PL202186B1

PL202186B1 - Nowe związki a1-aminoalkano-karbamoiloalkano-fosfinowe użyteczne jako inhibitory aminopeptydazy N oraz sposób ich wytwarzania

Info

Publication number: PL202186B1
Application number: PL376515A
Authority: PL
Inventors: Renata Grzywa; Marcin Drąg; Józef Oleksyszyn
Original assignee: Politechnika Wroclawska
Priority date: 2005-08-05
Filing date: 2005-08-05
Publication date: 2009-06-30
Also published as: PL376515A1

Abstract

Wynalazek dotyczy nowych związków αι-aminoalkano-karbamoiloalkano-fosfinowych, będących kwasami αι-aminoalkano-karbamoiloalkano-fosfinowymi bądź estrami kwasów a1-aminoalkano-karbamoiloalkano-fosfinowych, o wzorze ogólnym 1, w którym W1 oznacza wodór albo ochronną grupę benzyloksykarbonylową (Cbz), R1 oznacza podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego naturalnych aminokwasów waliny i leucyny, R2 oznacza podstawnik fenylowy bądź benzylowy, X1 oznacza wodór lub grupę metylową, które charakteryzują się wysoką aktywnością inhibitorową w stosunku do aminopeptydazy N. Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania nowych związków a1-aminoalkano-a2-karbamoiloalkanofosfinowych, który polega na tym, że substraty w postaci estrów kwasu N-(benzyloksykarbonyloamino)alkanofosfinowego poddaje się reakcji z 2,5 równoważnikami molowymi, w stosunku do fosfinowego substratu, izocyjanianu aromatycznego oraz 3-4 równoważnikami trójetyloaminy i trimetylochlorosilanu, a reakcję prowadzi się 14-16 godzin w atmosferze azotu w bezwodnym dichlorometanie.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe związki a₁-aminoalkano-karbamoiloalkano-fosfinowe, które charakteryzują się wysoką aktywnością inhibitorową w stosunku do aminopeptydazy N. Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania nowych związków a₁-aminoalkan-karbamoiloalkano-fosfinowych.

W literaturze naukowej istnieje tylko jeden przypadek opisujący syntezę i właściwości biologiczne kwasów a₁-aminoalkano-karbamoiloalkano-fosfinowych. Dotyczy on analogu leucyno-P-leucyny (Giannousis P.P., Bartlett P.A., w J. Med. Chem. 1987, 30(9), 1603-9). Związek ten był słabym inhibitorem (Κ=56μ) aminopeptydazy leucynowej (LAP) (Gianno-usis P.P., Bartlett P.A., w J. Med. Chem.

1987, 30(9), 1603-9).

Istotą wynalazku są nowe związki a₁-aminoalkano-karbamoilo-alkanofosfinowe o wzorze ogólnym 1, w którym W1 oznacza wodór albo ochronną grupę benzyloksykarbonylową (Cbz), R1 oznacza podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego naturalnych aminokwasów waliny i leucyny, R2 oznacza podstawnik fenylowy bądź benzylowy, X1 oznacza wodór lub grupę metylową, które stanowią ester metylowy kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonyl-amino)-3-metylobutano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego oraz jego kwas, ester metylowy kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego oraz jego kwas, ester metylowy kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-mety lopropano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego oraz jego kwas, ester metylowy kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylopropano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego oraz jego kwas.

Sposób wytwarzania nowych związków a₁-aminoalkano-a₂-karbamoilo-alkanofosfinowych o wzorze ogólnym 1, w którym W1 oznacza wodór albo ochronną grupę benzyloksykarbonylową (Cbz), R1 oznacza podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego naturalnych aminokwasów waliny i leucyny, R2 oznacza podstawnik fenylowy bądź benzylowy, X1 oznacza wodór lub grupę metylową, według wynalazku polega na tym, że substraty w postaci estrów metylowych kwasów N-(benzyloksykarbonylamino)-alkanofosfinowych poddaje się reakcji z 2,5 równoważnikami molowymi izocyjanianu aromatycznego oraz 3-4 równoważnikami molowymi trójetyloaminy oraz 3-4 równoważnikami molowymi trimetylochlorosilanu w stosunku do fosfinowego substratu. Mieszaninę reakcyjną pierwotnie schłodzoną do 0°C pozostawia się na 14-16 godzin w temperaturze pokojowej, w atmosferze azotu, w rozpuszczalniku w postaci bezwodnego dichlorometanu. Korzystnie utrzymuje się przy tym całkowitą ilość rozpuszczalnika w granicach od 2 do 5 ml na 1 mM fosfinowego substratu.

