto dávkou být až přibližně 500 mg, avšak zpravidla přibližně 0,1 až 200 mg, a v případě injekčních roztoků v podobě ampule až přibližně 200 mg, avšak obvykle přibližně 0,5 až 100 mg, za den.

Podávaná denní dávka je obecně závislá na tělesné hmotnosti, věku, pohlaví a stavu savce. V určitých situacích však mohou být vhodné i vyšší či nižší denní dávky. Podávání denní dávky lze provádět jak použitím jednoho podání v podobě • ·

- 26 jednotlivé dávkovači jednotky nebo i více menších dávkovačích jednotek, tak i pomocí vícenásobného podávání rozdělených dávek v určitých intervalech.

Léčiva podle vynálezu lze připravovat vnesením alespoň jedné sloučeniny memnopeptidů podle vynálezu do vhodné formy pro podávání, s použitím obvyklých přísad a, pokud je to vhodné, aditiv nebo/a pomocných látek.

Předkládaný vynález dále ilustrují následující příklady provedení vynálezu. Procentuální údaje jsou hmotnostní. Směšovací poměry jsou udány v případě kapalin jako objemové, pokud není uvedeno jinak. Následující příklady jsou určeny k ilustraci předkládaného vynálezu, aniž by nějakým způsobem omezovaly jeho rozsah.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava glycerolové kultury Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195

100 ml živného roztoku (sladový extrakt 2,0 %, kvasinkový extrakt 0,2 %, glukóza 1,0 %, (ΝΗ^ΗΡΟή 0,05 %, pH 6,0) ve sterilní 300 ml Erlenmeyerově baňce bylo inokulováno kmenem Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195, a inkubováno na rotačním protřepávači při 25° C a 140 otáčkách za minutu po dobu 7 dní. Poté bylo 1,5 ml této kultury rozředěno 2,5 ml 80% glycerolu a uchováváno při -20° C.

Příklad 2

Příprava kultury nebo předkultury Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195 v Erlenmeyerově baňce • ·

Sterilní 300 ml Erlenmeyerova baňka obsahující 100 ml následujícího živného roztoku, 10 g/1 glukózy, 5 g/1 kaseinového peptonu, 1,7 g/1 kapalného kukuřičného výluhu a 7 ml roztoku stopových prvků (10 g/1 KC1, 10 g/1 MgSO₄ x 7 H₂O, 3,6 g/1 FeSO₄ x 7 H₂O a 6 g/1 MnSO₄ x H₂O) bylo inokulováno kulturou vypěstovanou v kultivační zkumavce (stejný živný roztok, avšak s 2 % agaru) nebo 1 ml glycerolové kultury (viz příklad 1) a inkubováno na protřepávači při 180 otáčkách za minutu a 30° C. Maximální produkce alespoň jedné sloučeniny memnopeptidů podle vynálezu bylo dosaženo přibližně po 120 hodinách. Pro inokulaci 10 a 200 1 fermenterů postačuje ponořená kultura stará 48 až 96 hodin (inokulované množství přibližně 10 %) ze stejného živného roztoku.

Příklad 3

Příprava memnopeptidů

1 fermenter pracoval za následujících podmínek: živný roztok:

g/1 glukózy,

0,5 g/1 kaseinového peptonu,

1,7 g/1 kapalného kukuřičného výluhu, 7 ml roztoku stopových prvků, pH 6,5 (před sterilizací), roztok stopových prvků:

g/1 KC1, 10 g/1 MgSO₄ x 7 H₂O,

3,6 g/1 FeSO₄ x 7 H₂O a 6 g/1 MnSO₄ x H₂O, inkubační doba: inkubační teplota: rychlost mixeru: provzdušnění:

hodin,

28° C,

300 otáček za minutu, 15 l.min'¹.

Tvorba pěny byla případně potlačována opakovaným přidáváním ethanolového polyolového roztoku. Maxima produkce bylo dosaženo přibližně po 35 až 70 hodinách.