Zasadnicze korzyści wynikające z wynalazku polegają na wytwarzaniu związków, które wykazują silną aktywność biologiczną - hamującą funkcjonowanie aminopeptydazy N (E.C.3.4.14.2.). Związki o wzorze ogólnym 1, mogą być skutecznymi inhibitorami aminopeptydazy N, enzymu, który według ostatnich doniesień może uczestniczyć w procesie apoptozy (Sekine K., i inni w Leukemia, 1999, 13, 729-734; Scornik O.A. i inni w Curr. Drug Metab. 2001, 2, 67-85). Jego inhibicja indukuje apoptozę komórek rakowych. Zdolność wybranych pochodnych a₁-aminoalkano-karbamoiloalkano-fosfinowych do inhibicji aminopeptydazy N (E.C.3.4.14.2.) przetestowano przy użyciu enzymu wyizolowanego ze świńskiej nerki i zakupionego w firmie Sigma-Aldrich.

Aminopeptydaza N jest enzymem proteolitycznym występujących w błonach komórkowych (z ang. membranę protease) i posiadającym w centrum aktywnym jeden atom cynku. Jej największe stężenie u ssaków notuje się w nerkach. Katalizuje ona hydrolizę N-końcowego aminokwasu w polipeptydach i białkach. Preferencje substratowe enzymu oscylują przede wszystkim wokół takich aminokwasów jak leucyna, alanina, metionina, nor-leucyna i fenyloalanina.

Przedmiot wynalazku jest przedstawiony w przykładach wytwarzania a₁-aminoalkano-a₂-karbamoiloalkanofosfinianów, z których pierwszy dotyczy sposobu wytwarzania estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutano]-[N-fenyl-karbamoilo] fosfinowego przedstawionego wzorem 2, jego pochodnej z wolną grupą a₁-N-aminową przedstawionej wzorem 3 oraz kwasu [(a₁-amino)-3-metylobutano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego przedstawionego wzorem 4, drugi - estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego przedstawionego wzorem 5, jego pochodnej z wolną grupą a₁-N-aminową przedstawionej wzorem 6 oraz kwasu [(a₁-amino)-3-metylobutano]-[N-benzyl-karbamoilojfosfinowego przedstawionego wzorem 7, trzeci - estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzylo-ksykarbonylamino)-3-metylopropano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego przedstawionego wzorem 8, jego pochodnej z wolną grupą a₁-N-aminową przedstawionej wzorem 9 oraz kwasu [(a₁-amino)-3-metylopropano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego przedstawionego wzorem 10 i czwarty - estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylopropano]PL 202 186 B1

-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego przedstawionego wzorem 11, jego pochodnej z wolną grupą a₁-N-aminową przedstawionej wzorem 12 oraz kwasu [(a₁-amino)-3-metylopropano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego przedstawionego wzorem 13.

P r z y k ł a d I

Sposób wytwarzania estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonyl-amino)-3-metylobutano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego przedstawionego wzorem 2, jego pochodnej z wolną grupą a₁-N-aminową przedstawionej wzorem 3 oraz kwasu przedstawionego wzorem 4 rozpoczyna etap otrzymywania substratu w postaci estru metylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutanofosfinowego.

Etap 1: Otrzymywanie estru metylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutanofosfinowego

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 2,0 g (7,01 mM) kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutanofosfinowego oraz dodaje 0,22 g (7,0 mM) alkoholu metylowego. Całość zalewa się 10 cm³ bezwodnego tetrahydrofuranu, a następnie dodaje 1,45 g dicykloheksylokarbodiimidu (7,01 mM) oraz 0.085 g dimetyloaminopirydyny (0,701 mM). Całość miesza się intensywnie przez 2-8 godzin. Następnie do mieszaniny poreakcyjnej dodaje się 40 ml octanu etylu i odsącza powstały dicykloheksylomocznik na lejku Buchnera. Mieszaninę ekstrahuje się kolejno 25 ml 5% wodnego roztworu KHSO4, 25 ml nasyconego, wodnego roztworu NaHCO3 i solanką. Następnie do warstwy organicznej dodaje się 3 gramy bezwodnego MgSO4. Całość sączy się przez filtr bibułowy i odparowuje. Po usunięciu lotnych składników pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej uzyskuje się klarowny olej, który krzepnie po ostudzeniu. Po reakcji uzyskuje się 1,92 g surowego produktu (92% wagowo) w postaci białego osadu o konsystencji lekko oleistej, który używa się w następnym etapie bez dodatkowego oczyszczania. Wzór sumaryczny C14H22NO4P. Masa cząsteczkowa: 299,3 l/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 37,9 (s, 38%) i 39,2 (s, 62 %) Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl₃, δ [ppm]: 0,93 (m, 6H, 2xCH₃), 1,32-2.17 (m, 3H, CH₂, CH), 3,78 (d, 3H, J=11,4 Hz, POCH₃), 3,80 (d, 3H, J=10,75 Hz, POCH₃), 4,09 (m, 1H, CHP), 5,13 i 5,17 (s, 2H, PhCH₂OC), 6,61 (d, 1H, J=6,8 Hz, NH), 6,06 i 7,.89 (d, 1H, J=550,2 Hz, 38% PH), 6,07 i 7,91 (d, 1H, J=549,6 Hz, 68% PH), 7,26-7,40 (m, 5H, aromat.).

Etap 2: Otrzymywanie estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 0,50 g (1,67 mM) estru metylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutanofosfinowego, zalewa się 5 cm³ bezwodnego dichlorometanu i schładza do 0°C. W atmosferze azotu dodaje się 0,695 ml (5,01 mM) trójetyloaminy oraz 0,701 ml (5,51 mM) trimetylochlorosilanu. Po 30 minutach, przy zachowaniu temperatury 0°C, dodaje się 0,417 ml (3,01 mM) trójetyloaminy oraz 0,455 ml (4,18 mM) izocyjanianu fenylowego. Temperaturę 0°C utrzymuje się przez godzinę, reakcję prowadzi się 14-16 godzin. Następnie do mieszaniny dodaje się 3 ml nasyconego wodnego roztworu chlorku amonu a po 10 minutach rozcieńcza 50 ml octanu etylu. Mieszaninę przemywa się kolejno 50 ml nasyconego wodnego roztworu chlorku amonu, 50 ml nasyconego wodnego roztworu NaHCO3, 50 ml solanki. Następnie do warstwy organicznej dodaje się 3 gramy bezwodnego MgSO4. Całość sączy się przez filtr bibułowy i odparowuje. Po usunięciu lotnych składników pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej uzyskuje się olej, który krzepnie po ostudzeniu. Mieszaninę oczyszcza się za pomocą chromatografii kolumnowej (15 g żelu) przy użyciu mieszaniny rozpuszczalników chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu odpowiednich frakcji, rozpuszczalniki usuwa się na wyparce rotacyjnej i otrzymuje się 0,20 g (28,6% wagowo) czystego estru metylowego kwasu [a1-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego w postaci półprzezroczystego, gęstego oleju, który zastyga po kilku godzinach. Wzór sumaryczny C21H27N2O5P. Masa cząsteczkowa: 418,4 l/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 31,07 (s, 60%), i 30,88 (s, 40%). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]: 0,92-1,26 (m, 6H, 2xCHs), 1,56-1,81 (m, 3H, CH2, CH), 3,79 (d, 3H, J=11,0 Hz, POCH^, diastereotopowy), 3,81 (d, 3H, J=10,9 Hz, POCH₃, diastereotopowy), 4,47-4,54 (m, 1H, CbzNHCHP), 5,01-5,17 (m, 2H, CH₂OCO), 5,51 (d, 1H, J=10,1, CbzNH) 7,10-7,63 (m, 10H, aromat.), 8,98 (s, 1H, NHCOP); MS (ESI) -440,3 [M + Na]+, 456,6 [M + K]+.

Etap 3: Otrzymywanie estru metylowego kwasu [(a₁-amino)-3-metylobutano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 0,15 g (0,36 mM) estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego zalewa się 5 cm³

PL 202 186 B1 bezwodnego metanolu a następnie dodaje 10% wagowo (0,02 g) 10% Pd/C. Przez mieszaninę przepuszcza się wodór. Procedurę przeprowadza się do momentu zaniku substratu, co sprawdzane jest z wykorzystaniem chromatografii cienkowarstwowej. Nastę pnie mieszaninę przesącza się przez celit i odparowuje. Po usunię ciu lotnych skł adników pod zmniejszonym ciś nieniem na wyparce rotacyjnej uzyskuje się olej, który krzepnie po ostudzeniu. Otrzymuje się pożądany ester metylowy kwasu [(α1-amino)-3-metylobutano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego w ilości 0,1 g (98% wagowo). Wzór sumaryczny C13H21N2O3P. Masa cząsteczkowa: 284,3 l/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 35,36 (s, 58%), i 33,76(s, 42%). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl₃, δ [ppm]: 0,88-0,99 (m, 6H, 2xCH₃), 1,52-1,93 (m, 5H, CH₂, CH, NH₂), 3,38-3,44 (m, 1H, NCHP), 3,78 (d, 3H, J=4,2 Hz, POCH₃, diastereotopowy), 3,81 (d, 3H, J=3,7 Hz, POCH₃, diastereotopowy), 7,16-7,67 (m, 5H, aromat.), 9,37(s, 1H, NHCOP);