Příklad 4

Izolace směsi memnopeptidu z kultivačního roztoku Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195

Po dokončení fermentace Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195, byl kultivační bujón z fermenteru, získaný podle příkladu 3 (200 1), filtrován s přidáním přibližně 2 % filtračního pomocného prostředku (např. Celíte®) a buněčná hmota (22 1) byla extrahována 66 litry methanolu. Methanolový roztok obsahující cennou látku -byl zbaven mycelií pomocí filtrace a koncentrován ve vakuu. Koncentrát byl rozředěn vodou a aplikován na připravený sedmnáctilitrový sloupec MCI GEL, CHP20P, společně s filtrátem kultury (180 1) . Toto bylo eluováno pomocí gradientu vody po 60% propan-2-olu ve vodě. Tok z válce (25 litrů za hodinu) byl shromážděn ve frakcích (každá 10 1) a frakce obsahující memnopeptid (od 25% do 30% propan-2-olu) byly smíchány.

Koncentrací ve vakuu bylo získáno 20 1 hnědého roztoku. Do sloupce (125 mm x 500 mm) bylo vloženo 6 litrů kationtového měniče, Fractogel® EMD SO₃~, upraveného na pH 7 pufrem fosforečnanu draselného. Po naplnění iontoměniče 20 litry koncentrátu popsaného výše, bylo toto eluováno gradientem lOmM pufru fosforečnanu draselného o pH 7, po 1M NaCl v lOmM pufru fosforečnanu draselného o pH 7 ve směsi voda/methanol (1:1). Tok z válce, tj. nevázaný materiál, obsahoval neutrální memnopeptidy (49 g) . Tok z válce činil 12 litrů za hodinu; během gradientově eluce byly ve frakcích shromažďovány jednolitrové porce. Memnopeptid A byl získán pomocí 0,75M NaCl (frakce 31 a 32) . Frakce 31 a 32 byly smíchány a koncentrovány ve vakuu přibližně na objem 500 ml.

Příklad 5

Získání memnopeptidů A pomocí gelové chromatografie

Na sloupec o kapacitě 3,9 1 naplněný přípravkem Fractogel® TSK HW-40 s (šířka x výška = 10 cm x 50 cm) bylo aplikováno 8 g produktu získaného podle příkladu 4. Sloupcem byl proháněn eluent, tj. směs methanolu a vody (1:1), při rychlosti toku činící 20 ml za minutu a výtok ze sloupce byl shromažďován ve frakcích (20 ml). Memnopeptid A byl nalezen převážně ve frakcích 75 až 85. Tyto byly smíchány a zbaveny methanolu ve vakuu. Takto bylo získáno 0,9 g směsi účinné sloučeniny.

Příklad 6

HPLC systém k detekci memnopeptidů

Systém popsaný níže umožňoval testování čistoty a také separaci a kvantifikaci memnoterpenů, například v surové směsi nebo ve filtrátech kultur.

Eluent: 0,1% kyselina trifluoroctové v 32% acetonitrilu.

Sloupec: Nucleosil lOOCigAB 250/4,· Macherey-Nagel.

Průtok: 1,2 ml/min.

Detekce: absorbce ultrafialového světla při 210 nm.

Za uvedených podmínek mohl memnopeptid A vykazovat následující retenční čas: Memnopeptid A: 7,0 minut.

Příklad 7

Purifikace memnopeptidů A

500 ml roztoku memnopeptidů A izolovaného a získaného podle příkladu 5 bylo aplikováno -na 500 ml sloupec Nucleosil® • · • ♦ »·*♦

100-7CisAB 250/4 a podroben chromatografií s použitím gradientu 25 až 50 % acetonitrilu ve směsi 0,05% kyselina trifluoroctová/voda. Tok eluentu činil 50 ml za minutu; velikost frakce činila 50 ml. Memnopeptid A byl nalezen ve frakcích 71 až 88. Opakovanou purifikací smíchaných frakcí konstantní koncentrací roztoku ve výši 28 % acetonitrilu v 0,05% kyselině trifluoroctové bylo po sušení mrazením získáno >95 % čistého memnopeptidů C (lOOmg).