Etap 4; Otrzymywanie kwasu [(a₁-amino)-3-metylobutano]-[N-fenyl-karbamoiloJfosfinowego

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 60 mg (0,21 mM) estru metylowego kwasu [(α1-amino)-3-metylobutano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego, zalewa się 5 cm metanolu a następnie dodano 150 μl 2M NaOH. Całość zamyka się i pozostawia na 12-16 godzin. Następnie lotne składniki usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej. Pozostałość rozpuszcza się w 2 ml metanolu, dodaje 150 μl 2M HCl a następnie tlenku propylenu do momentu zmętnienia mieszaniny. Całość pozostawia się na noc w lodówce. Wytrącony osad odsącza się na lejku Buchnera i przemywa 10 ml eteru dietylowego, a następnie suszy na powietrzu. Otrzymuje się pożądany kwas [(a₁-amino)-3-metylobutano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfino wy w ilości 40 mg (70% wagowo). Wzór sumaryczny C12H19N2O3P. Masa cząsteczkowa: 270,3 l/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w D2O, δ [ppm]): 27,34. Widmo ¹H NMR (roztwór w D₂O, δ [ppm]: 0,84-0,92 (m, 6H, 2xCH₃), 1,36-1,45 (m, 2H, CH₂), 1,78-1,81 (m, 1H, CH), 3,03-3,10 (m, 1H, NCHP), 7,19-7,47 (m, 5H, aromat.).

P r z y k ł a d II

Sposób wytwarzania estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego przedstawionego wzorem 5 jego pochodnej z wolną grupą a₁-N-aminową przedstawionej wzorem 6 oraz kwasu przedstawionego wzorem 7 rozpoczyna się od otrzymania substratu w postaci estru metylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutanofosfinowego.

Etap 1: Otrzymywanie estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego

Ester metylowy kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutanofosfinowego otrzymuje się sposobem opisanym w etapie 1 w przykładzie I a następnie poddaje reakcji z 0,516 ml (4,18 mM) izocjanianu benzylowego w tej samej skali molowej i warunkach opisanych w etapie 2 w przykładzie I. Surowy produkt oczyszcza się za pomocą chromatografii kolumnowej (15 g żelu) przy użyciu mieszaniny rozpuszczalników chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu odpowiednich frakcji i usunięciu rozpuszczalników na wyparce rotacyjnej otrzymuje się pół przezroczysty olej krzepnący na powietrzu z wydajnością 0,34 g (47,1 %-wagowo) estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylo-butano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego. Wzór sumaryczny C22H29N2O5P. Masa cząsteczkowa: 432,4 l/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 30,88 (s, 80%), i 31,09 (s, 20%). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCI₃, δ [ppm]: 0,81-0,93 (m, 6H, 2xCH₃), 1,50-1,74 (m, 3H, CH2, CH), 3,72 (d, 3H, J=9,5 Hz, POCH₃ diastereotopowy), 3,75 (d, 3H, J=10,6 Hz, POCH₃ diastereotopowy), 4,40-4,55 (m, 3H, CbzNHCHP, CH₂Ph), 4,96 (d, 1H, J=10,1, NH), 5,11 (s, 2H, CH^OCO), 7,26-7,33 (m, 10H, aromat.), 7,57 (s, 1H, NH). MS (ESI) = 454,8 [M + Na]+, 470,7 [M + K]+.

Etap 2 (3): Otrzymywanie estru metylowego kwasu [(a₁-amino)-3-metylobutano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego

Ester metylowy kwasu [(a₁-amino)-3-metylobutano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego otrzymuje się poddając reakcji 0,1 g (0,23 mM) estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylobutano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego zachowując proporcje i warunki według sposobu opisanego w etapie 3 w przykładzie I. Po usunięciu lotnych składników pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej uzyskuje się krzepnący na powietrzu olej estru metylowego kwasu [(a₁-amino)3-metylobutano]-[N-benzyl-karbamoilojfosfinowego z wydajnością 60 mg (87,0% wagowo). Wzór sumaryczny C14H24N2O3P. Masa cząsteczkowa: 298,3 l/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 34,21 (s, 61%), i 35,73 (s, 39%). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]: 0,84-0,96 (m, 6H, 2xCH₃), 1,44-1,89 (m, 5H, CH₂, CH, NH₂), 3,28-3,34 (m, 1H, NH₂CHP), 3,71 (d, 3H, J=4,1 Hz, POCH^,

PL 202 186 B1 diastereotopowy), 3,74 (d, 3H, J=4,1 Hz, POCH₃, diastereotopowy), 4,37-4,53 (m, 2H, CH₂Ph), 7,18-7,34 (m, 5H, aromat.), 8,05 (s, 1H, NH);

Etap 3: Otrzymywanie kwasu [(a₁-amino)-3-metylobutano]-[N-benzyl-karbamoiloJfosfinowego mg (0.17 mM) estru metylowego kwasu [(a₁-amino)-3-metylobutano]-[N-benzyl-karbamoilo]-fosfinowego poddaje się reakcji według sposobu opisanego w etapie 4 w przykładzie I przy zachowaniu opisanych warunków i skali molowej. Otrzymuje się pożądany kwas [(a₁-amino)-3-metylobutano]-[N-benzyl-karbamoilo] fosfinowy z wydajnością 30 mg (83% wagowo). Wzór sumaryczny C13H21N2O3P. Masa cząsteczkowa: 284,3 l/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w D2O, δ [ppm]): 26,81 Widmo ¹H NMR (roztwór w D₂O, δ [ppm]: 0,71-0,84 (m, 6H, 2xCH₃), 1,22-1,90 (m, 2H, CH₂) 1,65-1,74 (m, 1H, CH) 2,89-2,95 (m, 1H, CHP), 4,35-4,50 (m, 2H, CH₂Ph), 7,26-7,38 (m, 5H, aromat.).

P r z y k ł a d III

Sposób wytwarzania estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylopropano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego przedstawionego wzorem 8 jego pochodnej z wolną grupą α1N-aminową przedstawionej wzorem 9 oraz kwasu przedstawionego wzorem 10 rozpoczyna się od otrzymania substratu w postaci estru metylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-2-metylopropanofosfinowego.

Etap 1: Otrzymywanie estru metylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-2-metylopropanofosfinowego

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 2,0 g (7,37 mM) kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylopropanofosfinowego oraz dodaje 0,24 g (7,37 mM) alkoholu metylowego. Całość zalewa się 10 cm³ bezwodnego tetrahydrofuranu, a następnie dodaje 1,52 g dicykloheksylokarbodiimidu (7,37 mM) oraz 0,09 g dimetyloaminopirydyny (0,737 mM). Całość miesza się intensywnie przez 2-8 godzin. Następnie do mieszaniny poreakcyjnej dodaje się 40 ml octanu etylu i odsącza powstały dicykloheksylomocznik na lejku Buchnera. Mieszaninę ekstrahuje się kolejno 25 ml 5% wodnego roztworu KHSO4, 25 ml nasyconego, wodnego roztworu NaHCO3 i solanką. Następnie do warstwy organicznej dodaje się 3 gramy bezwodnego MgSO4. Całość sączy się przez filtr bibułowy i odparowuje. Po usunięciu lotnych składników pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej uzyskuje się klarowny olej, który krzepnie po ostudzeniu. Po reakcji uzyskuje się 2,06 g surowego produktu (98% wagowo) w postaci białego osadu o konsystencji lekko oleistej, który używa się w następnym etapie bez dodatkowego oczyszczania. Wzór sumaryczny C13H20NO4P. Masa cząsteczkowa: 285,3 l/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 38,2 (s, 65%) i 38,4 (s, 35 %) Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]: 0,99-1,10 (m, 6H, 2xCH3), 2,19-2,26 (m, 1H, CH) 3,76 (d, 3H, J=11,5 Hz, POCH3, diastereotopowy), 3,80 (d, 3H, J=12,2 Hz, POCH3, diastereotopowy), 3,88-3,97 (m, 1H, CHP), 5,07-5,22 (m, 3H, PhCH^OC, NH), 6,06 i 7,88 (d, 1H, ¹JHP= 548,4Hz, PH, distereotopowy), 6,13 i 7,95 (d, 1H, ¹J_HP= 547,2Hz, PH, distereotopowy), 7,25-7,39 (m, 5H, aromat.).