Charakterizace memnopeptidů A:

gg memnopeptidů A bylo hydrolyzováno v konstantně se vařící kyselině chlorovodíkové a podrobeno zkoumání v aminokyselinovém analyzéru. Byly nalezeny následující obvyklé aminokyseliny:

kyselina glutamová	11	nmol
prolin	22	nmol
histidin	10	nmol
leucin	5, 6	nmol
methioninoxid	5,5	nmol

absorbce UV: X^max při 269 nm, 305 nm (okraj) .

Hmotová spektra získaná pomocí ionizace rychlými neutrálními částicemi (FAB) s vysokou rozlišovací schopností ukázala intenzívní MH⁺ při m/z 1565,7819, což bylo v dobrém souladu s vypočítanou hmotou (pro C76H109N16O18S, monoisotopní) činící 1565,7827. MS/MS fragmentace odpovídala obecnému vzorci IVa.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučenina obecného vzorce I ve kterém.

Ri a R₂ společně znamenají dvojnou vazbou navázaný atom kyslíku, nebo dva atomy vodíku, nebo atom vodíku a hydroxylovou skupinu, nebo atom vodíku a O-alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy;

R3 a R₄ společně znamenají dvojnou vazbou navázaný atom kyslíku, nebo dva atomy vodíku, nebo atom vodíku a hydroxylovou skupinu, nebo atom vodíku a O-alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy;

Rs se zvolí ze skupiny zahrnující atom vodíku, hydroxylovou skupinu, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy a O-alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy;

Re znamená skupinu obecného vzorce II

CH, (II), ve kterém

Rg znamená atom vodíku nebo glykosidicky vázaný cukr, nebo skupinu obecného vzorce III • · · · * · ve kterém

Rio znamená atom vodíku nebo glykosidicky vázaný cukr; přičemž pokud Rg znamená skupinu obecného vzorce II, pak R₅ znamená vazbu k uhlíkovému atomu C9 obecného vzorce II a R₇znamená atom vodíku nebo R₇ znamená vazbu k uhlíkovému atomu C9 obecného vzorce II a R5 znamená atom vodíku, a pokud Rg znamená skupinu obecného vzorce III, pak R₅ a R₇znamenají atom vodíku;

A znamená aminokyselinu;

n znamená celé číslo zvolené ze skupiny zahrnující čísla 1 až 12, přičemž význam každého symbolu A je stejný či odlišný od každého jiného symbolu A; přičemž dusíkový atom v isoindolovém kruhu obecného vzorce I je N-terminální aminový dusík první aminokyseliny ze skupiny (A)_n;

nebo její sůl či derivát; s tou výhradou, že

A znamená jinou aminokyselinu než Glu, pokud n je 1, a R_x a R₂ společně znamenají dvojnou vazbou navázaný atom kyslíku, a R₃ a R₄ znamenají společně dva atomy vodíku, a Rg znamená skupinu obecného vzorce II, a R5 znamená vazbu k uhlíkovému atomu C9 skupiny obecného vzorce II, a R₇znamená atom vodíku, a Rg znamená atom vodíku a Rg znamená atom vodíku.

• 9 ♦ · · * • · · · • · · · · • · · » · · · · · ·· · · · • · · · · · • · · · » ·« 99 9999
2. Sloučenina podle nároku 1 obecného vzorce IV (IV), v nároku 1, nebo její sůl či derivát.
3. Sloučenina podle nároku 2, kde

Ri a R₂ společně znamenají dvojnou vazbou navázaný atom kyslíku,

R3 a R₄ společně znamenají dva atomy vodíku a

R9 znamená atom vodíku, nebo její sůl či derivát.
4.

kde symboly R_x, R₂, R3, R4, R5, R?j Re, uvedené v nároku 1,

R10 a (A)_n mají významy • « · · nebo její sůl čí derivát.
5. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 4, kde symbol (A)_n znamená peptidový řetězec obsahující 2 až 12 přirozených aminokyselinových skupin, nebo její sůl či derivát.
6. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 5, kde symbol (A) _n znamená peptidový řetězec obsahující sekvenci aminokyselin:

Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro, tj. sekvenci identifikační č. 1, kde je skupina Met oxidována na sulfoxid, nebo její sůl či derivát.
7. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 6, kde symboly Rg a Rio znamenají aldohexózu, nebo její sůl či derivát.
8. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 7 získatelná kultivací houby zvolené ze skupiny zahrnující Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195, její mutanty a varianty, za vhodných podmínek v kultivačním mediu, dokud není v kultivačním mediu sloučenina přítomna a následnou izolací uvedené sloučeniny, nebo její sůl či derivát.
9. Sloučenina podle nároku 8 dále konvertovaná na alespoň jednu chemickou formu zvolenou ze skupiny zahrnující deriváty a fyziologicky tolerovatelné soli.
10. Sloučenina podle nároku 1 obecného vzorce IVb • « ·*·· (IVb), kde má symbol (A)_n významy uvedené v nároku 1.
11. Sloučenina podle nároku 1, tj . memnopeptid A, CheHiosNieOieS, vzorce IVa
12. Sloučenina podle libovolného z nároků 1 až 11, kde skupina (A)_n obsahuje část aminokysellinové sekvence kaseinu.

• · <·»·♦
13. Sloučenina podle nároku 12, kde symbol (A)_n znamená sekvenci aminokyselin:

Met His Gin Pro His Gin Pro Leu Pro Pro, tj. sekvenci identifikační č. 1.
14. Sloučenina podle nároku 13, kde je methionin, t j. Met oxidován k vytvoření sulfoxidu.
15. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I, přičemž uvedená sloučenina je definována podle libovolného z nároků 1 až 14, a přijatelný nosič.
16. Kompozice podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedenou kompozicí je farmaceutická kompozice a uvedeným přijatelným nosičem je farmaceuticky přijatelný nosič.
17. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli či derivátu podle libovolného z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že se kultivuje mikroorganismus Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195, nebo jedna z jeho variant či mutací, za vhodných podmínek v kultivačním mediu obsahujícím alespoň jeden zdroj uhlíkových atomů a alespoň jeden zdroj atomů dusíku, dokud není alespoň jedna sloučenina obecného vzorce I přítomna v kultivačním mediu a následně se uvedená sloučenina izoluje.
18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že se dále sloučenina konvertuje na alespoň jednu chemickou formu zvolenou ze skupiny zahrnující deriváty a fyziologicky tolerovatelné soli.

*· ···· • 4 • ·
19. Způsob podle nároku 17 nebo 18, vyznačující se t í m , že uvedená kultivace probíhá za aerobních podmínek.
20. Způsob podle libovolného z nároků 17 až 19, vyznačující se tím, že se uvedený alespoň jeden zdroj atomů dusíku zvolí ze skupiny zahrnující aminokyseliny a peptidy.
21. Způsob podle libovolného z nároků 17 až 20, vyznačující se tím, že uvedené živné medium obsahuje kaseinový pepton v koncentraci pohybující se přibližně v rozmezí od 0,05 % do 5 % hmotn. celkového živného roztoku.
22. Způsob podle libovolného z nároků 17 až 21, vyznačující se tím, že uvedené živné medium obsahuje kaseinový pepton, glukózu, kukuřičný výluh a stopy chloridu draselného, síranu hořečnatého a síranu železa.
23. Použití sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli nebo jejího derivátu podle libovolného z nároků 1 až 14 k přípravě léčiva k léčení srdeční nedostatečnosti.
24. Použití sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli nebo jejího derivátu podle libovolného z nároků 1 až 14 k přípravě léčiva k léčení onemocnění, u nichž je srdeční nedostatečnost primární nebo sekundární příčinou.
25. Použití sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli nebo jejího derivátu podle libovolného z nároků 1 až 14 k přípravě léčiva k léčení diabetes mellitus.
26. Použití sloučeniny obecného vzorce I nebo její soli nebo jejího derivátu podle libovolného z nároků 1 až 14 k přípravě léčiva k léčení mikrobiální infekce.