Etap 2: Otrzymywanie estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylopropano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 0,50 g (1,75 mM) estru metylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylopropanofosfinowego, zalewa się 5 cm bezwodnego dichlorometanu i schładza do 0°C. W atmosferze azotu dodaje się 0,728 ml (5,25 mM) trójetyloaminy oraz 0,735 ml (5,78 mM) trimetylochlorosilanu. Po 30 minutach, przy zachowaniu temperatury 0°C, dodaje się 0,437 ml (3,15 mM) trójetyloaminy oraz 0,476 ml (4,38 mM) izocyjanianu fenylowego. Temperaturę 0°C utrzymuje się przez godzinę, reakcję prowadzi się 14-16 godzin. Następnie do mieszaniny dodaje się 3 ml nasyconego wodnego roztworu chlorku amonu a po 10 minutach rozcieńcza 50 ml octanu etylu. Mieszaninę przemywa się kolejno 50 ml nasyconego wodnego roztworu chlorku amonu, 50 ml nasyconego wodnego roztworu NaHCO3, 50 ml solanki. Następnie do warstwy organicznej dodaje się 3 gramy bezwodnego MgSO4. Całość sączy się przez filtr bibułowy i odparowuje. Po usunięciu lotnych składników pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej uzyskuje się olej, który krzepnie po ostudzeniu. Mieszaninę oczyszcza się za pomocą chromatografii kolumnowej (15 g żelu) przy użyciu mieszaniny rozpuszczalników chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu odpowiednich frakcji, rozpuszczalniki usuwa się na wyparce rotacyjnej i otrzymuje się 0,22 g (31,0% wagowo) czystego estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylopropano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego w postaci półprzezroczystego, gęstego oleju, który zastyga po kilku godzinach. Wzór sumaryczny C20H25N2O5P. Masa cząsteczkowa: 404,4 l/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 30,85 (s, 70%), i 29,96 (s, 30%). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]: 1,01-1,23 (m, 6H, 2xCH₃), 2,22-2,33 (m, 1H, CH), 3,79 (dd, 3H, J=11,1 Hz, POCH₃, diastereotopowy,

PL 202 186 B1 nachodzące na siebie sygnały), 4,35-4,45 (m, 1H, CbzNHCHP), 5,10-5,76 (m, 2H, CH₂OCO), 5,77 (d, 1H, J=9,5, NH), 7,17-7,63 (m, 10H, aromat.), 8,99 (s, 1H, NH).

Etap 3: Otrzymywanie estru metylowego kwasu [(a₁-amino)-3-metylopropano]-[N(fenylo-karbamoilo]fosfinowego

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 0.15 g (0,37 mM) estru metylowego kwasu [α1-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylopropano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego, zalewa się 5 cm bezwodnego metanolu a następnie dodaje 10% wagowo (0,015 g) 10% Pd/C. Przez mieszaninę przepuszcza się wodór. Procedurę przeprowadza się do momentu zaniku substratu, co sprawdzane jest z wykorzystaniem chromatografii cienkowarstwowej. Następnie mieszaninę przesącza się przez celit i odparowuje. Po usunięciu lotnych składników pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej uzyskuje się olej, który krzepnie po ostudzeniu. Otrzymuje się pożądany ester metylowy kwasu [(α1-amino)-3-metylopropano]-[N-fenylo-karbamoilo]fosfinowego w ilości 80 mg (80% wagowo). Wzór sumaryczny C12H19N2O3P. Masa cząsteczkowa: 270,3 l/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 33,16 (s, 48%), i 35,15 (s, 52%). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]: 1,07-1,09 (m, 6H, 2xCH₃), 1,89 (s, 2H, NH₂) 2,19-2,20 (m, 1H, CH,), 3,25-3,28 (m, 1H, NCHP), 3,77 (d, 3H, J=13,3Hz, POCH₃, diastereotopowy), 3,81 (d, 3H, J=11,0 Hz, POCH₃, diastereotopowy), 7,17-7,67 (m, 5H, aromat.), 9,47(bs, 1H, NH);

Etap 4: Otrzymywanie kwasu [(a₁-amino)-3-metylopropano]-[N-fenyl-karbamoilojfosfinowego

W tym celu do kolby okrągłodennej odważa się 60 mg (0,22 mM) estru metylowego kwasu [(α1-amino)-3-metylopropano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego, zalewa się 5 cm³ metanolu a następnie dodano 150 μl 2M NaOH. Całość zamyka się i pozostawia na 12-16 godzin. Następnie lotne składniki usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej. Pozostałość rozpuszcza się w 2 ml metanolu, dodaje 150 μl 0.5M HCl1 a następnie tlenku propylenu do momentu zmętnienia mieszaniny. Całość pozostawia się na noc w lodówce. Wytrącony osad odsącza się na lejku Buchnera i przemywa 10 ml eteru dietylowego, a następnie suszy na powietrzu. Otrzymuje się pożądany kwas [(a1-amino)-3-metylopropano]-[N-fenylo-karbamoilo]fosfinowy w ilości 30 mg (53% wagowo). Wzór sumaryczny C11H17N2O3P. Masa cząsteczkowa: 256,2 l/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w D2O, δ [ppm]): 25,38 Widmo ¹H NMR (roztwór w D2O, δ [ppm]: 0,85-0,91 (m, 6H, 2xCH₃), 1,99-2,01 (m, 1H, CH), 2,80-2,85 (m, 1H, NCHP), 7,14-7,35 (m, 5H, aromat.);

P r z y k ł a d IV

Sposób wytwarzania estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylopropano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego przedstawionego wzorem 11 jego pochodnej z wolną grupą a₁-N-aminową przedstawionej wzorem 12 oraz kwasu przedstawionego wzorem 13 rozpoczyna się od otrzymania substratu w postaci estru metylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-2-metylopropanofosfinowego.

Etap 1: Otrzymywanie estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-2-metylopropano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego

Ester metylowy kwasu N-(benzyloksykarbonylamino)-2-metylopro-panofosfinowego otrzymuje się sposobem opisanym w etapie 1 w przykładzie III a następnie poddaje reakcji z 0,610 ml (4,84 mM) izocjanianu benzylowego w tej samej skali molowej i warunkach opisanych w etapie 2 w przykładzie III. Surowy produkt oczyszcza się za pomocą chromatografii kolumnowej (15 g żelu) przy użyciu mieszaniny rozpuszczalników chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu odpowiednich frakcji i usunięciu rozpuszczalników na wyparce rotacyjnej otrzymuje się półprzezroczysty olej krzepnący na powietrzu z wydajnością 0,36 g (44,4% wagowo) estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylopropano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego. Wzór sumaryczny C21H27N2O5P. Masa cząsteczkowa: 418,4 l/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 29,63 (s, 26%), i 30,89 (s, 74%). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl₃, δ [ppm]: 0,96-1,04 (m, 6H, 2xCH₂), 2,04-2,24 (m, 1H, CH), 3,71 (d, 3H, J=4,1 Hz, POCH₃, diastereotopowy), 3,75 (d, 3H, J=3,9 Hz, POCH₃diastereotopowy), 4,25-4,50 (m, 3H, CbzNHCHP, CH^OCO), 5,07-5,13 (m, 2H, CH^NH), 5,80 (d, 1H, J=7,7 Hz, NH), 7,26-7,35 (m, 10H, aromat.), 7,59 (s, 1H, NH).

Etap 2: Otrzymywanie estru metylowego kwasu [(a₁-amino)-3-metylopropano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego

Ester metylowy kwasu [(a₁-amino)-3-metylopropano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego otrzymuje się poddając reakcji 0,30 g (0,72 mM) estru metylowego kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylopropano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego zachowując proporcje i warunki według sposobu opisanego w etapie 3 w przykładzie III. Po usunięciu lotnych składników pod zmniejszonym

PL 202 186 B1 ciśnieniem na wyparce rotacyjnej uzyskuje się krzepnący na powietrzu olej estru metylowego kwasu

[(a₁-amino)-3-metylopropano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego z wydajnością 150 mg (73,5 % wagowo). Wzór sumaryczny C13H21N2O3P. Masa cząsteczkowa: 284,3 l/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): 33,76 (s, 69%), i 35,57 (s, 31%). Widmo ¹H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]: 0,94-1,02 (m, 6H, 2xCH₃), 1,70 (s, 2H, NH^), 2,02-2,09 (m, 1H, CH), 3,10-3,17 (m, 1H, NH₂CHP) 3,65 (d, 3H, J=2,8 Hz, POCH₃, diastereotopowy), 3,69 (d, 3H, J=2,8 Hz, POCH₃ diastereotopowy), 4,33-4,51 (m, 2H, CH₂NH), 7,22-7,31 (m, 5H, aromat.), 8,32 (s, 1H, NH);

Etap 3: Otrzymywanie kwasu [(a₁-amino)-3-metylopropano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego

100 mg (0,35 mM) estru metylowego kwasu [(a₁-amino)-3-metylopropano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego poddaje się reakcji według sposobu opisanego w etapie 4 w przykładzie III przy zachowaniu podanych warunków i skali molowej. Otrzymuje się pożądany kwas [(a₁-amino)-3-metylopropano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowy z wydajnością 70 mg (83% wagowo). Wzór sumaryczny C12H19N2O3P. Masa cząsteczkowa: 270,3 l/mol. Widmo ³¹P NMR (roztwór w D2O, δ [ppm]): 26,19; Widmo ¹H NMR (roztwór w D2O, δ [ppm]: 0,81-0,88 (m, 6H, 2xCH3), 1,92 (m, 2H, CH) 2,71-2,75 (m, 1H, NH2CHP), 4,27-4,41 (s, 2H, CH2NH), 7,25-7,29 (m, 5H, aromat.), Widmo ¹³C NMR (roztwór w D2O, δ [ppm]: 17,20 (d, 2C, CH₃), 20,50 (d, 1C, CH), 42,54 (d, 1C, CH₂NH), 54,10 (d, 1C, NH₂CHP), 127,47-128,88 (m, 5C, aromat.), 137,72 (s, 1C, aromat.);

Aktywność inhibitorowa otrzymanych w przykładach I-IV pochodnych a₁-aminoalkano-karbamoiloalkanofosfinowych z wolną grupą a₁-N-aminową wobec aminopeptydazy N.

Pomiary kinetyczne wykonano w 50 mM buforze fosforanowym o pH=7,2 i temperaturze 23°C. Jako substratu użyto L-leucylo-p-nitroanilidu z firmy Sigma rozpuszczonego w DMSO i o stężeniu końcowym 0,05 mM. Stężenia końcowe inhibitora rozpuszczonego w DMSO wynosiły 500 μM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,75 μM, 0,5 μM, 0,25 μM oraz 0,1 μM, natomiast stężenie końcowe aminopeptydazy N wynosiło 2 μg/ml Wyniki mierzono jako zmianę absorbancji przy długości fali 410 nm w czasie 10 minut i porównywano z wynikami kontroli polegającej na identycznym pomiarze, lecz bez dodatku czynnika aktywnego. Końcowy skład objętościowy mieszaniny w czasie pomiaru był następujący: roztwór enzymu w buforze - 20 pl, roztwór czynnika aktywnego - 50 pi, roztwór substratu - 100 μl i bufor uzupełniający - 1830 ul. Otrzymane wartości inhibicji podano w tabeli 1.

T a b e l a 1. Aktywność inhibitorowa α₁-aminoaikano-karbamoiioaikano-fosfinianów wobec aminopeptydazy N.

Pochodna	IC50 (μΜ)
Wzór 3	35
Wzór 4	45
Wzór 6	0.53
Wzór 7	2
Wzór 9	160
Wzór 10	310
Wzór 12	0.9
Wzór 13	0.78

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowe związki a₁-aminoalkano-karbamoiloalkano-fosfinowe użyteczne jako inhibitory aminopeptydazy N, o wzorze ogólnym 1, w którym W1 oznacza wodór albo ochronną grupę benzyloksykarbonylową (Cbz), R1 oznacza podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego naturalnych aminokwasów waliny i leucyny, R2 oznacza podstawnik fenylowy bądź benzylowy, X1 oznacza wodór lub grupę metylową, które stanowią ester metylowy kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonyl-amino)-3-metylobutano]-[N-fenyl-karbamoilo]-fosfinowego oraz jego kwas, ester metylowy kwasu [a₁-N-(benzy-loksykarbonylamino)-3-metylobutano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego oraz jego kwas, ester metylowy kwasu [a₁-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylopropano]-[N-fenyl-karbamoilo]fosfinowego oraz jego kwas,

PL 202 186 B1 ester metylowy kwasu [a1-N-(benzyloksykarbonylamino)-3-metylopropano]-[N-benzyl-karbamoilo]fosfinowego oraz jego kwas.
2. Sposób wytwarzania nowych związków a1-aminoalkano-karbamoiloalkano-fosfinowych, będących kwasami a1-aminoalkano-karbamoiloalkano-fosfinowymi bądź estrami kwasów a1-aminoalkano-karbamoiloalkano-fosfinowych, o wzorze ogólnym 1, w którym W1 oznacza wodór albo ochronną grupę benzyloksykarbonylową (Cbz), R1 oznaczają podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego naturalnych aminokwasów waliny i leucyny, R2 oznacza podstawnik fenylowy bądź benzylowy, X1 oznacza grupę metylową lub wodór, znamienny tym, że substraty w postaci estrów metylowych kwasu N-(benzyloksykarbonyloamino)alkanofosfinowego poddaje się reakcji z 2,5 równoważnikami molowymi, w stosunku do fosfinowego substratu, izocyjanianu aromatycznego, w obecności 3-4 równoważników molowych trójetyloaminy i 3-4 równoważników molowych trójmetylochlorosilanu, a reakcję prowadzi się 14-16 godzin, początkowo w temperaturze 0°C a następnie w temperaturze pokojowej, w atmosferze azotu, w bezwodnym dichlorometanie.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że podczas syntezy utrzymuje się całkowitą ilość rozpuszczalnika w granicach od 2 do 5 ml na 1 mM fosfinowego substratu.